CN104447970B - 调控水稻花期的蛋白OsEFL1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了调控水稻花期的蛋白OsEFL1及其编码基因与应用。本发明提供了抑制OsEFL1蛋白编码基因表达的物质在调控植物花期中的应用；所述OsEFL1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明利用反义核酸沉默水稻体内OsEFL1基因表达，得到不育水稻，从而证明OsEFL1基因可以调控水稻花期，创建不同生育期的育种材料，对水稻的遗传改良具有深远的实际应用意义。

Description

调控水稻花期的蛋白OsEFL1及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及调控水稻花期的蛋白OsEFL1及其编码基因与应用。
背景技术
抽穗期是决定水稻品种的地区和季节适应性的重要农艺性状，抽穗期遗传研究对指导育种实践、品种改良和品种推广均具有重要的意义。抽穗期是水稻育种家在育种过程中重点关注的农艺性状，该性状受主效基因位点和微效多基因位点的共同控制。因此，水稻抽穗期的遗传方式既有质量性状遗传特性，也有数量性状遗传特点。同时，不同类型品种由于遗传背景不同会表现出不同的遗传特性，而同一品种的抽穗期也会由于光温条件的不同而表现各异。
对于水稻抽穗期遗传的分子机制已有较深入的研究。目前的研究表明水稻的抽穗由Heading date 3a[Hd3a，主要的short-day(SD)成花素]和Flowering locus T1[RFT1，Hd3a最近的同源物，主要的long-day(LD)成花素]促进(Tamaki et al.,2007；Komiya2009)。在这些成花素基因的上游基因中，Heading date 1(Hd1)和Early headingdate 1(Ehd1)作为两个主要的开花信号集成者，接受来自其它基因的多种信号，如OsGIGANTEA(OsGI),Rice Indeterminate1(RID1,也即OsID1/Ehd2),Early heading date3(Ehd3),OsMADS50,OsMADS51,Ghd7(for Grain number,plant height and heading date7),和DTH8(for days to heading on chromosome 8,也即Ghd8)，来调控成花素基因的表达(Tsuj i et al.,2011；Yano et al.,2000；Doi et al.,2004；Hayama et al.,2003；Wuet al.,2008；Park et al.,2008；Matsubara et al.,2008；Matsubara et al.,2011；Leeet al.,2004；Kim et al.,2007；Xue et al.,2008；Wei et al.,2010b；Yan et al.,2010)。分析这些开花时间基因对于研究水稻的地区适应提出了许多借鉴。例如，有研究表明，Hd1和Ehd1等位基因的组合对水稻的开花性状是十分重要的(Izawa,2007)。另外Ghd7等位变异的序列分析表明该位点对于栽培稻在全球范围的适应性起重要作用(Xue et al.,2008)。然而，根据这些基因的等位基因对地区适应性的不同表型，栽培稻的开花时间表型和大多数开花时间基因单倍型之间的关联需要深入研究。
通过对水稻突变体库进行细致的筛选，获得一个花期提前的水稻突变体efl1，研究证实了突变体efl1是由于水稻逆转座子Tos17插入到LOC_Os02g55080基因3’UTR区域所致(TIGR:http://rice.plantbiology.msu.edu)，OsEFL1基因在突变体植株中的正常mRNA表达量比对照显著降低，导致该基因编码的蛋白质表达明显降低。
发明内容
本发明一个目的是提供抑制OsEFL1蛋白编码基因表达的物质的用途。
本发明提供的抑制OsEFL1蛋白编码基因表达的物质在调控植物花期中的应用；
所述OsEFL1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
上述应用中，所述调控植物花期为提前植物花期或促进植物开花。
上述应用中，所述调控植物花期为促进植物开花和/或抽穗。
上述应用中，所述抑制OsEFL1编码基因表达的物质为DNA分子A，所述DNA分子A的序列为序列表中序列1自5’末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列或含有所述DNA分子A的重组载体或含有所述DNA分子A的重组菌。
上述应用中，所述重组载体为将所述DNA分子A插入表达载体pCambia1390-Ubi中得到的重组载体；
所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将抑制OsEFL1编码基因表达的物质导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；
上述方法中，所述抑制OsEFL1编码基因表达的物质为DNA分子A，所述DNA分子A的序列为序列表中序列1自5’末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列；
所述DNA分子A具体通过上述重组载体中导入目的植物中。
上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
本发明第三个目的是提供一种DNA分子A。
本发明提供的DNA分子A，为如下1)或2)：
1)序列为序列表中序列1自5’末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列的DNA分子；
2)在严格条件下与1)杂交且编码相同蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本发明的实验证明，本发明利用反义核酸沉默水稻体内OsEFL1基因表达，得到不育水稻，从而证明OsEFL1基因可以调控水稻花期，创建不同生育期的育种材料，对水稻的遗传改良具有深远的实际应用意义。
附图说明
图1为野生型与突变体efl1的植株与开花期比较图
图1a：成熟期野生型植株与突变体efl1植株形态比较：左为野生型，右为突变体efl1；图1b:不同光周期下野生型与突变体的开花时间比较。
图2为OsEFL1基因的结构和Tos17插入位点分析及OsEFL1在突变体efl1中的表达
图2a为OsEFL1基因的结构和Tos17插入位点分析，起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出，黑色方框表示OsEFL1基因的外显子，白色方框表示基因的内含子；两个倒三角形分别表示efl1中Tos17插入的位置。P1，P2，表示位于两个外显子的引物；
图2b为是RT-PCR分析OsEFL1在野生型(WT)和突变体efl1中的表达
图3为互补试验图
图4为利用RNAi技术抑制野生型水稻内源OsEFL1的表达可以提高水稻开花期
图5为干涉载体OsEFL1i-pCambia1390-UBI的示意图
图6为干涉株系中OsEFL1基因的定量表达分析
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、OsEFL1基因突变体efl1获得及表型
一、efl1突变体的获得
1、efl1突变体的获得
所用的水稻T-DNA插入突变体库由中国农业科学陆军生物技术研究所利用载体pFX-E24.2-15R构建而成(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见等见Wan等，Activation tagging,an efficient tool for functional analysis of the ricegenome。Plant Mol Biol.2009Jan；69(1-2):69-80).挑选出10000份水稻转基因品种“日本晴(为中国农业科学院生物技术所保持的粳稻测序品种，以下也称为野生型水稻)”的种子，经浸种、催芽后播于秧田，35天后移栽至大田。每份材料种两行，每行10株，为一个家系，种植地点为河北廊坊万庄中国农科院高新技术产业园内的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。经过大田筛选共获到100个花期提前的突变株系。其中，一个原始编号为E78的突变体表型为抽穗期显著提前(如图1a)，将突变体命名为efl1。
北京自然光照条件ND每年4月下旬播种，1个月后插秧，田间管理同大田生产。光照培养箱控制的短日照条件(SD,10h光,30℃/14h暗,25℃)，光照培养箱控制的长日照条件(LD,14h光,30℃/10h暗,25℃)。光照培养箱用荧光灯照明(300μmol m-2s-1)，湿度为70％。图1b显示各个材料的开花时间。
2、分离efl1突变体T-DNA插入位点的侧翼序列
利用PCR Walking方法(Siebert等，An improved PCR method for walking inuncloned genomic DNA.Nucleic Acids Res,1995,23:1087-1088),分离了这个突变体的侧翼序列。根据侧翼序列与水稻基因组的匹配位置确定插入位点，结果显示该侧翼序列位于水稻的第2染色体上，插入位点对应于水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上的一个基因命名为OsEFL1，其核苷酸序列为序列表中序列1，编码区为序列表中序列1自5′末端第292至921位脱氧核糖核苷酸，该基因编码的蛋白命名为OsEFL1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。Tos17插入到该基因的第3’-UTR区域(见图2a)。
PCR Walking方法分离得到的efl1突变体Tos17插入位点的侧翼序列如序列3所示。
3、OsEFL1基因在突变体的表达检测
为了证实花期提前的突变表型是由于OsEFL1基因内的Tos17插入引起，对3个突变体和野生型同时进行半定量分析，检测的具体步骤为：(1)在OsEFL1基因Tos17插入位点上游设计一对基因组引物P1(5′ATT TGG GAC CTC AGC GAA GC 3′)和P2(5′TGA CTC AAG GGCTCT GTT GC 3′)，提取突变体和野生型的RNA，进行反转录，结果表明OsEFL1基因在突变体efl1中表达量显著降低(图2b)。
二、OsEFL1基因的互补突变体验证功能
根据预测基因的编码框，从起始密码子与终止密码子两侧设计引物：
正向引物:5-GG GCC CCT CTC TTC TCG CCG TCC TAG，
反向引物:5-TCT AGA CAG CAA ACA GAA CCC CTT CA；下划线所示为Smal和XbaI酶切位点。
提取野生型水稻日本晴叶片RNA，反转录cDNA为模板，用上述正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到957bpPCR产物，即为OsEFL1基因。
将该PCR产物连入pEASY-T1simple载体，经测序正确后，再用Smal和XbaI酶切，得到的酶切产物连入pCambia23A植物双元表达载体，构建成互补重组载体，命名为OsEFL1-1-Pcambia2300A，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1所示的OsEFL1基因插入pCambia23A载体的Smal和XbaI酶切位点，得到的载体。
将OsEFL1-1-Pcambia2300A导入农杆菌EHA105菌株，转化水稻突变体efl1，经过一系列的组培过程，获得再生的转基因植株，即转OsEFL1-1-Pcambia2300A水稻(回补)，通过鉴定转OsEFL1-1-Pcambia2300A水稻(回补)。
播种转OsEFL1-1-Pcambia2300A水稻(回补)株系#1、#4、水稻突变体efl1、野生型水稻(WT)，培育，在播种第120天观察生长表型，统计开花时间。
结果如图3所示，图3a为种第120天观察生长表型，看出，与野生型水稻相比，水稻突变体efl1抽穗时间早，而回补得到的转OsEFL1-1-Pcambia2300A水稻(回补)与野生型表型无显著差异；
图3b为开花时间统计，ND、SD、LD分别代表自然生长状态、短日照条件、长日照条件。可以看出在自然生长状况下，互补系#1、#4开花期恢复到了野生型状况。在SD短日照下，差异不显著。在LD条件下，开花期与在自然生长状况下相似。
上述结果表明，OsEFL1基因能够互补突变体efl1的突变表型。
实施例2、抑制OsEFL1基因的物质在培育花期提前水稻中的应用
1、DNA分子的制备
根据OsEFL1基因的CDS序列(序列1)设计引物，如下正向引物:5-ACT AGT CAG CAAACA GAA CCC CTT CA，反向引物:5-GGA TCC CTC TCT TCT CGC CGT CCT AG。
提取野生型日本晴水稻总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA作为模板，用上述正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到997bpPCR产物，与预期结果相符。将上述PCR产物与pMD19-T Simple(Takara)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pMD19-TSimple载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的通用引物M13对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明，上述PCR产物为序列表中序列1自5＇末端第78至1074位脱氧核糖核苷酸，为OsEFL1基因的部分片段。
2、Ubiquitin启动子的获得
以玉米基因组DNA为模板5’-AAG CTT TCT AGT GCA GTG CAG CGT GAC-3’和5’-CTG CAG CCT CTA GTG CAG AAG TAA CACCA-3’为引物，进行PCR扩增，得到2Kbp的PCR产物即为Ubiquitin启动子，核苷酸序列为序列表中序列4。
3、抑制OsEFL1基因表达的重组载体的获得
将上述2得到的序列表中序列4所示的Ubiquitin启动子插入植物双元表达载体pCambia1390(该载体可购自Cambia,Queensland.Australia)的HindIII和PstI位点间，构成中间载体pCambia1390-Ubi；
再将上述1得到的序列表中序列1自5＇末端第78-1074位核苷酸的反向互补片段(OsEFL1i)替换中间载体pCambia1390-Ubi的SpeI和BamHI位点间的片段，得到重组载体，命名为OsEFL1i-pCambia1390-UBI(图5)。
4、干扰OsEFL1基因表达的转基因水稻的获得
构建好的OsEFL1i-pCambia1390-UBI重组载体电转入(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，转化后的菌株命名为OsEFL1i-pCambia1390-UBI。
将OsEFL1i-pCambia1390-UBI转入水稻粳稻品种日本晴(A Draft Sequence ofthe Rice Genome(Oryza sativa L.ssp.japonica)Stephen A.Goff,et al.Science296,92(2002)，以下也称为野生型水稻)种子诱导的愈伤组织中，得到再生株系。具体如下：
1)种子愈伤组织诱导如下：选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳(注意保持胚完整)，将脱谷壳米粒转到50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次→弃水，倒入75％酒精适量，摇动搅拌，放置30秒(过程中适当轻摇动混匀)→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2％NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO→用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+3.6g/L植物凝胶(pH5.8)。
2)农杆菌介导的转化
(1)挑选继代约7天的胚性愈伤组织作为转化受体材料。
(2)收集上述农杆菌重组菌体OsEFL1i-pCambia1390-UBI，重悬于液体共培养培养基(在YEP液体培养基的基础上添加终浓度为100mg/L AS(乙酰丁香酮)，调PH5.2得到的液体培养基)中，28℃，200rpm震荡培养1-2小时；调整OD值至0.2。
(3)将步骤(2)获得的胚性愈伤组织浸泡步骤2)获得的农杆菌菌液，然后进行菌液浸泡，处理30min。
(4)将愈伤组织在无菌滤纸上吸干，转移到铺有一层灭菌滤纸的固体共培养培养基(在MS基本培养基的基础上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH(水解酐酪素)、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、10g/L葡萄糖、20mg/L As(乙酰丁香酮)和3.6g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.2灭菌得到的固体培养基)上，19℃暗培养2-3天。
(5)将步骤(4)培养得到的愈伤组织转出，无菌水漂洗3-4次，再用含50mg/L Cef(头胞噻呐霉素)的无菌水漂洗，然后将愈伤组织放到灭菌的滤纸上。
(6)将步骤(5)得到的用无菌滤纸吸干的愈伤组织转移到选择培养基(在MS基本培养基的基础上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH(水解酐酪素)、250mg/L Cef(头胞噻呐霉素)、50mg/L HPT和3.6g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)上，25℃暗培养，每两周转至继代培养基上继代一次。
(7)经步骤(6)所述3次继代培养后，将生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基(在MS基本培养基的基础上，添加1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1g/L CH(水解酐酪素)、250mg/L Cef(头胞噻呐霉素)、50mg/L HPT和3.6g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)上，25℃、16h、2000Lx光照培养，两周左右新鲜的愈伤组织上开始有绿色芽点出现，每15天继代一次，两次继代后，长出小苗，转移到生根培养基(在MS基本培养基基础上添加3g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)进行生根培养。
(8)待生根培养长出完整小苗，将小苗转入到壮苗培养基(1/2MS基本培养基的添加3g/L植物凝胶(phytagel)，调PH至5.8灭菌得到的固体培养基)上培养获得到幼苗。
(9)将步骤(8)壮苗培养基上的幼苗，炼苗一周，在清水中将培养基漂洗干净，先移栽到温室，再移栽到大田中得到转OsEFL1-pCambia1390-UBI T0代植株。共得到60株独立转化苗。
表1为所用培养基为MS基本培养基添加不同成分，具体如下：
3)RNA干涉系检测
对转OsEFL1-pCambia1390-UBI T0代株系叶片进行反转录得到cDNA作为模板，用LP:TGCTGAAATGTTGCTCCCAC、RP：CGTTCGCTTCTTACGCTCAT
进行QRT-PCR扩增，以Actin为内参，内参引物为5’-TGC TAT GTA CGT CGC CATCCA G-3’和5’-AAT GAG TAA CCA CGC TCC GTC A-3’。以水稻日本晴作为野生型对照(WT)。
结果见图6，与水稻日本晴相比，60株独立转化苗中30株独立转化苗中OsEFL1基因表达量明显下降，选择3个表达量下降较高的再生株系#3、#8进行下面的实验，命名为转OsEFL1RNAi水稻#3、#8。
采用同样的方法将空载体pCambia1390-UBI导入水稻粳稻品种日本晴中，得到转空载体水稻。
5、干扰OsEFL1表达的转基因水稻的花期表型观察
转OsEFL1RNAi水稻#3、#8、日本晴(WT)和转空载体水稻(UBI-1390)种子播种，培育，每个株系10株，实验重复3次，结果取平均值。
播种后第90天，观察生长表型，结果如图4a所示，看出，与野生型水稻相比，转OsEFL1RNAi水稻#3、#8提前抽穗；
统计开花时间，结果如图4b所示，ND、SD、LD分别代表自然生长状态、短日照条件、长日照条件，可以看出，#3、#8株系在LD、ND情况下开花显著提前，而在SD情况下，与野生型相似，这与突变体efl1是相似的。
日本晴(WT)和转空载体水稻(UBI-1390)无显著差异。
由此可见，通过RNAi技术抑制野生型水稻中内源OsEFL1基因的表达后造成了水稻植株的生育期的影响，进一步证明了OsEFL1基因为控制水稻花期的基因，并由此方法可以促进植物开花和抽穗提前，用于实际生产。

Claims (5)

1.抑制OsEFL1蛋白编码基因表达的物质在调控水稻花期中的应用；
所述OsEFL1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2；
所述调控水稻花期为促进水稻开花和/或抽穗。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述抑制OsEFL1编码基因表达的物质为DNA分子A或含有所述DNA分子A的重组载体或含有所述DNA分子A的重组菌，所述DNA分子A的序列为序列表中序列1自5’末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述重组载体为将所述DNA分子A插入表达载体pCambia1390-Ubi中得到的重组载体；
所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
4.一种培育转基因水稻的方法，包括如下步骤：将抑制OsEFL1编码基因表达的物质导入目的水稻中，得到转基因水稻，所述转基因水稻的开花和/或抽穗时间早于所述目的水稻；
所述OsEFL1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抑制OsEFL1编码基因表达的物质为DNA分子A，所述DNA分子A的序列为序列表中序列1自5’末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列；
所述DNA分子A具体通过权利要求3中的所述重组载体中导入目的水稻中。
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