CN118146329A - 与植物抗逆性相关蛋白SpJAZ5及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白SpJAZ5及其编码基因与应用，属于生物技术领域，蛋白SpJAZ5的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的SpJAZ5基因可被NaCl诱导表达。对转化本发明所提供的植物抗逆性相关基因SpJAZ5后得到的过量表达的拟南芥植株进行逆境生理实验，证明转入SpJAZ5基因后，提高了拟南芥的抗逆性。本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白SpJAZ5及其编码基因为人为控制植物中抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆植物中发挥重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种与植物抗逆性相关蛋白SpJAZ5及其编码基因与应用。
背景技术
海马齿是一种贴地生长在热带和亚热带近海岸沙地的肉质草本盐生植物，具有繁殖快，并且对干旱、盐碱和重金属具有高度的耐受性，因而可以作为土壤修复以及盐碱地改造的潜力植物。
植物体在逆境胁迫下会产生一系列应答反应，同时伴随着许多生理及发育上的变化。通过基因工程等手段解析植物对逆境的反应机制，并深入到细胞、分子水平，以生物技术手段改良植物生长特性，能够有效提高植物对逆境的适应能力。
在盐胁迫等非生物胁迫环境下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。如植物可以通过激素代谢调节减少水分的过度散失，维持细胞的膨压，从而保植物多种生理过程的正常进行。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物能够直接参与植物的胁迫应答，或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。
茉莉酸及其衍生物(JAs)是一类重要的植物内源性抗逆信号分子，其介导的信号转导途径在植物的生长发育、抗逆以及衰老过程中起着重要的作用。茉莉酸信号通路主要涉及茉莉酸的生物合成和茉莉酸信号的转导等两个方面，当前对茉莉酸信号通路的研究多涉及胁迫方面。植物茉莉酸信号途径的3个核心环节包括SCFCOI1-JAZ-MYC2(TF)。
然而，在海马齿中茉莉酸应对高盐胁迫的分子机制相关研究目前很少。因此，发现新的与植物抗逆性相关的茉莉酸信号途径调节蛋白，将为人为控制植物中抗逆相关基因的表达奠定基础，同时也为培育新的抗逆植物提供重要的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种与植物抗逆性相关的新的蛋白及其编码基因与应用。
本发明的技术方案为：SpJAZ5蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
编码上述所述的SpJAZ5蛋白的基因。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
一种载体，含有上述所述的基因。
一种工程菌，含有上述所述的载体。
上述所述的基因或载体或工程菌在提高植物抗逆性上的应用。
进一步地，所述植物为双子叶植物。
更进一步地，所述植物为海马齿或拟南芥。
进一步地，所述抗逆性是指耐盐性。
更进一步地，所述耐盐性是指耐NaCl。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的SpJAZ5基因可被NaCl诱导表达。对转化本发明所提供的植物抗逆性相关基因SpJAZ5后得到的过量表达的拟南芥植株进行逆境生理实验，证明转入SpJAZ5基因后，提高了拟南芥的抗逆性。本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白SpJAZ5及其编码基因为人为控制植物中抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆植物中发挥重要的作用。
附图说明
图1为SpJAZ5基因受到盐胁迫时在根、茎、叶等组织中的诱导表达。其中，处理时间是0h的为对照组(CK)，处理时间是1-12h的为处理组。
图2为pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA重组表达载体的构建流程图
图3为T3代转SpJAZ5基因拟南芥植株的PCR检测结果，泳道M为DNA分子量标准；泳道WT为野生型拟南芥阴性对照；泳道H2O为空白对照，泳道1-10分别为10个鉴定阳性的转空载和SpJAZ5基因拟南芥植株。
图4为盐胁迫条件下T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)表型观察结果。其中OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3分别为鉴定阳性的T3代转SpJAZ5基因拟南芥植株。CK表示转空载体pCAMBIA2300-GFP-HA的拟南芥植株对照。
图5为盐胁迫条件下T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)根长比较结果。(图中不同小写字母表示两组数据之间差异性显著(p<0.05),下同)。
图6为盐胁迫条件下T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)侧根数比较结果。
图7为T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)盐胁迫处理前后表型比较结果。
图8为盐胁迫条件下T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)过氧化氢积累部位显色比较结果。
图9为盐胁迫条件下T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)过氧化氢含量比较结果。
图10为T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)盐胁迫处理前后脯氨酸的增加量比较结果。
图11为T3代转SpJAZ5基因拟南芥和转空载拟南芥(CK)盐胁迫处理前后叶绿素的减少量比较结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1、与植物抗逆性相关的基因SpJAZ5的获得
以中国海南省三亚市红沙码头附近海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)品种为实验材料，使用植物多糖多酚总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录得其全基因组cDNA，作为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增。
引物1：5′-ATGACCTTTTCTCAGACTT-3′(SEQ ID No.1的第58-76位)
引物2：5′-CTAGAGCTGCTGTTGCTGA-3′(SEQ ID No.1的第789-807位的反向互补序列)
PCR扩增体系(50ul)：2×TransHiFi PCR SuperMix 25ul，cDNA模板(反转录反应液)1ul(0.05ug)上游引物(10uM)1ul，下游引物(10uM)1ul，ddH2O补足至50ul。
反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火64℃30s；72℃延伸1min；循环数35；72℃延伸7min；4℃保存。扩增出第一轮PCR产物。反应结束后，得到PCR产物进行测序鉴定，表明该PCR产物片段具有SEQ ID No.1的第58-807位核苷酸序列，然后通过5′RACE和3′RACE的方法获得cDNA全长序列，将其命名为SpJAZ5。SpJAZ5基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，cDNA全长807bp，该序列包括57bp的5′非编码区(5′-UTR)，747bp的蛋白质编码区(SEQ ID No.3)。该序列可编码249个氨基酸的蛋白质(SEQ ID No.2)，预测蛋白质分子量为269.08kD，等电点(pI)9.79。WoLFPSORT软件内部程序预测基因表达产物定位于细胞核；蛋白质功能域预测发现包含2个功能域：TIFY domain和Jas domain。
因此，预测SpJAZ5能编码一个茉莉酸信号途径中的调节蛋白，从而在海马齿耐盐过程中发挥作用。
实施例2、SpJAZ5在盐胁迫下的表达模式分析
选取生长环境及生理状态一致的海马齿进行扦插，从母株剪取含有四片对生叶带有两个节点的茎段，长约4-6cm，放于自来水中，自然条件下培育14d后再用1/2Hoagland营养液培养一周，之后用含400mM NaCl的1/2Hoagland营养液正式处理实验材料12h。每隔1h采集根、茎和叶进行qRT-PCR分析。每个阶段的样本至少从三株植物数据中获得。RNA提取使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒，逆转录反应使用0.8ugRNA和II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)完成，4ul 5×/>II All-in-One SuperMix、1ul gDNA Remover和0.8ugRNA混合反应合成cDNA第一链。样品于50℃孵化15min，然后在85℃孵化5s，最后在4℃下储存。使用ABclonal Genious 2×SYBR Green Fast qPCR Mix实时聚合酶链式反应系统在96孔板中进行qRT-PCR。
以海马齿看家基因GAPDH为内参，作为衡量模板量的对照，通过RT-PCR分析SpJAZ5基因在不同胁迫时间的表达。同时设置未经NaCl处理的海马齿(Sesuvium portulacastrumL.)材料作为对照(CK)。实验重复三次，结果取平均值。
用于扩增SpJAZ5基因非编码区的引物：
引物1：5′-AGAGCTGACGTTTTTGTGAG-3′(取自SpJAZ5基因序列非编码区)
引物2：5′-TAAGGGAATAGATATTTGTA -3′(取自SpJAZ5基因序列非编码区)
用于扩增GAPDH基因的引物：
上游引物：5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′
下游引物：5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′
结果如图1所示，从图中可以看出，NaCl胁迫处理时，SpJAZ5基因的mRNA在不同组织中迅速积累。在根中，SpJAZ5基因在第1h时达到最大值，此后SpJAZ5的表达量开始下调。在茎中，SpJAZ5基因在第11h时达到最大值。而在叶中，SpJAZ5基因在第8h时达到最大值。SpJAZ5的表达量海马齿植株上总体表现为先上调后下调的趋势。
实施例3、转SpJAZ5基因拟南芥的获得及其功能验证
一、转SpJAZ5基因拟南芥的获得
1、SpJAZ5基因重组表达载体pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA的构建
以上述实施例1扩增得到的SpJAZ5基因(SEQ ID No.1)为模板，以含有BamHI和KpnI酶切位点的同源臂引物G-SpJAZ5-F和G-SpJAZ5-R进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段回收并纯化，将其通过无缝克隆技术连接至pCAMBIA2300-GFP-HA载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(TIANGEN，北京，货号CB101)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。
G-SpJAZ5-F：5′-GGGGACTCTTGAGGATCCATGACCTTTTCTCAGACTT-3′(下划线为BamHI位点，其后的序列为SEQ ID No.1的第58-76位)
G-SpJAZ5-R：5′-GACAGATCCCCGGGTACCCTAGAGCTGCTGTTGCTGA-3′(下划线为KpnI位点，其后的序列为SEQ ID No.1的第789-807位的反向互补序列)
测序结果表明，扩增出的片段具有SEQ ID No.1中的自5’端第58-807位所示的核苷酸序列。提取测序结果正确的质粒即重组表达载体，命名为pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA。在重组表达载体pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA中，启动所述SpJAZ5基因转录的启动子为35S启动子，该重组表达载体的构建流程图如图2所示。
2、转SpJAZ5基因拟南芥的获得
将上述步骤1构建好的重组表达载体pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA通过冻融法(参考张露，李世峰，彭绿春等.一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法[P].云南省：CN115521941A.2022)转入农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司，产品目录号为AC1001)。同时设置转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体的对照。对转化空载体及重组表达载体的重组农杆菌用通用引物1和引物2进行PCR鉴定：
引物1：CGCAAGACCCTTCCTCTAT(载体骨架核酸片段序列)
引物2：CACCTTCACCCTCTCCACT(载体骨架核酸片段序列)
将经鉴定表明含有SpJAZ5基因(PCR目的条带大小约为959bp)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA；将转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体(PCR目的条带大小约为224bp)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA2300-GFP-HA。
采用农杆菌花序侵染的方法将上述所得的重组农杆菌GV3101/pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA(或GV3101/pCAMBIA2300-GFP-HA)转化拟南芥品种野生哥伦比亚生态型Col-0。具体如下：选用哥伦比亚野生型拟南芥种子在超净工作台内点在1/2MS培养基上，依次按照避光4℃，3d；23℃，16h光照/8h黑暗，10d左右(长出两片真叶后移栽至营养土中)；23℃，8h光照/16h黑暗，24d等条件培养。之后在23℃，15h光照/9h黑暗条件下继续培养。将农杆菌GV3101/pCAMBIA2300-SpJAZ5-GFP-HA和GV3101/pCAMBIA2300-GFP-HA各吸取1ml分别加入到60ml含卡那霉素(50ug/ml)和利福平(20ug/ml)等抗生素的LB液体培养基中，在恒温摇床中以220rpm，28℃条件进行培养，待OD600值达到1.5左右，将菌液以4000rpm离心15min，分别倒掉上清液收集菌体沉淀，并利用重悬液(1/2MS，5％蔗糖，PH＝5.8)重新悬浮菌体至OD600值达到1左右，添加0.02％的silwet-L-77。待拟南芥长出两片真叶时移栽至营养土中，并在开花期开始侵染。侵染时将整个花序浸没在重悬后的菌液中1～2min，随后用干净的塑料膜将侵染过的拟南芥植株包裹起来，黑暗条件培养48h，随后在23℃，15h光照/9h黑暗条件下正常培养。为了提高转化效率，在第一次侵染7天后可重新侵染一次。待拟南芥生长成熟后，将转基因T0代种子进行回收，将回收的转基因T0代种子晾干后，制备含有卡那霉素(40ug/ml)的1/2MS培养基。将种子依次进行以下处理：75％酒精4～5min，10％次氯酸钠5～6min，无菌水重悬处理8次(最后一次尽量吸除水分)，0.05％琼脂将种子悬浮。随后将准备好的种子均匀接种在制备好的抗性平板上，待种子晾干并紧附在培养基上，将平板用塑封膜封口，依次按照避光4℃，3d；23℃，16h光照/8h黑暗，14d左右(抗性苗长出两片真叶后移栽至营养土中)；23℃，8h光照/16h黑暗，24d等条件培养。之后在23℃，16h光照/8h黑暗条件下继续培养。期间待拟南芥在营养土中生长1周左右采集少量叶片提取DNA进行PCR检测。同样，待拟南芥成熟后收集T1代种子。按上述操作继续收集得到T2、T3代转基因植株。为避免干扰，上述PCR检测针对空载体和重组表达载体分别设计两对引物(引物1/引物2；引物3/引物4)。设置未转基因的野生型拟南芥作为阴性对照(WT)，并设置空白对照(H2O)。
引物1：CGGCTATGACTGGGCACAACAGACAAT(载体骨架核酸片段序列)
引物2：CTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGAC(载体骨架核酸片段序列)
引物3：CGTAAGGGATGACGCACAA(载体骨架核酸片段序列)
引物4：CCATCAAAGGACTAAACCC(SEQ ID No.1的第271-289位的反向互补序列)
PCR检测结果如图3所示，不同的转基因株系用引物3和引物4均扩增得到了长度约为380bp的片段。而用引物1和引物2对转空载体的拟南芥对照植株进行PCR检测，得到274bp的载体骨架核酸片段。野生型拟南芥植株(WT)和空白对照组(H2O)进行PCR检测均未得到上述扩增片段。此结果表明，所检测的10个(图3泳道1至10)转SpJAZ5基因株系均为阳性，依次命名为OE_JAZ5_1至OE_JAZ5_10。
二、转SpJAZ5基因拟南芥的耐盐性鉴定
以步骤一获得的T3代转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)幼苗为实验材料，以盐胁迫下植株表型、过氧化氢、脯氨酸、叶绿素、相对含水量及离体失水率等生理指标的变化，对比转入空载体的拟南芥，研究转基因拟南芥的耐盐性。
1.转SpJAZ5基因拟南芥生长情况
以转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体的拟南芥作为对照(CK)，待转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)和CK对照植株在1/2MS培养基上培养7d，之后将苗移至含有150mM NaCl的1/2MS培养基上。处理10d后，观察植株的表型，所述表型涉及主根长及侧根数等因素。实验重复三次，结果取平均值。表型结果如图4所示，T3代转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)和CK对照植株相比较，明显主根长更长，侧根数更多。具体根长与侧根数测量统计结果见图5、图6、表1和表2。
表1T3代转基因拟南芥盐胁迫下根长统计结果单位：cm(平均值精确到百分位)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| CK | 2.1 | 2.6 | 2.3 | 2.33 |
| OE_JAZ5_1 | 2.7 | 2.8 | 3.1 | 2.87 |
| OE_JAZ5_2 | 2.7 | 2.4 | 2.5 | 2.53 |
| OE_JAZ5_3 | 2.4 | 2.8 | 2.2 | 2.47 |
表2T3代转基因拟南芥盐胁迫下侧根数统计结果单位：个(精确到个位)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| CK | 8 | 5 | 5 | 6.0 |
| OE_JAZ5_1 | 9 | 7 | 10 | 8.7 |
| OE_JAZ5_2 | 7 | 8 | 10 | 8.3 |
| OE_JAZ5_3 | 7 | 10 | 10 | 9.0 |
以转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体的拟南芥作为对照(CK)，待转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)和CK对照植株在1/2MS培养基上培养7d，之后移苗至土壤中培养14天后用350mM NaCl浇灌处理5天，观察拟南芥表型，所述表型涉及植株长势等因素。表型观察结果如图7所示，在土壤生长环境中，经高盐胁迫处理后，与对照组拟南芥相比较，转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)生长存活状况更佳。由此可见，SpJAZ5基因过表达后能有效提升拟南芥的耐盐能力。
2.转SpJAZ5基因拟南芥过氧化氢积累及含量测定
以转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体的拟南芥作为对照(CK)，待转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)和CK对照植株在1/2MS培养基上培养14d，用150mMNaCl溶液处理5h。利用DAB染色试剂盒(Biosharp公司，产品目录号为BL732A)对过氧化氢的积累部位进行显色。结果如图8所示，转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)染色均比转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体对照(CK)植株浅，染色部位于叶柄和叶脉处分布居多。
同时，以转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体的拟南芥作为对照(CK)，待转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)和CK对照植株在1/2MS培养基上培养14d，随后移苗至土壤中继续培养14d后用150mM NaCl浇灌72h，依次取材测定过氧化氢含量。实验重复三次，结果取平均值。最终实验结果如图9和表3所示，转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)的过氧化氢含量均显著低于转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体对照(CK)植株，说明SpJAZ5基因过表达后能有效提升拟南芥植物体内对过氧化氢等活性氧的处理能力，从而赋予其对盐胁迫的耐受性。
表3T3代转基因拟南芥盐胁迫下过氧化氢含量测定结果单位(umol/g鲜重)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| CK | 8.571 | 8.227 | 7.094 | 7.964 |
| OE_JAZ5_1 | 6.207 | 6.305 | 6.453 | 6.322 |
| OE_JAZ5_2 | 6.552 | 6.798 | 7.192 | 6.847 |
| OE_JAZ5_3 | 7.143 | 6.650 | 7.488 | 7.094 |
3.转SpJAZ5基因拟南芥脯氨酸和叶绿素含量测定
以转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体的拟南芥作为对照(CK)，待转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)和CK对照植株在1/2MS培养基上培养7d，随后移苗至土壤中培养4周后用350mM NaCl浇灌72h，对浇灌前后拟南芥苗依次取材测定脯氨酸含量和叶绿素，各处理材料3个重复，结果取平均值。
表4T3代转基因拟南芥盐胁迫下脯氨酸的增加量单位(ug/ml)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| CK | 1.442518 | 1.639225 | 1.508087 | 1.529943333 |
| OE_JAZ5_1 | 1.96707 | 1.639225 | 1.508087 | 1.704794 |
| OE_JAZ5_2 | 2.163777 | 1.704794 | 2.360484 | 2.076351667 |
| OE_JAZ5_3 | 1.508087 | 1.639225 | 2.098208 | 1.748506667 |
表5T3代转基因拟南芥盐胁迫下叶绿素的减少量单位(mg.g-1FW)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均 | |
| CK | 0.238 | 0.211 | 0.231 | 0.227 |
| OE_JAZ5_1 | 0.176 | 0.213 | 0.205 | 0.198 |
| OE_JAZ5_2 | 0.147 | 0.142 | 0.176 | 0.155 |
| OE_JAZ5_3 | 0.158 | 0.175 | 0.168 | 0.167 |
最终实验结果如图10、图11、表4和表5所示，转SpJAZ5基因拟南芥(OE_JAZ5_1、OE_JAZ5_2和OE_JAZ5_3)的脯氨酸的增加量均显著高于转入pCAMBIA2300-GFP-HA空载体对照(CK)植株，且叶绿素的减少量低于对照(CK)植株，这表明转基因拟南芥在盐胁迫逆境环境中能够积累更多的脯氨酸来进行相应的代谢调节，从而降低盐胁迫对机体的伤害程度。同时也表明，盐胁迫对转基因拟南芥叶绿素的破坏程度更小。
Claims (10)
1.SpJAZ5蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述的SpJAZ5蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.一种载体，含有权利要求2或3所述的基因。
5.一种工程菌，含有权利要求4所述的载体。
6.权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的载体或权利要求5所述的工程菌在提高植物抗逆性上的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为海马齿或拟南芥。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗逆性是指耐盐性。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述耐盐性是指耐NaCl。
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