CN104004773B - 一种小麦wrky转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供一种小麦WRKY转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用，该小麦WRKY转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。转化所述基因的拟南芥根系有明显表型改变,该基因参与了植物的发育过程。

Description

一种小麦WRKY转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，尤其是涉及一种小麦WRKY转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用。

背景技术

小麦是我国重要的粮食作物，其稳产丰产事关国家粮食安全，围绕小麦开展的研究也比较全面。根系固植小麦于土壤，可提供生长所需的养分和水分，是进行小麦生长发育及应答逆境胁迫等全部生物学活动的基础。但与模式作物相比，目前对小麦根系发育的机理研究还很薄弱，鉴定的调控基因很少，因而，很难采取遗传操作的方法来改良小麦的根系性状。转录因子控制着基因的表达，对小麦根系的生长发育调控发挥重要作用。其中WRKY类转录因子家族在多种组织中广泛存在，参与众多代谢过程的调控，对植物生长发育过程也具有非常重要的作用，它们参与了对表皮毛的形态建成和果皮中单宁的合成、果实的成熟、胚的发育、衰老、休眠和根细胞的成熟等发育过程的调控。但有关小麦WRKY转录因子参与植物根系发育调控的研究鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦WRKY转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用。

本发明通过电子克隆法分离了具有完整开放阅读框的小麦WRKY家族基因，根据这些序列设计特异性PCR引物。采用RT-PCR的方法，获得了TaWRKY72-b基因，并且构建了可诱导的超表达载体，利用模式植物拟南芥进行了转基因的功能鉴定。

本发明的具体技术方案是：一种小麦WRKY转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

所述WRKY转录因子基因根据水稻OsWRKY72基因的序列，通过同源序列比对，扩增，测序等分子生物学操作获得，命名为TaWRKY72-b。

所述WRKY转录因子基因连接到超表达载体上，通过农杆菌介导转化的方法，获得转基因拟南芥植株。该超表达载体中的pOp6/LhGR系统下游为GUS基因，上游为Gateway元件。pOp6/LhGR系统在地塞米松诱导后，pOp6双向启动子可同时表达GUS基因和Gateway元件中的TaWRKY72-b基因，因此通过GUS染色可以很方便的监测目的基因的表达情况。同时，此载体可以通过外源的化学诱导物地塞米松来控制目的基因的表达，具有着独特的优势。

本发明克隆了一种小麦WRKY转录因子基因TaWRKY72-b，构建可诱导的TaWRKY72-b超表达载体，用农杆菌介导转化，获得转基因拟南芥植株，该转基因拟南芥植株的根系发育受到抑制，植株生长停滞，表明该基因的超量表达，通过影响其上下游基因的表达从而抑制拟南芥根系的形成。

附图说明

图1是含有本发明序列表中序列1基因TaWRKY72-b的表达载体；

图2是转基因植株的分子鉴定图；

图3是诱导前后转基因拟南芥与野生型植株的根系发育情况对比；

图4是诱导前后转基因拟南芥与野生型植株的根系发育情况的显微图像对比，其中A为拟南芥根系表型，B代表侧根的显微图像，C代表主根的显微图像，WT为野生型拟南芥对照植株，72b(4A)和72b(4C)为两种转基因拟南芥株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

一、小麦WRKY转录因子基因TaWRKY72-b的获得

1.总RNA的提取：以小麦扬麦158叶片作为提取材料，采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA溶液用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，-80℃低温保存。

2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScript^TM Ⅲ First-StrandSynthesis System for RT-PCR，首先取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分：总RNA11μL；Oligo(dT)1μL；10mM dNTP1μL，混匀，轻甩离心管，使溶液集中至底部，将混合液65℃温浴5min，然后迅速置于冰上1min，再在上述离心管中加入下列反转录反应液：5×First-strand Buffer 4μL，0.1M DTT 1μL，Recombinant RNase Inhibitor 1μL，SuperScript^TM Ⅲ RT 1μL，轻轻混匀，短暂离心收集至管底，50℃温浴50min，70℃，15min，将反转录产物放-20℃保存。

用小麦β-Actin检测反转录产物。PCR扩增程序为：94℃4min，35个循环的程序为95℃30s，60℃30s，72℃30s，最后72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.TaWRKY72-b基因的分离

以水稻相应基因的全长序列为基础到NCBI数据库上对EST库进行BLANSTN查询，将搜索到的一些部分高度相似且重叠的小麦ESTs进行序列拼接，组合成序列较长的复合EST，再以此为查询序列重复进行BLASTN搜索、聚类、拼接直至无法进行，以达到最有效延伸。利用BLASTX验证该拼接片段是否符合预测。根据符合预测的拼接片段设计特异性PCR引物，TaWRKY72-b F：5'-ATGGAGAATTACCCCATTCTC-3'；TaWRKY72-b R：5'-TCATTGAAACATGTGTTGGTT-3'。以步骤2中合成的cDNA为模板，TaWRKY72-b F、TaWRKY72-b R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μL，包括反转录产物1μL，5×phushion HF buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 1μL，10mMPrimer F 1μL，10mM Primer R 1μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O 35.5μL。PCR扩增程序为：98℃1min，35个循环的程序为98℃10s，47℃20s，72℃30s，最后72℃10min。其中PCR扩增选用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶。电泳完毕在紫外线灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化(Takara公司，北京)。将纯化后的cDNA克隆到pGEM-T easy载体(Promega公司)上，并送至北京博迈德测序，获得如序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

二、TaWRKY72-b转基因拟南芥的获得

1.带有AttB位点的基因序列的扩增

以通过测序鉴定的质粒为模板，以AttB-TaWRKY72-b F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGAGAATTACCCCATTCTC-3，AttB-TaWRKY72-b R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTGAAACATGTGTTGGTT-3’

为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：反应总体系包括质粒模板1.5μL，5×phushion HFbuffer 10μL，10mmol/L dNTPs 1μL，10mM基因特异引物各2.5μL，phusion DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O 32μL。PCR扩增程序为：98℃30s，35个循环的程序为98℃10s，60℃30s，72℃1min，最后72℃5min。50μl全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。

2.入门载体的构建

利用得到的AttB-TaWRKY72-b产物和pDONR(amp)进行BP反应，TaWRKY72-b基因编码序列将pDONR(amp)载体上的ccdB位点置换，构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5α后，用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，pDONR(amp)载体上游有T₇引物和TaWRKY72-b R引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物1μL，pDONR(amp)vector 1μL，BP cloneⅡenzyme 1μL和dd H₂O 1μL。

3.表达载体Expression clone的构建

如图1所示，将鉴定正确的质粒连接到pKIGW表达载体上，进行转化和酶切检测，将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒2μL，pKIGW vector1μL，LR clone II enzyme 1μL和dd H₂O 1μL。

4.Expression clone的电击转化农杆菌

1)取50μL的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2μL已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时；

2)将1)中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷；

3)用细胞融合仪进行电击；

4)电击结束后立即加入不含抗生素的SOC培养基中，混匀后移入2mL离心管中，28℃下震荡培养2h；

5)8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃下倒置，培养2天。挑取培养基上的单菌落，作菌落PCR筛选单克隆。将鉴定正确的单克隆，液氮速冻，-80℃保存以备用。

5.用蘸花法转化拟南芥植株

将活化后的菌液取1mL接种于200mL含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8～0.9。将上述菌液5000rpm离心8min，用5％(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体，使OD₆₀₀＝0.8～0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02％的Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了Silwet L-77的蔗糖溶液中浸泡1min。之后把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获T₀代种子。

6.转基因拟南芥的筛选

转化当代植株(T₀代)收获的种子用1/2MS+75mg/L kanamycin平板筛选，10天后挑选T₁代阳性植株转移到土中，PCR鉴定并收种子。T₂代株系kanamycin抗性，3∶1分离的被认为是单基因插入株系，抗性植株转移到土中培养并收种子。T₃代株系中kanamycin抗性不再分离的为单基因插入纯合株系，用作进一步的试验研究。

三.转基因拟南芥的PCR鉴定

用SIGMA公司的Extract-N-Amp^TM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下：

1.DNA提取：取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入100μL ExtractionSolution，95℃保持10min，加入100μL Dilution Solution混匀，2℃-8℃储存以备用；

2.PCR扩增：PCR扩增反应体系包括ddH₂O 4μL、Extract-N-Amp PCR Readymix10μL、10mM Primer F 1μL、10mM Primer R 1μL、Leaf disk extract 4μL；PCR扩增反应程序为：94℃3min，30个循环包括94℃1min、60℃1min、72℃1min30sec，然后72℃10min。如图2所示，PCR分子鉴定有扩增条带的为转基因植株。

四.转基因植物的表型鉴定

将纯合体拟南芥转基因种子和野生型(Col-0)种子同时种植在含有地塞米松(DEX)的培养基中，生长两周后观察转基因植株与野生型的变化，如图3所示，发现与野生型拟南芥植株相比，转基因植株的根系发育受到了抑制，植株生长停滞。由图4拟南芥侧根和主根的显微图像也可以看出，转基因植株经诱导后根系发育受到影响，图B和C可见侧根和主根的根毛差别不大。说明该基因的超量表达，通过影响其上下游基因的表达抑制拟南芥根系的形成。为了查明是侧根的发育受到影响，还是所有根系的发育均出现问题，我们对侧根数，主根长度等指标进行统计。结果如表1所示，转基因植株经地塞米松(DEX)诱导后，主根长度和侧根数量都有明显减少，与未诱导植株有极显著差异，但是两者比值与未诱导植株及野生型无差异，说明转基因植株只在根系的长度上明显减少，对侧根的密度并无影响，该基因的超量表达影响了转基因植株根系的长度。

表1根系发育的统计分析

注：植株为18天的拟南芥幼苗；每种植株调查数量为10株。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (2)

1.一种小麦WRKY转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用，其特征在于：所述小麦WRKY转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的小麦WRKY转录因子基因在改变拟南芥根系发育中的应用，其特征在于：将所述小麦WRKY转录因子基因连接到超表达载体上，通过农杆菌介导转化，得到转基因拟南芥植株。