CN103276012A

CN103276012A - 水稻基因ORYsa;SIZ1的基因工程应用

Info

Publication number: CN103276012A
Application number: CN2013102051713A
Authority: CN
Inventors: 孙淑斌; 徐国华; 王化敦
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103276012B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及水稻基因ORYsa;SIZ1的基因工程应用。本发明将ＳUMO化E3连接酶ORYsa;SIZ1转入水稻中，发现ORYsa;SIZ1具有提高水稻磷素吸收利用和促进水稻磷酸盐从营养器官向繁殖器官转运的功能，首次提出水稻基因ORYsa;SIZ1提高水稻磷素吸收利用的工程应用，及其在促进提高水稻磷酸盐从营养器官向繁殖器官转运方面的应用。

Description

水稻基因ORYsa;SIZ1的基因工程应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及水稻基因ORYsa;SIZ1的基因工程应用。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，我国水稻种植面积占全球谷类作物种植面积的1/3，水稻产量占全国粮食总产的50%，是保证我国粮食安全的最重要作物(胡培松等,2002)。

磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一。它不仅涉及到生物膜及核酸的合成，同时在能量代谢和酶的调控上扮演重要的角色。由于磷素（PO43-、HPO42-、H2PO4-）在酸性与碱性土壤中的强烈固定作用，使得饱和的土壤溶液中可溶性磷的含量很低（小于10μM）（Bieleski,R.L.Phosphate pools,phosphate transport and phosphate availability.Annu.Rev.PlantPhysiol.1973,24,225-252），远远满足不了植物的生长需要，使其成为植物生长的一大限制性因子。因此植物能否高效利用土壤中少量的可溶性磷对植物生长有着至关重要的影响。

另外，植物体的生长过程分为营养生长和繁殖生长两个时期。营养生长时期，根系吸收的氮、磷除了满足自身各种生命活动的需要，在液泡中积累形成库；繁殖生长时期，在叶片、茎秆中积累的磷向繁殖器官转移，形成新的源和库(Marschner,1995)。磷元素在体内的再分配受严格的时空调控，而且随着人们生活水平的提高，稻米的营养品质日益受到关注。

研究如何提高磷的利用效率、如何改良磷生长后期向籽粒中的转运与再分配对于促进水稻生长发育、提高产量改善品质具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供水稻基因ORYsa;SIZ1的基因工程应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在提高磷素吸收利用中的应用，其中所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在NCBI网站登录号为Os05g0125000。

水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在提高水稻磷素从营养器官向繁育器官转运方面应用，其中所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在NCBI网站登录号为Os05g0125000。

水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在开发水稻稻米品质的应用，其中所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在NCBI网站登录号为Os05g0125000。

水稻ORYsa;SIZ1的SUMO化E3连接酶的工程应用，其中所述的水稻ORYsa;SIZ1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1的表达载体，其特征在于将NCBI网站登录号为Os05g0125000的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1插入双元表达载体pTCK303所得。

所述的表达载体在提高磷素吸收利用中的应用。

所述的表达载体在提高水稻磷素从营养器官向繁育器官转运方面应用。

所述的表达载体在开发水稻稻米品质的应用。

有益效果：

本发明将ＳUMO化E3连接酶ORYsa;SIZ1转入水稻中，发现ORYsa;SIZ1具有提高水稻磷素吸收利用和促进水稻磷酸盐从营养器官向繁殖器官转运的功能，首次提出水稻基因ORYsa;SIZ1提高水稻磷素吸收利用的工程应用，及其在促进提高水稻磷酸盐从营养器官向繁殖器官转运方面的应用。

本发明首次提供了水稻基因ORYsa;SIZ1作为目的基因导入植物，有望应用于单子叶植物的遗传改良。本发明提供的ORYsa;SIZ1基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

附图说明

图1：水稻基因ORYsa;SIZ1在正常供磷和低磷条件下表达模式。

其中：+Pi表示正常供磷（300μmol/L）处理，-Pi表示低磷（15μmol/L）处理，OsActin为内参基因。

图2：ORYsa;SIZ1突变纯合体鉴定

图3：ORYsa;SIZ1突变体沉默效果鉴定

OsSIZ1突变体沉默效果鉴定。数字代表购买的水稻材料单株编号，“WT”为野生型对照。1、3、26为纯合体，2、22、23、24、25为杂合体，27为野生型

图4：突变体拷贝数鉴定

1：阳性对照（质粒），2：marker，3：突变体，4：突变体

图5：突变体表型差异

图6：在缺磷条件下，生长21天的ORYsa;SIZ1基因超表达植株的根、茎、老叶和新叶中的有效磷含量。

其中，WT代表野生型水稻，Oe1和Oe2分别代表ORYsa;SIZ1超表达株系。

图7：ORYsa;SIZ1基因超表达转基因材料在生长后期全磷含量。

其中，WT代表野生型水稻，Oe1代表ORYsa;SIZ1超表达株系。

图8pTCK303质粒图谱。

具体实施方式

实施例1基因序列的获得

申请人在NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）上输入ORYsa;SIZ1得到基因序列号为Os05g0125000的一段编码SUMO化E3连接酶基因的DNA序列。分析表明该基因序列全长11525bp，mRNA（SEQ ID NO.1）全长3371bp，开放阅读框ORF为2628bp，编码875个氨基酸（SEQ ID NO.2）。该基因有17个外显子、16个内含子。

实施例2ORYsa;SIZ1基因的表达模式鉴定

1、总RNA的提取和转录合成cDNA第一链

选用水稻品种东粳，待水稻幼苗长至10天后，分别进行正常供磷（300μM KH₂PO₄）和低磷（10μM KH₂PO₄）处理，3周后采集叶片和根部，分别采用TriZol试剂抽提总RNA，用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模版，经过逆转录获得水稻cDNA第一链，供后续的实验使用。cDNA第一链的合成步骤：用DEPC水处理过的PCR管（300μl），加入总RNA5μg，oligodT1μL（25ng/μL），dNTP（10mmoL/L）2μL，65℃水浴5min，迅速置于冰上冷却，加5×反应缓冲液4μL，M-MLV逆转录酶（200U/μL）1μL,RNase抑制剂0.5μL，DEPC水至总体积为20μL（以上均在冰上操作）。稍离心后置于42℃水浴1h，70℃水浴10min，然后置于冰上迅速冷却。所得产物即为cDNAs，置于-20℃保存。

2、ORYsa;SIZ1基因的表达模式鉴定

以步骤1获得的东粳cDNA为模板，根据水稻ORYsa;SIZ1基因的编码序列，设计以下ORYsa;SIZ1基因特异引物P1、P2扩增长度为301bp片段长度鉴定ORYsa;OsSIZ1基因的表达模式。

P1AACATAATGCCACAGACG （SEQ ID NO.3）

P2AAAGAGCAGGAGTTACCG （SEQ ID NO.4）

PCR具体步骤为：以步骤1获得的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR反应体系为20μl：2×PCR mix10μl，正向和反向引物各0.5μl，模板1μl，双蒸水8μl；PCR程序如下：94℃预变性1分钟，94℃变性30s,56℃复性30s，72℃延伸0.5min，28个循环后，72℃5min。PCR产物经凝胶电泳鉴定ORYsa;SIZ1基因的时空表达模式，结果见图1。委托上海英俊公司测序确定序列为ORYsa;SIZ1片段。

由图1可以看出，ORYsa;SIZ1基因在低磷与正常供磷处理条件下，根部和地上部均表达强烈，地上部表达量高于地下部。

3、ORYsa;SIZ1突变体鉴定

根据ORYsa;SIZ1基因序列，从韩国突变体库（http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE）搜索购买到两个编号分别为PFG_3A-02154.L和PFG_3A-02154.R的水稻材料。该材料可能为ORYsa;SIZ1突变株系，但要获得突变纯合体需要进一步鉴定。我们采用两轮PCR方法对其突变纯合体进行鉴定（Huadun Wang，Kousar Makeen，Yan Yan，Yue Cao，Shubin Sun，GuohuaXu.OsSIZ1Regulates the Vegetative Growth and Reproductive Development in Rice.PlantMol Biol Rep2011,29:411-417）。

根据ORYsa;SIZ1基因序列设计以下两对PCR引物，对上述材料水培苗进行两轮PCR鉴定。

P3TCACCAAAGGTTAGCAGCAAC （SEQ ID NO.5）

P4TCTCTCAATTTTGGCCAAGC （SEQ ID NO.6）

P5ACGTCCGCAATGTGTTATTAA （SEQ ID NO.7）

P6AACGCTGATCAATTCCACAG （SEQ ID NO.8）

提取水稻材料PFG_3A-02154.L和PFG_3A-02154.R的总RNA，并转录合成cDNA，用作PCR的模板。PCR反应体系为20μl：2×PCR mix10μl，正向和反向引物各0.5μl，模板1μl，双蒸水8μl；PCR程序如下：94℃预变性1分钟，94℃变性30s,56℃复性1min，72℃延伸0.5min，30个循环后，72℃5min。PCR产物经凝胶电泳成像。如附图2所示，我们鉴定出了纯合体、杂合体。

使用根据ORYsa;SIZ1mRNA序列设计的基因特异性引物P1、P2分别对采用RT-PCR对纯合体和杂合体进行沉默效果鉴定。PCR反应体系为20μl：2×PCR mix10μl，正向和反向引物各0.5μl，模板（纯合体或杂合体的cDNA）1μl，双蒸水8μl；PCR程序如下：94℃预变性1分钟，94℃变性30s,56℃复性1min，72℃延伸30s，28个循环后，72℃5min。PCR产物经凝胶电泳成像。如附图3所示，纯合体1、3、26中该基因没有表达，完全沉默。而杂合体2、22、23、24、25中该基因表达正常，没有沉默。27为野生型。

为了鉴定突变纯合体里有几个T-DNA插入，我们根据Roche公司southern试剂盒说明书进行southern杂交。结果如附图4所示。两个纯合体株系各单株均为单拷贝。至此，获得完全沉默且只有一个拷贝数的两个纯合体株系。

ORYsa;SIZ1基因突变体表型明显。如图5所示，植株矮小，结实率低。

实施例3利用Ubi启动子+编码区转基因水稻植株研究ORYsa;SIZ1的应用前景

1、超表达载体的构建

根据水稻基因ORYsa;SIZ1的cDNA序列，设计引物扩增ORYsa;SIZ1的编码区。

提取水稻日本晴品种总RNA，反转录合成cDNA，用作PCR的模板（RT-PCR）扩增ORYsa;SIZ1编码区1626bp。所用引物为P7，P8。

P7ATCAAGATCTAAAGTGGGTTGCGGTTTGCTG （SEQ ID NO.9）

P8CGCTCTAGAAAGCCTCGATACCCAGTTAGA （SEQ ID NO.10）

PCR产物克隆至pUC18T载体(Takara公司)，测序正确后通过相应的Sac I和Spe I酶切位点导入双元表达载体pTCK303,（Wang Z,Chen CHB,Xu YY,Jiang RX,Han Y,Xu ZHH,Chong K.A practical vector for efficient knockdown of gene expression in rice.PlantMolecular Biology Reporter.200422:409-417图8），然后转化至农杆菌EHA105（天恩泽基因科技有限公司）中。

2、超表达转基因植株的获得和功能鉴定

转入表达载体的农杆菌，侵染转化水稻（采用根癌农杆菌介导方法将构建的表达载体转入水稻日本晴品种）。诱导水稻成熟胚愈伤。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可，不停的摇动）；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；愈伤组织置于共培养基上，28℃暗培养2.5天。然后愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素（Car）和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行筛选。挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中，放入恒温培养室分化成苗。再放入生根培养基中壮苗一到两周，即获得转基因植株。

对获得的转基因植株进行检测后，取ORYsa;SIZ1超表达转基因植株在缺磷（10μM）条件下培养生长三周后，分别取根、茎、老叶和新叶各0.5g，测定样品的有效磷含量。成熟期分别测定穗柄，穗，籽粒等繁育器官的磷含量。操作步骤如下：⑴取0.5克鲜样用液氮研磨成粉末，在4℃放置(冰上或者冰箱)至样品冻融，加入1ml10%(w/v)的高氯酸（PCA）研磨均匀。⑵匀浆液用5%(w/v)的高氯酸（PCA）稀释10倍，于冰上放置30分钟。⑶于4℃，10000g离心10分钟，上清液用于有效磷含量的测定（钼蓝法）。⑷取2ml工作溶液与1ml样品上清液混合，于40℃温育20分钟。⑸反应液在冰上冷却后，于820nm可见光波长下测定吸收值。如样品浓度过高，应适当稀释，使其OD值落在标线的线性范围内。计算获得各个部位的磷含量。实验结果显示，与野生型相比转基因植株根部磷酸盐吸收为野生型的2倍，地上部分茎、老叶和新叶中有效磷含量也达到了野生型部位的1.5-2倍，显著提高了磷素的利用（图6）。同时也大大提高植物磷素向繁殖器官的转运。与野生型相比，种壳、瘪壳和米粒中的全磷含量分别增加了52%、20%和17%（图7）。

综上所述，本发明人提供的ORYsa;SIZ1的工程应用为水稻中首次报道。ORYsa;SIZ1可作为目的基因导入植物，提高植物磷素利用效率和磷素向繁殖器官的转运效率，为培育高磷素吸收及其体内磷素高效再分配的水稻新品种提供了保障。

为了简单起见，本发明中ORYsa;SIZ1有时标注为OsSIZ1。

Claims

1.水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在提高磷素吸收利用中的应用，其中所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在NCBI网站登录号为Os05g0125000。

2.水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在提高水稻磷素从营养器官向繁育器官转运方面应用，其中所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在NCBI网站登录号为Os05g0125000。

3.水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在开发水稻稻米品质的应用，其中所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1在NCBI网站登录号为Os05g0125000。

4.水稻ORYsa;SIZ1的SUMO化E3连接酶的工程应用，其中所述的水稻ORYsa;SIZ1的SUMO化E3连接酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

5.含有所述的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1的表达载体，其特征在于将NCBI网站登录号为Os05g0125000的水稻SUMO化E3连接酶基因ORYsa;SIZ1插入双元表达载体pTCK303所得。

6.权利要求5所述的表达载体在提高磷素吸收利用中的应用。

7.权利要求5所述的表达载体在提高水稻磷素从营养器官向繁育器官转运方面应用。

8.权利要求5所述的表达载体在开发水稻稻米品质的应用。