CN102925454B - 基因OsBBX22b在降低水稻株高方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因OsBBX22b在降低水稻株高方面的应用。本发明是通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX22b基因的全长编码区（如SEQ ID NO：1所示），正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表达，得到OsBBX22b基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，营养生长阶段及成熟期阳性转基因水稻植株的株高明显低于非转基因植株。本发明在水稻中过量表达OsBBX22b基因对于降低株高，增强耐倒伏能力具有重要意义。

Description

基因OsBBX22b在降低水稻株高方面的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及基因OsBBX22b在降低水稻株高方面的应用。

背景技术

水稻是世界上主要粮食作物之一，水稻产量由多个性状决定，其中水稻植株高度（简称株高）是一个重要的农艺性状。水稻株高是指水稻植株茎基部到穗尖（不包括芒长）的高度。传统的高秆水稻品种抗倒伏性较差，在自然界逆境条件下（如风和雨）容易倒伏并造成不同程度的产量损失。因此株高性状虽然不直接构成水稻的产量，却是水稻高产稳产的基本前提（许学等，原子核物理评论，2008，25:171-175；魏灵珠等，生物工程学报，2012，28:144-153）。20世纪60年代，由于水稻Sd1和小麦Rht等矮杆基因在育种中的广泛应用，引发了第一次“绿色革命”（Khush，Genome，1999，42:646-655）。

近年来，越来越多的遗传学证据表明，许多植物的株高与赤霉素（Gibberellin，GA）途径密切相关。此外，其他植物激素包括油菜素内酯（Brassinosteriod，BR）和生长素（Indole-3-acetic acid，IAA）以及开花相关转录因子、细胞壁形成基因也会影响植物的株高。

GA是调控植物株高的重要激素（Kazan and Manners，J Exp Bot,2011,62:4087-4100）。活性GAs生物合成过程中有6个编码关键酶的基因，包括CPS(ENT-COPALYLDIPHOSPHATESYNTHASE)、KS(ENT-KAURENE SYNTHASE)、KO(ENT-KAURENE OXIDASE)、KAO(ENT-KAURENE ACID OXIDASE)、GA3ox(GA3-OXIDASES)和GA20ox(GA20-OXIDASES)（Yamaguchi，Annu Rev Plant Biol,2008,59:225-251）。在拟南芥中GAs生物合成途径上的相关基因缺失突变均能够导致植株严重矮化或者半矮化表型（Sakamoto et al.,Plant Physiol,2004,134:1642-1653）。在水稻中发现的3个GA缺陷型半矮化突变体d35、sd1（semidwarf1）和d18分别是由OsKO2、OsGA20ox2和OsGA3ox2位点变异引起的（Itoh et al.,Plant Cell,2002,14:57-70;Sasaki et al.,Nature,2002,416:701-702;Itoh et al.,Plant Mol Biol,2004,533-547）。水稻EUI（ELONGATED UPPERMOST INTERNODE 1）基因编码细胞色素P450单加氧酶，该基因产物能够导致GA失活。过量表达EUI的转基因水稻株高显著降低（Zhu et al.,Plant Cell,2006,18:442-456）。此外，GA信号途径也可以影响株高。GID1（GA-INSENSITIVE DWARF1）基因编码GA受体蛋白，该基因功能缺失突变体水稻gid1植株显著矮化（Ueguchi-Tanaka etal.,Nature,2005,437:693-698）。DELLA蛋白是GA信号传导途径的负调控因子，在水稻中编码DELLA蛋白的两个基因是SLR1（SLENDER RICE-1）和SLRL1（SLR1-LIKE 1）。SLR1和SLRL1基因过表达水稻的株高显著降低（Itoh et al.,Plant Cell,2002,14:57-70）。近来，Kovi等人（Theor Appl Genet,2011,123:705-714）定位到一个调节水稻株高的基因，该基因编码几丁质诱导的赤霉素应答蛋白。

其他植物激素如油菜素内酯和生长素均影响株高。D11（DWARF11）基因编码细胞色素P450单加氧酶，参与BR生物合成，该基因的缺失突变体表现矮化（Tanabe et al.,Plant Cell,2005,17:776-790）。OsBRI1基因（BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1）编码油菜素内酯BR受体，该基因的功能缺失突变体d61-1和d61-2明显矮化（Yamamuro et al.,Plant Cell,200012:1591-1606）。水稻生长素信号途径转录因子OsIAA的TOS17突变体表现出矮化表型，这表明生长素也参与株高调控（Jain et al.,Funct Integr Genomics,2006,6:47-59）。水稻ND1（NARROW LEAF AND DWARF 1）基因编码类纤维素合成酶D，参与细胞壁纤维素的合成，该基因缺失突变体株高明显降低（Li et al.,Plant J,2009,60:1055-1069）。

除了植物激素途径，一些调节水稻株高的基因也已被报道。GHD7基因（GRAINNUMBER,PLANT HEIGHT AND HEADING DATE 7）位点，是一个能同时控制水稻每穗粒数、株高和抽穗期3个性状的主效QTL。该基因编码一个由257氨基酸组成的核蛋白，该产物是一个CCT（CO,CO-LIKE and TIMING OF CAB1）蛋白，与拟南芥CO蛋白的CCT域有很大的相似性，野生型GHD7等位基因可使抽穗期大大延迟，株高和每穗粒数显著增加（Xue etal.,Nat Genet,2008,40:761-767）。中国农业科学院万建民课题组鉴定了一个QTL DTH8（DATE TO HEADING ON CHROMOSOME 8)，能够同时调控水稻花期、株高和产量这3种农艺性状。DTH8编码1个含有CCAAT-box-binding转录因子的HAP3亚基。该基因自然突变会导致光周期敏感性减弱和株高降低（Wei et al.,Plant Physiol,2010,153:1747-1758）。华中农业大学张启发课题组鉴定到一因多效的主效QTLGHD8，也能够同时影响水稻籽粒产量、抽穗期和株高（Yan et al.,Mol Plant,2011,4:319-330）。氨基酸序列分析结果表明，GHD8与DTH8是同一个基因。何祖华研究团队鉴定的BUI1（BENT UPPERMOST INTERNODE1）基因编码一个植物特异的Class Ⅱ formin蛋白，调控细胞微丝骨架（actin cytoskeleton）的装配和动态变化。BUI1的缺失突变导致细胞中F-actin含量降低、微丝束数目减少，细胞伸长和极性扩展受到抑制，进而影响了BUI1突变体水稻的节间发育，表现为最上节间严重缩短，呈弯曲生长（Yang et al.,Plant Cell,2011,23:661-680）。

发明内容

本发明从水稻日本晴中分离克隆到B-box锌指蛋白的OsBBX22b基因（进化树分析表明，该蛋白质与拟南芥的BBX22属于同一个分支，该基因编码的氨基酸序列与拟南芥的AtBBX22蛋白质同源性为68%，故命名为OsBBX22b），该基因在水稻中过量表达后，转基因阳性植株的株高明显低于非转基因植株。因此，在水稻中过量表达OsBBX22b基因对于降低株高，增强耐倒伏能力具有重要意义，这为水稻高产的分子设计育种提供新的基因资源和新思路。

本发明申请人在一个水稻光敏色素突变体中，利用基因表达图谱鉴定到一个序列号为AK106865的、编码B-box锌指蛋白的OsBBX22b基因的信使RNA序列。水稻OsBBX22b基因信使RNA序列为2055个碱基，编码377个氨基酸和一个终止密码子。本发明是通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX22b基因的全长编码区，包含1134个碱基，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表达，得到OsBBX22b基因表达增强的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，营养生长阶段及成熟期阳性转基因水稻植株的株高明显低于非转基因植株：在营养生长阶段，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的80-90%；在成熟期，转基因水稻的株高约为非转基因水稻的90%。

本发明用于构建过量表达OsBBX22b基因的植物表达载体、增强OsBBX22b基因表达的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明利用水稻品种日本晴的OsBBX22b基因的cDNA片段作为应用基因，将该基因正向转入水稻中，提高OsBBX22b基因的表达水平，转基因水稻植株表现出株高降低。

本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种通过降低株高而提高水稻抗倒伏能力的水稻基因OsBBX22b的应用。申请人在水稻中过量表达OsBBX22b基因表达后，发现转基因阳性植株的株高降低。

（2）本发明首次分离克隆了水稻OsBBX22b基因，并首次在水稻中过量表达了OsBBX22b基因。为培育高抗倒伏水稻品种提供了新的思路，也为其它作物利用异源基因技术提高抗倒伏性提供了理论支持。

（3）本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物抗倒伏研究提供支持。

附图说明

图1为本发明的OsBBX22b基因表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18-T载体上的OsBBX22b基因利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI和SpeI之间的DNA片段，这样OsBBX22b基因正向插入玉米泛素基因启动子（Pubi）后，即pCAMBIA1390-ubi-BBX22b植物表达载体。

图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中OsBBX22b基因转录本相对表达水平结果图。其中OsBBX22b-OX表示转OsBBX22b基因的植株，#3、#5、#7、#16和#17代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因。

图3为转OsBBX22b基因水稻植株和野生型植株在营养生长阶段不同发育时期相对株高比较图。A图是8天幼苗；B图是三叶期幼苗；C图是六叶期植株。其中OsBBX22b-OX表示转OsBBX22b基因的植株，#3、#5和#7代表三个独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株；图中的标尺代表1cm。

图4为转OsBBX22b基因水稻植株和野生型植株在成熟期株高比较图。A图是成熟期株高比较图；B图是成熟期表型图；C图是成熟期株高相对图。其中OsBBX22b-OX表示转OsBBX22b基因的植株，#3、#7、#16和#17代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著（P<0.01）。

图5为转OsBBX22b基因水稻植株和野生型植株在成熟期株不同节间长度比较图。其中OsBBX22b-OX表示转OsBBX22b基因的植株，#3、#7、#16和#17代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。*表示根据TTEST统计学分析差异显著（P<0.05）；**表示根据TTEST统计学分析差异极显著（P<0.01）。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆用于构建OsBBX22b基因植物表达载体的DNA片段，以及验证功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。

实施例1：分离克隆用于构建OsBBX22b基因植物表达载体的DNA片段

采用TRIZOL试剂（Invitrogen）从水稻品种日本晴（公开报道的一个品种）的叶片中提取总RNA。具体步骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离心管中，迅速加入1ml Trizol（Invitrogen）颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟，室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75%乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水（一般为60μl）溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。

利用反转录酶SuperScript II（Invitrogen）将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加入1μl 500μg/ml oligo（dT）12-18、2μg总RNA、1μl 10mM dNTP混合物和DEPC水至12μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入4μl5×第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT（40U/μl），42℃，2分钟。然后加入1μl SuperScript II，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，然后70℃水浴15分钟使酶失活，这样就合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。用带有酶切位点的上游引物OsBBX22bF（5’-ATGGATCCATGTCGCCTCCTCCTCCACCATATTA  -3’，SEQ ID NO：3），序列特异引物外加BamHI位点和两个保护碱基；和下游引物OsBBX22bR（5’-AACTAGTTTATTGCCTCCGGCGTTTGGAGGTG-3’，SEQ ID NO：4），序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基。利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer（TaKaRa）扩增目的片段，PCR反应条件是94℃预变性1分钟；98℃ 10秒，68℃ 4分钟，30个循环。利用TArget Clone TM-Plus试剂盒（TOYOBO）在PCR产物末端加A。然后连接到pMD18-T载体（TaKaRa）。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段（序列如SEQ ID NO：1所示），将该克隆命名为pMD18-OsBBX22b cDNA。

实施例2：OsBBX22b基因植物表达载体的构建和遗传转化

为了能更好地分析OsBBX22b的功能，申请人通过过量表达技术使OsBBX22b基因在水稻中表达水平提高。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。

OsBBX22b基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pMD18-OsBBX22b cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌XL1-Blue。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pCAMBIA1390-ubi-BBX22b(见图1)。pCAMBIA1390-ubi是在国际常用的植物遗传转化载体（见图1）。将pCAMBIA1390-ubi-BBX22b转化至农杆菌菌株EHA105。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系（参见本发明后面的实施例）将其导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良（Hiei等，1994，Plant J.，6:271-282）。转化共获得18株独立的转基因水稻植株。

具体步骤如下：

（1）愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70%乙醇表面消毒1分钟；5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织（成分见后），于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。

（2）愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培养4天。

（3）农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中（含有50mg/L的卡那霉素），28℃，220rpm，培养至对数生长晚期（大约培养18-24小时）。将获得的菌液按1%接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中（成分见后）；28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右（培养5-6小时）。

（4）农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把（2）的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液，侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上（培养基上铺一层无菌滤纸），26℃，黑暗共培养2-3天。

（5）愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组织置于固体筛选培养基（含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素）上，26℃暗培养2周。然后转移到固体筛选培养基（含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素）上，26℃暗培养，每2周继代一次，筛选4周。

（6）分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次后，培养至产生再生苗。

（7）壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。

试剂配方：

（1）试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb（Cabenicillin,羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮）；DMSO（Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜）。

（2）用于水稻遗传转化的培养基配方：

1）YEP液体培养基：2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1g NaCl，加水定容至200mL，用5N NaOH调PH至7.0。

2）愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。

3）AB液体培养基：3g/L K₂HPO₄，1g/L NaH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，300mg/L MgSO₄·7H₂O，150mg/L KCl，10mg/L CaCl₂·2H₂O，2.5mg/L FeSO₄·7H₂O，5g/L葡萄糖，pH 7.0。

4）AAM培养基：AA大量，AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/LAS，pH 5.2。

5）共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20mg/LAS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8。

6）固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH 5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。

7）分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L 山梨醇，2mg/L KT，0.2mg/LNAA，pH 5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素。

8）1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/L Gelrite，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH 5.8.

(3)主要溶液配方：

1）N6大量元素（10×）

2）N6微量（1000×）：

3）N6维生素（1000×）

3）MS大量元素（10×）

4）MS微量（1000×）：

5）MS维生素（1000×）

6）铁盐（200×）

FeSO₄.7H₂O      5.56g

Na₂EDTA.2H₂O    7.46g

7）AA大量（200×）

MgSO₄.7H₂O     5g

CaCl₂·2H₂O    3g

NaH₂PO₄      3g

KCl          60g

8）AA微量（1000×）

9)2,4-D储存液(2mg/ml)

称取2，4-D 100mg,溶于1ml DMSO,加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH，至完全溶解，于-20℃保存。

10）Kinetin储存液（0.2mg/ml）

称取Kinetin 10mg,溶于1ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

11)NAA储存液(0.2mg/ml)

称取NAA 10mg,溶于0.5ml 1N KOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

12）乙酰丁香酮（100mg/ml）

称取乙酰丁香酮100mg,溶于1ml DMSO，于-20℃保存。

13）卡那霉素（50mg/ml）

称取卡那霉素500mg,溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存。

实施例3：检测转基因水稻植株和野生型水稻的OsBBX22b基因的转录本水平

以水稻野生型日本晴和7个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中OsBBX22b基因的转录本水平。具体方法如下：采用TRIZOL试剂（Invitrogen）从上述材料收集0.03g水稻叶片提取总RNA，具体步骤如实施例1的描述。

利用RNase-free DNase（TaKaRa）除去RNA中的DNA，具体步骤如下：依次加入TotalRNA 50μg，10×DNase I Buffer 5μl，DNase I（RNase-free，5U/μl）2μl，RNase Inhibitor（50U/μl）0.4μl，加DEPC水补足总体积至50μl。反应体系混匀后在37℃反应30min。然后在反应体系中加入50μl DEPC水补足至100μl。随后加入苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混合物100μl，充分混匀，4℃，12000rpm离心15min。将上层移至新的1.5ml离心管中。加入100μl氯仿∶异戊醇（24∶1）混合物，充分混匀，4℃，12000rpm离心15分钟。取最上层移至另一新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAc（pH=5.2）和2.5倍体积的冷无水乙醇，-80℃放置1小时，4℃，12000rpm离心10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75%乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清，在室温干燥至沉淀变透明。加入25μl DEPC水溶解沉淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。

根据PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I（TaKaRa）说明书合成cDNA第一链。具体步骤如下：依次加入上述总RNA 1μg、5×PrimeScript buffer 2μl、PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μl、Random 6mers（100μM）和Oligo dT Prime（50μM）各0.5μl，最后用RNase Free dH₂O补充至总体积为10μl。然后将反应体系在37℃下保温15分钟，使反转录反应进行，然后用85℃高温处理5秒使酶失活，即完成了cDNA第一链的合成。

以上述cDNA为模板，用OsBBX22b基因的特异性上游引物OsBBX22bqF1（5’-TCCTCCACCATATTACCACCA-3’，SEQ ID NO：5），和下游引物OsBBX22bqR1（5’-GCGCTGCACAGTAGCTTCAT-3’，SEQ ID NO：6）进行荧光定量PCR分析。同时用水稻内源翻译延伸因子基因(OsEF-1a)作为荧光定量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为OsEF-1aF (5’-TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3’，SEQ ID NO：7），特异下游引物为OsEF-1aR（5’-GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3’，SEQ ID NO：8）。利用SYBR PremixEx Taq^TM PCR试剂盒（TaKaRa）进行荧光定量PCR反应。具体步骤如下：依次加入10μl 2×SYBR Premix Ex Taq^TM、2.0μl cDNA模板、0.2μM基因特异性引物对，用RNase-free H₂O补足反应体系为20μl。PCR反应条件是95℃预变性30秒；95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。然后用Excel通过2^-△△Ct法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结果作图。结果表明过表达株系中OsBBX22b基因的转录本水平是非转基因水稻植株的5-50倍，从而证明OsBBX22b基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达（图2）。

实施例4：转OsBBX22b基因水稻在营养生长期不同发育阶段的株高降低

本实施例分析了转基因水稻植株和野生型水稻植株苗期的株高。具体步骤如下：将转基因植株（#3、#5和#7）和非转基因野生型植株的种子用70%乙醇表面消毒1分钟；5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20分钟，然后无菌水冲洗4-5次，然后分别进行了如下培养，比较了转基因水稻植株和野生型植株在不同发育阶段时的株高。第一个发育阶段：将消毒后的种子播种于含有0.4%的琼脂培养基的玻璃培养瓶。在光照培养箱（14小时光照28℃/10小时黑暗23℃）生长8天后，测量地上部分的高度，并拍照。以非转基因野生型植株的株高作为100%，转OsBBX22b基因水稻植株的株高降低了约20%（图3A）。第二个发育阶段：将上述培养8天的幼苗转移至土中，在温室中培养（自然条件）至三叶期，测量水稻株高，并照相。以非转基因野生型植株的株高作为100%，转OsBBX22b基因水稻植株的株高降低了约30%（图3B）。第三个发育阶段：将上述培养8天的幼苗转移至土中，在温室中培养（自然条件）至六叶期，测量水稻株高，并照相。以非转基因野生型植株的株高作为100%，转OsBBX22b基因水稻植株的株高降低了约10-18%（图3C）。上述结果表明，OsBBX22b基因过量表达导致水稻营养生长期株高降低。

实施例5：转OsBBX22b基因水稻植株和野生型植株成熟期株高和节间长度比较

本实施例分析了转基因植株和野生型植株成熟期株高及节间长度。具体步骤如下：转基因和野生型水稻种子用70%乙醇表面消毒1分钟；5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中培养至成熟期，测定转基因植株和非转基因野生型植株的株高、拍照，并利用TTEST进行统计学分析野生型和转基因植株株高差异的显著性（图4A和4B）。同时，以非转基因野生型植株株高作为100%，转OsBBX22b基因植株的株高降低了约10%（图4C）。这个结果表明，OsBBX22b基因过量表达能够导致成熟期水稻植株株高降低。同时我们测定了成熟期水稻植株不同节间长度，结果显示转基因水稻的第一节间、第二节间和第四节间长度均小于非转基因水稻，而第三节间和第五节间差异不明显（图5）。这些结果表明，OsBBX22b基因过量表达能够抑制第一节间、第二节间和第四节间延伸。

Claims (3)

1.基因OsBBX22b在降低水稻株高方面的应用，所述基因OsBBX22b的序列如SEQ IDNO：1所示。

2.基因OsBBX22b在降低水稻株高方面的应用方法，其特征是，通过PCR方法，扩增出水稻品种日本晴的OsBBX22b基因的全长编码区，正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上；再进行遗传转化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表达，得到OsBBX22b基因表达增强的转基因水稻植株；所述基因OsBBX22b的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求2所述的应用方法，其特征是，PCR扩增的上游引物OsBBX22bF如SEQ IDNO：3所述，下游引物OsBBX22bR如SEQ ID NO：4所述。

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