CN104046634A - 一种小麦wrky转录因子基因及其在拟南芥应答高温胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供一种小麦WRKY转录因子基因，还涉及了该基因在拟南芥应答高温胁迫中的应用，该小麦WRKY转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。转化所述基因的拟南芥植株在高温等逆境胁迫时有明显表型改变，该基因参与了植物的抗逆防御信号转导的响应过程，为小麦的遗传改良提供了优良的基因资源。

Description

一种小麦WRKY转录因子基因及其在拟南芥应答高温胁迫中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，尤其是涉及一种小麦WRKY转录因子基因及其在拟南芥应答高温胁迫中的应用。

背景技术

小麦是我国第二大口粮作物，其稳产丰产是确保国家粮食安全的重要基础。我国大部分麦区在小麦的籽粒灌浆期经常出现30℃以上的高温，严重影响了小麦的产量和品质；另外，在我国北方和长江中下游麦区也常发生“高温逼熟”灾害。高温胁迫造成小麦的生长发育紊乱，甚至干枯死苗，是限制我国小麦产量的主要自然灾害之一。转录因子在植物基因表达中发挥中心调控作用，其中WRKY转录因子广泛参与植物对生物和非生物逆境胁迫应答反应。但有关小麦WRKY转录因子参与调控耐热应答的机制目前知之甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦WRKY转录因子基因及其在拟南芥应答高温胁迫中的应用。

本发明利用NCBI数据库中的基因序列，查找与水稻WRKY基因cDNA同源的小麦EST片段，将部分重叠且高度同源的小麦EST进行序列拼装,组合成具有WRKY结构域和完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得了TaWRKY71基因，并且构建了可诱导的超表达载体，利用模式植物拟南芥进行了转基因的功能鉴定。

本发明的具体技术方案是：一种小麦WRKY转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

所述WRKY转录因子基因根据水稻OsWRKY71基因的序列，通过同源序列比对，扩增，连接，转化，筛选、测序等分子生物学操作获得，命名为TaWRKY71。

所述WRKY转录因子基因连接到超表达载体上，通过农杆菌介导转化的方法，获得转基因拟南芥植株。

所述超表达载体为pKIGW-TaWRKY71。该载体中pOp6/LhGR系统的下游为GUS基因，上游为Gateway元件。pOp6/LhGR系统在地塞米松诱导后，pOp6双向启动子可同时表达GUS基因和Gateway元件中的TaWRKY71基因，因此通过GUS染色可以很方便的监测目的基因的表达情况。同时，此载体可以通过外源的化学诱导物地塞米松来控制目的基因的表达，具有着独特的优势。

本发明克隆了一种小麦WRKY转录因子基因TaWRKY71，构建可诱导的TaWRKY71超表达载体，用农杆菌介导转化，获得转基因拟南芥植株，该转基因拟南芥植株对高温胁迫的抗性明显下降，大多死亡，说明该基因参与了植物的热调控网络，为小麦的遗传改良提供优良的基因资源。

附图说明

图1是含有本发明序列表中序列1基因TaWRKY71的表达载体pKIGW-TaWRKY71；

图2是含有本发明序列表中序列1基因TaWRKY71的拟南芥；

图3是转基因植株的分子鉴定图；

图4是转基因拟南芥与野生型植株经高温胁迫后的生长情况比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

一、小麦WRKY转录因子基因TaWRKY71的获得

1.总RNA的提取：以小麦扬麦158叶片作为试验材料，采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示，得到RNA溶液后，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-80℃保存。

2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScript^TMⅢFirst-StrandSynthesis System for RT-PCR，具体步骤如下：

1)取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分：总RNA11μL，Oligo(dT)1μL和10mMdNTP1μL。混匀，轻甩离心管，使溶液集中至底部；

2)离心管置于水浴锅内，65℃保温5min；

3)迅速取出置于冰上冷却1min以上，将离心管轻微离心；

4)在上述离心管中加入下列反转录反应液：5×First-strand Buffer4μL，0.1M DTT1μL，Recombinant RNase Inhibitor1μL，SuperScript^TMⅢRT1μL；

5)轻微震荡混匀后短暂离心；

6)50℃保温50min；

7)70℃保温15min，-20℃保存。

用小麦β-Actin检测反转录产物；PCR扩增程序为：94℃4min，35个循环的程序为95℃30s，60℃30s，72℃30s，最后72℃5min；1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.TaWRKY71基因的分离

以水稻相应基因的全长序列为基础到NCBI数据库上对EST库进行BLANSTN查询，将搜索到的一些部分高度相似且重叠的小麦ESTs进行序列拼接，组合成序列较长的复合EST，再以此为查询序列重复进行BLASTN搜索、聚类、拼接直至无法进行，以达到最有效延伸。利用BLASTX验证该拼接片段是否符合预测。根据符合预测的拼接片段设计特异性PCR引物，TaWRKY71-a F：5'-ATGGATCCATGGGTCAGCAGC-3'；TaWRKY71-a

R：5'-ATTGATGTCCCTGGTCGGCGATA-3'。以步骤2中合成的cDNA为模板，TaWRKY71-a F、TaWRKY71-a R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μl，包括反转录产物，5×phushion HF buffer10μL，10mmol/L dNTPs1μL，10mM PrimerF1μL，10mM Primer R1μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O35.5μL。PCR扩增程序：98℃1min，35个循环的程序为98℃10s，47℃20s，72℃30s，最后72℃10min。

4.PCR产物的加A连接

利用Phusion DNA聚合酶产生的克隆片段为平末端，在进行TA克隆之前，用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物10μL、5×Taq buffer1μL、10mM dATP0.1μL、Taq酶0.1μL，72℃保持15分钟，取出2μL加A后的PCR回收产物加入2×T₄连接酶缓冲液5μL、pGEM-T easy载体(50ng/μL)1μL、T₄DNA连接酶(3U/μL)1μL连接到pGEM-T easy载体上，pGEM-T easy载体购自Promega公司。

5.连接产物的转化

1)从-80℃冰箱中取出1管(50μL)感受态细胞，置冰上；

2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μL连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟；

3)42℃水浴热激60秒，迅速置冰上5分钟；

4)向离心管中加入SOC液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h；

5)室温下8000rpm离心5分钟，弃掉上清液，将剩余上清液重新悬浮菌体，用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分钟；

6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出；

7)放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。

6.重组质粒的PCR鉴定

所用的pGEM-T载体的插入片段上游有T₇引物，下游有SP₆引物和M₁₃引物，所以可以用这三个启动子序列做引物对插入片段进行特异性扩增，对重组质粒进行鉴定，鉴定程序如下：PCR扩增体系包括10×buffer(含MgCl₂)1μL，dNTP10mmol/L0.2μL，T₇和SP₆引物(20ng/μL)各0.5μL，Taq酶0.1μL，模板为转化后的白色菌斑。反应条件为：94℃，10min；35个循环：94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；72℃延伸5min。最后，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，选择合适大小的阳性克隆测序，获得如序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。测序在北京博迈德基因测序部完成。

二、TaWRKY71转基因拟南芥的获得

表达载体的构建：根据TaWRKY71基因的ORF序列，将Gateway技术中的AttB位点加入原始引物序列，从阳性克隆的质粒中扩增出ORF片段，用于构建表达载体。

1.带有AttB位点的基因序列的扩增

以通过测序鉴定的质粒为模板AttB-TaWRKY71F，AttB-TaWRKY71R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：反应总体系包括质粒模板1.5μL，5×phushion HF buffer10μL，10mmol/L dNTPs1μL，10mM基因特异引物各2.5μL，phusion DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O32μL。PCR扩增程序：98℃30s，35个循环的程序为98℃10s，60℃30s，72℃1min，最后72℃5min。50μL全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。

2.入门载体的构建

利用得到的AttB-TaWRKY71产物和pDONR(amp)进行BP反应，TaWRKY71基因编码序列将pDONR(amp)载体上的ccdB位点置换，构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5α后，用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，pDONR(amp)载体上游有T₇引物和TaWRKY71-R引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物1μL，pDONR(amp)vector1μL，BP cloneⅡenzyme1μL和dd H₂O1μL。

3.表达载体的构建

如图1所示，将鉴定正确的质粒连接到pKIGW表达载体上，进行转化和酶切检测，将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒2μL，pKIGWvector1μL，LR clone II enzyme1μL和dd H₂O1μL。

4.重组质粒pKIGW-TaWRKY71农杆菌的电击转化

1)取50μL的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2μL已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时；

2)将1)中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷；

3)用细胞融合仪进行电击；

4)电击结束后立即加入不含抗生素的SOC培养基中，混匀后移入2mL离心管中，28℃下震荡培养2h；

5)8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃下倒置，培养2天。

5.PCR验证和菌种保存

挑取培养基上的单菌落，作菌落PCR筛选单克隆。将鉴定正确的单克隆，液氮速冻，-80℃保存以备用。

6.将活化后的菌液取1mL接种于200mL含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中，28℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8～0.9。

将上述菌液5000rpm离心8min，用5％(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体，使OD₆₀₀＝0.8～0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02％的Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了Silwet L-77的蔗糖溶液中浸泡1min。把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获T₀代种子。

7.拟南芥T₀代种子筛选

1)将干燥2周后的T₀代种子先用75％酒精消毒1分钟，再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(75mg/L卡那霉素)上；

2)4℃春化两天后置于22℃、16h光照条件下，10d后观察其子叶和根的发育状况，挑选转化体，如图2所示，转化体表现为真叶健康呈深绿色，根长至培养基里。转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。10d后，把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8～10叶时，提取幼嫩叶片基因组DNA，进行PCR鉴定；通过鉴定的植株分单株收获种子。

三、转基因拟南芥的PCR分子鉴定

用SIGMA公司的Extract-N-Amp^TM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下：

1.DNA提取：取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入100μL Extraction Solution，95℃保持10min，加入100μL Dilution Solution混匀，2℃-8℃储存以备用；

2.PCR扩增：PCR扩增反应体系包括ddH₂O4μL、Extract-N-Amp PCR Readymix10μL、10mM Primer F1μL、10mM Primer R1μL、Leaf disk extract4μL；PCR扩增反应程序为：94℃3min，30个循环包括94℃1min、60℃1min、72℃1min30sec，然后72℃10min。如图3所示，PCR分子鉴定有扩增条带的为转基因植株。

四、TaWRKY71转基因拟南芥T1代植株的耐高温性鉴定

将纯合体拟南芥转基因种子和野生型(Col-0)种子同时种植在含有化学诱导物地塞米松(DEX)的培养基中，生长一周后将其转入40℃的高温中处理10h，处理后，转移培养皿到正常的生长条件下，培养2d后观察转基因植株与野生型的变化。如图4所示，可以发现，转基因拟南芥对高温胁迫极端敏感，与野生型拟南芥植株相比，转基因植株对高温胁迫的抗性明显下降，大多死亡，说明该基因参与了植物的热调控网络。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (4)

1.一种小麦WRKY转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的小麦WRKY转录因子基因，其特征在于：该基因序列与水稻OsWRKY71基因有很高的同源性，对其进行克隆测序，经基因工程操作，使其受控于化学诱导型启动子。

3.权利要求1或2所述的小麦WRKY转录因子基因在拟南芥应答高温胁迫中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述小麦WRKY转录因子基因连接到超表达载体上，通过农杆菌介导转化，得到转基因拟南芥植株。