CN103088056A - 基因phyb在控制水稻低温胁迫耐性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因PHYB在控制水稻低温胁迫耐性中的应用。本发明将水稻PHYB基因的全长编码区反向连接在pIG121Hm-8上，构建成反义植物表达载体；或者利用PHYB基因编码区的部分特异性序列构建RNAi植物表达载体，再将反义植物表达载体或RNAi植物表达载体至分别转化至水稻中，抑制水稻内源PHYB基因的表达，得到水稻PHYB基因表达受到抑制的转基因植株，发现阳性转基因水稻植株的低温胁迫耐性明显高于对照植株。本发明进一步利用荧光定量分析结果表明：PHYB基因表达水平降低导致OsDREB1家族基因表达水平的升高，从而使PHYB反义转基因株系或者RNAi转基因水稻株系具有较强低温胁迫耐性。

Description

基因PHYB在控制水稻低温胁迫耐性中的应用

技术领域

本发明涉及农业科学领域，具体而言，本发明涉及通过降低水稻PHYB基因的表达来提高水稻低温胁迫耐性。

背景技术

水稻是我国播种面积最大、总产量最多、单产最高的粮食品种，是我国65%左右人口的主食，在粮食生产和消费中处于主导地位。水稻是一种低温敏感植物，在生长发育的早期阶段和开花期特别容易受低温伤害(de Los Reyes et al.,Methods Mol Biol,2013,956:227-241)，全世界每年有1500万hm²以上的稻作受到低温威胁。我国稻谷生产地区都受到程度不同的低温冷害危害：长江中下游及华南地区的水稻容易受“倒春寒”的危害而造成早稻烂种、烂秧，并且“寒露风”影响晚稻的抽穗与结实；东北地区的水稻平均3～4年中有1年遭受低温冷害，我国每年因冷害损失稻谷30～50亿kg，全国灾年每年要损失稻谷50～100亿kg(刘永巍，北方水稻2011，41(4):75-77)。目前我国水稻南方种植面积已经趋于饱和，传统水稻主产区的南方区、长江中下游区水稻播种面积减少较多，产量上升空间不大，而东北区水稻播种面积则出现较大幅度的增长(钟甫宁和刘顺飞,中国农村经济,2007,9:39-44)，提高水稻耐冷性，可以进一步往北扩大水稻种植面积。另外提高水稻苗期耐冷性可以提前水稻种植时间，提前水稻收割时间，避免后期低温对水稻影响。因此研究提高水稻的耐冷性是保持水稻持续高产、稳产，扩大水稻的种植面积的重要保障。

温带植物可以通过冷锻炼而耐受零度以下的寒害，热带亚热带植物只能耐受冷害(PearcePlant Growth Regul,1999,29(1-2):47-76)。当植物遭遇寒冷环境时，通过活性氧（ROS）调节信号途径、钙离子信号途径等信号转导进而激活许多寒冷胁迫应答基因的表达，在植物体内产生大量的特异蛋白，协同调节植物生理生化以及代谢的变化，从而提高植物对寒冷的耐性(Cheng et al.,BMC Genomics,2007,8:175;Yang et al.,2010,J Biol Chem,285(10):7119-7126;Yun et al.,BMC Plant Biol,2010,10:16;Knight and Knight,New Phytol,2012,195(4):737-751.)冷胁迫诱导的1000多个应答基因中170个是转录因子，其中CRT/DRE-binding factor(CBF，也称为DREB)基因在这个调控网络中起到重要的枢纽作用(Thomashow,Plant Physiol,2010,154(2):571-577)。研究显示DREB受到多重调控：DREB基因的启动子区域具有多拷贝的MYC蛋白识别序列，可被ICE1、ICE2(MYC类蛋白)正调控，ICE1是HOS1泛素化目标蛋白，在正常生长条件下ICE1被HOS1（一个E3连接酶）泛素化而降解，从而诱导CBF/DREB表达进而避免引起下游耐冷基因的表达（Park et al.,J Plant Biol,2011,54:275-285），而SIZ1（SUMO-E3连接酶）可以阻止ICE1的泛素化，导致低温响应的CBFs表达量增加（Miura et al.,Plant Cell,2007,19(4):1403-1414）；在拟南芥中MYB15负调控DREBs（Agarwal et al.,J BiolChem,2006,281:37636-37645）。近几年来，多个报道表明昼夜节律调控因子MYB、LATEELONGATED HYPOCOTYL(LHY)和CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1(CCA1)调节DREB的表达而参与植物的耐冷调节(Dong and Thomashow,Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(17):7241-7246;Lee et al.,Proc Natl Acad Sci USA，2012,109(37):15054-15059)。

光敏色素（phytochrome,phy）是植物体内的一种重要光受体，主要感受红光和远红光，参与调节植物生命循环中多个重要发育过程（Bae and Choi,Annu Rev Plant Biol,2008,59:281-311）。高等植物的光敏色素由一个小基因家族编码，在拟南芥中光敏色素基因家族由5个成员(PHYA-PHYE)组成（Sharrock and Quail,Genes Dev，1989,3:1745-1757；Clack et al.,Plant Mol Biol,1994,25:413–427.）。水稻光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB和PHYC(Kay et al.,Nucleic Acids Res,1989,17:2865–2866；Dehesh et al.,Mol Gen Genet,1991,225:305–313）。图位克隆和全基因组序列检索显示，PHYA、PHYB和PHYC位于水稻的第3染色体，其中PHYB基因位于短臂，在基因组中以单拷贝形式存在。Takano等人的研究表明水稻PHYB感受红光调节水稻幼苗去黄花、幼苗叶片与叶鞘之间的角度和花期等水稻的生长发育（Takano et al.,Plant Cell,2005,17:3311–3325）。

发明内容

本发明在水稻日本晴中，通过不同方法降低编码水稻光敏色素B的PHYB基因的表达水平，显著提高了水稻耐冷性。这为耐低温水稻品种的培育提供新的途径，具有一定的经济意义。

本发明提供了基因PHYB在控制水稻低温胁迫耐性中的应用，具体是在水稻中利用反义技术或RNAi技术降低PHYB基因的表达后，发现PHYB基因表达水平降低的转基因阳性水稻植株耐冷性提高。在低温条件下，对照材料的存活率为百分之五至百分之十，而转基因水稻幼苗的存活率为百分之九十以上，均明显高于对照。

本发明是这样实现的：

本发明通过两种方法降低PHYB基因的表达水平，一是利用水稻PHYB基因的cDNA片段作为应用基因，将该基因反向转入水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表达；二是利用水稻PHYB基因cDNA的特异片段，构建相应的RNAi（RNA interference）植物表达载体，转化水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表达。通过这两种方法获得转基因水稻植株均表现出较强的低温胁迫耐性。

水稻PHYB基因的mRNA序列可以在NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）（序列号为AB109892）上获得。本发明是通过PCR方法，扩增出水稻PHYB基因的全长编码区，包含3516个碱基，反向连接在植物表达载体pIG121Hm-8上，构建成反义植物表达载体；或者利用PHYB基因编码区的部分特异性序列构建RNAi植物表达载体。再利用农杆菌介导的遗传转化方法将反义植物表达载体或RNAi植物表达载体至分别转化至水稻品种日本晴中，抑制水稻内源PHYB基因的表达，得到水稻PHYB基因表达受到抑制的转基因植株。在转基因的T3代植株中发现，阳性水稻植株的低温胁迫耐性明显高于对照植株。

本发明用于构建反义PHYB基因植物表达载体、能够抑制内源PHYB基因表达的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明进一步利用荧光定量分析结果表明：PHYB基因表达水平降低导致OsDREB1家族基因表达水平的升高，从而使PHYB反义转基因株系或者RNAi转基因水稻株系具有较强低温胁迫耐性。

本发明的优点在于：

（1）本发明在水稻品种日本晴中，利用反义技术或者RNAi技术抑制水稻PHYB基因表达后，发现转基因阳性植株的低温胁迫耐性明显提高。在同样条件下低温处理后，发现90%以上转基因阳性植株能够恢复正常生长，而对应的野生型植株仅仅5%-10%恢复正常生长。

（2）本发明中所涉及的抑制PHYB基因的表达方法，除了反义技术或者RNAi技术外，还可以通过下面一种或多种途径实现：物理诱变、化学诱变、T-DNA插入、转座子插入等。因此通过降低PHYB基因的表达培育耐冷性水稻新品种具有较为广泛的应用空间。同时本发明也为利用水稻PHYB同源基因培育其它作物（如玉米）的耐冷性品种提供支持。

（3）本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物耐寒性研究提供支持。

附图说明

图1为本发明中反义PHYB基因表达载体的结构示意图。

具体为：把pIG121Hm植物表达载体上的SacI位点替换成KpnI酶切位点，构建成pIG121Hm-8植物表达载体。将克隆在pMD18-T载体上的PHYB基因利用KpnI和XbaI酶切，替换pIG121Hm-8植物表达载体上KpnI和XbaI之间的DNA片段，这样PHYB基因反向插入35S启动子后，即pIG121Hm-anti-PHYB植物表达载体。

图2为本发明中PHYB基因RNAi植物表达载体的构建示意图。

A为RNAi植物表达载体构建过程中的中间载体的结构示意图，其中，RNAi代表用于构建PHYB基因RNAi植物表达载体的特异性DNA序列；Pubq是玉米泛素基因的启动区。B为PHYB基因RNAi植物表达载体流程图。

图3为用Western blot检测T3代转基因阳性植株中PHYB蛋白质的表达水平结果图。

其中RNAi代表RNAi植物表达载体的转基因水稻株系，Anti代表反义植物表达载体的转基因水稻株系，WT代表野生型水稻植株。

图4为转反义PHYB基因植株和野生型植株的低温胁迫耐性比较图。A为野生型和反义转基因株系在低温下培养7天时的表型图；B为野生型和反义转基因株系在低温下培养14天时的存活百分比。其中Anti表示转反义PHYB基因的植株，WT代表野生型水稻植株。

图5为PHYB基因的RNAi转基因水稻和野生型植株的低温胁迫耐性比较图。

A为野生型和RNAi转基因植株6天幼苗在2-4°C下生长3天后的表型；B为三叶期野生型和RNAi转基因株系在低温（8±1°C）下生长3天后的表型；C为五叶期野生型和RNAi转基因株系在低温（8±1°C）下生长5天后，而后在正常温度（28°C）下继续培养5天后的表型。其中RNAi表示转RNAi转基因水稻植株，WT代表野生型水稻植株。

图6为水稻OsDREB1基因家族基因在低温处理不同时间的野生型和PHYB RNAi转基因水稻植株中的表达模式。

三叶期的野生型和PHYB基因的RNAi转基因株系在4°C中处理0、1、4、12和24小时，取材，利用荧光定量PCR分析水稻OsDREB1家族基因的表达水平。其中RNAi表示PHYB基因的RNAi转基因植株，WT代表野生型水稻植株。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆用于构建反义PHYB基因植物表达载体和RNAi植物表达载体的DNA片段，以及验证功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。

实施例1：分离克隆用于构建反义PHYB基因植物表达载体的DNA片段

采用TRIZOL试剂（Invitrogen）从水稻品种日本晴（公开报道的一个品种）的叶片中提取总RNA。具体步骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol（Invirogen）颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75%乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水（一般为60μl）溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。

利用反转录酶SuperScript II（Invitrogen）将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加入1μl500μg/ml oligo（dT）12-18、2μg总RNA、1μl10mM dNTP混合物和DEPC水至12μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心，收集样品于管底。然后依次加入4μl5×第一链缓冲液、2μl0.1M DTT和1μl RNaseOUT（40U/μl），42℃，2分钟。然后加入1μlSuperScript II，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，70℃水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。用带有酶切位点的上游引物PHYBF1（5’-ATG GTACCATGG CCT CGG GTAGCC-3’（SEQ ID NO：3），序列特异引物外加KpnI位点和两个保护碱基)和下游引物PHYBR1（5’-ATT CTA GAT CAG CTT GTC CCC CTA C-3’（SEQ ID NO：4），序列特异引物外加XbaI位点和两个保护碱基）。利用PrimerSTAR HS DNApolymerase with GC buffer（TaKaRa）进行扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性1min；98℃10min,68℃4min,30个循环。利用TArget Clone^TM-Plus试剂盒（TOYOBO）在PCR产物末端加A。然后连接到pMD18-T载体（TaKaRa）。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段（序列如SEQ ID NO：1所示），将该克隆命名为pMD18-PHYB cDNA。

实施例2：反义PHYB基因植物表达载体的构建和遗传转化

为了能更好地分析PHYB的功能，申请人通过反义技术使PHYB基因在水稻中的表达水平降低。根据转基因植株的表型和生理特征研究该基因的功能。

反义PHYB基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pMD18-PHYB cDNA用KpnI和XbaI双酶切，回收插入片段；同样，用同样的方法酶切pIG121Hm-8的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌XLI-Blue。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pIG121Hm-anti-PHYB(见图1)。pIG121Hm-8是在国际常用的植物遗传转化载体pIG121Hm基础上，用KpnI酶切位点取代GUS基因编码区和终止区之间的SacI位点所得到的（见图1）。将pIG121Hm-anti-PHYB转化至EHA105宿主菌。

实施例3：分离克隆用于构建PHYB基因RNAi植物表达载体的DNA片段以及RNAi植物表达载体的构建

根据实施例1的方法，提取水稻叶片RNA，合成第一链cDNA。利用PrimerSTAR HS DNApolymerase with GC buffer（TaKaRa）进行扩增PHYB基因cDNA的特异性片段，所用的特异性引物是：上游引物PHYBF2（5’-CAC CAT GAAAAG AAG TGT TAT GCAAG-3’（SEQID NO：5）、下游引物PHYBR2（5’-ATT TCA TCA GGG ATA TCT CGAATAAG-3’（SEQ IDNO：6）。PCR反应条件是98℃预变性1min；98℃10sec,60℃15sec，72℃1min，30个循环；后延伸72℃5min，即得到了PHYB基因特异性RNAi片段。

利用

Cloning Kit试剂盒（Invitrogen）将上述PCR产物克隆在pENTR载体。具体步骤如下：依次加入3μl RNAase-free water、1μl Salt solution、1μl pENTR vector和1μl PCR产物（>10ng），轻微混合均匀，23℃连接10分钟，然后转化试剂盒中提供的感受态TOPO10细胞。将该克隆命名为pENTR-PHYB RNAi(图2)。

利用

LR Clonase II Enzyme Mix（invitrogen）试剂盒将PHYB基因的RNAi片段重组在pANDA载体。具体步骤如下：依次加入150ng pENTR-PHYB RNAi质粒、150ngPANDA vector、2μl LR Clonase enzyme mix，然后加TE Buffer(PH8.0)，至终体积为8μl，稍微涡旋离心（<2sec），25℃温浴1-16h，加入1μl蛋白酶K（20μg/μl），37℃温浴10min终止反应后，取1-5μl反应液转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，获得PHYB基因的RNAi植物表达载体，命名为pANDA-PHYBRNAi（图2）。然后将pANDA-PHYBRNAi转化至EHA105宿主菌。

实施例4：反义PHYB基因植物表达载体和PHYB基因RNAi植物表达载体的遗传转化

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系（参见本发明后面的实施例）将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上改良进行（Hieiet al.,1994,Plant J,6:271-282）。转化分别获得30株独立的转基因水稻植株。

具体步骤如下：

（1）愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70%乙醇表面消毒1分钟；5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织（成分见后），于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。

（2）愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。

（3）农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中（含有50mg/L的卡那霉素），28℃，220rpm，培养至对数生长晚期（大约培养18-24小时）。将获得的菌液按1%接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中（成分见后）；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右（培养5-6小时）。

（4）农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把（2）的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上（培养基上铺一层无菌滤纸），26℃，黑暗共培养2-3天。

（5）愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基（含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素）上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基（含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素）上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。

（6）分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。

（7）壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。

试剂配方：

（1）试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb（Cabenicillin,羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮）；DMSO（Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜）。

（2）用于水稻遗传转化的培养基配方：

1）YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5N NaOH调PH至7.0。

2）愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8。

3）AB液体培养基：3g/L K₂HPO₄，1g/L NaH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，300mg/L MgSO₄·7H₂O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl₂·2H₂O，2.5mg/L FeSO₄·7H₂O，5g/L葡萄糖，pH7.0。

4）AAM培养基：AA大量，AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/LAS，pH5.2。

5）共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L2,4-D，20mg/LAS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8。

6）固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。

7）分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/L NAA，pH5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素。

8）1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH5.8.

(3)主要溶液配方：

1）N6大量元素（10×）

用水定容1L

2）N6微量（1000×）：

用水定容1L

3）N6维生素（1000×）

用水定容100mL

3）MS大量元素（10×）

用水定容1L

4）MS微量（1000×）：

用水定容1L

5）MS维生素（1000×）

用水定容100mL

6）铁盐（200×）

FeSO₄.7H₂O          5.56g

Na₂EDTA.2H₂O        7.46g

7）AA大量（200×）

8）AA微量（1000×）

用水定容1L

9)2,4-D储存液(2mg/ml)

称取2，4-D100mg,溶于1ml DMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。

10）Kinetin储存液（0.2mg/ml）

称取Kinetin10mg，溶于1ml1NKOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

11)NAA储存液(0.2mg/ml)

称取NAA10mg，溶于0.5ml1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

12）乙酰丁香酮（100mg/ml）

称取乙酰丁香酮100mg，溶于1ml DMSO，于-20℃保存。

13）卡那霉素（50mg/ml）

称取卡那霉素500mg,溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。

实施例5：检测转基因水稻植株和野生型水稻的PHYB蛋白质水平

以水稻品种日本晴、3个独立的RNAi转基因水稻株系和3个反义转基因株系。提取5叶期水稻叶片的可溶性蛋白质，利用western blot检测水稻叶片中PHYB蛋白质水平。具体方法如下：从上述材料收集1克水稻叶片，在液氮中充分研磨，加入2ml蛋白质提取缓冲液（100mM Tris-HCl,pH8.3,5mM EDTA,0.2%β-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物)，混匀，在冰上放置30min。然后12000×g4℃离心15min。转移上清液至另一管中，加入2/3体积的饱和硫酸铵，混匀，冰上静止30min。12000×g4℃离心30min。弃上清，沉淀用200μl蛋白质提取缓冲液悬浮。利用Coomassie PLUS Protein Assay Reagent(Pierce,Rockford,IL)测定蛋白质浓度。利用10%SDS-PAGE进行蛋白质电泳，每个上样孔50μg蛋白质。电泳结束后，通过印迹法转移到PVDF膜(Millipore,Billerica,MA)。然后按照Takano等人的方法进行免疫化学分析，检测PHYB蛋白质水平(Takano et al，Plant Cell，2005.17:3311-3325)。结果表明，在3个独立的反义转基因水稻植株和3个RNAi转基因水稻植株中，PHYB蛋白质的水平都显著低于野生型（图3）。

实施例6：转反义PHYB基因植株具有较强的低温胁迫耐性

将反义PHYB转基因植株和野生型植株种子用70%乙醇表面消毒1分钟；5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于含有0.4%的琼脂培养基的玻璃培养瓶。在光照培养箱（28°C，7900Lx）条件下生长6天后，挑选生长一致的幼苗转移至土中，在正常情况下培养至二叶期，转移至低温生长室中（暗期12h,8±1°C；暗期12h,4±1°C）培养，在低温下培养7天时野生型叶片出现显著萎蔫现象（图4A）。在生长室中培养14天时，90%以上的野生型枯死，而反义转基因水稻基本全部正常，仅仅约5-10%枯萎（图4B），因此转反义PHYB基因的水稻植株具有较强的低温胁迫耐性。

实施例7：PHYB基因的RNAi转基因水稻植株具有较强的低温胁迫耐性

将不同发育阶段的T3代RNAi转基因水稻和野生型进行低温处理，比较野生型和转基因水稻植株的表型。具体步骤如下：去壳的RNAi转基因水稻株系和野生型如实施例4所述经过表面消毒后，播种于含有0.4%的琼脂培养基的玻璃培养瓶。对不同生长发育阶段的水稻幼苗进行不同低温处理。第一种情况：在光照培养箱（28°C，7900Lx）条件下生长6天后，转移至低温培养箱（2-4°C，7900Lx）生长3天，可见野生型叶鞘出现漂白、叶片萎蔫，而RNAi转基因水稻基本正常（图5A）。第二种情况：在光照培养箱（28°C，7900Lx）条件下生长6天后，转移至Yoshida溶液（Yoshida，1976）在光照培养箱中继续培养至三叶期，而后转移至低温培养箱（8±1°C，7900Lx）生长3天，RNAi转基因水稻植株能够正常生长，而野生型全部萎蔫（图5B）。第三种情况：在光照培养箱（28°C，7900Lx）条件下生长6天后，转移至Yoshida溶液（Yoshida）在光照培养箱中继续培养至五叶期，转后转移至低温培养箱（8±1°C，7900Lx）生长5天，大部分野生型水稻植株的叶片发生萎蔫，而仅仅少数RNAi转基因水稻植株的叶片发生萎蔫；随后转移至光照培养箱（28°C，7900Lx）继续培养5天，可以看出，在野生型中萎蔫的叶片全部死亡，而RNAi转基因水稻植株中萎蔫的叶片能够恢复（图5C）。上述结果显示，PHYB基因的RNAi转基因基因水稻植株具有较强的低温胁迫耐性。

实施例8：PHYB基因表达水平降低增强水稻低温胁迫耐性的机制分析

已有报道表明，DREB1（CBF）家族基因在冷胁迫反应调控网络中具有重要的枢纽作用。因此我们检测了RNAi转基因株系和野生型水稻在低温处理不同时间后，水稻OsDREB1家族基因的表达水平。具体实施步骤如下：将RNAi转基因植株（#1）和非转基因野生型植株的种子用70%乙醇表面消毒1分钟；5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20分钟，然后无菌水冲洗4-5次，在30°C下诱导萌发3天后，在光照培养箱（28°C，7900Lx）培养至3叶期，然后转移至低温培养箱（4°C，7900Lx）处理，分别在处理后0、1、4、12、24h取材。按照实施例1方法提取RNA、合成cDNA第一链，并利用荧光定量RT-PCR分析水稻OsDREB1家族不同成员的的转录水平。荧光定量PCR所用引物序列及SEQ ID NO如表1。同时用水稻内源翻译延伸因子基因(OsEF-1a)作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异引物见表1。

利用SYBR Premix Ex Taq^TMPCR试剂盒（TaKaRa）进行荧光定量PCR反应。具体步骤如下：依次加入10μl2×SYBR Premix Ex Taq^TM、2.0μl cDNA模板、0.2μM基因特异性引物对，用RNase-free H₂O补足反应体系为20μl。PCR反应条件是95℃预变性30秒；95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2^-ΔΔCt法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。如图6所示，在低温处理后，OsDREB1家族基因在RNAi转基因株系中的表达水平明显高于野生型（OsDREB1D和OsDREB1F在低温处理12小时后的表达水平在转基因植株中降低）。另一方面，在正常生长条件下，除OsDREB1A外，其余OsDREB1家族基因在RNAi转基因株系中的表达水平均高于野生型。这些结果表明PHYB基因表达水平降低导致OsDREB1家族基因表达水平的升高，OsDREB1基因的较高表达水平可能是PHYB反义转基因株系或者RNAi转基因水稻株系具有较强低温胁迫耐性的原因。

表1.实施例6中所用的荧光定量PCR引物及其在本发明中所对应的序列号（SEQ ID NO.）

实施例9：转反义PHYB基因植株产量不会降低

本实施例分析了大田中生长的转反义PHYB基因株系、RNAi转基因株系和野生型的千粒重、穗数和产量。具体步骤如下：转基因植株和野生型植株种子表面消毒后，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至4叶期，移栽至大田中，2个水稻植株之间的距离是30cmх30cm。收获时分析转基因植株和野生型的每个植株上的有效穗数、每个穗的重量和千粒重。结果表明，这些参数在野生型和转基因植株之间没有差异，这表明尽管转基因植株中OsDREB1家族基因的表达水平提高，并不影响转基因植株的产量。

Claims (6)

1.基因PHYB在控制水稻低温胁迫耐性中的应用。

2.如权利要求1所述的基因PHYB在控制水稻低温胁迫耐性中的应用，其特征是，通过降低水稻PHYB基因的表达来提高水稻低温胁迫耐性。

3.如权利要求2所述的基因PHYB在控制水稻低温胁迫耐性中的应用，其特征是，基因PHYB表达水平降低导致OsDREB1家族基因表达水平的升高，从而提高了水稻的低温胁迫耐性。

4.基因PHYB在提高水稻低温胁迫耐性中的应用方法，其特征是，利用水稻PHYB基因的cDNA片段作为应用基因，将该基因反向转入水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表达；或者利用水稻PHYB基因cDNA的特异片段，构建相应的RNAi植物表达载体，转化水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表达。

5.如权利要求4所述的应用方法，其特征是，通过PCR方法，扩增出水稻PHYB基因的全长编码区，反向连接在植物表达载体pIG121Hm-8上，构建成反义植物表达载体；或者利用PHYB基因编码区的部分特异性序列构建RNAi植物表达载体；再利用农杆菌介导的遗传转化方法将反义植物表达载体或RNAi植物表达载体分别转化至水稻品种日本晴中，抑制水稻内源PHYB基因的表达，得到水稻PHYB基因表达受到抑制的转基因植株。

6.如权利要求4或5所述的应用方法，其特征是，扩增PHYB基因编码区的部分特异性序列的上游引物PHYBF2为5’-CAC CAT GAA AAG AAG TGT TAT GCA AG-3’，下游引物PHYBR2为5’-ATT TCA TCA GGG ATA TCT CGA ATA AG-3’。

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