CN103773777A - 一个开花诱导基因及其在拟南芥植株中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个来源于高粱的开花诱导基因，还涉及了该基因在拟南芥植株中的应用。转化所述基因的拟南芥，比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。

Description

一个开花诱导基因及其在拟南芥植株中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个来源于高粱的开花诱导基因，还涉及该基因在拟南芥植株中的应用。

背景技术

高等植物生命周期主要包括种子萌发、营养器官生长、开花、受精、胚胎发育和种子形成等过程。其中，开花过程涉及由营养生长向生殖生长的转换，花器官的发生，以及在环境因子作用下，内部各种信号的产生、传递和相互作用等，在植物生命周期中占有中心地位，与农作物产量以及品质密切相关。开花诱导即植物由营养生长向生殖生长转换的过程，它受内源发育信号和环境因子的严格控制。开花诱导由一种复杂的信号途径“网络”形成，是一个非常复杂的过程。根据近年来对拟南芥、金鱼草、玉米等几种模式植物的开花调控信号途径的研究，尤其是对拟南芥的研究，提出了四种开花诱导途径：光周期(Photoperiod)途径、春化(Vernalization)途径、自发(Autonomous)途径和赤霉素(GA)途径。

本研究以高梁品种Roma为试验材料，采用同源克隆的策略，对高梁开花诱导相关的基因SbAGL6进行克隆和测序。高粱是短日照作物，其开花期受光周期的诱导。日照长度影响着其生长发育，尤其是开花。同时，高梁开花期还受温度、湿度等环境因子以及内源发育信号的影响。高梁的开花时期对其栽培和育种研究具有重要意义，解决花期相遇问题是提高结实率以及制种产量的重要内容。我们以拟南芥中开花诱导的基因AtAGL6的序列为参考序列，克隆了高粱中的相应同源基因，命名为SbAGL6，并通过基因工程操作，将其转到拟南芥中，并处于组成型超表达启动子35S的控制下。表型鉴定的结果表明，转基因拟南芥比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。高粱SbAGL6基因具有使植物提早开花的能力，是进行农作物花期性状改良的一个重要候选基因。

发明内容

本发明的目的是提供一个开花诱导基因及其在拟南芥植株中的应用。

本发明的技术方案是：一个高粱开花诱导基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

ATGGGGAGGG GACGAGTTGA GCTGAAGCGG ATCGAGAACA AGATCAACCG CCAGGTCACC

TTCTCCAAGC GCCGCAACGG CCTGCTCAAG AAGGCGTACG AGCTCTCCGT GCTCTGCGAC

GCCGAGGTCG CGCTCATCAT CTTCTCCAGC CGCGGCAAGC TCTACGAGTT CGGCAGCGCC

GGCATAACTA AAACACTAGA AAGGTATCAA CATTGCTGCT ACAACGCTCA AGATTCCAAT

GGTGCACTCT CTGAAACTCA GAGCTGGTAC CAGGAAATGT CAAAACTGAG GGCAAAATTT

GAAGCCTTGC AGCGCACTCA GAGGCACTTG CTCGGGGAGG ACCTTGGCCC ACTGAGTGTT

AAGGAATTGC AGCAGCTAGA GAAACAGCTA GAATGTGCTT TGTCACAGGC AAGACAGAGA

AAGACACAAC TTATGATGGA GCAAGTGGAA GAGCTTCGCA GAAAGGAGCG TCACCTGGGA

GAAATGAACA GGCAACTCAA ACACAAGCTT GAAGCTGAAG GTTCTAGCAA CTACAGAACC

TTGCAGCATG CCGCCGCCTG GCCAGCTCCC GGCGGCACCA TCGTGGAGCA TGACGGCGCC

ACGTATCATG TTCATCCACC TGCTCACTCA GTTGCTATAG ACTGTGAACC CACTCTGCAA

ATTGGGTACC CTCATCACCA GTTTCTGCCT TCTGATCAGG CAGCCAATAA TATCCCAAGG

AACGCCCCCG GAGGCGAGAA CAACTTCATG CTGGGATGGG TTCTTTGA

SEQ ID NO：1

所述基因根据拟南芥AtAGL6基因的序列，通过同源序列比对获得高粱的SbAGL6基因序列，通过扩增、连接、植物转化等分子生物学操作而获得。具体如下：

采用生物信息学的方法，获得SbAGL6基因序列。利用PRIMER5设计引物用于扩增开放阅读框序列。提取高粱6B叶片的RNA，将1μg的RNA逆转录为cDNA作为扩增的模板备用。用设计的特异引物进行扩增。将扩增的产物连接到克隆载体上。转入大肠杆菌，筛选阳性的进行测序，获得SEQ ID NO：1所示的基因序列。

将上述克隆到的基因连接到超表达载体，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株。结果表明转基因拟南芥比野生型提早开花，但不影响后代的生长结实。

附图说明

图1野生型拟南芥生长四周的图；

图2含有SbAGL6基因的拟南芥生长四周的图；

图3转基因的拟南芥生长四周喷施DEX过表达SbAGL6基因，4d后开花的图。

具体实施方式

下面以高粱的叶片作为试验材料详细说明制备方法。

1.总RNA的提取采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA溶液后琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-80℃保存。

2.cDNA的合成：cDNA的合成使用Invitrogen的SuperScriptTM III First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR，步骤如下：

1)取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分：总RNA；Oligl dT；10mM dNTP。混匀，轻甩离心管，使溶液至底部；

2)离心管置于PCR内，65℃保温5min；

3)迅速取出置于冰上冷却1min以上，将离心管轻微离心；

4)在上述离心管中加入下列反转录反应液：5×First-strand Buffer；0.1M DTT；Recombinant RNase Inhibitor；SuperScript^TM III RT；

5)轻微震荡混匀后短暂离心；

6)50℃保温50min；

7)70℃保温15min，-20℃保存。

高粱β-Actin F(GenBank accession No.X79378)检测反转录产物。PCR扩增程序：94℃4min，35个循环的程序为95℃30s，60℃30s，72℃30s，最后72℃5min。2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.SbAGL6的分离

PCR扩增引物采用“Primer 5.0”引物设计软件进行设计，并对得到的引物序列用VectorNTI进行分析，找出解链温度，自身互补性，两引物互补性合适的引物对。用cDNA为模板，SbAGL6-F、SbAGL6-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μl，包括反转录产物，10×phushion HF buffer，10mmol/L dNTPs，10mM基因特异引物，phusionDNA聚合酶，DMSO，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃ 1min，30个循环的程序为98℃10s，58℃ 20s，72℃ 1min 10s，最后72℃ 10min。本试验PCR扩增选用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶。

4.PCR产物的加A连接

利用Phusion DNA聚合酶产生的克隆片段为平末端，在进行TA克隆之前，可用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物、5×Taq buffer、10mM dATP、Taq酶，72℃保持15分钟，取出2μl加A后的PCR回收产物加入2×T₄连接酶缓冲液、pGEM-T载体(50ng/μl)、T₄DNA连接酶(3U/μl)连接到pGEM-T载体上，pGEM-T载体购自Promega公司。

5.连接产物的转化

1)从-80℃冰箱中取出1管(50μl)感受态细胞，置冰上。

2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μl连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟。

3)42℃水浴热激60秒，迅速置冰上5分钟。

4)向离心管中加入SOC液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h。

5)室温下8000rpm离心5分钟，弃掉上清液，将剩余上清液重新悬浮菌体，用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分钟。

6)倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出。

7)放入4℃冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。

6.重组质粒的PCR鉴定

本实验所用的pGEM-T载体的插入片段上游有T7启动子，下游有SP₆启动子和M₁₃启动子，所以可以用这三个启动子序列做引物对插入片段进行特异性扩增，对重组质粒进行鉴定，鉴定程序如下：PCR扩增体系包括10×buffer(含MgCl₂)，dNTP 10mmol/L，T₇和SP₆引物(20ng/μl)，Taq酶，模板为转化后的白色菌斑。反应条件为：94℃，10min；35个循环：94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；72℃延伸5min。最后，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，选择合适大小的阳性克隆测序。测序在华大基因测序部完成。

表达载体的构建：根据SbAGL6基因的ORF序列，将Gateway技术中的AttB位点加入原始引物序列，从阳性克隆的质粒中扩增出ORF片段，用于构建表达载体。

7.带有attB位点的基因序列的扩增

以通过测序鉴定的质粒为模板SbAGL6F，SbAGL6R，为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：

反应总体系50μl，包括反转录产物1.5μl，10×phushion HF buffer 10μl，10mmol/LdNTPs 1μl，10mM基因特异引物2.5μl，phusion DNA聚合酶0.5μl，DMSO 1.5μl，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃ 30s，35个循环的程序为98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃ 5min。50μl全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。

8.入门载体的构建

利用得到的AttB-SbAGL6产物和pDONR(Amp)进行BP反应，SbAGL6基因编码序列将pDONR(Amp)载体上的ccdB位点置换，构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5α后，用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，pDONR(amp)载体上游有T7启动子和Sb-AGL6R引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物、pDONR(amp)vector、BP clone II enzyme、dd H₂O。

9.表达载体的构建

将鉴定正确的质粒连接到pGWB14表达载体上，进行转化和酶切检测，将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒、pGWB14vector、LR clone IIenzyme、dd H₂O。

10.重组质粒pKIGW-SbAGL6农杆菌的电击转化

①取50μl的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2μl已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时。

②将①中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷。

③用Bio--Rad细胞融合仪进行电击。

④电击后立即加入1ml不含抗生素的SOC培养基，混合均匀后移至2ml离心管中，28℃震荡培养2h。

⑤8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃下倒置，培养2天。

11.PCR验证和菌种保存

挑取平板上长出的单菌落，菌落PCR扩增鉴定。将鉴定正确的菌种取菌液800μl加入400μl甘油，混匀，液氮速冻，-80℃保存备用。

12.转化拟南芥植株

(1)种植野生型拟南芥。

(2)植株发育花蕾后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展，在剪顶后的3-4天内，准备农杆菌的转化；

(3)取鉴定正确且保存于-80℃的菌种接种于含有5ml卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28℃，培养2d。于5ml含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中活化菌种，28℃，培养1d。将活化后的菌液取1ml于200ml接种于含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中，28℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8～0.9。

(4)将上述菌液5000rpm离心8min，用5％(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体，使OD₆₀₀＝0.8～0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02％ Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了Silwet L-77的蔗糖溶液液中浸泡1min。

(5)把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获T₀代种子。

13.拟南芥T₀代种子筛选

(1)将干燥2周后的T₀代种子先用75％酒精消毒1分钟，再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(75mg/L卡那霉素)上。

(2)4℃春化两天后置22℃、16h光照条件下，10d后观察其子叶和根的发育状况，挑选转化体，转化体表现为真叶健康呈深绿色，根长至培养基里。于与转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。10后，把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8～10叶时，提取幼嫩叶片基因组DNA，进行PCR鉴定；通过鉴定的植株分单株收获种子。

14.转基因拟南芥的PCR鉴定

用SIGMA公司的Extract-N-Amp^TM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下：

(1)DNA提取：取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入Extraction Solution，95℃保10min，加入Dilution Solution，2℃-8℃储存以备用。

(2)PCR扩增：PCR扩增反应体系包括ddH₂O、Extract-N-Amp PCR Readymix、10mM Primer F、10mM Primer R、Leafdisk extract；PCR扩增反应程序为：94℃ 3min，30个循环包括94℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 1min30sec，然后72℃ 10min。

15.转基因植物的表型鉴定

直观观察结果可以明显看到，野生型拟南芥和转基因的拟南芥同时生长四周后，转基因拟南芥叶面喷施DEX过表达sbAGL6，4d后转基因拟南芥提前开花。综上所述，野生型拟南芥5-6周，转基因的拟南芥过表达sbAGL6后4d提前开花。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.一个开花诱导基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的开花诱导基因，其特征在于：与拟南芥AtAGL6基因有很高的同源性，对其进行克隆测序，经基因工程操作，使其受控于组成型的启动子。

3.权利要求1或2所述的开花诱导基因在拟南芥植株中的应用。

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