CN102154316A - 花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域,公开了睡莲花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法。睡莲花器官发育基因NsAGL6,序列为SEQ ID NO.1,本发明所构建的表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6是由NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。将该植物表达载体用于植物遗传转化,NsAGL6基因在CaMV35S启动子的驱动下超量表达,大量合成AGL6蛋白,调控下游基因的表达,使之提前开花,改变植物花型。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及睡莲花器官发育基因NsAGL6及其植物表达载体和构建方法。
背景技术
AGL6是参与花分生组织的建成和花器官形成过程中的一类重要转录因子。目前已经从玉米、矮牵牛、风信子、水稻等植物中克隆到了AGL6的同源基因,并对其功能进行了分析。研究发现,尽管这些植物的亲缘关系不尽相同,但其AGL6基因都参与了花发育的调控。这类基因的功能多集中于使植物提前开花和改变花器官形态、花部数目。AGL6类基因均含有高度保守的MADS结构域,并且在表达模式上具有一定的相似性。但迄今为止对AGL6基因的功能尚未完全确定。
睡莲(Nymphaea ssp.)为睡莲属睡莲科多年生水生植物,具有很高观赏价值。由于花色艳丽,姿态优美,花态各异、其品种资源十分丰富。通过克隆控制睡莲花器官发育的关键基因,构建表达载体,转化其他植物,可培育出新花型、花期提前的植物新品种。
在作物的遗传转化途径中,农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一,其中有效的植物表达载体至关重要。将控制花发育的基因构建植物表达载体,用于农杆菌介导的植物遗传转化,使该转录因子在CaMV35S启动子的启动下超量表达,并调控下游目的基因的表达,改变植物形态建成,对于植物新品种的培育及在生产中的广泛应用,具有重要意义。
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发明内容
本发明的目的在于为改良植物花型和花期,提供一个睡莲花器官发育基因NsAGL6,该基因的序列为SEQ ID NO.1。
本发明的另一目的在于提供睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体。
本发明的又一目的在于提供睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化,创制新花型、花期提前的新种质,可用于植物品种改良。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
睡莲花器官发育基因NsAGL6,该基因的序列为SEQ ID NO.1。
睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体,由所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6与质粒pCAMBIA 1301-220构成。
上述的睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体,该植物表达载体是由NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。
睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法,包括如下步骤:
1)睡莲花器官发育基因NsAGL6的克隆
以睡莲小花蕾为材料,提取总RNA,反转录为cDNA,设计引物并用高保真酶扩增NsAGL6基因,
上游引物NsAGL6-F:SEQ ID NO.2
下游引物NsAGL6-R:SEQ ID NO.3
以反转录的cDNA为模板,进行聚合酶链式PCR反应,产物连接到pMD19-T Simple载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;
2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建
从TOP10菌株中提取提取pMD19-T Simple-NsAGL6重组质粒,BamH I和Sma I双酶切后回收NsAGL6片段,再插入到经BamH I和Sma I双酶切得到的线性化的pCAMBIA1301-220质粒,转化TOP10感受态细胞,提取阳性质粒,酶切电泳检测并测序验证,植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6构建成功。
将NsAGL6基因的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化,方法如下:(1)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化;(2)拟南芥花序浸染及种子筛选;(3)PCR鉴定及植物形态观察。
本发明的有益效果:
1.本发明提供的睡莲花器官发育基因NsAGL6基因是一个新的花发育基因,该基因可调控植物开花和花器官发育。
2.本发明构建的睡莲花器官发育基因NsAGL6基因植物表达载体为首次报道,可直接用于农杆菌介导的遗传转化,改良植物花型和花期。
附图说明
图1NsAGL6琼脂糖凝胶电泳分析:
M:DNAMarker(2Kb/1.5Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.3Kb/0.1Kb)
1:NsAGL6开放阅读框扩增;
2:pMD 19-T Simple-NsAGL6质粒Sma I和BamH I双酶切;
3:pCAMBIA 1301-220-NsAGL6表达载体Sma I和BamH I双酶切检测图
图2植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建过程示意图。
图3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定。
图4植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6导致拟南芥提前开花。
图5植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6导致拟南芥花瓣排列的改变。
具体实施方式
实施例1植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建
1.NsAGL6的克隆:
选用睡莲栽培种‘黄公主’(Nymphaea sp.cv.‘Yellow Prince’)作为材料,提取花蕾总RNA,按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA,用RNase消化cDNA产物,参照睡莲NsAGL6序列信息(NCBI登录号:AB495345),经PrimerPremier 5软件分析设计引物扩增NsAGL6;
上游引物NsAGL6-F:5′-CGCGGATCCCTTTGAGTGATCATCGCAAGA-3′(SEQ ID NO.2)
下游引物NsAGL6-R:5′-TCCCCCGGGATGGTATGGATTACAGGACCC-3′(SEQ ID NO.3)
以花蕾cDNA为模板,进行PCR反应,50μL反应体系:10×RCR Bμffer 5.0μL,NsAGL6-F、NsAGL6-R引物各1.0μL(20μmol·L-1),dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1),PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.2μL,cDNA模板1μL,ddH2O 37.8μL;反应程序:95℃预变性4min,然后94℃解链30sec,55℃退火30sec,72℃延伸1min 30sec,反应33个循环,72℃延伸10min;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化,用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa),转化TOP10感受态细胞,进行序列测定,测定序列为SEQ ID NO.1。
2.植物表达载体pCAMBIA 1301-220-Ns4GL6的构建
提取含有目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA 1301-220质粒DNA并双酶切,酶切体系为:10×bμffer K 2.5μl,Sma I 2.0μl,BamH I 2.0μl,质粒DNA 10μl,ddH2O μp to50μl,37℃过夜充分酶切。将含有NsAGL6完整开放阅读框的片段和pCAMBIA 1301-220线性化质粒片段分别回收,并将两个片段连接。连接反应体系为:T4 Bμffer 2.0μl,T4连接酶1.0μl,载体回收液1.0μl,目的基因回收液4.0μl,dd H2O μp to 20μl,4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-220-NsAGL6转化TOP10细胞,提取阳性质粒,酶切电泳检测并测序验证。
实施例2植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6转化拟南芥及花发育特性观察
1、农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化
从YEB(50mg/L利福平)平板上挑取EHA105单菌落,接种于50mL含50mg/L利福平的YEB液体培养基中,200rpm,28℃培养至OD值0.5,而后冰浴菌液30min,离心收集菌体,悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl2(20%甘油)溶液中,200μL/管分装,待用。
取10μL pCAMBIA 1301-220-NsAGL6载体质粒,加入200μL感受态细胞,冰浴30min,液氮冷冻5min,37℃5min,加入800μL YEB液体培养基,28℃200rpm预培养4h,菌液涂板于YEB(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)固体培养基上,28℃暗培养2天,挑取单克隆检测,选取阳性克隆摇菌,用于拟南芥花序转化。
2、拟南芥花序浸染及种子筛选
将阳性单克隆接到50mL的YEB(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)液体培养基中,培养24小时,5000rpm离心20分钟,然后用转化液(1/2MS,添加50克/升的蔗糖,调pH为5.8,然后加200μL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟,然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿,放回培养室培养12小时,打开保鲜膜,待种子成熟时采收。
种子消毒与播种:将野生型和转基因拟南芥种子分别放入1.5mL的离心管中,加入1mL 75%酒精,添加0.1%的Triton X-100摇晃15分钟,然后在超净台中用95%的酒精洗两次,而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上,以吹干种子(放置30分钟),轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(1/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天,然后将抗性苗移栽到土中,用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。
3、PCR鉴定及植物形态观察。
以经抗生素筛选的抗性植株总DNA为模板,以未转基因菊花苗为阴性对照进行PCR反应(如图3)。反应体系见实施例1。
将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播到栽培基质中,人工培养条件为:相对湿度80%,光照强度80-200μmol/M2/S,温光周期为16h光照,22℃/8h黑暗,17℃。记录每株开花的时间,并用体式显微镜观察花器官的变化。转基因苗相比野生型拟南芥,开花提前了6、9、10天(图4);花瓣的排列也发生了变化,野生型的拟南芥花瓣呈辐射对称,而转基因的花瓣却不再是辐射对称(图5)。
综上所述,本发明构建了含有睡莲花器官发育基因的植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6,其中NsAGL6首次报道。所构建的植物表达载体可导入多种植物中,使之提前开花并改变植物花型。
Claims (4)
1.睡莲花器官发育基因NsAGL6,该基因的序列为SEQ ID NO.1。
2.睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体,其特征在于由权利要求1所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6与质粒pCAMBIA 1301-220构成。
3.根据权利要求2所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6的植物表达载体,其特征在于所述的植物表达载体为NsAGL6基因连接到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒而得到的。
4.权利要求3所述的睡莲花器官发育基因NsAGL6植物表达载体的构建方法,其特征在于包括如下步骤:
1)睡莲花器官发育基因NsAGL6的克隆
以睡莲小花蕾为材料,提取总RNA,反转录为cDNA,设计引物并用高保真酶扩增NsAGL6基因,
上游引物NsAGL6-F:SEQ ID NO.2
下游引物NsAGL6-R:SEQ ID NO.3
以反转录的cDNA为模板,进行聚合酶链式PCR反应,产物连接到pMD19-T Simple载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;
2)植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6的构建
从TOP10菌株中提取提取pMD19-T Simple-NsAGL6重组质粒,Sma I和BamH I双酶切后回收NsAGL6片段,再插入到线性化的pCAMBIA 1301-220质粒,转化TOP10感受态细胞,提取阳性质粒,酶切电泳检测并测序验证,植物表达载体pCAMBIA 1301-220-NsAGL6构建成功。
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