CN104498489B

CN104498489B - 芫荽花对称性基因CsCYC2及其植物表达载体和构建方法

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Publication number: CN104498489B
Application number: CN201410738398.9A
Authority: CN
Inventors: 宋春凤; 刘启新; 张所兵
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-12-05
Also published as: CN104498489A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了芫荽花对称性新基因CsCYC2及其表达载体和构建方法。芫荽花对称性基因CsCYC2，序列为SEQ ID NO.1，本发明所构建的表达载体为pCAMBIA 1300s‑CsCYC2是由CsCYC2基因连接到线性化的pCAMBIA 1300s质粒而得到的。将该植物表达载体用于植物遗传转化，CsCYC2基因在CaMV35S启动子的驱动下超量表达大量CYC2蛋白，调控下游基因的表达，使拟南芥花型改变，花对称性改变。

Description

芫荽花对称性基因CsCYC2及其植物表达载体和构建方法

一、技术领域

本发明属于分子生物学领域，公开了芫荽花对称性新基因CsCYC2及其表达载体和构建方法。

二、背景技术

被子植物的花不对称性是由多个基因所共同控制的，其中控制花背腹不对称性的为TCP转录因子的CYC类基因，其功能在被子植物中是相对保守的。有趣的是所有分离到的控制花背部属性的TCP基因都属于CYC2类基因。因此，该研究表明了广义CYC类基因与核心真双子叶植物的形态建成关系密切。

而伞形科植物属于蔷薇亚纲，它具有典型的伞形花序，而在一个小伞形花序中，处于中央位置的小花和边缘小花的对称性又有所不同，分别为辐射对称花和两侧对称花，中间还存在过渡类型的小花，这为花对称性的研究提供了独特的材料。本项目选用一种代表性的伞形科植物-芫荽作为研究对象，采用RACE-PCR技术分离控制芫荽花不对称性的CYC类基因，然后利用转基因等技术，研究CYC类基因的表达和功能分化，为阐明伞形科植物花不对称性的分子机制提供依据，并对花不对称性基因在不同亚纲的花序类群中可能存在的功能分化进行初步探讨。

在作物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将控制花发育的基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，使该转录因子在CaMV35S启动子的启动下超量表达，并调控下游目的基因的表达，改变植物形态建成，具有重要意义。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的在于为改良植物花不对称性性，提供一个芫荽花不对称性发育基因CsCYC2，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

本发明的另一目的在于提供芫荽花不对称性发育基因CsCYC2的植物表达载体。

本发明的又一目的在于提供芫荽花不对称性发育基因CsCYC2植物表达载体的构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制新花型、新种质，可用于植物品种改良。

技术方案

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

芫荽花不对称性发育基因CsCYC2，该基因的序列为SEQ ID NO.1。所述基因可直接用于植物品种改良，创制新花型、新种质。

芫荽(Coriandrum satium L.)花对称性基因CsCYC2，该基因的序列为SEQ IDNO.1。

所述芫荽花对称性基因CsCYC2的应用,可直接用于农杆菌介导的遗传转化，改变植物花对称性。

所述芫荽花对称性基因CsCYC2的重组质粒，其特征在于，由所述的芫荽花对称性基因CsCYC2与pMD18-T Vector重组构成的pMD18-T Vector-CsCYC2重组质粒。

所述芫荽花对称性基因CsCYC2的植物表达载体，为所述的芫荽花对称性基因CsCYC2与pMD18-T Vector重组构成的pMD18-T Vector-CsCYC2重组质粒双酶切后连接到线性化的pCAMBIA 1300s质粒而得到的。

芫荽花不对称性发育基因CsCYC2植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1、芫荽花对称性基因CsCYC2序列的克隆

以芫荽小花蕾为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计上游引物CsCYC2F，终止密码子处设计下游引物CsCYC2R；利用以上设计的引物，从cDNA中扩增得到CsCYC2基因开放阅读框ORF，基因序列为SEQ ID NO.1；

上游引物CsCYC2F:SEQ ID NO.10

下游引物CsCYC2R:SEQ ID NO.11

2、植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2的构建

将CsCYC2基因连接到pMD18-T Vector载体中，转化至大肠杆菌TOP10菌株中,从TOP10菌株中提取pMD18-T Vector-CsCYC2重组质粒，BamHI和SalI双酶切后回收CsCYC2基因片段，同时将pCAMBIA 1300s双元载体质粒利用BamHI和SalI双酶切线性化，利用T4连接酶同回收的CsCYC2基因片段进行连接，然后转化农杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2构建成功。

将CsCYC2基因的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，方法如下：(1)农杆菌菌株感受态制备及冻融法转化；(2)拟南芥花序浸染及种子筛选；(3)PCR鉴定及植物形态观察。

有益效果

1、本发明提供的芫荽花不对称性发育基因CsCYC2是一个新的花发育基因，该基因可调控植物开花和花器官发育。

2、本发明构建的芫荽花不对称性发育基因CsCYC2植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，改变植物花对称性。

四、附图说明：

图1：CsCYC2基因琼脂糖凝胶电泳分析：

M：DNAMarker(2kb/1kb/0.75kb/0.5kb/0.25kb/0.1kb)

1：CsCYC2基因的3’RACE扩增；

2：CsCYC2基因的5’末端序列扩增；

3：CsCYC2基因的序列开放阅读框扩增；

4：pMD 18-T Vector-CsCYC2质粒SalI和BamH I双酶切；

图2植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2的构建过程示意图。

图3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定。

图4植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2导致拟南芥植株分蘖增多。。

图5植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2导致拟南芥花瓣排列的改变。

五、具体实施方式

实施例1植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2的构建

1、CsCYC2基因部分序列的克隆：

选用芫荽(Coriandrum satium L.)(种子购自南京丰邦种业有限公司的“丰邦”牌“大叶香菜”)花蕾作为材料，提取花蕾总RNA，按照反转录试剂盒(TaKaRa)将总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照并根据被子植物其他物种设计兼并引物上游引物CsF：5’-GGATAGGCACAGCAAGATCAA-3’(SEQ ID NO.2)和下游引物CsR：5’-TTCCCTTGCTTTCTGTCTAGC-3’(SEQ ID NO.3)。以花蕾cDNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系组成如下：10×Taq Buffer 2μL；25mmol/L MgCl₂2μL；2.5mmol/L dNTPs2μL；上下游引物(2mmol/L)各2μL，ddH2O 9.2μL；cDNA 0.8μL；Taq酶0.15μL。PCR扩增反应在Long Gene公司生产的MG96G PCR仪中进行。扩增程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸1min，重复循环30次；最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，用Tanon 2500图像分析仪观察。反应产物采用Axgen胶纯化试剂盒进行纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD18-T载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，在GeneBank中进行Blast比对，挑选出CYC的同源序列CsCYC2基因片段，获得含有目的CsCYC2基因片段的T-载体质粒。

2、3’RACE-PCR获得CsCYC2基因3’端部分序列

利用步骤1得到的基因序列，以反转录的cDNA做模板，设计上游特异引物CsCYC2F1：5’-GAGGCGAATTACCAAAGAA-3’(SEQ ID NO.4)和上游引物CsCYC2F2：5’-GTTCGGGCTTGGAATGACC-3’(SEQ ID NO.5)，下游分别采用3’RACE outer primer和3’RACEinnner primer(TakaRa公司试剂盒：D314)作引物，采用巢式PCR，扩增得到CsCYC2基因的3’端序列。

3.利用改良的扩增cDNA 5’末端的方法扩增得到CsCYC2基因的5’末端序列，获得CsCYC2序列起始密码子附近序列

为了获得CsCYC2基因的全长，特别是起始密码子的部位，然后根据步骤1和步骤2获得的序列，设计下游引物。首先利用dCTP和末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)对cDNA进行加尾反应；然后采用巢式PCR，上游利用5’-AP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACGCGGGGGGGGGG-3’(SEQ ID NO.6)，5’-NP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT-3’(SEQID NO.7)作引物，下游设计特异引物CsCYC2R1:5’-GGTTCTGGTGTG GGTTTAG-3’(SEQ ID NO.8)和CsCYC2R2:5’-ATTGCATTTTTCGCCTTG-3’(SEQ ID NO.9)，采用巢式PCR，扩增得到CsCYC2基因的5’端序列。

4.CsCYC2基因开放阅读框ORF序列的克隆

利用步骤1-3获得的CsCYC2基因的部分序列，进行拼接，可获得CsCYC2基因的全长序列(包含一部分5’和3’非编码区)；利用获得的全长序列，从起始密码子处设计上游引物CsCYC2F(5’-CGCGGATCCATGTGTGCAGGAGGAAGC-3’)，终止密码子处设计下游引物CsCYC2R(5’-ACGCGTCGACCTAAAAGTCTGTGAACTG-3’)；利用以上设计的引物，从CDNA中扩增得到CsCYC2基因开放阅读框ORF，基因序列为SEQ ID NO.1。

5.植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2的构建

提取含有目的基因CsCYC2的pMD18-T载体质粒及表达载体质粒pCAMBIA 1300s(公知公用，见Zhou X,Yuan YX,Yang Y.et al.2009.Involvement of a BroccoliCOQ5Methyltransferase in the Production of Volatile Selenium Compounds.PlantPhysiol,151:528-540)(是通过对载体pCAMBIA 1300改造而来，质粒结构图如图2所示)并双酶切，酶切体系为：10×buffer T 7.5ul，SalI 2.0ul，BamHI 2.0ul，质粒DNA30ul，ddH₂O8.5u1，37℃酶切5h。将含有CsCYC2基因完整开放阅读框的片段和pCAMBIA 1300s线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接。连接反应体系为：T4Buffer 1.0ul，T4连接酶l.0ul，载体回收液l.0ul，目的基因回收液7.0ul，4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA1300s-CsCYC2转化TOP10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。

实施例2植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2转化拟南芥及花发育特性观察

l、农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

从YEP(50mg/L利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50mg/L利福平的YEP液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl(20％甘油)溶液中，200uL每管分装，待用。

取10uL pCAMBIA 1300s-CsCYC2载体质粒，加入200u L感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800uL YEP液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEP(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。

2、拟南芥花序浸染及种子筛选

将阳性单克隆接到50mL的YEP(50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。

种子消毒与播种：将野生型和转基因拟南芥种子分别放入1.5mL的离心管中，加入1mL75％酒精摇晃1分钟，吸取酒精，添加15％(体积比)的次氯酸钠摇晃10分钟，然后在超净台中用无菌水洗6次，而后直接把种子连无菌水倒在灭菌过筛选培养基上(1/2MS+30mg/L潮霉素)，吹干后筛造培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。

3、PCR鉴定及植物形态观察。

以经抗生素筛选的抗性植株总DNA为模板，以未转基因拟南芥为阴性对照进行PCR反应(如图3)。反应体系见实施例l。

将鉴定出的转基因T2代种子和野生型拟南芥种子同时播到栽培基质中，人工培养条件为：相对湿度80％，温光周期为16h光照，22℃/8h黑暗，18℃，并用体式显微镜观察花器官的变化。转基因苗相比野生型拟南芥，植株叶片数明显增多，而且花序分枝数也有所增加，叶片数可由10多片增加至20几片，花序分枝数也增加1倍左右(图4)；花瓣的排列也发生了变化，野生型的拟南芥花瓣呈辐射对称，而转基因的花瓣却不再是辐射对称，呈现两侧对称花样式(图5)。

综上所述，本发明构建了含有芫荽花器官发育基因的植物表达载体pCAMBIA1300s-CsCYC2，其中CsCYC2基因为首次报道。所构建的植物表达载体可导入多种植物中，使之分蘖增多并改变植物花的对称性。

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 芫荽花对称性基因CsCYC2及其植物表达载体和构建方法

<160> 9

<210> 1

<211> 1595

<212> DNA

<213> 芫荽（CoriandrumsatiumL.）

<220>

<221>

<223> 花不对称性基因CsCYC2核苷酸序列

<400> 1

ATTTTCAAAT TAGGAGGTGG AGGTGACACT GGGGTCTAGA TTCAGGAGGG TCAGACATTGGGATTATCAC 70

CAAAAACTAG TACCAGCAAA AGCAGAAGCA TCAAGATTTT AGGGGTGATA ATTGTGACACATCCTCAACT 140

AGATTAGATC AAGGAGAGGA GGAAAGTGTG TAAGCTGACA TATAAGAAAA AAGAGAAACA GACTACTAAA 210

TTAAACAGTG CAAGGTTCAG AAAAAGAAGA AAAGGAAAAG TTGTTCGTTC CTTGAGATCT GTTTTGTACC 280

CAAGAAGAGG CCAAAATTAA TATGCATTAC TTGCAAGTAT AATGGGCATG AAGAGTAACG GAGGAGAAAT 350

TGTACAAGTT GAAGGAGGCC ATATTCTCCG GTCCACAGGC CGGAAAGACA GGCACAGCAA GGTGTACACT 420

GCCAAAGGTC CTAGAGACCG GAGAGTCCGA CTCGCTGCTC ACACTGCCAT TCAGTTCTAT GATGTTCAAG 490

ACAGATTAGG GTACGACCGT CCCAGCAAGG CAGTAGATTG GCTCATCAAC AAGGCGAAAA ATGCAATTGA 560

CAAGCTCGAA GAGTTGCCTC CATGGAATCC AATGGATACT ACTACCGCAG TACTAAACCC ACACCAGAAC 630

CCTAATGGAC TTCCACCGGA ACAACACCAG TCTGAGGCTT ACCCATTTCA TGATAACCCA ACTGATGATA 700

CCATGAAATC TTTCTTCCCA ACAAGCTCAG GAATGAATTA TCACAATTAC CCAGGTGATG TCATTTCTAG 770

ATGTTCACTA CAAAATAACT CCCAGGATCT TTGTTTGTCT CTTCAGTCTT TACAGGAGGA CCTAAACAGT 840

AATTCACCCC ATCCAACTCC TCATCAAGGA CTTTATTCGG GTCAGCCGGA GGCGAATTAC CAAAGAATGG 910

TGGGCTGGGA TGGGGAAATC AAACCAGCAG GATATTATTT TAATGCACAA CCACAATTGA TATGTCAAAG 980

CTCTACAGCT GCATTTAGTC AGAGGGAACC CCTTCAGTCC AGTTTTTCGC CTTACGTTCG GGCTTGGAAT 1050

GACCTGCCAT TTCCAGTCTC AGACCATAAC AACACACAAG CACTTCATCA GTTCTCATTA TCATCAGGCT 1120

CTCAATATGG GTTTGAAAAG TTTTCAGGCT TCCAAGTTCC AGCACGAATT CAGGGAGAGG AGGAGCAGCT 1190

ATCCACTATT CCTACCAAGT CTCATAACTG ATTTACCATT GTCTAGTCCA TCAGATATGG TTCTCAATCA 1260

TATAAAGATG ATTCAGAAGA AGGCTTCATC AATGTTGTGA CAAGTTGGCA ACTAGTGTAT GTTAAACATT 1330

TCATCTTTCA CATTCCTCTC CCAGCTCAAC GCCTCAACAT TGTTGTTTGA TTGTATTTTA ATGTGTTCAA 1400

TTCTTTTCTT TGTCAGTTTG TGGTGTGTGT AATGACATCA TATTTATTTA GAGTATCGTT GCATTGCCTA 1470

GCCTAGCTAG CTATGAATGA CATTTCTCTA GACATTAGGG CTATCCATGT TTTCTGGTTA AGACTGGTTA 1540

AGAAACAATA GTCTTAACAT TGCTGTTTGA TAGAAATCTT ATCTGTTTTT TCTGT 1595

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物CsF

<400> 2

GGATAGGCAC AGCAAGATCAA 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物CsR

<400> 3

TTCCCTTGCT TTCTGTCTAG C 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3’RACE上游特异引物CsCYC2F1

<400> 4

GAGGCGAATT ACCAAAGAA 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3’RACE上游特异引物CsCYC2F2

<400> 5

GTTCGGGCTT GGAATGACC 19

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5’末端扩增上游引物5’-AP

<400> 6

AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACGCGGG GGGGGGG 37

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5’末端扩增上游引物5’-NP

<400> 7

AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGT 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5’末端扩增下游特异引物CsCYC2R1

<400> 8

GGTTCTGGTG TGGGTTTAG 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5’末端扩增下游特异引物CsCYC2R2

<400> 9

ATTGCATTTT TCGCCTTG 18

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 起始密码子处特异引物CsCYC2F

<400> 10

CGCGGATCCA TGTGTGCAGG AGGAAGC 27

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止密码子处特异引物CsCYC2R

<400> 11

ACGCGTCGAC CTAAAAGTCT GTGAACTG 28

Claims

1.芫荽(Coriandrum satium L.)花对称性基因CsCYC2，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述芫荽花对称性基因CsCYC2在改变植物花对称性方面的应用。

3.用权利要求1所述芫荽花对称性基因CsCYC2构建的重组质粒，其特征在于，由权利要求1所述的芫荽花对称性基因CsCYC2与pMD18-T Vector重组构成的pMD18-T Vector-CsCYC2重组质粒。

4.用权利要求1所述芫荽花对称性基因CsCYC2构建的植物表达载体，其特征在于，所述的植物表达载体为由权利要求1所述的芫荽花对称性基因CsCYC2与pMD18-T Vector重组构成的pMD18-T Vector-CsCYC2重组质粒双酶切后连接到线性化的pCAMBIA 1300s质粒而得到的。

5.权利要求4所述植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)芫荽花对称性基因CsCYC2序列的克隆

上游引物CsCYC2F:SEQ ID NO.10

下游引物CsCYC2R:SEQ ID NO.11

2)植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2的构建

将CsCYC2基因连接到pMD18-T Vector载体中，转化至大肠杆菌TOP10菌株中,从TOP10菌株中提取pMD18-T Vector-CsCYC2重组质粒，BamHI和SalI双酶切后回收CsCYC2基因片段，同时将pCAMBIA 1300s双元载体质粒利用BamHI和SalI双酶切线性化，利用T4连接酶与回收的CsCYC2基因片段进行连接，然后转化农杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1300s-CsCYC2构建成功。