CN115851761A - 一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，公开了一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用，从红花大金元中克隆获得类扩展蛋白基因外显子，烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，NtEXLA2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。本发明为分析烟草抗旱提供新的基因，利用基因工程技术获得抗旱性更高的红花大金元植株；将烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2导入红花大金元，并使其在红花大金元中过表达，调控相关抗氧化酶基因在红花大金元中的转录，为烟草抗旱品种的培育提供参考和科学依据，有利于克服烟草品质和产量因为生产过程中遭受干旱胁迫而受损的问题，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用。

背景技术

在20世纪70年代初期，科学家就曾提出“酸生长理论”即生长中的植物组织细胞，在酸性条件下的扩展或生长速度将大大超过中性条件。研究发现植物激素等可以刺激胞壁合成，增加胞壁可塑性，其诱导的起始阶段包括一个快速的胞壁酸化过程，即酸性环境刺激引起细胞膨胀。为此现象的研究中提供了突破性进展的是一种细胞壁松弛蛋白expansin的出现，美国宾夕法尼亚大学Daniel实验室在1992年从黄瓜细胞壁中分离得到了CsEXP1和CsEXP2两种细胞壁蛋白。这两种蛋白可以在酸性条件下诱导离体细胞壁的扩张生长，随后这类蛋白被命名为“扩展蛋白(expansins)”。

典型的植物扩展蛋白是椭圆形状的蛋白质(长约6nm，宽约4nm)，一般有250～275个氨基酸，蛋白大小一般为25～27kDa，包含N端22～25个氨基酸组成的信号肽和两个主要结构域：一个纤维素结合域、一个类似GH45的水解结构域。扩展蛋白的蛋白结构中存在信号肽，信号肽可能行使引导功能，将expansin蛋白定位于细胞壁上，所以推测其在细胞壁形成过程中发挥作用。

扩展蛋白作为植物细胞壁的重要组成部分，通过削弱壁多糖之间非共价结合的作用方式，使细胞壁组分间疏松，促使细胞伸展，增强细胞的柔韧性，以此缓解各种环境胁迫对细胞的压力。扩展蛋白参与了植物生长发育中种子发育、根生长发育、叶片生长发育、花粉发育、果实成熟过程。当病原菌侵染植株时，植株细胞中扩展蛋白基因的表达迅速增加，并在距离病原菌接种部位有一定距离的细胞中发现扩展蛋白的转录本也有所增加，表明接收到外侵信号时，细胞壁可能通过提高扩展蛋白表达实现细胞壁延展性的变化来阻挡病菌的侵入。当植物处于逆境胁迫时，通过扩展蛋白疏松细胞壁的组分，增加细胞壁的柔韧性，维持细胞的基本形态，可以舒缓逆境造成的压力。

烟草作为一种重要的经济作物，其品质和产量常常因为遭受干旱胁迫而受损。在烟草抗旱相关基因的研究中，烟草自身与抗旱相关的基因还有待进一步发掘与深入研究。在早期研究中认为细胞壁能够调控植物细胞延伸以应对水分亏缺，在近年来的研究中报道了扩展蛋白基因参与植物抗旱过程，但关于其在烟草抗旱的研究报道较少，而类扩展蛋白基因的研究报道更是少之又少。因此，分析烟草中的类扩展蛋白EXLA家族基因NtEXLA2对干旱胁迫的响应以及对烟草抗旱性的影响有着重要意义。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：类扩展蛋白基因的研究报道少，现有技术中针对扩展蛋白基因在烟草抗旱的研究报道较少。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用，尤其涉及一种具有抗逆抗旱能力的烟草expansin-like类扩展蛋白基因NtEXLA2及其在提高烟草对干旱胁迫的抗性中的应用。

本发明是这样实现的，一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2，所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

进一步，从红花大金元中克隆获得类扩展蛋白基因外显子，所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2的cDNA全长序列为801bp。

进一步，所述NtEXLA2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2编码得到的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述的烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定所述的烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法，所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法包括：

分离克隆红花大金元的抗旱胁迫相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，同时将基因命名为NtEXLA2，最后通过实验验证基因NtEXLA2是否具有抗干旱胁迫的作用。

进一步，所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法包括以下步骤：

步骤一，NtEXLA2基因克隆：从红花大金元根中提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，采用扩增NtEXLA2的特异引物，通过逆转录-聚合酶链式反应扩增出NtEXLA2的编码区并连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

步骤二，植物超表达载体构建以及农杆菌介导的遗传转化：用Sac I和BamH I酶切载体pCAMBIA1300S并回收，根据基因序列设计与载体有相同酶切位点的引物21OVEXLA2-F与21OVEXLA2-R，以构建的TA-NTEXLA2质粒为模板进行扩增，获得与pCAMBIA1300S具有相同酶切位点的PCR产物21OVEXLA2；酶切载体与扩增的目的基因片段用同源重组方式连接，构建植物超表达载体，并将构建的重组载体通过根癌农杆菌介导的叶盘法转入红花大金元中表达；

步骤三，NtEXLA2超表达株系相关抗氧化酶基因表达：以重组载体pCAMBIA1300s-NtEXLA2上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR检测得到真正的转基因株系，检测相关抗氧化酶基因在超表达红花大金元株系的转录水平。

进一步，所述步骤一中，以反转录得到的cDNA为模板扩增目的基因片段，上游引物序列为SEQ ID NO：3，上游引物序列为SEQ IDNO：4。

进一步，所述步骤二中，用限制性内切酶Sac I和BamH I对pCAMBIA1300S载体进行酶切，以pGEM-T-NtEXLA2为模板，用带有相同酶切位点的引物扩增基因，上游引物序列为SEQ ID NO：5，上游引物序列为SEQ ID NO：6。

进一步，所述步骤三中的NtEXLA2超表达株系相关抗氧化酶基因包括SOD、POD和CAT；所述相关抗氧化酶基因的定量PCR引物序列为SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

本发明为分析烟草抗旱提供了一个新的基因，通过利用基因工程技术获得抗旱性更高的烟草植株。本发明将烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2导入红花大金元，并使其在红花大金元中过表达，调控了相关抗氧化酶基因(SOD，POD，CAT)在红花大金元中的转录，这些结果为烟草抗旱品种的培育提供了参考和科学依据。

本发明提供的烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2有利于克服烟草品质和产量常常因为生产过程中遭受干旱胁迫而受损的问题，具有广阔的市场应用前景。

本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：通过表达烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2提高烟草抵抗干旱胁迫的能力，在生产上具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法流程图；

图2是本发明实施例提供的部分NtEXLA2超表达株系基因组DNA的PCR检测结果示意图；其中M为DNAMarker，1～19为阳性转基因过表达单株，B为空白对照，N为阴性对照，P为阳性对照；

图3是本发明实施例提供的阳性NtEXLA2过表达红花大金元株系中NtEXLA2转录水平的表达分析结果图；其中WT2为非过表达对照植株，OV2-2、OV2-13、OV2-17、OV2-24为过表达株系；a～e等不同的字母代表差异达到显著水平(P<0.05)；

图4是本发明实施例提供的在过表达株系中相关抗氧化酶基因表达水平图；其中WT2为非过表达对照植株，OV2-2、OV2-13、OV2-17、OV2-24为过表达株系；a～e等不同字母代表差异达到显著水平(P<0.05)；图a为SOD酶基因相对表达量，图b为POD酶基因相对表达量，图c为CAT酶基因相对表达量。

图5是本发明实例提供的相同生长时期的阴性红花大金元与T1代转基因红花大金元植株比较图；其中A为阴性红花大金元植株，B～D为相同生长时期T1代转基因红花大金元植株。

图6是本发明实例提供的转化植株PCR鉴定，-为水模板，+为含有目标基因的载体，2为图5阴性植株A，3～5为图5B～D阳性植株。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

本发明实施例的目的是提供一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其在提高烟草对干旱胁迫的抗性中的应用。

本发明实施例从烟草中克隆获得类扩展蛋白基因外显子，类扩展蛋白基因NtEXLA2核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因cDNA全长序列为801bp，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：1：

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本发明实施例中NtEXLA2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。

本发明实施例分离克隆烟草的一个抗旱胁迫相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗干旱胁迫的作用，为后期利用该基因改良烟草奠定基础，本发明人将这个基因命名为NtEXLA2。

如图1所示，本发明实施例提供的鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法包括以下步骤：

S101，NtEXLA2基因克隆；

S102，植物超表达载体构建以及农杆菌介导的遗传转化；

S103，NtEXLA2超表达株系相关抗氧化酶基因表达。

本发明实施例提供的NtEXLA2基因可以应用于提高烟草的抗旱胁迫特性，具体操作如下：

(1)从烟草根中提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，采用扩增NtEXLA2的特异引物，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出NtEXLA2的编码区，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

(2)用Sac I和BamH I酶切载体pCAMBIA1300S并回收，根据基因序列设计与载体有相同酶切位点的引物21OVEXLA2-F与21OVEXLA2-R，以构建的TA-NTEXLA2质粒为模板进行扩增，获得与pCAMBIA1300S具有相同酶切位点的PCR产物21OVEXLA2。酶切载体与扩增的目的基因片段用同源重组方式连接，构建植物超表达载体，之后将构建的重组载体通过根癌农杆菌介导的叶盘法转入烟草中表达；

(3)以重组载体pCAMBIA1300s-NtEXLA2上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR检测得到真正的转基因株系，检测相关抗氧化酶基因(SOD，POD，CAT)在超表达烟草株系的转录水平。

本发明实施例提供的烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2，为分析烟草抗旱提供了一个新的基因，通过基因工程技术获得抗旱性更高的烟草植株，有利于克服烟草品质和产量常常因为生产过程中遭受干旱胁迫而受损的问题。将烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2导入烟草，并使其在烟草中过表达，调控了相关抗氧化酶基因(SOD，POD，CAT)在红花大金元中的转录，这些结果为烟草抗旱品种的培育提供了参考和科学依据，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

将烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2通过基因工程技术在红花大金元中过表达，获得NtEXLA2的过表达植株，过表达植株中抗氧化酶POD和CAT基因表达显著上调。通过类扩展蛋白基因NtEXLA2的应用，期望获得高抗旱能力的烟草植株。

实施例1：NtEXLA2基因克隆及序列分析

用液氮将红花大金元根部研磨成粉末，采用magenRNA提取试剂盒提取红花大金元总RNA，采用宝生生物公司逆转录试剂盒TAKARA047A进行逆转录反应，反应体系跟操作过程为：取1μg总RNA，依次加入2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser，加入RNaseFree dH₂O到10μL，42℃反应2min或室温放置5min，反应完后放在冰上，分别加入1.0μLPrime Script RT Enzyme Mix I，1.0μLRT PrimerMix，4.0μL 5×Prime ScriptBuffer 2(forReal Time)，4.0μLRNase Free dH₂O，37℃反应15min，85℃反应5s，放入-20℃保存待用。

以反转录得到的cDNA为模板，扩增目的基因片段，所用上下游引物为SEQ ID NO：3(5'atgaagattatggctgtcaaattcc 3')及SEQ ID NO：4(5'ctaatgaagtttccagtttccatcat3')，采用PCR克隆，反应条件为95℃、3min；95℃、15s，60℃、15s，72℃、60s，35个循环；72℃、5min。反应体系为1μL cDNA，12.5μL Phanta酶，1μL正向引物，1μL反向引物，9.5μL ddH₂O。PCR结束后，取4μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性及大小。对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-TVector SystemI(Promega，USA)，反应体系和操作过程为：取1.5μLPCR产物，依次加入1μLpGEM-T Vector(50ng/μL)和2.5μL 2×Ligation solutionI，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中；使用含有卡那霉素的LB固体培养基，筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用通用引物鉴定出插入的NtEXLA2克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的NtEXLA2 cDNA与预测序列完全一致，总长801bp，为完整的开放阅读框，编码含266个氨基酸残基的蛋白质，分子量为28.98kDa。

图2是本发明实施例提供的NtEXLA2超表达株系基因组DNA的PCR检测结果示意图；其中M为DNAMarker，1～19为阳性转基因过表达单株，B为空白对照，N为阴性对照，P为阳性对照。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入NtEXLA2的大肠杆菌质粒pGEM-T-NtEXLA2以及植物表达载体pCAMBIA1300s的质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶Sac I和BamH I对pCAMBIA1300S载体进行酶切，以pGEM-T-NtEXLA2为模板，用带有相同酶切位点的引物扩增基因，引物序列为SEQ ID NO：5(5'ctctct cgagctttcgcgagctcatgaagattatggctgtcaaattc3')及SEQ ID NO：6(5'ctgcaggtcgactctagaggatccctaatgaagtttccagtttccatc 3')，使扩增产物两端带酶切位点，利用同源重组法将NtEXLA2与酶切后的pCAMBIA1300S载体相连。反应体系如下：取5μg pCAMBIA1300s质粒，依次加入5μL 10×M buffer、2.5μL SacI、2.5μLBamHI，补齐ddH₂O至总体积为50μL，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后pCAMBIA1300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒；取1μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用同源重组将扩增后的NtEXLA2和酶切后的pCAMBIA1300S载体连接，反应体系及过程如下：目基因片段50ng，酶切载体100ng，同源重组酶2.5μL，ddH₂O To 5μL，50℃水浴20min。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增NtEXLA2的特异引物进行PCR，挑选出Nt EXLA2与pCAMBIA1300S成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA1300S-NtEXLA2质粒，将重组质粒pCAMBIA1300S-NtEXLA2通过电击法转化到农杆菌GV3101感受态细胞，将活化后的农杆菌涂于含有50mg/L Km的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增NtEXLA2的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA1300S-NtEXLA2是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的遗传转化及超表达红花大金元株系的筛选

取出保存在-80℃超低温冰箱中的农杆菌GV3101(含重组质粒)置于冰上融化，取1mL菌液涂在LB固体培养基上(含有卡那霉素)，然后将平板放于28℃暗培养48h。从平板上刮取适量的农杆菌，接种于LB液体培养基中，加入一定量的乙酰丁香酮，在28℃，200rpm振荡培养0.5～1h，当菌液OD600＝0.3～0.5时，即可进行转化红花大金元叶片。

在超净工作台内，将活化好的菌液30mL倒入已灭菌的100mL三角瓶中，将生长良好的红花大金元无菌苗的叶片切成1cm×1cm大小，然后将叶片放入菌液中，确保所有的叶片都浸没在菌液中，侵染7至10分钟，在侵染过程中轻轻摇晃三角瓶。将侵染过的叶片用镊子从三角瓶中轻轻取出，在无菌滤纸上吸干多余菌液。在共培养培养基中放入一张无菌滤纸，将侵染后的红花大金元叶片均匀分散在滤纸上，在21℃暗培养2至4天。将共培养后的红花大金元叶片转移到愈伤组织诱导培养基上，每个培养基接种6～7块叶片，1～2周后获取愈伤组织。红花大金元再生和生根：切下叶片边缘愈伤组织分化出的不定芽，转移到烟草生根培养基上进行生根培养，两周后长出不定根，获得转基因红花大金元无菌苗。准备若干100mL三角瓶，标注好编号，装满清水备用。用镊子将在生根培养基中获得的转基因红花大金元无菌苗从组培瓶中取出，冲洗干净根部的培养基，将无菌苗按编号放置准备好的三角瓶中，在培养箱练苗2至3天。然后将练苗后的红花大金元移栽到温室生长。

采用CTAB法提取转基因红花大金元基因组DNA，取1μL所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因红花大金元基因组DNA为模板，用筛选标记基因hpt的特异引物进行PCR检测。PCR结束后，取5μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性植株。筛选出的T₀代超表达红花大金元阳性苗种于温室中。

图3是本发明实施例提供的阳性NtEXLA2过表达红花大金元株系中NtEXLA2转录水平表达分析结果图；其中WT2为非过表达对照植株，OV2-2、OV2-13、OV2-17、OV2-24为过表达株系；a～e等不同字母代表差异达到显著水平(P<0.05)。

实施例4：NtEXLA2超表达株系相关抗氧化酶基因(SOD，POD，CAT)表达。

提取阳性超表达红花大金元叶片总RNA，并将总RNA逆转录为cDNA。设计烟草相关抗氧化酶基因(SOD，POD，CAT)的定量PCR引物，引物序列见SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12。

其中，SEQ ID NO：7(ccaccagaag catcatcaga)，SEQ ID NO：8(ttcccagaagaggaaccaaa)，SEQ ID NO：9(caccccaact gatgttgttg)，SEQ ID NO：10(ttggccctaatttcaccttg)，SEQ ID NO：11(tcatgctaga ggtgccagtg)，SEQ ID NO：12(ctgtcgggag acaaacatca)。

采用qRT-PCR的方法对超表达红花大金元株系中NtEXLA2的表达水平以及上述几个关键酶基因的表达量进行定量分析。qRT-PCR反应体系如下：1μL cDNA、10μL

Green Master Mix、1μLPrimer QF(10mM)、1μLPrimer QR(10mM)、7μL RNase-Free ddH₂O；PCR反应条件：94℃，5min，1个循环；94℃、15s，60℃、60s，40个循环；熔解曲线分析：60～95℃。以上每个qRT-PCR反应均做3个重复。为保证实验结果的可靠性，本次实验将cDNA模板稀释至同一水平，并利用2^-ΔΔCt法对荧光定量数据进行计算。qRT-PCR结果表明NtEXLA2在几个超表达红花大金元株系中大量表达，并且NtEXLA2的过表达显著提高了烟草相关抗氧化酶基因POD和CAT的表达水平。

图4是本发明实施例提供的在过表达株系中相关抗氧化酶基因表达水平图；其中WT2为非过表达对照植株，OV2-2、OV2-13、OV2-17、OV2-24为过表达株系；a～e等不同字母代表差异达到显著水平(P<0.05)；图a为SOD酶基因相对表达量，图b为POD酶基因相对表达量，图c为CAT酶基因相对表达量。图4b和4c中结果显示转基因阳性苗中POD酶基因和CAT酶基因表达量相较于阴性植株显著上调。

图5是本发明实例提供的相同生长时期的阴性红花大金元与T1代转基因红花大金元植株比较图；其中A为阴性红花大金元植株，B～D为相同生长时期T1代转基因红花大金元植株。与A相比，T1代转基因植株B、C、D在相同生长时期下根系更长，叶片更大。

图6是本发明实例提供的转化植株PCR鉴定，-为水模板，+为含有目标基因的载体质粒，2为图5阴性植株A，3～5为图五B～D阳性植株，转基因T1代植株中带有目标基因，该基因可遗传给后代。

图5图6表明转基因植株可把目标基因遗传给后代，并且具有该过表达基因的植株生长速度快于普通植株。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2，其特征在于，所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2，其特征在于，从烟草中克隆获得类扩展蛋白基因外显子，所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2的cDNA全长序列为801bp。

3.如权利要求1所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2，其特征在于，所述NtEXLA2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。

4.一种实施如权利要求1～3任意一项所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2编码得到的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

5.一种如权利要求1～3任意一项所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中的应用。

6.一种鉴定如权利要求5所述烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法，其特征在于，所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法包括：

分离克隆烟草的抗旱胁迫相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，同时将基因命名为NtEXLA2，最后通过实验验证基因NtEXLA2是否具有抗干旱胁迫的作用。

7.如权利要求5所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法，其特征在于，所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法包括以下步骤：

步骤一，NtEXLA2基因克隆：从红花大金元根中提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，采用扩增NtEXLA2的特异引物，通过逆转录-聚合酶链式反应扩增出NtEXLA2的编码区并连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

步骤二，植物超表达载体构建以及农杆菌介导的遗传转化：用Sac I和BamH I酶切载体pCAMBIA1300S并回收，根据基因序列设计与载体有相同酶切位点的引物21OVEXLA2-F与21OVEXLA2-R，以构建的TA-NTEXLA2质粒为模板进行扩增，获得与pCAMBIA1300S具有相同酶切位点的PCR产物21OVEXLA2；酶切载体与扩增的目的基因片段用同源重组方式连接，构建植物超表达载体，并将构建的重组载体通过根癌农杆菌介导的叶盘法转入红花大金元中表达；

步骤三，NtEXLA2超表达株系相关抗氧化酶基因表达：以重组载体pCAMBIA1300s-NtEXLA2上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR检测得到真正的转基因株系，检测相关抗氧化酶基因在超表达红花大金元株系的转录水平。

8.如权利要求7所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法，其特征在于，所述步骤一中，以反转录得到的cDNA为模板扩增目的基因片段，上游引物序列为SEQ ID NO：3，上游引物序列为SEQ ID NO：4。

9.如权利要求7所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法，其特征在于，所述步骤二中，用限制性内切酶Sac I和BamH I对pCAMBIA1300S载体进行酶切，以pGEM-T-NtEXLA2为模板，用带有相同酶切位点的引物扩增基因，上游引物序列为SEQ ID NO：5，上游引物序列为SEQ ID NO：6。

10.如权利要求7所述鉴定烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2在提高烟草的抗旱胁迫特性中应用的方法，其特征在于，所述步骤三中的NtEXLA2超表达株系相关抗氧化酶基因包括SOD、POD和CAT；所述相关抗氧化酶基因的定量PCR引物序列为SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12。

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