发明内容
本发明的目的是提供一种小麦WRKY转录因子基因在拟南芥应答高温胁迫中的应用。
本发明利用NCBI数据库中的基因序列,查找与水稻WRKY基因cDNA同源的小麦EST片段,将部分重叠且高度同源的小麦EST进行序列拼装,组合成具有WRKY结构域和完整ORF的cDNA序列,根据这些序列设计特异性PCR引物,采用RT-PCR的方法,获得了TaWRKY71基因,并且构建了可诱导的超表达载体,利用模式植物拟南芥进行了转基因的功能鉴定。
本发明的具体技术方案是:一种小麦WRKY转录因子基因,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
所述WRKY转录因子基因根据水稻OsWRKY71基因的序列,通过同源序列比对,扩增,连接,转化,筛选、测序等分子生物学操作获得,命名为TaWRKY71。
所述WRKY转录因子基因连接到超表达载体上,通过农杆菌介导转化的方法,获得转基因拟南芥植株。
所述超表达载体为pKIGW-TaWRKY71。该载体中pOp6/LhGR系统的下游为GUS基因,上游为Gateway元件。pOp6/LhGR系统在地塞米松诱导后,pOp6双向启动子可同时表达GUS基因和Gateway元件中的TaWRKY71基因,因此通过GUS染色可以很方便的监测目的基因的表达情况。同时,此载体可以通过外源的化学诱导物地塞米松来控制目的基因的表达,具有着独特的优势。
本发明克隆了一种小麦WRKY转录因子基因TaWRKY71,构建可诱导的TaWRKY71超表达载体,用农杆菌介导转化,获得转基因拟南芥植株,该转基因拟南芥植株对高温胁迫的抗性明显下降,大多死亡,说明该基因参与了植物的热调控网络,为小麦的遗传改良提供优良的基因资源。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
一、小麦WRKY转录因子基因TaWRKY71的获得
1.总RNA的提取:以小麦扬麦158叶片作为试验材料,采用TIANGEN试剂盒,操作步骤如试剂盒说明所示,得到RNA溶液后,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量,-80℃保存。
2.cDNA的合成:cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScriptTMⅢFirst-StrandSynthesis System for RT-PCR,具体步骤如下:
1)取0.5ml灭菌微量离心管,分别加入以下成分:总RNA11μL,Oligo(dT)1μL和10mMdNTP 1μL。混匀,轻甩离心管,使溶液集中至底部;
2)离心管置于水浴锅内,65℃保温5min;
3)迅速取出置于冰上冷却1min以上,将离心管轻微离心;
4)在上述离心管中加入下列反转录反应液:5×First-strand Buffer 4μL,0.1MDTT 1μL,Recombinant RNase Inhibitor 1μL,SuperScriptTMⅢ RT 1μL;
5)轻微震荡混匀后短暂离心;
6)50℃保温50min;
7)70℃保温15min,-20℃保存。
用小麦β-Actin检测反转录产物;PCR扩增程序为:94℃ 4min,35个循环的程序为95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,最后72℃ 5min;1%琼脂糖凝胶电泳检测。
3.TaWRKY71基因的分离
以水稻相应基因的全长序列为基础到NCBI数据库上对EST库进行BLANSTN查询,将搜索到的一些部分高度相似且重叠的小麦ESTs进行序列拼接,组合成序列较长的复合EST,再以此为查询序列重复进行BLASTN搜索、聚类、拼接直至无法进行,以达到最有效延伸。利用BLASTX验证该拼接片段是否符合预测。根据符合预测的拼接片段设计特异性PCR引物,TaWRKY71-a F:5'-ATGGATCCATGGGTCAGCAGC-3';TaWRKY71-aR:5'-ATTGATGTCCCTGGTCGGCGATA-3'。以步骤2中合成的cDNA为模板,TaWRKY71-a F、TaWRKY71-aR为引物进行PCR扩增,PCR扩增体系为:反应总体系50μl,包括反转录产物,5×phushion HFbuffer 10μL,10mmol/L dNTPs 1μL,10mM Primer F 1μL,10mM Primer R 1μL,PhusionDNA聚合酶0.5μL,dd H2O 35.5μL。PCR扩增程序:98℃ 1min,35个循环的程序为98℃ 10s,47℃ 20s,72℃ 30s,最后72℃ 10min。
4.PCR产物的加A连接
利用Phusion DNA聚合酶产生的克隆片段为平末端,在进行TA克隆之前,用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物10μL、5×Taq buffer 1μL、10mM dATP 0.1μL、Taq酶0.1μL,72℃保持15分钟,取出2μL加A后的PCR回收产物加入2×T4连接酶缓冲液5μL、pGEM-T easy载体(50ng/μL)1μL、T4DNA连接酶(3U/μL)1μL连接到pGEM-Teasy载体上,pGEM-T easy载体购自Promega公司。
5.连接产物的转化
1)从-80℃冰箱中取出1管(50μL)感受态细胞,置冰上;
2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μL连接反应物,轻轻摇匀,置冰上30分钟;
3)42℃水浴热激60秒,迅速置冰上5分钟;
4)向离心管中加入SOC液体培养基,混匀后37℃振荡培养1h;
5)室温下8000rpm离心5分钟,弃掉上清液,将剩余上清液重新悬浮菌体,用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上,放置30分钟;
6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜,待出现明显单菌落时拿出;
7)放入4℃冰箱数小时,使蓝白斑颜色分明。
6.重组质粒的PCR鉴定
所用的pGEM-T载体的插入片段上游有T7引物,下游有SP6引物和M13引物,所以可以用这三个启动子序列做引物对插入片段进行特异性扩增,对重组质粒进行鉴定,鉴定程序如下:PCR扩增体系包括10×buffer(含MgCl2)1μL,dNTP 10mmol/L 0.2μL,T7和SP6引物(20ng/μL)各0.5μL,Taq酶0.1μL,模板为转化后的白色菌斑。反应条件为:94℃,10min;35个循环:94℃,30s;56℃,30s;72℃,2min;72℃延伸5min。最后,PCR扩增产物用1%琼脂糖电泳检测,选择合适大小的阳性克隆测序,获得如序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。测序在北京博迈德基因测序部完成。
二、TaWRKY71转基因拟南芥的获得
表达载体的构建:根据TaWRKY 71基因的ORF序列,将Gateway技术中的AttB位点加入原始引物序列,从阳性克隆的质粒中扩增出ORF片段,用于构建表达载体。
1.带有AttB位点的基因序列的扩增
以通过测序鉴定的质粒为模板AttB-TaWRKY71F,AttB-TaWRKY71R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为:反应总体系包括质粒模板1.5μL,5×phushion HF buffer 10μL,10mmol/L dNTPs 1μL,10mM基因特异引物各2.5μL,phusion DNA聚合酶0.5μL,dd H2O 32μL。PCR扩增程序:98℃ 30s,35个循环的程序为98℃ 10s,60℃ 30s,72℃ 1min,最后72℃5min。50μL全部点样,琼脂糖电泳后回收PCR产物。
2.入门载体的构建
利用得到的AttB-TaWRKY71产物和pDONR(amp)进行BP反应,TaWRKY71基因编码序列将pDONR(amp)载体上的ccdB位点置换,构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5α后,用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒,保存进行菌落PCR鉴定,pDONR(amp)载体上游有T7引物和TaWRKY71-R引物,以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物1μL,pDONR(amp)vector1μL,BP cloneⅡenzyme 1μL和dd H2O 1μL。
3.表达载体的构建
如图1所示,将鉴定正确的质粒连接到pKIGW表达载体上,进行转化和酶切检测,将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒2μL,pKIGW vector 1μL,LR clone II enzyme 1μL和dd H2O 1μL。
4.重组质粒pKIGW-TaWRKY 71农杆菌的电击转化
1)取50μL的农杆菌感受态细胞于冰上融化,加入2μL已构建好的质粒DNA,轻柔混匀,冰上放置半小时;
2)将1)中的混合物转入电击杯中,电击杯提前预冷;
3)用细胞融合仪进行电击;
4)电击结束后立即加入不含抗生素的SOC培养基中,混匀后移入2mL离心管中,28℃下震荡培养2h;
5)8000rpm,离心5min,弃上清,剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上,28℃下倒置,培养2天。
5.PCR验证和菌种保存
挑取培养基上的单菌落,作菌落PCR筛选单克隆。将鉴定正确的单克隆,液氮速冻,-80℃保存以备用。
6.将活化后的菌液取1mL接种于200mL含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中,28℃,250rpm振荡培养至OD600=0.8~0.9。
将上述菌液5000rpm离心8min,用5%(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体,使OD600=0.8~0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02%的Silwet L-77,将拟南芥花序浸入加了Silwet L-77的蔗糖溶液中浸泡1min。把拟南芥用塑料袋套好,密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实,收获T0代种子。
7.拟南芥T0代种子筛选
1)将干燥2周后的T0代种子先用75%酒精消毒1分钟,再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(75mg/L卡那霉素)上;
2)4℃春化两天后置于22℃、16h光照条件下,10d后观察其子叶和根的发育状况,挑选转化体,如图2所示,转化体表现为真叶健康呈深绿色,根长至培养基里。转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长,而非转基因植株则不能正常生长。10d后,把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8~10叶时,提取幼嫩叶片基因组DNA,进行PCR鉴定;通过鉴定的植株分单株收获种子。
三、转基因拟南芥的PCR分子鉴定
用SIGMA公司的Extract-N-AmpTM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定,步骤如下:
1.DNA提取:取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中,加入100μL ExtractionSolution,95℃保持10min,加入100μL Dilution Solution混匀,2℃-8℃储存以备用;
2.PCR扩增:PCR扩增反应体系包括ddH2O 4μL、Extract-N-Amp PCR Readymix 10μL、10mM Primer F 1μL、10mM Primer R 1μL、Leaf disk extract 4μL;PCR扩增反应程序为:94℃ 3min,30个循环包括94℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 1min30sec,然后72℃ 10min。如图3所示,PCR分子鉴定有扩增条带的为转基因植株。
四、TaWRKY71转基因拟南芥T1代植株的耐高温性鉴定
将纯合体拟南芥转基因种子和野生型(Col-0)种子同时种植在含有化学诱导物地塞米松(DEX)的培养基中,生长一周后将其转入40℃的高温中处理10h,处理后,转移培养皿到正常的生长条件下,培养2d后观察转基因植株与野生型的变化。如图4所示,可以发现,转基因拟南芥对高温胁迫极端敏感,与野生型拟南芥植株相比,转基因植株对高温胁迫的抗性明显下降,大多死亡,说明该基因参与了植物的热调控网络。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。