CN103667306B - 一个高粱蜡质合成调控基因在拟南芥植株中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明主要提供了一个高粱蜡质合成调控基因在拟南芥植株中的应用。转化所述基因的拟南芥，其叶片蜡质更厚，叶片有光泽，具有抗旱、抗病虫害等优点。

Description

一个高粱蜡质合成调控基因在拟南芥植株中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个高粱蜡质合成调控基因在模式植物拟南芥中的应用。

背景技术

植物表皮细胞的外面有一层结构，称为角质层。角质层为网状结构，有蜡质填充其间，这些填充在角质层网状结构内的蜡层被称为内蜡质层；在角质层外形成只有蜡质成分的结构，为外蜡质层，外蜡质层一般会形成自我组装的蜡质晶体。研究表明：被蜡质填充的角质层能够降低通过植物表面的水分散失，提高植物的抗旱性。角质层还在防止紫外线辐射伤害、抵抗病虫害的侵入方面起重要作用，此外，角质层的蜡质含量与花粉育性和一些农艺性状表现有关。

为获得能显著提高农作物蜡质含量的基因，我们选用了蜡质含量较高的高粱为材料，进行蜡质合成相关基因的克隆。高粱属于禾本科，高粱属，1年生草本，植株表面常覆有明显的蜡质成分，使其具有广泛的适应性和较强的抗逆能力，是用于蜡质相关优良基因鉴定的理想材料。我们以拟南芥中调控蜡质合成的基因WIN1的序列为参考序列，克隆了高粱中的相应同源基因，命名为SbWIN1，并通过基因工程操作，将其转到拟南芥中，并处于组成型超表达启动子35S的控制下。表型鉴定的结果表明，转基因拟南芥的叶片的蜡质含量明显增加，叶片有光泽。采用扫描电镜对其进行深度形态学扫描，结果表明，叶片表面的蜡质晶体成分明显增多，高粱SbWIN1基因具有显著提高植物表面蜡质成分的能力，是进行农作物蜡质性状改良的一个重要候选基因。

发明内容

本发明的目的是提供一个高粱蜡质合成调控基因在拟南芥蜡质成分性状改变中的应用。

本发明的技术方案如下：一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

AUGGUACAGCCAAAGAAGUUUCGUGGAGUCCGGCAGCGCCACUGGGGUUCCUGGGUCUCCGAGAUCAGGCAUCCCCUCCUUAAGAGGAGGGUCUGGCUGGGCACCUUCGAGACCGCUGAGGAGGCAGCGAGAGCAUAUGACGAGGCUGCCGU GCUGAUGAGCGGCCGCAACGCCAAGACCAACUUCCCGGUCCAAAGGAGCAGCACAGGGGAGCCAACCCCAGCUGCGGGAAGGGACGCUCACAGCAACGCCGGCAGCGGCUCCUCUACCGCCAACCUGUCCCAGAUUCUCAGUGCGAAGCUCCGCAAAUGCUGCAAGGCGCCAUCGCCCUCCCUGACCUGUCUCCGCCUUGACCCUGAGAAGUCCCACAUUGGUGUUUGGCAGAAGCGUGCAGGAGCCCGUGCUGACUCCAACUGGGUCAUGACCGUGGAGCUCAACAAAGGUGCAGCAUCCACUGAUGCUGCAUCACAGUCCACAUCAGCAACAACUGCUCCACCAGCCACCCCGAUGGAUGACGAGGAGAGGAUCGCCCUGCAAAUGAUCGAAGAGUUGCUGAGCAGCAGCAGCCCAGCUUCACCCUCGCACGGAGAUGACCAAGGUCGCUUCAUCAUCUGA

SEQ ID NO：1

所述基因根据拟南芥AtWIN1基因的序列，通过同源序列比对获得高粱的SbWIN1基因序列，通过扩增、连接、植物转化等分子生物学操作而获得。具体如下：

采用生物信息学的方法，获得SbWIN1基因序列。利用PRIMER5设计引物用于扩增开放阅读框序列。提取高粱BTX623茎秆的RNA，将1μg的RNA逆转录为cDNA作为扩增的模板备用。用设计的特异引物进行扩增。将扩增的产物连接到克隆载体上。转入大肠杆菌，筛选阳性的进行测序，获得SEQ ID NO：1所示的基因序列。

将上述克隆到的基因连接到超表达载体，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株。结果表明转基因拟南芥叶片蜡质比普通的要厚，叶片有光泽。

附图说明

图1野生型拟南芥；

图2是含有本发明序列表中序列1基因的拟南芥；

图3野生型拟南芥的扫描电镜图；

图4是含有本发明序列表中序列1基因的拟南芥电镜扫捕图。

具体实施方式

下面以高粱的茎秆作为试验材料详细说明制备方法。

1.总RNA的提取采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA溶液后琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-80℃保存。

2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，步骤如下：

1)取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分：总RNA；Oligl dT；10mM dNTP。混匀，轻甩离心管，使溶液至底部；

2)离心管置于水浴锅内，65℃保温5min；

3)迅速取出置于冰上冷却1min以上，将离心管轻微离心；

4)在上述离心管中加入下列反转录反应液：5×First-strand Buffer；0.1M DTT；Recombinant RNase Inhibitor；SuperScript^TM III RT；

5)轻微震荡混匀后短暂离心；

6)50℃保温50min；

7)70℃保温15min，-20℃保存。

高粱β-Actin F(GenBank accession No.X79378)检测反转录产物。PCR扩增程序：94℃4min，35个循环的程序为95℃30s，60℃30s，72℃30s，最后72℃5min。2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.SbWIN1的分离

PCR扩增引物采用“Primer 5.0”引物设计软件进行设计，并对得到的引物序列用Vector NTI进行分析，找出解链温度，自身互补性，两引物互补性合适的引物对。cDNA为模板，SbAGL6-F、SbAGL6-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μl，包括反转录产物，10×phushion HF buffer，10mmol/L dNTPs，10mM基因特异引物，phusion DNA聚合酶，DMSO，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃1min，35个循环的程序为98℃10s，47℃20s，72℃30s，最后72℃10min。本试验PCR扩增选用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶。

4.PCR产物的加A连接

利用Phusion DNA聚合酶产生的克隆片段为平末端，在进行TA克隆之前，可用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物、5×Taq buffer、10mM dATP、Taq酶，72℃保持15分钟，取出2μl加A后的PCR回收产物加入2×T₄连接酶缓冲液、pGEM-T easy载体(50ng/μl)、T₄DNA连接酶(3U/μl)连接到pGEM-T easy载体上，pGEM-T easy载体购自Promega公司。

5.连接产物的转化

1)从-80℃冰箱中取出1管(50μl)感受态细胞，置冰上。

2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟。

3)42℃水浴热激60秒，迅速置冰上5分钟。

4)向离心管中加入SOC液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h。

5)室温下8000rpm离心5分钟，弃掉上清液，将剩余上清液重新悬浮菌体，用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分钟。

6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出。

7)放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。

6.重组质粒的PCR鉴定

本实验所用的pGEM-T载体的插入片段上游有T₇引物，下游有SP₆引物和M₁₃引物，所以可以用这三个启动子序列做引物对插入片段进行特异性扩增，对重组质粒进行鉴定，鉴定程序如下：PCR扩增体系包括10×buffer(含MgCl₂)，dNTP 10mmol/L，T₇和SP₆引物(20ng/μl)，Taq酶，模板为转化后的白色菌斑。反应条件为：94℃，10min；35个循环：94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；72℃延伸5min。最后，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，选择合适大小的阳性克隆测序。测序在华大基因测序部完成。

表达载体的构建：根据SbWIN1基因的ORF序列，将Gateway技术中的AttB位点加入原始引物序列，从阳性克隆的质粒中扩增出ORF片段，用于构建表达载体。

7.带有attB位点的基因序列的扩增

以通过测序鉴定的质粒为模板SbWIN1F，SbWIN1R，为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：反应总体系包括反转录产物，10×phushion HF buffer，10mmol/L dNTPs，10mM基因特异引物，phusion DNA聚合酶，DMSO，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃30s，35个循环的程序为98℃10s，60℃30s，72℃1min，最后72℃5min。50μl全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。

8.入门载体的构建

利用得到的Sb-WIN1产物和pDONR(amp)进行BP反应，Sb-WIN1基因编码序列将pDONR(amp)载体上的ccdB位点置换，构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5α后，用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，pDONR(amp)载体上游有T₇引物和SbAGL6 R引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物、pDONR(amp)vector、BP clone II enzyme、dd H₂O。

9.表达载体的构建

将鉴定正确的质粒连接到pGWB14表达载体上，进行转化和酶切检测，将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒、pGWB14 vector、LR clone II enzyme、dd H₂O。

10.重组质粒pKIGW-SbWIN1农杆菌的电击转化

①取50μl的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2μl已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时。

②将①中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷。

③用细胞融合仪进行电击。

④电击结束后立即加入不含抗生素的SOC培养基中，混匀后移入2ml离心管中，28℃下震荡培养2h。

⑤8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃下倒置，培养2天。

11.PCR验证和菌种保存

挑取培养基上的单菌落，作菌落PCR筛选单克隆。将鉴定正确的单克隆，液氮速冻，-80℃保存以备用。

12.将活化后的菌液取1ml于200ml接种于含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中，28℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8～0.9。

将上述菌液5000rpm离心8min，用5％(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体，使OD₆₀₀＝0.8～0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02％Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了Silwet L-77的蔗糖溶液中浸泡1min。

把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获T₀代种子。

13.拟南芥T₀代种子筛选

(1)将干燥2周后的T₀代种子先用75％酒精消毒1分钟，再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(75mg/L卡那霉素)上。

(2)4℃春化两天后置于22℃、16h光照条件下，10d后观察其子叶和根的发育状况，挑选转化体，转化体表现为真叶健康呈深绿色，根长至培养基里。于与转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。10d后，把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8～10叶时，提取幼嫩叶片基因组DNA，进行PCR鉴定；通过鉴定的植株分单株收获种子。

14.转基因拟南芥的PCR鉴定

用SIGMA公司的Extract-N-Amp^TM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下：

(1)DNA提取：取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入Extraction Solution，95℃保持10min，加入Dilution Solution，2℃-8℃储存以备用。

(2)PCR扩增：PCR扩增反应体系包括ddH₂O、Extract-N-Amp PCR Readymix、10mM Primer F、10mM Primer R、Leafdisk extract；PCR扩增反应程序为：94℃3min， 30个循环包括94℃1min、60℃1min、72℃1min30sec，然后72℃10min。

15.转基因植物的表型鉴定

直观观察结果可以明显看到，转基因的拟南芥具有光泽叶片。

16.扫描电镜观察叶片的结果：通过扫描电镜的观察我们发现转基因的叶片上的蜡质大量的增加了。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (2)

1.一种高粱蜡质合成调控基因在制备具有蜡质合成调控能力的拟南芥植株中的应用，其特征在于：所述高粱蜡质合成调控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的一种高粱蜡质合成调控基因在制备具有蜡质合成调控能力的拟南芥植株中的应用，其特征在于：将所述高粱蜡质合成调控基因连接到超表达载体上，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株。