CN102140443A - 植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。该植物抗旱调控蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物抗旱调控蛋白活性的蛋白质。该蛋白具有泛素连接酶活性的蛋白，是ABA信号传导途径的一个正调控因子。将与植物抗逆相关蛋白的编码基因导入野生型拟南芥的转基因实验证明，转入RHA2b基因的植株的抗旱性有明显提高。本发明培育转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白及其编码基因与应用，尤其涉及一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

脱落酸(abscisic acid，ABA)是一种非常重要的天然植物生长激素，是最早得到确认的五大类植物激素之一。脱落酸参与了许多植物生长和发育过程，如种子萌发、幼苗生长、叶片气孔开闭等，此外还是一种重要的抗逆诱导因子，介导了植物对逆境如干旱、盐碱、低温等的抵抗作用，因此脱落酸信号转导的研究对植物生长发育调控的理解、作物产量和品质的提高具有十分重要的意义。

目前，ABA信号传导途径中，已经有四个不同的RING FINGER类泛素连接酶的功能研究报道，AIP2，AFP和KEG是三个负调控因子，分别降解ABA信号途径两个基本点重要的组分ABI3和ABI5。SDRI1位于ABI3和ABI5的下游，是ABA信号途径的正调控因子。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白，名称为RHA2b，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列3由147个氨基酸残基组成，其中，疏水氨基酸占55个，亲水氨基酸占46个，碱性氨基酸占12个，酸性氨基酸占10个，该蛋白质的分子量为16.24KD，等电点为8.16。

为了使1)中的RHA2b便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK

c-myc

10

EQKLISEEDL

上述2)中的RHA2b可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的RHA2b的编码基因可通过将序列表中序列2(即序列表中序列1自5′末端第2019-2462位碱基)所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中的序列2；

2)核苷酸序列是序列表中的序列1的基因；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由2811个碱基组成，序列1的5’端未翻译区包括54个碱基，3’端未翻译区包括349个碱基(其中包括34个碱基组成的PolyA)，编码区由2019-2462组成(也即序列表中序列2的自5′末端第1-444位碱基)，编码具有序列表中序列3的氨基酸序列的RHA2b蛋白，编码区中，A占20.50％(91个)，C占32.43％(144个)，G占18.92％(84个)，T占28.15％(125个)，A+T占48.65％(216个)，C+G占51.35％(228个)。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述与植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有RHA2b基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用RHA2b基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pCanG-HA的多克隆位点间插入上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体，如重组表达载体pCanG-HA-RHA2b。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，是将上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因RHA2b导入目的植物中，得到抗逆性强于目的植物的抗逆转基因植物。

上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因RHA2b是通过所述重组表达载体导入植物中的。

上述抗逆转基因植物具体可为抗旱(耐旱)转基因植物。

携带有本发明的与植物抗逆性相关蛋白编码基因RHA2b的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以为单子叶植物又可以为双子叶植物，主要可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。

本发明从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选到的抗旱调控的RHA2b基因，将该基因导入拟南芥野生型(Col-0生态型)的转基因过量表达抗旱实验证明，转入RHA2b的转pCanG-HA-RHA2b植株复活率为100％，未转基因的拟南芥(Col-0生态型)的复活率为52％，RHA2b突变体Salk 014943的复活率为33％。说明转pCanG-HA-RHA2b植株的抗旱性远高于未转基因的拟南芥(Col-0生态型)的抗旱性。

本发明的植物抗旱调控蛋白也是ABA信号传导蛋白，是具有泛素连接酶活性的蛋白，其编码基因是RING FINGER家族中结构相对简单的一个新基因。功能研究表明，本发明的植物ABA信号传导及抗旱调控蛋白是ABA信号传导途径的一个正调控因子。本发明的植物ABA信号传导及抗旱调控蛋白可调节植物对ABA的敏感性和对干旱胁迫的反应，本发明培育转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，同时也为植物中基因的分离和功能研究提供了重要手段。

附图说明

图1为RHA2b的泛素连接酶活性检测。图中第1条至第4条泳道分别为第①组至第④组反应后，电泳、转膜、用HIS抗体的westernblot结果。

图2为转RHA2b基因的拟南芥的ABA敏感性实验。

图3为转RHA2b基因的拟南芥的抗旱实验。

图2和图3中Col-0表示拟南芥Col-0野生型，35S：RHA2b表示转pCanG-HA-RHA2b植株，rha2b表示RHA2b突变体Salk_014943。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例所涉及的所有实验材料，如无特别说明，均从商业途径得到。

本发明依赖的遗传资源是拟南芥(Col-0生态型)，于2003年9月从中国科学院遗传与发育生物学研究所左建儒课题组获得，其原始来源不清楚。

实施例1、抗旱转基因植物的获得及其功能检测

一、目的基因的克隆

1、全长序列的获得

提取拟南芥(Col-0生态型)(公众可网上购自www.arabidopsis.org)(Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia)的总DNA，以其为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增。

引物1：5′-GGCTGCAGCCGAGGAATCAACGGATGTCT-3′(上游引物，下划线部分碱基为PstI识别位点)

引物2：5′-GGGAATTCGTCTAGAATGCAAAATTAAAT-3′(下游引物，下划线部分碱基为EcoRI识别位点)

反应结束后对PCR产物进行纯化，扩增得到2811bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，序列表中序列1的自5′端的第2019-2462位核苷酸序列(即序列表中序列2所示的核苷酸序列)为编码序列(cDNA序列)，编码具有序列表中序列3所述氨基酸残基序列的蛋白质，即本发明的植物ABA信号传导和抗旱调控蛋白，将其命名为RHA2b，将该蛋白的编码基因命名为RHA2b。

2、编码序列的获得

以提取的拟南芥(Col-0生态型)的总DNA为模板，在引物3和引物4的引导下，进行PCR扩增。

引物3：5′-GGGGATCCATGGGACTACAAGGTCAGCTCT-3′(上游引物，下划线部分碱基为BamHI识别位点)

引物4：5′-GGGAGCTCTCAATGAGATGATGCAGTAGAGA-3′(下游引物，下划线部分碱基为SacI识别位点)

反应结束后对PCR产物进行纯化，扩增得到444bp左右的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列(与序列表中序列1的5′端的第2019-2462位核苷酸序列相同)，为RHA2b的编码序列(cDNA序列)。

二、转基因植物的获得

1、重组表达载体的获得

将上述步骤一中步骤2扩增得到的cDNA片段用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，然后将经纯化的酶切产物与经相同酶酶切的载体pCanG-HA(中国科学院遗传与发育生物学研究所，Liang W.，Li C-B.，Liu F.，Jiang H.，Li S.，Sun J.，Wu X.and Li C.The Arabidopsis homologs of CCR4-associated factor 1 exhibit mRNA deadenylation activity and play a role in plant defense responses.Cell Research.2009，19：307-316.)连接。再将连接产物进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有RHA2b的正确的重组表达载体命名为pCanG-HA-RHA2b。

2、获得转基因植物

将重组表达载体pCanG-HA-RHA2b在根癌农杆菌的介导下转化拟南芥野生型(Col-0生态型)，然后用选择性标记基因卡那霉素(在含50mg/L卡那霉素的MS培养基)进行抗性筛选，筛选得到在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上能够生长的转pCanG-HA-RHA2b植株。抗性筛选得到的转pCanG-HA-RHA2b植株，用引物3和引物4对其进行PCR扩增鉴定，得到PCR鉴定正确的转pCanG-HA-RHA2b植株(即阳性转pCanG-HA-RHA2b植株)25株。

三、转基因植物的抗旱性功能检测

将上述步骤二中步骤2得到的阳性转pCanG-HA-RHA2b植株(图3中的35S：RHA2b)、突变体Salk_014943(购自NASC，The Nottingham Arabidopsis StockCentre)(图3中的rha2b)、拟南芥(Col-0生态型)(图3中的Col-0)的种子分别播种在MS培养基上，4℃暗培养3天，然后转移至光照条件为16h光照/8h黑暗，温度是22℃的培养箱里生长，然后将生长一周左右的苗子移到营养土和蛭石为2∶1的混合土里培养，大约30天左右进行干旱处理，大约3天后会出现萎焉表型，然后复水，两天后拍照。

结果如图3所示，相对于拟南芥Col-0野生型(图3中的Col-0)来说，转pCanG-HA-RHA2b植株(图3中35S：RHA2a)对抗旱的适应性大大提高，在Col-0野生型叶片发生失水萎焉时，RHA2b过量表达的转pCanG-HA-RHA2b植株的叶片还没完全萎焉。复水两天后，Col-0野生型植株的复活率为52％，而转pCanG-HA-RHA2b植株全部复活，Salk_014943(图3中的rha2b)有33％的复活率。这些数据说明，RHA2b过量表达能明显提高植物对干旱的抗性。

实施例2、RHA2b蛋白的功能研究

一、RHA2b过量表达的植物对ABA的敏感性

将上述实施例1中步骤二中步骤2得到的阳性pCanG-HA-RHA2b植株进行ABA敏感性试验，具体步骤如下所述：

将同时种植，同时收获的转pCanG-HA-RHA2b植株(图2中的35S：RHA2b)、RHA2b突变体Salk_014943(购自NASC，The Nottingham Arabidopsis Stock Centre)(图2中的rha2b)和拟南芥(Col-0生态型)(图2中的Col-0)的种子分别播种在含有不同浓度(0μM、0.3μM、0.5μM、0.8μM(如图2所示))的ABA的MS培养基上，4℃暗培养3天，然后转移至22℃光照条件，每天统计萌发率、子叶变绿和根的伸长等指标。

结果如图2所示，相对于拟南芥Col-0野生型(图2中的Col-0)来说，转pCanG-HA-RHA2b植株(图2中35S：RHA2b)对ABA的敏感性大大提高，在非常低浓度的ABA培养基上，RHA2b过量表达的转pCanG-HA-RHA2b植株就不能正常生长，子叶不能变绿，根系伸长也受明显抑制，而RHA2b突变体Salk_014943(图2中的rha2b)对ABA的敏感性降低，能够在较高浓度的ABA条件下生长。这些说明，RHA2b过量表达能明显提高植物对ABA的敏感性，也就是说RHA2b是ABA信号途径中的一个新的正调控因子。

二、RHA2b的泛素连接酶活性

1、目的基因的克隆

根据实施例1获得的RHA2b cDNA序列及载体pMal-c2(购自NEB公司)适宜的酶切位点设计引物扩增RHA2b，引物序列如下：

引物5：5′-GGGAATTCATGGGACTACAAGGTCAGCTCT-3′(上游引物，下划线部分碱基为EcoRI识别位点)

引物6：5′-GGGGATCCTCAATGAGATGATGCAGTAGAGA-3′(下游引物，下划线部分碱基为BamHI识别位点)

提取拟南芥Col-0的总DNA，以其为模板，在引物5和引物6的引导下，进行PCR扩增，反应结束后对PCR产物进行纯化，表明扩增得到444bp左右的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列2的自5′端第1-444位的核苷酸序列。

2、重组载体的构建

将上述步骤1中扩增得到的片段用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，即用限制性内切酶EcoRI和BamHI对经纯化的PCR产物进行双酶切，然后将经纯化的酶切产物与经EcoRI和BamHI双酶切后的载体pMal-c2(购自NEB公司)连接，将连接产物进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有RHA2b的正确的重组表达载体命名为pMal-c2-RHA2b。

3、重组菌的获得

将步骤2中得到的重组表达载体pMal-c2-RHA2b转化大肠杆菌BL21，筛选转入了pMal-c2-RHA2b的大肠杆菌BL21，将含有pMal-c2-RHA2b的大肠杆菌BL21命名为BL-pMal-c2-RHA2b。

4、MBP-RHA2b融合蛋白、MBP蛋白的获得

将步骤3中得到的大肠杆菌BL-pMal-c2-RHA2b接种于LB培养基，挑选单克隆在37℃摇培过夜，第二天按照1/100转接到LB培养基中，摇菌培养至OD₆₀₀为0.5时候，加入终浓度为1毫摩尔/升IPTG诱导，继续培养3小时，收集菌体。按照pMal-c2载体说明书纯化RHA2b蛋白，同时按照上述方法以表达pMal-c2空载体为对照，纯化后上样SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色后分析。

根据电泳迁移速率结果表明，诱导培养后的pMal-c2-RHA2b菌体纯化得到的是MBP-RHA2b融合蛋白，表达pMal-c2空载体纯化得到MBP蛋白。

5、RHA2b的泛素连接酶活性的功能检测

将上述步骤4中得到的MBP蛋白和MBP-RHA2b融合蛋白进行如下4组反应实验，验证RHA2b的泛素连接酶活性：

以下小麦的泛素激活酶E1(GI：136632)、泛素结合酶E2(UbcH5b)、融合HIS标签的泛素蛋白Ubiquitin均是本所谢旗研究组自己纯化的。

①将1ug的MBP蛋白、40ng小麦的泛素激活酶E1(GI：136632)、40ng来源于人的泛素结合酶E2(UbcH5b)、2ug融合HIS标签的泛素蛋白Ubiquitin一起加入40ul泛素反应液(50mM Tris(pH7.4)，2mMATP，5mMMgCl2，2mMDTT.)中，30℃反应2小时；

②将1ug的MBP-RHA2b蛋白、40ng来源于人的泛素结合酶E2(UbcH5b)、2ug融合HIS标签的泛素蛋白Ubiquitin一起加入40ul泛素反应液(50mM Tris(pH7.4)，2mMATP，5mMMgCl2，2mMDTT.)中，30℃反应2小时；

③将1ug的MBP-RHA2b蛋白、40ng小麦的泛素激活酶E1(GI：136632)、2ug融合HIS标签的泛素蛋白Ubiquitin一起加入40ul泛素反应液(50mM Tris(pH7.4)，2mMATP，5mMMgCl2，2mMDTT.)中，30℃反应2小时；

④将1ug的MBP-RHA2b蛋白、40ng小麦的泛素激活酶E1(GI：136632)、40ng来源于人的泛素结合酶E2(UbcH5b)、2ug融合HIS标签的泛素蛋白Ubiquitin一起加入40ul泛素反应液(50mM Tris(pH7.4)，2mMATP，5mMMgCl2，2mMDTT.)中，30℃反应2小时；

取上述4组的反应液进行SDS-PAGE胶电泳，电泳后转膜，分别用HIS抗体westernblot。

结果如图1所示，结果表明第①组(MBP对照)、第②组(不加E1)、第③组(不加E2)的反应液中均不能检测到被泛素化修饰的MBP-RHA2b，只有第④组在E1、E2和RHA2b都存在的情况下，可以明显地检测到RHA2a能被泛素化后得到的蛋白条带((Ub)n-MBP-RHA2b)。其中图1中，第1条至第4条泳道分别为第①组至第④组反应液的HIS抗体westernblot结果。

上述结果表明，RHA2b具有泛素连接酶活性。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

<160>3

<210>1

<211>2811

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

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ttcttagtat gaaaagaatc aaattaagct tcatgtattc ctccttggct ggtaaatctt    2760

tttgtagtat atttgacaaa gcctactact atttaatttt gcattctaga c             2811

<210>2

<211>444

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

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ttggaaggct ggcttcaaca tctcaacttc aattgcccgc tctgtagatc tccattgcta    360

cctcatcatc atcagggaca tggcagtgat gcgtcgatct cagccttccc tcttcgctct    420

acctctactg catcatctca ttga                                           444

<210>3

<211>147

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

Met Gly Leu Gln Gly Gln Leu Ser Asp Val Ser Ser Asp Ser Ile Pro

1               5                   10                  15

Leu Met Leu Leu Ala Leu Leu Ala Thr Phe Phe Arg His Val Arg Ser

            20                  25                  30

Leu Leu Leu Phe Pro Ser Ser Ala Pro Val Val Val Val Thr Ser Asn

        35                  40                  45

Leu Ser Val Leu Ala Asp Gln Leu Asn Leu Asn Arg Leu Phe Ser Tyr

    50                  55                  60

Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Ser Asp Cys Ile Val Cys Leu Ser Lys

65                  70                  75                  80

Leu Lys Thr Gly Glu Glu Val Arg Lys Leu Asp Cys Arg His Val Phe

                85                  90                  95

His Lys Gln Cys Leu Glu Gly Trp Leu Gln His Leu Asn Phe Asn Cys

            100                 105                 110

Pro Leu Cys Arg Ser Pro Leu Leu Pro His His His Gln Gly His Gly

        115                 120                 125

Ser Asp Ala Ser Ile Ser Ala Phe Pro Leu Arg Ser Thr Ser Thr Ala

    130                 135                 140

Ser Ser His

145

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中的序列2；

2)核苷酸序列是序列表中的序列1的基因；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pCanG-HA的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到抗逆性强于目的植物的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入植物中。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻、小麦、大豆、烟草、拟南芥、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三叶草、冰草、草莓或西红柿。

10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆转基因植物为抗旱转基因植物。

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