CN102286491A

CN102286491A - 一种控制水稻根系发育的基因OsZRL

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Publication number: CN102286491A
Application number: CN 201110222611
Authority: CN
Inventors: 牛向丽; 玉晓红; 刘永胜; 曾正明; 苗雁文
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2011-08-23
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-08-23
Also published as: CN102286491B

Abstract

一种控制水稻根系发育的基因OsZRL，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。将SEQIDNO：1所述基因全长编码序列、SEQIDNO：1所述基因片段正向和反向插入到真核载体中，获得本发明所述OsZRL基因过量表达、RNA干涉真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得OsZRL过表达、RNA干涉转基因植株。实验表明：本发明所述SEQIDNO：1基因能够调控水稻的根系发育；与野生型植株相比，OsZRL过表达转基因植株根系发育受到明显抑制，而OsZRL下调转基因植株根系发达，茎杆、植株粗壮。因此，本发明所述基因对水稻根系发育具有负调控作用，并可在水稻性状改良中应用。

Description

一种控制水稻根系发育的基因OsZRL

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种控制水稻根系发育的基因及其在水稻性状改良中的应用。

背景技术

水稻根系是吸收水分、矿物质和感受土壤环境的桥梁，又是氨基酸、多种激素同化、合成的场所，根系状况直接影响着地上部分的生长发育及产量的形成，是制约水稻产量潜力进一步发挥的关键因素。但由于植物根系隐藏于地下，其发育的形态和生理学观察不易进行，相应分子机制的研究也较其他植物器官滞后。虽然，近年在双子叶模式植物拟南芥根的发育方面有了比较大的进展(Benfey 等，Plant J, 2010)，但由于单、双子叶植物根系的不同，如在拟南芥中有主根，然后顺序分生出侧根，而水稻、玉米等则是形成庞大而复杂的不定根系(Osmont等，Annu Rev Plant Biol，2007)。所以，谷类作物还没有一套具体的根系形态、生理特征改良指标，对根系发育的分子调控机制也了解不多。

在已知的水稻根发育相关基因研究中，CRL1 (CROWN ROOTLESS 1)和WOX11(WUSCHEL-related homeobox gene)基因分别通过介导生长素信号传导或生长素/细胞分裂素信号整合调控水稻不定根的生长发育(Inukai等，Plant Cell, 2005；Zhao等，Plant Cell, 2009)；OsRMC基因通过茉莉酸信号途径促进水稻根的发育、弯曲和卷曲(Jang等，Plant cell Environment, 2007)，而bHLH (basic helix-loop-helix)转录因子基因RSL4 (ROOT HAIR DEFECTIVE 6-LIKE 4)可以控制根部细胞生长的大小(Yi等，Nature genetics, 2009)。

锌指蛋白(zinc-finger protein)是转录因子中研究得比较深入的一个类型(杨致荣等，遗传，2004)。锌指蛋白中有单个或成簇出现的锌指结构域，可以结合DNA而调控基因转录、染色质重构等(Gamsjaeger等，Trends Biochem Sci, 2007)。在植物中普遍存在锌指蛋白，有些锌指蛋白是植物所特有，并广泛参与植物各个时期的生长发育调控、胁迫应答等。但总体来说，在单子叶植物中相应研究还较少，尤其是在根系发育调控方面，而这对于水稻等重要粮食作物田间农艺性状调控来说尤为重要。

发明内容

本发明的目的是在于提供一个新的控制水稻根系发育的基因，所述基因的过量表达可明显抑制水稻的根系发育，而该基因的下调可以促进根系的生长发育，因而发挥负调控作用。

本发明的技术方案如下：

本发明所述控制水稻根系发育的基因，命名为OsZRL (Oryza sativa Zinc-finger Rootless)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，其编码序列在第211-233位氨基酸有一个C2H2型锌指(zinc-finger)结构域，第298-320位氨基酸有一个C2HC型锌指结构域。该基因的克隆：根据GenBank中水稻mRNA序列(登录号：NM_001062214, CI472510)，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计了2对巢式PCR特异引物。从水稻叶子中提取总RNA，利用反转录PCR (RT-PCR)技术从水稻中分离到OsZRL基因编码序列。

本发明所述OsZRL 基因过表达真核重组质粒，是将SEQ ID NO：1所述基因全长编码序列插入到真核表达载体中获得。

本发明所述OsZRL 基因RNA干涉真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游1112bp至1546bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列。

本发明所述真核重组质粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

(1) 在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是位于起始密码子下游1112bp至1546bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；

(2) 利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。

本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303中的一种。

将上述过表达、RNA干涉重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验表明：相比于野生型植株，过量表达OsZRL基因的转基因阳性植株根系生长受到明显抑制，而OsZRL下调转基因植株根系发达，茎杆、植株粗壮。因此，本发明所述基因对水稻根系发育具有负调控作用，并可在水稻性状改良中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为研究水稻等单子叶禾本科作物的根系发育调控和性状改良提供了一种新的基因。

2、本发明所用的基因为水稻本身自有的基因，所以转基因水稻的安全性能高。

3、本发明所述基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图 1是从水稻cDNA中扩增OsZRL基因编码序列的第二轮PCR扩增产物电泳结果。

图 2 是OsZRL基因过表达真核重组质粒(pHB-OsZRL)的示意图。

图 3 是重组质粒pHB-OsZRL酶切鉴定图。图中所示为pHB-OsZRL质粒Hind III、Sac I双酶切结果。

图 4 是OsZRL转基因植株表型。A：OsZRL转基因小苗从生根培养基移入土壤前的生长情况，从左至右依次为OX-1～OX-4、OX-8、OX-9；B：转基因小苗OX-4、OX-9移入土壤一周后的生长情况；C：转基因小苗OX-5、OX-6持续在培养瓶中培养三周后的生长情况。

图 5 是转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果电泳图。图中，1-5泳道：PCR模板为转基因植株OX-5～OX-9基因组DNA；6泳道：阳性对照，PCR模板为重组质粒pHB-OsZRL；7泳道：阴性对照，PCR模板为野生型植株；M：DNA marker, DL2000。

图 6 是OsZRL转基因植株实时定量PCR检测结果。从左至右依次为5个独立转基因植株(OX-5～OX-9)、野生型(WT)。

图 7 是OsZRL基因RNA干涉真核重组质粒(pHB-OsZRLRi)的示意图。

图 8 是重组质粒pHB-OsZRLRi酶切鉴定图。图中，1-3泳道：为pHB-OsZRLRi质粒Xho I+Hind III、EcoR I+Sac I和BamH I+Sac I双酶切结果；M：DNA marker, DL2000。

图 9 是OsZRL基因RNA干涉转基因植株表型。A：野生型(WT)、转基因成体植株(Ri-1)生长情况；B：野生型(WT)、转基因植株(Ri-1)根系生长情况；C：野生型(WT)、转基因植株(Ri-1)茎杆。

图 10 是转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果电泳图。图中，1-3泳道：PCR模板为转基因植株Ri-1～Ri-3基因组DNA；4泳道：阳性对照，PCR模板为重组质粒pHB-OsZRLRi；5泳道：阴性对照，PCR模板为野生型植株；M：DNA marker, DL2000。

图 11 是OsZRL RNA干涉转基因植株半定量PCR检测结果。从左至右依次为野生型(WT)、3个独立转基因植株(Ri-1～Ri-3)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook, Russell的分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：水稻OsZRL基因的克隆

1、试剂

植物RNA提取试剂盒购于北京天根生化有限公司；反转录试剂盒购于Toyobo公司；pEASY Blunt 载体、高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌克隆菌株为E. coli DH5α，购于北京全式金生物技术有限公司；水稻粳稻品种日本晴(Oryza sative L. Nipponbare)种子由重庆大学农学及生命科学研究院试验基地提供。

3、培养基和溶液

LB培养基: 胰蛋白胨 10 g /L，酵母粉 5 g /L，NaCl 10 g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基: 胰蛋白胨 20 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 0.58 g/L，KCl 0.19 g/L，100×Mg²⁺ 10 mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基: SOB + 20 mM葡萄糖。

TB buffer（临用前配置）: 1 M KCl 4 mL，0.45 M MnCl₂2.4 mL，0.50 M CaCl₂0.6 mL，0.50 M K-MES 0.5 mL，ddH₂O 12.5 mL（总体积20 mL）。

100×Mg ²⁺ 溶液: 20.33 g MgCl₂.6H₂O和24.65 g MgSO₄.7H₂O定容于100 mL H₂O，高压灭菌。

20%葡萄糖溶液: 20g葡萄糖定容于100 mL H₂O，过滤除菌。

1M KCl溶液: 7.45 g KCl定容于100 mL H₂O，高压灭菌。

0.45M MnCl ₂ 溶液: 8.9 g MnCl₂.4H₂0定容于100 mL H₂O，高压灭菌。

0.50M CaCl ₂ 溶液: 7.35 g CaCl₂.2H₂0定容于100 mL H₂O，高压灭菌。

0.50M K-MES溶液: 9.76 g MES定容于100 mL H₂O，用KOH 调pH至6.3，过滤除菌，分装成0.5 mL每管，-20℃储存。

DMSO: 分装200 μL新鲜DMSO，-20℃储存。

4、方法

4.1 水稻叶片 RNA提取

RNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司，RNA提取过程按照生产商建议程序进行。

1）将50-100 mg水稻叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μL RL（使用前加入β-巯基乙醇4.5 μL），涡旋剧烈震荡混匀；在56℃孵育1-3 min使水稻组织裂解；

2）将所有溶液转移至过滤柱CS上，12000 rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，洗头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；

3）缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

4）向吸附柱CS3中加入350 μL去蛋白液RW1，12000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

5）DNase I工作液的配置：取10 μL DNase I储存液于RNase-free离心管中，加入70 μL RDD溶液，轻柔混匀；

6）向吸附柱CS3中央加入80 μL的DNase I工作液，室温放置15 min；

7）向吸附柱CR3加入350 μL去蛋白液RW1，12000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CR3放回收集管中；

8）向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW（使用前加入乙醇，12 mL RW原液中加入无水乙醇48 mL）。室温静置2 min，12000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

9）重复步骤8；

10）12000 rpm离心2 min，弃去收集液。将吸附柱CS3置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

11）将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free 离心管，在柱的中央加入30-100 μL洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000 rpm离心2 min，洗脱RNA。RNA样品在-70°C中保存。

4.2 RT-PCR

4.2.1 RT

1）取1 μg总RNA 与1 μL 25 pmol oligo dT 引物混合，用RNase-free ddH₂O补足到12.75 μL，轻轻混匀；

2）65°C 保温5 min，立即转移至冰浴中，放置2 min；

3）加入5×反应缓冲液4 μL，10mM dNTP 2 μL，RNA 抑制剂0.25 μL (40 U/μL)，ReverTra Ace反转录酶1 μL (100U/μL)，42°C 保温30 min，合成第一链cDNA；

4）95°C加热5 min，失活反转录酶，终止合成反应。

4.2.2 PCR

水稻OsZRL基因的克隆

将200 μl EP管放置于冰上，加入以下各种试剂：

5×PrimeStar Buffer 10 μL

dNTP Mixture(各2.5 mM ) 4 μL

RT产物 1 μL

OsZRL-F1 1 μL

OsZRL-R1 1 μL

ddH₂O 32.5 μL

PrimeStar 0.5 μL

按以下程序进行扩增：98℃ 2 min（预变性）；98℃ 10 s（变性），56℃ 10 s（复性），72℃ 80 s（延伸），所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5 min（终延伸）。

以上述PCR产物为模板，以引物OsZRL-F2和OsZRL-R2进行第二轮高保真PCR，复性温度58℃，延伸时间75 s，其它条件同上。

引物序列如下：

OsZRL-F1: 5’- CGTCGGCATAAAGCAGTCTC -3’

OsZRL-R1: 5’- GCTGCTTCACTGCCTTTAGC -3’

OsZRL-F2: 5’- AAGCTTTCGAGCTGAAGTAGGGATGG -3’

OsZRL-R2: 5’- GAGCTCTTGCATTTTGTGTGGGTGTG -3’

通过上述操作，获得了OsZRL基因PCR扩增产物(图1)。

4.3 高保真PCR产物和克隆载体pBLUNT-EASY连接

第二轮高保真PCR产物与克隆载体pBLUNT-EASY按摩尔分子数比2：1连接(25℃，10min)，连接体系如下：

pBLUNT-EASY (50 μg/μl) 1 μL

PCR产物 (～150 μg/μl) 2 μL

4.4 大肠杆菌转化

4.4.1 感受态细胞的制备

1）接种大肠杆菌单菌落于2 mL SOB培养液中，37℃过夜培养；

2）转接0.5 mL过夜培养物至50 mL SOB培养液中，18℃剧烈震荡18～24 h至A₆₀₀≈0.55；

3）将培养液转入50 mL离心管中，冰浴10 min, 4℃ 4000 rpm离心10 min；

4）去上清，加16 mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意：轻轻旋转,不要用振荡器或吹吸混匀)，冰浴10 min，4℃ 4000 rpm离心10 min；

5）去上清，加4 mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280 μl的DMSO，轻柔混匀，冰浴10 min；

6）分装于预冷得1.5 mL EP管中，液氮冻存。

4.4.2 转化

1）从液氮中取出一管感受态细胞冰浴解冻；

2）将10 μL连接产物与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30 min；

3）42℃热冲击90 s，立即冰浴1-2 min；

4）加0.8 mL的SOC，混匀，37℃温和振荡培养1 h；

5）室温13000 rpm离心1 min，倒掉一部分上清液，留约200 μL的上清液，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布LB+Amp(100 μg/mL)平板，37℃培养过夜。

4.5 细胞快速裂解法鉴定重组子

1）挑取单个转化子接种于500 μL含有抗生素Amp(100 μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8；

2）取200 μL菌液至0.5ml EP管中，13000 rpm离心1 min，去上清，留约20 μL上清；

3）加20 μL 2×快速裂解液(0.2 mol/L NaOH 50mL + SDS 0.5g, 蔗糖27.2 g,加双蒸水至200 mL)，剧烈振荡；

4）13000 rpm离心15min；

5）取5 μL上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组载体。

4.6菌落PCR鉴定重组质粒

经过快速裂解法鉴定的重组载体再做菌落PCR以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

10×PCR Buffer 2 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 1.6 μL

菌液 1 μL

OsZRL-F2 0.5 μL

OsZRL-R2 0.5 μL

ddH₂O 14.2 μL

Taq DNA聚合酶 0.2 μL

反应条件：94℃ 3 min（预变性）；94℃ 30 s（变性），58℃ 30 s（复性），72℃ 90 s（延伸），所述变性-复性-延伸26个循环；72℃ 5 min（终延伸）。

对菌落PCR确定的重组载体进行测序。测序结果表明，获得了OsZRL基因全长编码序列。

实施例2：OsZRL基因过表达重组质粒的构建

1、试剂

质粒提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶、T4连接酶购于TaKaRa公司。

其它进口分装、常规试剂与实施例1相同。

2、农杆菌菌株和植物表达载体

用于转基因的农杆菌菌株为EHA105 购自Clontech公司；真核表达载体pHB由重庆大学农学及生命科学研究院提供。

3、培养基

YEB培养基: 酵母提取物 1 g/L，牛肉膏 5 g/L，蛋白陈 5 g/L，蔗糖 5 g/L，MgS0₄.7H₂O 0.5 g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

4、方法

4.1质粒微量提取

提取已测序、连接于pEASY-Blunt克隆载体的OsZRL基因重组质粒，质粒提取过程按照生产商建议程序进行。

1）将带有克隆载体质粒的E. coli DH5α接种于裝有5 mL LB培养液(含有抗生素Amp, 100 μg/mL)的试管中，37°C培养12-16 h；

2）取1.5-5 mL菌液，室温下10000 g离心1 min。尽量吸尽上清。加入250 μL无色溶液RB（含RNase A），漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；

3）加入250 μL 蓝色溶液LB，温和翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮溶液；

4）加入350 μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2 min；

5）15000 g离心5 min，小心吸取上清加入吸附柱中；

6）15000 g离心1 min，弃去收集液；

7）加入650 μL溶液WB，15000 g离心1 min，弃去收集液；

8）15000 g离心2 min，彻底去除残留的WB；

9）将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50 μL EB溶液，室温静置1 min；

10）10000 g离心1 min，洗脱DNA。DNA溶液于-20°C保存。

4.2 DNA片段酶切回收

用限制酶Hind III、Sac I分别双酶切pEASY-Blunt重组质粒和pHB植物表达载体，然后进行胶回收。DNA回收过程按照生产商建议程序进行。

1）切取琼脂糖凝胶中的DNA片段，放入干净的离心管中；

2）加入3倍体积溶液GSB，于55°C水浴6-10 min确保胶块完全融化。当胶块完全融化后，观察溶液颜色，如颜色为紫色，加入适量3 M醋酸钠(pH 5.2)，调整颜色和GSB颜色相同(黄色)；

3）待融化的凝胶溶液降至室温(高温时吸附柱结合DNA能力弱)，加入吸附柱中静置1 min，10000 g离心1 min，弃去收集液；

4）加入650 μL溶液WB，10000 g离心1 min，弃去收集液；

5）10000 g离心2 min，去除残留的WB；

6）将吸附柱开盖静置1 min，使残留乙醇挥发干净，在柱的中央加入60-70°C预热30-50 μL EB溶液，室温静置1 min；

7）10000 g离心1 min，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20°C保存。

4.3 DNA片段酶切回收

对回收片段进行连接、大肠杆菌转化，操作步骤同实施例1中4.4。经酶切鉴定，获得OsZRL基因过量表达重组质粒，命名为pHB-OsZRL (图2、图3)。

4.4 农杆菌感受态细胞的制备

1) 挑取农杆菌单菌落于2 mL的YEB液体培养基(含有Rif 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜；

2) 取过夜培养液500 μL转接于50 m1 YEB(含Rif 50μg/mL)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀= 0.5；

3) 4℃ 5000 rpm离心5 min收集菌体，加l0 ml 0.15 M的NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10 min；

4) 4℃ 5000 rpm离心5 min收集菌体，用l ml预冷的20 mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10 min；

5) 制备好的细胞立即使用，或分装成200 μL/管，液氮中速冻l min, 置-80℃保存备用。

4.5 农杆菌的转化

1）取200 μL感受态细胞，冰上解冻；

2）加l μg pHB-OsZRL重组载体，轻弹混匀，冰浴30 min；

3）液氮中速冻l min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基，28℃慢速振荡培养4 h；

4）将培养物涂布于含50 μg/mLKan和50 μg/mL Rif的YEB平板上，28℃培养约48 h。

4.6 农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于含50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif 的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

鉴定结果表明，获得了用于转基因的OsZRL过表达阳性农杆菌克隆。

实施例3：OsZRL过表达转基因水稻植株的获得

1、试剂

DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司。其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、培养基

常规用组织培养基：

组分 MS基本培养基(g/L) B5基本培养基(g/L) N6基本培养基(g/L)

大量元素

KNO₃1.900000 2.500000 2.830000

NH₄NO₃1.650000 n/a n/a

(NH₄)₂SO₄n/a 0.13400 0.463000

MgSO₄-7H₂O 0.370000 0.250000 0.185000

CaCl₂0.332020 0.113240 0.125330

KH₂PO₄0.170000 n/a 0.400000

NaH₂PO₄-H₂O n/a 0.150000 n/a

微量元素

MnSO₄-H₂O 0.016900 0.010000 0.003330

H₃BO₃0.006200 0.003000 0.001600

ZnSO₄-7H₂O 0.008600 0.002000 0.001500

NaMoO₄-2H₂O 0.000250 0.000250 n/a

CuSO₄0.000025 0.000025 n/a

KI 0.000830 0.000750 0.000800

CoCl-6H₂O 0.000025 0.000025 n/a

铁盐

FeSO₄-7H₂O 0.027800 0.027800 0.027800

Na₂-EDTA 0.037300 0.037300 0.0373000

有机成分

肌醇 0.100000 0.100000 n/a

甘氨酸 0.002000 n/a 0.002000

烟酸 0.000500 0.001000 0.000500

盐酸吡哆醇 0.000500 0.001000 0.000500

盐酸硫胺素 0.000100 0.010000 0.001000

其它

蔗糖 30 20 50

琼脂 8 8 8

pH 5.8 5.5 5.8

(1) 诱导培养基：NB + 2 mg/L 2，4-D，pH 5.8~5.9；(2) 共培养培养基：NB + 2 mg/L 2，4-D + 100 μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.2；(3) 筛选培养基：NB + 2 mg/L 2，4-D + 250 mg/L羧苄青霉素 + 30 ~ 50 mg/L潮霉素，pH 5.8 ~ 5.9；(4) 分化培养基：NB + 10 mg/L KT + 0.4 mg/L NAA + 250 mg/L 羧苄青霉素，pH 5.8~5.9；(5) 生根培养基：1/2 MS，pH 5.8~5.9。

3、方法

3.1 农杆菌介导法转化水稻

3.1.1 胚性愈伤组织的诱导及继代

水稻日本晴成熟种子手工去壳，75%乙醇消毒1 min，25%次氯酸钠溶液中振荡消毒25 min，灭菌蒸馏水再冲洗3次，然后接种到诱导培养基上。27℃暗培养条件下诱导愈伤组织形成，并继代2次。

3.1.2 农杆菌的培养及处理

从－80℃低温冻存管中刮取少量农杆菌阳性克隆菌液，在含有Kan 50mg/L和Rif 50mg/L 的YEB固体培养基划线，然后在28℃暗培养36-72 h活化。取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃培养两天后，悬浮于20 mL含有100 μM/L乙酰丁香酮培养基中，剧烈摇动1 min后，静置1 h。

3.1.3共培养

选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3 mm的颗粒状愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置15 min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃暗培养2 d。

3.1.4 洗除农杆菌

挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1 h，然后置于无菌滤纸上晾干，移至含有潮霉素的筛选培养基。

3.1.5 愈伤组织的筛选

转化愈伤在筛选培养板上生长，每两周转板1次。

3.1.6 抗性愈伤组织的继代与植株的再生

转化愈伤在筛选培养板上生长约三周后即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培养基上，约2周或更长时间后愈伤开始转绿，3周或更长时间后分化出幼苗。将幼苗移至生根培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。

3.2 转基因植株的鉴定

3.2.1 水稻基因组DNA的提取

分别取野生型、转基因植株叶片提取基因组DNA，提取过程按照生产商建议程序进行。

1）取新鲜水稻组织100 mg，加入液氮充分研磨；

2）加入250 μL溶液RB1，振荡混匀，使样品完全悬浮；

3）加入30 μL 10%SDS，15 μL RNase A至裂解液中，充分混匀；

4）55°C水浴孵育15 min；

5）12000 rpm离心15 min，轻轻吸取上清于干净的离心管中；

6）加入100 μL溶液PB1中，充分混匀，冰浴5 min，12000 rpm离心5 min；

7）轻轻吸取上清于干净的离心管中，加入375 μL溶液BB1(使用前加入无水乙醇)，充分混匀；

8）取全部混合液加入吸附柱中，12000 rpm离心30 s，弃去收集液；

9）加入500 μL溶液CB，12000 rpm离心30 s，弃去收集液；

10）加入500 μL溶液WB(使用前加入无水乙醇)，12000 rpm离心30 s，弃去收集液；

11）重复步骤10；

12）12000 rpm离心2 min，彻底去除残留的WB；

13）将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入100 μL预热(60°C)的EB溶液，室温静置1 min，12000 rpm离心1 min，洗脱DNA。DNA溶液于-20°C保存。

3.2.2 阳性转基因植株鉴定

分别以野生型、转基因植株基因组DNA为模板，对水稻潮霉素抗性标记基因(Hpt)进行PCR扩增。

潮霉素抗性基因特异引物为：

HPTF:：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3'

HPTR：5'-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3'

按以下程序进行扩增：94℃ 3 min（预变性）；94℃ 30 s（变性），58℃ 30 s（复性），72℃ 20 s（延伸），所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5 min（终延伸）。

3.2.3转基因植株表型分析

将转基因阳性鉴定植株与同期生长野生型植株进行比较、表型观察。

3.2.4 转基因植株real-time PCR检测

分别取野生型、转基因植株叶片液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1所述。

分别取野生型、转基因植株cDNA，以水稻内参基因（ACTIN）为对照进行实时定量PCR分析。OsZRL基因定量PCR扩增引物为：RTZRLF和RTZRLR；ACTIN基因RT-PCR扩增引物为：RTACTF和RTACTR。引物序列如下：

RTZRLF：5’- GGATGAAGAAGACGATGATGACG -3’

RTZRLR：5’- CGATCCCTCGCTATGTACTTGC -3’

RTACTF：5’-AGTGATTGCACCACCAGAAAGA -3’

RTACTR：5’-CAGGACCAGATTCATCATACTCG -3’

实时定量反应条件：95°C 30 s；95°C 5 s，60°C 20 s，40个循环。扩增后，样品在95°C保持15 s，60°C保持1 min，然后每15 s上升0.5°C进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Applied Biosystems Step-One RT-PCR system上运行。

4、结果

4.1 转基因水稻植株表型观察

经组织培养和抗性筛选获得40株再生水稻植株，其中共有7株转基因小苗因根系不能正常发育。图4A显示OX-1～OX-4转基因植株根系发育不良，植株整体褪绿发白。将OX-1～OX-4植株移入土壤生长约一周后萎蔫死亡(图4B)。OX-5～OX-7持续在封闭培养瓶中培养，虽然有较多幼茎、叶生长，但由于始终只有极少根系发育，影响植株地上部分生长，茎叶褪绿发白，部分开始萎蔫死亡(图4C)。

4.2 转基因植株鉴定

4.2.1 转基因阳性植株鉴定

利用潮霉素抗性标记基因（Hpt）序列对转基因、野生型水稻叶片基因组DNA进行PCR扩增检测。阳性转基因植株扩增出Hpt目标条带(560bp)，而野生型植株未能扩增出目标条带。检测结果显示转基因根系不发育植株(OX-5～OX-7)、根系发育正常植株(OX-8、OX-9)均为阳性转基因植株(图5)。

4.2.2 转基因水稻阳性植株OsZRL基因表达分析

Real-time PCR分析结果显示，OsZRL过表达水稻转基因阳性植株中，3个独立的根系不发育植株(OX-5～OX-7)OsZRL基因较根系发育植株(OX-8、OX-9)及野生型显著提高(图6)。由此表明，OsZRL基因在水稻根系发育中具有负调控作用，其表达量升高将会明显抑制水稻的根系发育。

实施例4：OsZRL基因RNA干涉重组质粒的构建

1、试剂

Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体购于TaKaRa公司，其它试剂与实施例2相同。

2、农杆菌菌株和植物表达载体

与实施例2相同。

3、培养基

与实施例2相同。

4、方法

4.1OsZRL基因片段的获得

4.1.1 PCR

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列起始密码子下游1112bp至1546bp的基因片段设计构建真核重组质粒的引物如下：

ZRLIF1: 5’-CTCGAGGATCCGAATCATACGCTTCGACGAC-3’

ZRLIR1: 5’-AAGCTTCGATCAATCATTAGATGCTGA-3’

ZRLIF2: 5’-GAGCTCGAATCATACGCTTCGACGAC-3’

ZRLIR2: 5’-GAATTCGATCAATCATTAGATGCTGA-3’

以ZRLIF1和ZRLIR1为正向片段扩增引物，以ZRLIF2和ZRLIR2为反向片段扩增引物，按下面的PCR反应体系以及以下程序进行扩增：预变性94°C 4 min，变性94°C 30 s，退火温度58°C 20 s 延伸72°C 20 s，所述变性-复性-延伸30个循环；72°C 10 min（终延伸）。

10×PCR Buffer 2 μL

Mg²⁺(1.5 mM) 1.2 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 0.6 μL

菌液 1 μL

ZRLIF 0.4 μL

ZRLIR 0.4 μL

ddH₂O 13.4 μL

Taq DNA聚合酶 1 μL

4.1.2 目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接

PCR产物与pMD18-T载体连接反应体系如下：

10×ligase Buffer 1 μL

pMD18-T (50 μg/μL) 1 μL

PCR产物 (～150 μg/μL) 3 μL

T4 Ligase (350 U/μL) 1 μL

ddH₂O 4 μL

16°C连接过夜。

4.1.3 连接产物的转化(操作步骤见实施例1中4.4)

4.1.4菌落PCR鉴定重组质粒(操作步骤见实施例1中4.6)

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，将测序结果与基因序列进行比对，确定所扩增片段为目的基因片段。

4.2 pSK中间载体的构建

4.2.1质粒提取、DNA片段酶切回收

将测序正确的正向基因片段和pSK载体，分别提取质粒，然后以 Xho I、Hind III进行双酶切、DNA片段回收，操作步骤见实施例2中4.1、4.2。

4.2.2正向基因片段与pSK载体的连接

将正向基因片段、pSK载体酶切回收产物进行连接，连接反应体系如下：

pSK 7 μL

正向基因片段 10 μL

T4连接酶 1 μL

10×T4连接缓冲液 2 μL

16°C反应12小时后进行转化。转化操作步骤见实施例1中4.4。

4.2.3反向基因片段与已连有正向基因片段的pSK载体的连接

将测序正确的反向基因片段和已连有正向基因片段的pSK载体，以EcoR I、Sac I进行双酶切后分别。将反向基因片段、已连有正向基因片段的pSK载体的酶切回收产物进行连接、转化。

4.3 真核重组质粒的获得

将含有正向基因片段和反向基因片段的pSK中间载体用BamH I、Sac I双酶切，同时将pHB真核表达载体用BamH I、Sac I双酶切后，分别回收、连接，并进行转化。

通过以上操作，获得OsZRL基因RNA干涉真核重组质粒，命名为pHB-OsZRLRi (如图7、图8所示)。

4.4 农杆菌的转化

将pHB-OsZRLRi重组质粒进行农杆菌转化、阳性克隆鉴定，操作步骤同实施例2中4.5、4.6。鉴定结果表明，获得了用于转基因的RNA干涉阳性农杆菌克隆。

实施例5：OsZRL基因RNA干涉转基因水稻植株的获得

1、试剂

与实施例3相同。

2、培养基

与实施例3相同。

3、方法

3.1 农杆菌介导法转化水稻

实验步骤与实施例3中3.1相同。

3.2 转基因植株的鉴定

3.2.1 水稻基因组DNA的提取

分别取野生型、转基因植株叶片提取基因组DNA，实验步骤与实施例3中3.2.1相同。

3.2.2 阳性转基因植株鉴定

分别以野生型、转基因植株基因组DNA为模板，对水稻潮霉素抗性标记基因(Hpt)进行PCR扩增。实验步骤与实施例3中3.2.1相同。

3.2.3转基因植株表型分析

3.2.4 转基因植株RT-PCR检测

分别提取野生型、转基因水稻植株叶片的RNA、反转录(操作步骤如实施例1所述)，进行RT-PCR分析，同时以水稻内参基因（ACTIN）做为对照。

OsZRL基因RT-PCR扩增引物为：

ZRLIF：5’ -GAATCATACGCTTCGACGAC-3’

ZRLIR：5’-CGATCAATCATTAGATGCTGA-3’

按以下程序进行扩增：94°C 4 min（预变性）；94°C 30 s（变性），58°C 20s（复性），72°C 20 s（延伸），所述变性-复性-延伸27个循环；72°C 10 min（终延伸）。

ACTIN基因RT-PCR扩增引物为：

ACTF：5’-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'

ACTR：5'-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3'

按以下程序进行扩增：94°C 5 min（预变性）；94°C 30 s（变性），59°C 30 s（复性），72°C 20 s（延伸），所述变性-复性-延伸27个循环；72°C 10 min（终延伸）。

4、结果

4.1 转基因水稻植株表型观察

经组织培养和抗性筛选获得15个独立的再生水稻植株。与野生型植株相比，OsZRL基因RNA干涉下调转基因植株根系发达，茎杆、植株粗壮。图9显示转基因植株(Ri-1)的生长情况。

4.2 转基因植株鉴定

4.2.1 转基因阳性植株鉴定

利用潮霉素抗性标记基因（Hpt）序列对转基因、野生型水稻叶片基因组DNA进行PCR扩增检测。阳性转基因植株扩增出Hpt目标条带(560bp)，而野生型植株未能扩增出目标条带(图10)。

4.2.2 转基因水稻阳性植株OsZRL基因表达分析

RT-PCR分析结果显示，在3个根系发达，茎杆、植株粗壮的独立转基因植株(Ri-1～Ri-3)中，OsZRL基因表达量较野生型显著降低(图11)。

<110> 重庆大学

<120> 一种控制水稻根系发育的基因OsZRL

<160> 2

<170> PatentIn Version 3.2

<210> 1

<211> 1799

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> mRNA

<222> (1)…(1799)

<223> 一种控制水稻根系发育的基因

<400> 1

aatctctctt ccatctctct ctttcttcca gaccgtggca tgcacggctt gacacagacg 60

ctctcgtacg tcgtcgtcgt cgccgtcgtc ctcctcgtcg gcataaagca gtctccactg 120

caaaccagct agctgtagct ctcaattcgt aggtgagatc gacgcgcatc gcgccgcgtc 180

tacgtttgta tatagagggg gagagaggat cggaggagcc gatcgagctg aagtagggat 240

ggtgctgagg gcgtgcacaa tggtggaggg gtcatctttc gtcgtcggcg gcggcggcgg 300

cgtgccgttc ttcgagtggc tcaagccgcg gtcctcgccg ccgccgtcgc cgtcctcctc 360

gtcgacgact acgacgtcat cgtccctcac cgcccaacga caaccgcgtg gtgctggtac 420

catgctgtgc ttgcctcttc ttggcaggct cggagaggag cccgttgatg ctgacgatgg 480

cggggcgatg aacaatcctc ctgtcaagga agaggtgagc aatactacag acgactatgc 540

cggtgttgat ctcaacatcg gcttgccggc gacgaccggc gggggtagct ctgaagatgc 600

gcccatggat gaggatgaag aagacgatga tgacgacgag gaggaggaga cggaggatga 660

tgaggagaaa gcagctgggc ttgaggggtg caaggtggag gagaaagaaa gagagcaagt 720

acatagcgag ggatcgaagt attacgtgtc cgtgggagga ggggaagatc agagcagcaa 780

cgccggcgat gtcgacgccg gcgccgcctg ccgtggccgg cggtattgga tcccgacgcc 840

ggcgcagata ctcatcggcc cggtgcagtt cgtctgccat gtctgcaaca aggccttcaa 900

tcgatacaac aacatgcaga tgcacatgtg ggggcacggt cgggagtaca ggaaggggcc 960

ggagtcgctc aaggggacgc aggcgacggc gacgctggcg atgctgaagc tgccgtgtta 1020

ctgctgcgcc gccggctgcc ggaacaacgt cggccacccg cgtgcgcggc cgctcaagga 1080

cttccgcacg ctgcagacgc actacaagcg caagcacggc gccaagccct tcgcctgccg 1140

ccgctgcgcc aagccgttcg ccgtcaaggg cgactggcgc acccacgaga agaactgcgg 1200

caagcgctgg ttctgcgcct gcggctccga cttcaagcac aagcgctccc tcaacgacca 1260

cgtccgctcc ttcggcggcg gccacttccc cgtcgccgcc gccgccgccg ccgcacatgc 1320

ggcggcggcg ccgcccaagc agcagcagcg aatcatacgc ttcgacgacg caatggcgca 1380

aatgcatggc ggcggattaa tgaactaaca gtgttaattg ttcttgatcg ttagctagct 1440

atagctaatt gcatgtacac ttccccctta gtttacacac acacacacac ccacacaaaa 1500

tgcaataaga ttatggagct aggttgccga ggagaagcta aaggcagtga agcagctgaa 1560

ttttcttctg gatgatgacc ggagtttgca tgcaatcggg ggactgactg atcacataag 1620

gtttgttagt tacccgtagc ttggtaattt gcaaggaaga aaatttgtca gcttcacagc 1680

ctaatgctgg tttggcagcc aaatgtatca atgtatcact cgtgcatgac ttaattttaa 1740

gaagatctgt taattaatca gttgtcagca tctaatgatt gatcgttgct gttttttgc 1799

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<223> 一种控制水稻根系发育的多肽

<400> 2

MET Val Leu Arg Ala Cys Thr MET Val Glu Gly Ser Ser Phe Val

1 5 10 15

Val Gly Gly Gly Gly Gly Val Pro Phe Phe Glu Trp Leu Lys Pro

20 25 30

Arg Ser Ser Pro Pro Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr

35 40 45

Thr Ser Ser Ser Leu Thr Ala Gln Arg Gln Pro Arg Gly Ala Gly

50 55 60

Thr MET Leu Cys Leu Pro Leu Leu Gly Arg Leu Gly Glu Glu Pro

65 70 75

Val Asp Ala Asp Asp Gly Gly Ala MET Asn Asn Pro Pro Val Lys

80 85 90

Glu Glu Val Ser Asn Thr Thr Asp Asp Tyr Ala Gly Val Asp Leu

95 100 105

Asn Ile Gly Leu Pro Ala Thr Thr Gly Gly Gly Ser Ser Glu Asp

110 115 120

Ala Pro MET Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu

125 130 135

Glu Glu Thr Glu Asp Asp Glu Glu Lys Ala Ala Gly Leu Glu Gly

140 145 150

Cys Lys Val Glu Glu Lys Glu Arg Glu Gln Val His Ser Glu Gly

155 160 165

Ser Lys Tyr Tyr Val Ser Val Gly Gly Gly Glu Asp Gln Ser Ser

170 175 180

Asn Ala Gly Asp Val Asp Ala Gly Ala Ala Cys Arg Gly Arg Arg

185 190 195

Tyr Trp Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ile Leu Ile Gly Pro Val Gln

200 205 210

Phe Val Cys His Val Cys Asn Lys Ala Phe Asn Arg Tyr Asn Asn

215 220 225

MET Gln MET His MET Trp Gly His Gly Arg Glu Tyr Arg Lys Gly

230 235 240

Pro Glu Ser Leu Lys Gly Thr Gln Ala Thr Ala Thr Leu Ala MET

245 250 255

Leu Lys Leu Pro Cys Tyr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Arg Asn Asn

260 265 270

Val Gly His Pro Arg Ala Arg Pro Leu Lys Asp Phe Arg Thr Leu

275 280 285

Gln Thr His Tyr Lys Arg Lys His Gly Ala Lys Pro Phe Ala Cys

290 295 300

Arg Arg Cys Ala Lys Pro Phe Ala Val Lys Gly Asp Trp Arg Thr

305 310 315

His Glu Lys Asn Cys Gly Lys Arg Trp Phe Cys Ala Cys Gly Ser

320 325 330

Asp Phe Lys His Lys Arg Ser Leu Asn Asp His Val Arg Ser Phe

335 340 345

Gly Gly Gly His Phe Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala His

350 355 360

Ala Ala Ala Ala Pro Pro Lys Gln Gln Gln Arg Ile Ile Arg Phe

365 370 375

Asp Asp Ala MET Ala Gln MET His Gly Gly Gly Leu MET Asn

380 385

Claims

1.一种控制水稻根系发育的基因OsZRL，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，其编码序列在第211-233位氨基酸有一个C2H2型锌指(zinc-finger)结构域，第298-320位氨基酸有一个C2HC型锌指结构域；命名为OsZRL(Oryza sativa Zinc-finger Rootless)。

2.一种OsZRL基因的过表达真核重组质粒，其特征在于，是将SEQ ID NO：1所述基因全长编码序列插入到真核表达载体中获得。

3.根据权利要求2所述OsZRL基因的过表达真核重组质粒，其特征在于，所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303中的一种。

4.一种OsZRL基因的RNA干涉真核重组质粒，其特征在于，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游1112bp至1546bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列。

5.如权利要求4所述OsZRL基因的RNA干涉真核重组质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求4所述OsZRL基因的RNA干涉真核重组质粒，其特征在于，所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303中的一种。

7.一种影响水稻根系发育的方法，其特征在于，将权利要求2或4所述真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。

8.权利要求1所述控制水稻根系发育的基因，在水稻根系发育和性状改良中的应用。