CN108034663A - 一种番茄泛素连接酶基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄泛素连接酶基因及应用。其中番茄基因S1SINAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该番茄基因S1SINAL具有泛素连接酶活性，对植物抗性蛋白所介导的超敏反应有抑制作用，也可以抑制病原菌效应蛋白所引发的超敏反应。本发明的番茄基因在植物免疫反应中发挥负调控作用，可用于调节植物抗病性。
Description
技术领域
本发明涉及植物遗传工程技术领域，尤其涉及一种番茄泛素连接酶活性基因S1SINAL，以及该基因在调控植物抗病性中的应用。
背景技术
病原微生物引起植物防御系统崩溃形成病害会造成农业的巨大损失。每年细菌性病害会造成农作物约20％的经济损失。植物和病原入侵者之间存在着复杂的相互作用关系，病害是否发生也是植物、病原微生物攻防博弈的结果(Plant Signaling&Behavior，2009，4：283-293)。如，在引起细菌性斑点病的丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonassyringae pv.tomato)与其所侵害宿主植物之间的攻防战中，病原微生物首先利用伤口、气孔等植物表面的孔隙，进而通过向植物注入毒性效应蛋白(effector)命令关闭的气孔再打开等方法，突破植物表面物理屏障；通过抑制胞壁降解酶、蛋白酶等的破坏作用，突破植物酶系保护屏障；通过阻断植物信号传导，防止植物抗菌化合物合成，及侵染信息的远程传递，突破植物的免疫防御应答防线，最终破坏、干扰植物生命活动，从植物体获得营养实现病原微生物自身的定植和繁殖。植物则针锋相对首先形成识别微生物保守成分的PTI(PAMP-triggered immunity)免疫机制，通过发现微生物的共同、必需结构和分子，来感知环境中微生物的存在激活防御反应；随后针对病原菌效应蛋白对PTI途径的阻断破坏，进化出识别效应蛋白的ETI(effector-triggered immunity)免疫机制，出现与动物相似的快速免疫应答，在感染部分迅速诱导程序性细胞死亡产生超敏反应，阻止病原微生物从侵染部位扩散。同时，通过系统获得性抗性将信号传至植物未侵染部位进行防御动员(Cell Host&Microbe，2012，11：587-596)。由此，植物与生存环境中的病原微生物形成了攻防协同进化模式。
如上所述，植物通过发现感知病原微生物、激活信号传导途径、重置基因转录，产生对病原菌的防卫反应。这些防卫反应包括：气孔关闭、胼胝质沉积、酚类等抗菌次生代谢物合成、氧化进发与超敏反应、病程相关蛋白合成、系统获得性抗性启动，等。防卫反应涉及物理、生化多种途径和众多的功能基因(Current Biology，2011，22：103-112)。所以，防御反应的启动实施是一个消耗大量物质、能量的过程。在一些突变体或过量表达抗病基因的植物中，由于持续处于防御状态，这些植物通常植株矮小、组成型表现超敏反应。因此，是否从生长状态转向防御状态，是否诱导感染部位细胞死亡，产生强烈的超敏反应，对于植物来说都是一个需要综合各种信息进行精细调控的过程。这种调控作用主要集约性地“聚焦”于植物免疫过程中的一些重要节点蛋白。如，通过一些具有泛素连接酶活性的蛋白使免疫节点蛋白连接上多个泛素(多泛素化)，这种多泛素化标签可以被26S蛋白酶体识别，启动节点蛋白的降解，从而达到调控其功能效应的作用。最终，使植物针对病原微生物做出及时、适度的防御反应。但是，近年来相关研究进展主要集中在植物防御反应的启动激活过程，对植物如何主动下调关闭这种防御效应，尤其是对产生快速剧烈组织坏死的超敏反应如何进行系统有效的负调控则少有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有泛素连接酶活性的基因。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供上述泛素连接酶基因在调节植物抗病性中的应用。
对于泛素连接酶基因，本发明提供的技术方案是，一种番茄基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所编码蛋白具有泛素连接酶活性。
本发明还包括上述的番茄泛素连接酶活性基因在调控植物抗病性中的应用。
本发明从番茄叶片中克隆得到基因Solanum lycopersicum SINA-Like，命名为S1SINAL。
本发明通过S1SINAL基因大肠杆菌表达载体构建、诱导表达与纯化获得S1SINAL标签蛋白；体外泛素化活性检测表明S1SINAL具有泛素连接酶活性。
将S1SINAL基因植物表达载体在植物叶片上注射表达时，S1SINAL对植物抗性蛋白所介导的超敏反应有抑制作用；S1SINAL也可以抑制病原菌效应蛋白所引发的超敏反应。表明本发明如SEQ ID NO.1所示的基因在植物免疫反应中发挥负调控作用，能够调节植物抗病性。
本发明的有益效果是：
本发明的S1SINAL基因为在植物中参与调控分子免疫反应提供了一种新的基因资源，可用于番茄等作物抗病材料的筛选、培育和改良。
具体实施方式
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J.和Russell，D.W.的分子克隆实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：S1SINAL基因克隆与大肠杆菌表达载体构建
从番茄叶片中提取总RNA，反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)，克隆获得S1SINAL基因。
1、试剂
植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；DNA酶I(Dnase I)购于Takara公司；反转录酶(TransScript Reverse Transcriptase)、Pfu高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶EcoR I、Sa1 I购于Fermentas公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于Omega公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、大肠杆菌菌株、载体和植物材料
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21购于Novagen公司；大肠杆菌表达载体pMAL-C2来自美国University of Idaho大学Fangming Xiao博士实验室；番茄栽培品种AC(Solanum lycopersicum cv.Ailsa Craig，AC+/+，LA2838A)和本氏烟草(Nicotianabenthamiana)来自美国康奈尔大学博伊斯汤普森研究所，种植于人工气候培养室。
3、培养基和溶液
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶解于去离子水，定容至1L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
SOB培养基：胰蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.58g，KCl 0.19g，100×Mg2+ 10mL，加入去离子水定容至1000mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
SOC培养基：方法同上述SOB培养基的配制，再加入2mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖。
100×Mg2+溶液：20.33g MgCl2.6H2O和24.65g MgSO4.7H2O溶于去离子水定容至100mL，高压灭菌。
1000×氨苄青霉素(Amp)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，无菌抽滤后分装，-20℃保存。
4、方法
4.1 RNA提取
1)液氮研磨破碎100mg番茄叶片组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml Trizol，剧烈震荡，室温放置5min；
2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；
3)4℃，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；
4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；
5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；
6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底；
7)加入1mL 70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
9)室温干燥5-10min；
10)加入50μL无RNA酶水(RNase-free H2O)，溶解RNA；
11)取RNA 50μg，加入5μL 10×缓冲液(400mM Tris-HCL，pH 7.5，80mM MgCl2，50mM DTT)、5μL Dnase I、2μL RNA酶抑制剂，37℃反应30min；
12)加入2.5μL 0.5M EDTA，80℃，2min失活Dnase；
13)加入10μL 3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；
14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
15)加入1mL 70％乙醇清洗RNA；
16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
17)室温干燥5-10min；
18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；
19)检测RNA样品的纯度、浓度。-80℃保存。
4.2 RT-PCR
4.2.1 RT
1)取1μg总RNA与1μL polyT18(10μM)引物混合，用RNase-free ddH2O补足至12.75μL，轻轻混匀；
2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；
3)加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)，TransScript Reverse Transcriptase反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；
4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应。
4.2.2 PCR
根据S1SINAL基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列如下：
S1SINALF1：5′TCCGAATTCATGCAGATTAGATGTGGGAAT 3′
S1SINALR1∶5′CATGTCGACTCATTCCTTCTCTTCTATGAGAACATC 3′
取4.2.1所获番茄叶片cDNA，进行S1SINAL基因的克隆。将200μL BP管放置于冰上，加入试剂：
按以下程序进行扩增：98℃2min(预变性)；98℃10s(变性)，55℃30s(复性)，72℃60s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(总延伸)。
通过上述操作，获得了S1SINAL基因编码序列PCR扩增产物。
4.3质粒提取
将大肠杆菌表达载体pMAL-C2进行质粒提取，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。
1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃废液，待用；
2)12000rpm，1min，离心收集菌沉淀，尽量弃尽上清；加入250μL P1(已加RNaseA)，吹吸混匀至菌沉淀彻底悬浮；
3)加入250μL P2，温和上下翻转8次离心管，使菌体充分裂解；
4)加入350μL P3，立即温和上下翻转8次离心管，12000rpm，离心10min；
5)吸出上清至新的离心管中，12000rpm，离心5min；
6)小心转移上清至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃废液；
7)加入500μL PD，12000rpm，离心1min，弃废液；
8)加入600μL PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，弃废液，重复操作一次；
9)12000rpm，离心2min，除尽残留的PW；
10)将吸附柱转移至新离心管中，在柱中央加入50μL无菌ddH2O，室温2min，12000rpm，离心2min，洗脱DNA；
11)将重新洗脱液吸出至吸附柱中，再重复此操作一次。
4.4酶切
利用限制性内切酶EcoR I、Sa1 I对上述4.2所获得的S1SINAL基因PCR纯化扩增产物、4.3所获得的pMAL-C2质粒分别进行酶切。反应体系如下所述，37℃，1h：
4.5胶回收
将上述4.4酶切后S1SINAL扩增产物、pMAL-C2质粒进行胶回收，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。
1)向胶回收吸附柱CA2中加入500μL的平衡液BL，在12000rpm离心机中离心1min，倒去柱底部的废液；
2)带上塑胶手套，在紫外切胶仪器上回收电泳好的片段，将切下的片段放入预先准备的干净的EP管中；
3)根据胶的质量来确定加入溶胶液PN的体积，根据1∶1体积加入。将EP管放入50℃的加热器上，加速溶解的速度，溶解10-15min，至胶完全溶解为止；
4)溶胶完全后，待其冷去至室温后，将溶解液体转入到胶回收吸附柱CA2中，静置3min，让溶胶液和吸附膜充分接触；
5)静置完全后，在12000rpm离心机中离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。向吸附管中加入600μL的PW，漂洗洗去质粒中的杂质，静置3min；
6)12000rpm离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。完成后，重复上一步的过程；
7)将空的吸附柱放入离心机中12000rpm离心3min，放置于通风处，放置15min，待酒精全部挥发干净；
8)向吸附柱CA2中正中心吸附膜上加入30μL洗脱剂EB，静置3min，12000rpm离心3min，获得胶回收产物。
4.6酶切片段连接
将上述4.5酶切回收的S1SINAL扩增产物、pMAL-C2质粒以T4连接酶进行连接，反应体系如下，25℃，3h：
4.7大肠杆菌转化
1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21感受态细胞冰浴解冻；
2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；
3)42℃热击90s，立即冰浴1-2min；
4)加入0.8mL SOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；
5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。
4.8菌落PCR鉴定
挑取单克隆接种于500μL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡培养至A600为0.6-0.8，然后进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：
反应条件：94℃3min(预变性)；94℃30s(变性)，56℃30s(复性)，72℃60s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃5min(总延伸)。
对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pMAL-SINAL，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pMAL-C2载体的SINAL基因全长编码序列，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
实施例2：S1SINAL标签蛋白表达纯化
将实施例1所获得的带有pMAL-SINAL载体的大肠杆菌进行S1SINAL基因诱导表达，然后对诱导表达的S1SINAL蛋白进行纯化，获得带有MBP(maltose binding protein，麦芽糖结合蛋白)标签的S1SINAL重组蛋白。
1、试剂
淀粉树脂购于NEB公司；maltose、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside)购于Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、培养基和溶液
LB培养基、1000×氨苄青霉素(Amp)配制方法如实施例1所述。
提取缓冲液：1M Tris(pH 7.5)2mL，5M NaCl 4mL，0.5M EDTA 200μL，加灭菌去离子水至100mL。
洗脱缓冲液：在10mL提取缓冲液中加入36mg maltose。
5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HC1(pH 6.8)0.6mL，50％甘油5mL，10％SDS2mL，β-巯基乙醇0.5mL，1％溴酚蓝1mL，加入去离子水定容至10mL。
10×SDS-PAGE电泳缓冲液：120g Tris base、576g甘氨酸、40g SDS溶解于去离子水中，定容至4L。使用前加水稀释至1×。
10×PBS磷酸盐缓冲液：NaCl 80g，KCl 2g，NaH2PO4 11.5g，KH2PO4 2g，溶解于去离子水，定容至1L。使用前加水稀释至1×。
3、方法
1)挑取单克隆，加入2mL带有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床中培养24h；
2)转接上述大肠杆菌培养液0.5mL至50mL带有氨苄青霉素的新鲜培养液中，使细胞的最终浓度约为OD600＝0.1。摇床中250rpm，37℃培养至OD600＝0.6-0.9；
3)加入20μL 0.5M IPTG，移至摇床中28℃，250rpm培养6-8h；
4)4000rpm离心20min，去上清，收集细胞；
5)加入10mL细胞蛋白提取缓冲液，超声破碎10s，间歇20s，重复10次；
6)在冷冻离心机中4℃20000rpm离心20min，收集上清；
7)取10mL提取缓冲液于15mL离心管中，加入300μL淀粉树脂，4000rpm离心2min，弃去上清液。重复洗涤一次；
8)将上述步骤6)所收集大肠杆菌细胞粗体液与步骤7)所洗涤处理的淀粉树脂混匀，4℃结合4-6h；
9)在4℃条件下，4000rpm离心1min，去上清。加入10mL提取缓冲液，清洗树脂20min。重复3次；
10)加入0.5mL洗脱缓冲液，洗脱2次，每次1-2h；
11)4℃10000rpm离心收集洗脱后的上清液；
12)将上清液加入透析袋中，在1×PBS溶液中4℃透析24h；
13)取20μL纯化蛋白，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液4μL，在垂直电泳槽中进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测纯化蛋白纯度、浓度；
14)将纯化蛋白分装后，-80℃保存。
4、结果
SDS-PAGE(solium dedecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳结果显示，利用淀粉树脂亲和层析法可以获得约80KD预期大小，且无其它蛋白杂带的高纯度MBP-S1SINAL标签蛋白。
实施例3：S1SINAL蛋白体外泛素化活性检测
将上述实施例2所制备S1SINAL纯化蛋白加入泛素化反应所需试剂，进行S1SINAL蛋白泛素连接酶活性的检测。
1、试剂
磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶、ATP(三磷酸肌苷)、带有Flag标签的泛素(ubiquitin)分子Flag-Ub购于Sigma公司；泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)购于R&D Systems公司；PVDF膜购于Merck Millipore公司；小鼠Flag标签单克隆抗体anti-Flag、抗小鼠抗体anti-mouse购于Sigma公司；ECL蛋白印迹底物购于GE公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、溶液
20×反应缓冲液：9.52mg MgCl，24.2mg ATP，7.65mg磷酸肌酸，1mg磷酸肌酸激酶，加入1M Tris-HC1(pH 7.5)至1mL。
SDS-PAGE上样缓冲液、SDS-PAGE电泳缓冲液配制方法如实施例2方法所述。
10×western blot转膜缓冲液：甘氨酸144g，Tris 30.2g。将Tris、甘氨酸溶解于0.9L去离子水中，搅拌混匀，定容至1L。配制1L 1×转膜缓冲液时，加入10×转膜缓冲液100mL、甲醇100mL，加去离子水定容至1L。
10×TBS(Trish-buffered saline)缓冲液：80g NaCl，2g KCl，30g Tris。将各组分溶解于0.8L去离子水中，调pH至7.4，加去离子水定容至1L。配制1×TBST(Trish-buffered saline with Tween)缓冲液时，加入10×TBS100mL、20％Tween-202.5mL，加去离子水定容至1L。
3、方法
1)按照如下反应体系添加泛素化试剂。
同时，将分别未加入S1SINAL蛋白、E1、E2、ub-Flag，以及加入了MBP蛋白的体外反应体系作为负对照，平行进行体外反应，30℃反应2h。然后加入7.5μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，终止反应；
2)将样品进行7.5％SDS-PAGE凝胶电泳2h；
3)凝胶进行PVDF膜转印，100V，1h；
4)将PVDF膜以5％脱脂牛奶封闭1h；
5)加入anti-Flag抗体室温反应1h；
6)以1×TBST缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化酶联的抗小鼠抗体，室温反应1h；
7)以1×TBST缓冲液洗膜3次，加入反应底物(western blotting ECLsubstrate)，在化学发光仪中对体外泛素化反应情况进行检测。
4、结果
通过上述体外反应、western-blotting检测，当以anti-Flag抗体孵育结合时，S1SINAL蛋白因连接上了带有Flag标签的泛素(ubiquitin)分子Flag-Ub，显示出分子量增加的多泛素化条带。而未加入S1SINAL蛋白、E1、E2、Flag-Ub，以及加入了MBP蛋白的各负对照样品反应体系均无明显泛素化条带。表明S1SINAL蛋白可进行自身泛素化，具有泛素连接酶活性。
实施例4：S1SINAL基因烟草瞬时表达载体构建
以实施例1所获eDNA为模板扩增S1SINAL基因，连接于植物表达载体pBTEX，并转化大肠杆菌、农杆菌。
1、试剂
质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于Omega公司；Pfu高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Kpn I和Stu I购于Fermentas公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、载体与菌株
植物表达载体pBTEX-HA来自美国University of Idaho大学Fangming Xiao博士实验室。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV2260购于北京全式金生物技术有限公司。
3、培养基和抗生素
LB培养基、SOC培养基的配制方法如实施例1所述。
1000×卡那霉素(Kan)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，无菌抽滤后分装-20℃保存。
500×利福平(Rif)：50mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。
4、方法
4.1 PCR
根据S1SINAL基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列如下：
S1SINALF2：5′TCCGGTACCATGCAGATTAGATGTGGGAAT 3′
S1SINALR2：5′CATAGGCCTTTCCTTCTCTTCTATGAGAACATC 3′
取实施例1中4.2.1所获番茄叶片cDNA，进行S1SINAL基因的PCR扩增。实验方法步骤如实施例1中4.2.2所述。
4.2质粒提取
将植物表达载体pBTEX-HA进行质粒提取，实验步骤如实施例1中方法4.3所述。
4.3酶切
利用限制性内切酶Kpn I、Stu I对上述4.1所获得S1SINAL基因扩增产物、4.2所获得pBTEX-HA质粒进行酶切。实验步骤如实施例1中方法4.4所述。
4.4胶回收
将上述酶切后S1SINAL基因扩增产物、pBTEX-HA质粒进行胶回收，实验步骤如实施例1中方法4.5所述。
4.5酶切片段连接
将上述酶切回收的S1SINAL基因扩增产物、pBTEX-HA质粒片段以T4连接酶进行连接，实验步骤如实施例1中方法4.6所述。
4.6大肠杆菌转化
实验步骤如实施例1中4.7所述。
4.7菌落PCR鉴定重组质粒
实验方法步骤如实施例1中4.8所述。
将菌落PCR鉴定重组载体(命名为pBTEX-SINAL)，进行测序。测序结果表明，S1SINAL编码序列已连接于pBTEX载体。将测序正确重组大肠杆菌-80℃保存。
4.8农杆菌转化
1)按实施例1中4.3所述步骤提取pBTEX-SINAL质粒；
2)将pBTEX-S1SINAL质粒加入50μL农杆菌菌株GV2260感受态细胞中，轻轻搅拌混匀，并让在冰上冰浴30min；
3)放置于液氮中冷激1min；
4)将EP管移置于37℃恒温加热器上，加热5min；
5)加入SOC培养液800μL，放置于摇床中28℃，200rpm/min培养4-5h；
6)菌液于4000rpm/min离心5min；
7)在超净台中吸取上清，剩余约100μL，将菌体轻轻吹打悬浮混匀；
8)用灭菌玻璃球将菌液均匀涂布于LB+Rif+Kana固体培养基，于28℃恒温培养箱培养48h；
9)按实施例1中4.8所述相同方法步骤进行菌落PCR鉴定，并将鉴定转入重组质粒的阳性农杆菌-80℃保存。
实施例5：S1SINAL在叶片中瞬时表达抑制超敏反应的发生
本实施例将S1SINAL与植物抗性蛋白、病原菌效应蛋白通过农杆菌介导方法在叶片中瞬时表达，观察S1SINAL对植物超敏反应的影响。
1、试剂
乙酰丁香酮购于美国Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
2、载体与植物材料
pBTEX-PrfD1416V、pBTEX-RxD461V、pBTEX-AvrPtoB来自美国University of Idaho大学Fangming Xiao博士实验室。本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和番茄栽培品种AC(Solanum lycopersicum cv.Ailsa Craig，AC+/+，LA2838A)来自美国康奈尔大学博伊斯汤普森研究所，种植于人工气候培养室。
3、培养基和溶液
IM溶液：2-吗啉乙磺酸(MES)4.88g；葡萄糖2.5g；NaH2PO4 0.126g。先将MES加至去离子水中，调节pH值至5.6，再加入葡萄糖、NaH2PO4，搅拌均匀，定容至475mL，高温灭菌。
20×AB盐溶液：NH4Cl 20g；MgSO4 6g；KC1 3g；FeSO4 0.05g，CaCl2 2g。依次加入各组分，完全且均匀溶解后定容至1L，高温灭菌。
200mM乙酰丁香酮(acetosyringone，1000×)：将39mg乙酰丁香酮粉末溶于1mL二甲基亚砜，-20℃避光保存。
诱导培养基：IM溶液19mL，20×AB盐溶液1mL，200mM乙酰丁香酮20μL，25mg/mL卡那霉素20μL，加去离子水定容至20mL。
5×蛋白质电泳缓冲液、10×western blot转膜缓冲液、10×TBS)缓冲液的配制方法如实施例2、实施例3所述。
4、方法
4.1 S1SINAL与植物抗性蛋白在烟草叶片中瞬时表达
1)将转入pBTEX-SINAL质粒和pBTEX-HA空载体、pBTEX-PrfD1416V、pBTEX-RxD461V的农杆菌，分别在带有Rif和Kana的LB培养板上划线，28℃恒温箱中培养48h；
2)挑取单克隆28℃培养12h，取300μL菌转接至2.7mL LB+Rif+Kana培养液中，28℃培养6-8h；
3)室温条件下，3000rpm离心6min，弃上清，加入3mL IM溶液重悬菌体；重复一次，以3mL IM溶液重悬菌体后，28℃250rpm培养5-14h；
4)3000rpm离心6min，弃上清，加入10mM MES 2mL(pH 5.7，含有200mM乙酰丁香酮200μL)，重悬菌体，涡旋震荡。重复一次；
5)以10mM MES作为空白对照，测定菌液浓度(0D600)。将带有pBTEX-SINAL质粒的农杆菌液分别与带有植物抗性蛋白质粒pBTEX-PrfD1416V、pBTEX-RxD461V的农杆菌液等量混合，配制侵染液；
6)使用一次性注射器，将侵染液从烟草叶片下表皮注射到叶片中，并标记侵染范围；
7)将注射植株置于阴暗处0.5h，然后放于光照下生长，观察叶片超敏反应的发生情况。
4.2S1SINAL与植物抗性蛋白在番茄叶片中瞬时表达
如上述4.1相同方法，将S1SINAL与植物抗性蛋白在番茄叶片中瞬时表达，观察叶片超敏反应的发生情况。
4.3 S1SINAL与病原菌效应蛋白在烟草叶片中瞬时表达
如上述4.1相同方法，将S1SINAL与病原菌丁香假单胞菌效应蛋白AvrPtoB在烟草叶片中瞬时表达，观察叶片超敏反应的发生情况。
5、结果
实验结果显示，与单独表达PrfD1416V、RxD461V的叶片相比，同时表达S1SINAL的叶片坏死程度显著减少，S1SINAL对植物抗性蛋白PrfD1416V、RxD461V所介导的超敏反应均有抑制作用。PrfD1416V、RxD461V分别是植物抗病基因Prf、Rx的突变活化形式，当prfD1416V、RxD461V在植物叶片单独表达时，即可激活植物免疫途径使注射叶片部位细胞发生程序性死亡超敏反应。但S1SINAL可以抑制PrfD1416V、RxD461V所介导的这种超敏反应。此外，S1SINAL也可以抑制病原菌效应蛋白AvrPtoB所引发的叶片超敏反应。AvrPtoB是丁香假单胞菌均番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)分泌进入植物体内的效应蛋白，用于阻断植物的免疫防御途径。但植物在进化中通过识别这种效应蛋白，反而可以激活自身的防卫反应，通过产生组织坏死超敏反应，防止病原菌的进一步定植扩散。同样，S1SINAL也对效应蛋白AvrPtoB所引发的超敏反应显示抑制效果。实验结果表明，如SEQ ID NO.1所示的基因在植物免疫反应中发挥负调控作用，能够调节植物抗病性。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> 一种番茄泛素连接酶基因及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 666
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 2
Met Gln Ile Arg Cys Gly Asn Gly His Ile Ala Cys Ala Pro Cys Cys
1 5 10 15
Ile Lys Ile Ala Asn Lys Cys Pro Ser Cys Cys Leu Pro Ile Gly Tyr
20 25 30
Asn Arg Cys Arg Ala Met Glu Asn Val Leu Glu Ser Leu Lys Val Ser
35 40 45
Cys Val Asn Asn Arg Tyr Gly Cys Lys Glu Ile Leu Asn Leu Ser Lys
50 55 60
Lys Thr Asp His Glu Asn Ala Cys Ile Tyr Val Pro Cys Phe Cys Pro
65 70 75 80
Ser His Gly Cys Asp Phe Ile Gly Thr Ser Ala Lys Val Tyr Ala His
85 90 95
Phe Ser Lys Lys His Ala Ser Ser Ala Glu His Ile Ser Phe Asn Ala
100 105 110
Val His Pro Ile Tyr Ile Glu Lys Asp Gln Arg Tyr Ile Ile Leu Gln
115 120 125
Met Arg Thr Glu Gly Ile Leu Phe Ile Val Asn His Ala Ser Asp Arg
130 135 140
Val Gly Ser Ala Ile Asn Ile Ile Cys Val Gly Gln Ala Arg Gln Lys
145 150 155 160
Arg Arg Phe Ser Tyr Lys Leu Val Val Thr Asp Gly Glu Ser Ser Phe
165 170 175
Lys Leu Glu Ser Val Ala Glu Ser Val Pro Asn Trp Ser Glu Asp Ser
180 185 190
Pro Met Lys Lys Phe Leu Val Val Pro Lys Asp Val Val Asn Ser Ser
195 200 205
Ala Arg Leu Lys Leu Asp Val Leu Ile Glu Glu Lys Glu
210 215 220
Claims (3)
1.一种具有泛素连接酶活性的番茄基因，其特征在于，所述番茄基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的番茄基因，其特征在于，所述番茄基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的番茄基因在调控植物抗病性中的应用。
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