CN117887757A - CpVQ20基因过表达载体及构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CpVQ20基因过表达载体及构建方法和用途。所述CpVQ20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的CpVQ20基因用于抑制烟草中的白粉病菌生长发育，所述CpVQ20基因用于清除烟草中的ROS，用于烟草的抗病性品种培育，还能够促进烟草抗病相关基因的表达。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CpVQ20基因过表达载体及构建方法和用途。
背景技术
白粉病是一种常见的植物病害，通常出现在叶片表面上，初期表现为黄绿色不规则小斑，边缘不明显，随后病斑不断扩大，表面生出白粉斑，最后该处长出无数黑点。染病部位变成灰色，连片覆盖其表面，边缘不清晰，呈污白色或淡灰白色。受害严重时叶片皱缩变小，嫩梢扭曲畸形，花芽不开。白粉病对许多植物都构成了威胁。
烟草是茄科烟草属的一年生草本植物，也是一种重要的经济作物，其叶片可以用于制作香烟、雪茄和烟斗等烟草制品。然而，在种植过程中，其叶片容易受到不同程度白粉病病害影响，会在烟草叶片叶面或叶背及幼茎上产生近圆形小粉斑，叶正面多，以后向四周扩展成边缘不明晰的连片白粉，严重的整个叶片布满白粉，严重影响了烟草植株的生长和产量。
如何提高烟草对白粉病的抗性是目前亟待解决的问题。
发明内容
为提高烟草对白粉病的抗性，本发明提供了CpVQ20基因、过表达载体及构建方法和用途，本发明提供的CpVQ20基因通过抑制烟草中的白粉病菌丝生长发育提高烟草对白粉病的抗性。
本发明提供了CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，所述CpVQ20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述CpVQ20基因用于抑制烟草中的白粉病生长发育。
进一步地，所述CpVQ20基因用于清除烟草中的ROS。
进一步地，所述CpVQ20基因用于烟草的抗病性品种培育。
进一步地，所述CpVQ20基因能够促进烟草抗病相关基因的表达。
进一步地，所述抗病相关基因包括NtNPR1、NtPAL、NtPDF1.2、NtPR1a及NtPR5。
本发明还提供了CpVQ20基因的过表达载体，所述的CpVQ20基因连接到载体上获得。
本发明还提供了CpVQ20基因的过表达载体的构建方法，包括如下步骤：
通过PCR扩增如SEQ ID NO.1所示的ORF两端含有 BamHI 和 KpnI 的酶切位点的目的基因CpVQ20；
将目的基因CpVQ20与pMD19-T载体进行连接得到重组产物后，大肠杆菌感受态细胞转化，获得质粒；
用限制性内切酶 BamHI 和 KpnI分别酶切质粒和p1301载体，并分别回收目的基因片段和p1301载体线性片段；
将目的基因片段和p1301载体线性片段进行连接，获得连接产物；
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，获得CpVQ20基因的过表达载体。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：premix Taq 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，ddH2O 15μL，cDNA 5μL。
本发明还提供了CpVQ20基因的过表达载体在提高烟草对白粉病的抗性中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的CpVQ20基因能抑制烟草中的白粉病菌丝生长发育，CpVQ20基因能用于清除烟草中的ROS，用于烟草的抗病性品种培育，还能够促进烟草抗病相关基因的表达。
本发明提供的CpVQ20基因，对其进行了白粉病及激素处理下的表达模式分析，遗传转化烟草抗白粉病功能分析，为探讨CpVQ20基因的抗性机制及基因利用提供了理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1 CpVQ20基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳及过表达载体双酶切结果示意图；
图中，A为CpVQ20基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果示意图：从左往右，泳道1和泳道2均表示为PCR扩增产物；
B为CpVQ20基因过表达载体双酶切结果示意图：从左往右，泳道1表示为限制性内切酶 BamHI 和 KpnI 的酶切产物，泳道2表示为p1301载体线性片段。
图2 CpVQ20不同组织及不同处理下的表达量示意图；
图中，A为CpVQ20基因在根、茎、叶中的表达量示意图；
图中，B为白粉病菌处理下CpVQ20基因表达量示意图；
图中，C为SA处理下CpVQ20基因表达量示意图；
图中，D为JA处理下CpVQ20基因表达量示意图；
图中，E为ABA处理下CpVQ20基因表达量示意图；
图中，F为Eth处理下CpVQ20基因表达量示意图。
图3 转基因烟草鉴定示意图。
图4 转基因烟草接种白粉病菌10d后表型观察示意图。
图5 转基因烟草生理生化指标含量示意图；
图中，A为转基因烟草SOD活性示意图；
图中，B为转基因烟草POD活性示意图；
图中，C为转基因烟草CAT活性示意图；
图中，D为转基因烟草MDA含量示意图。
图6 接种白粉病菌的转基因烟草后DAB、台盼蓝染色及切片观察示意图；
图中，A为接种白粉病菌的转基因烟草、野生型烟草的DAB示意图；
图中，B为接种白粉病菌的转基因烟草、野生型烟草的番红固绿染色切片观察示意图；
图中，C为接种白粉病菌的转基因烟草、野生型烟草的台盼蓝染色示意图。
图7 转基因烟草接种白粉病菌3d后抗病相关基因表达量示意图；
图中，A为转基因烟草接种白粉病菌3d后抗病基因NtNPR1表达量示意图；
图中，B为转基因烟草接种白粉病菌3d后抗病基因NtPAL表达量示意图；
图中，C为转基因烟草接种白粉病菌3d后抗病基因NtPDF1.2表达量示意图；
图中，D为转基因烟草接种白粉病菌3d后抗病基因NtPR1a表达量示意图；
图中，E为转基因烟草接种白粉病菌3d后抗病基因NtPR5表达量示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：CpVQ20基因过表达载体构建
一、植物材料：
籽用美洲南瓜种子F2（由内蒙古农业大学园艺与植物保护学院籽用南瓜课题组提供）先在1%高锰酸钾溶液中浸泡30min，然后在55°C温水中温汤浸种，并不断搅拌至水温降至室温，在清水中浸种6h。用清水浸透滤纸放入培养皿中，将浸种6h后的种子均匀放在浸透的滤纸上，28°C的培养箱中培养，待芽长1cm左右后及时播种于营养钵中。于育苗架上培养，白天（28°C）光照12h，夜晚（18°C）黑暗12h，光照24000LX，湿度控制在75%左右，获得籽用美洲南瓜植株。
二、CpVQ20基因过表达载体构建
（1）总RNA的提取及检测
采用总RNA试剂盒提取籽用美洲南瓜植株总RNA。测定总RNA的浓度以及OD260/OD280、OD260/OD230比值，1%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA是否降解。
（2）cDNA第一链合成
反转录以RNA为模板，参照PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser的操作说明书进行cDNA第一链合成。
通过PCR扩增如SEQ ID NO.1所示的ORF两端含有 BamHI 和 KpnI 的酶切位点的目的基因CpVQ20；
反应体系：premix Taq 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，ddH2O 15μL，cDNA5μL；
上游引物：GGGGATCCATGTATGTTGCAGGCAGAA（SEQ ID NO.2）；
下游引物：GGGGTACCAACAATTACCTGAGATGAAGG（SEQ ID NO.3）；
反应程序：95℃ 3min；95℃ 30s，65℃30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min；4℃保存；
将PCR扩增产物（目的基因CpVQ20）进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR扩增产物，将制得的回收产物与pMD19-T载体进行连接得到重组产物后，大肠杆菌感受态细胞（DH5α）转化，鉴定阳性菌液后按照质粒小提试剂盒操作步骤提取质粒，质粒测序，测序结果进行NCBI BLAST比对；
用限制性内切酶 BamHI 和 KpnI 分别酶切经过测序的质粒和p1301载体（pCAMBIA1301载体），并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分别回收目的基因片段和p1301载体线性片段，再将并回收目的基因片段和p1301载体线性片段 16℃连接过夜；
反应体系10μL：Solution I 5μL；目的基因片段 4μL；p1301表达载体线性片段 1μL；
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞（DH5α），鉴定阳性菌液后按照质粒小提试剂盒操作步骤提取质粒，质粒测序，获得CpVQ20基因的过表达载体。
琼脂糖凝胶电泳（图1）结合测序结果显示，CpVQ20在402bp处有清晰条带（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）。PCR扩增产物胶回收、连接pMD19-T载体后，进行菌落PCR，阳性菌落经LB液体培养基摇菌后，菌液送上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果进行NCBI BLAST比对，结果表明，CpVQ20的CDS全长390bp，编码129个氨基酸。双酶切结果显示，目的基因连接到表达载体上，成功完成了过表达载体构建。
SEQ ID NO .1：
TATATATATGTATGTTGCAGGCAGAAGAGAGGTTTGTGTGCCAAAATTTGCCCCCAAACCCTAAAAATGGAATCGAGTTTAGTTGGGAGGGACGTGGAAGAGGGGAGGAAAGAAAGGAGAAGGAAAAGGAAACCCTGTGATCGGAAGAACCAACCTCTCAAAGTTGTGTACATATCCAACCCCATGAGGGTTCAAGCCAGTGCGGCTGAATTTAGAGGCCTGGTTCAACAACTCACCGGCCAAGATGCGCCTAAGTTTCCTCCTTCCGCCTCGGTGGAGACTCCGGAGACTAATGTTCGAAAGATACAAGACGACGACGACGACGACGATCAACAACTCTTACTTCACTGGGCTGCTGCAATAATGGAGGATTCCAGTGATGATTTTCTTGGGGGTTCGTATGAGAGCTTGGAGGGTATTTTCATGAGGGATATGGTGGACAGATTGGCGGCTTGACTTCAAGTACCTTCATCTCAGGTAATTGTTTATTAACGAGGTTATGTGAAAATAAAAGAATCATCCACATATTATCCCTTAAATTACATATTTCCTTTTGATTTAATTGAACGTGCAACAAATTTGGTCATATTGTTGTAGTGTTTACA。
实施例2：CpVQ20基因表达特异性分析
一、白粉病菌处理：收集田间自然发病籽用美洲南瓜叶片上的白粉病菌（纯化3代），将白粉病菌溶于蒸馏水中，再滴加1滴2%的吐温-20（Tween-20），制成浓度为1×106/mL的孢子悬浮液，喷施于具有2叶1心的籽用美洲南瓜健康植株叶片上。接菌后分别在0h、6h、12h、24h、48h采取第二片真叶，液氮速冻，-80℃保存备用。
二、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、乙烯（Eth）处理：籽用美洲南瓜2叶1心时，挑选健康植株，选取长势一致的植株叶片分别作以下处理：0.2 mmol·L-1 SA、0.1mmol·L-1JA、0.1mmol·L-1Eth、0.1mmol·L-1ABA对籽用美洲南瓜植株进行叶面喷施，分别在处理后0h、3h、6h、12h、24h采取第二片真叶，液氮速冻，-80℃保存备用。
三、总RNA的提取及cDNA 的合成
（1）总RNA的提取及检测
采用总RNA试剂盒分别提取白粉病菌处理、SA、JA、ABA、Eth处理后籽用美洲南瓜植株总RNA。测取总RNA的浓度以及OD260/OD280、OD260/OD230比值，1%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA是否降解。
（2）cDNA 第一链合成
反转录以RNA为模板，参照PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser的操作说明书进行cDNA第一链合成。
四、实时定量PCR
qRT-PCR反应体系为10体系：TB Greenser Kit withTaq™aqGr，ddH2O 3.5ee，上游引物0.255e、下游引物0.255e，cDNA 1en；
上游引物：CTGAATTTAGAGGCCTGGTT（SEQ ID NO.16）；
下游引物：AACCCCCAAGAAAATCATCA（SEQ ID NO.17）；
在FTC-3000P系统上进行实时荧光定量PCR，反应程序：95℃预变性 30S，40个循环：95℃变性5s，50℃退火30s；计算方法采用2−ΔΔCT法，实验3次重复。
由图2分析可知，籽用美洲南瓜CpVQ20基因在根、茎和叶中均有表达，且差异显著（P<0.05），在根中表达量最高，茎次之，叶中表达量最少。白粉病菌胁迫及激素处理下CpVQ20基因表达量存在显著差异（P<0.05）。白粉病菌处理后，CpVQ20基因上调表达，在白粉病菌胁迫48h时，表达量最高，上调表达25.36倍。SA处理下，CpVQ20基因上调表达，处理后6h表达量最高，上调表达2.65倍。JA处理后，CpVQ20基因除3h外均上调表达，在24h时表达量最高，上调表达3.86倍。ABA处理下，CpVQ20基因上调表达，处理后6h表达量最高，上调表达4.97倍。Eth处理下，CpVQ20基因上调表达，处理后12h表达量最高，上调表达5.3倍。综上可知，CpVQ20基因响应白粉病菌胁迫且可能参与SA、ABA、JA、Eth一种或多种信号通路。
实施例3：CpVQ20基因的功能验证
一、转基因烟草阳性苗鉴定：
农杆菌GV3101感受态细胞转化重组产物：取实施例1中回收目的基因片段和p1301载体线性片段进行连接得到重组产物，加入农杆菌GV3101感受态细胞转化重组产物，得到活化的农杆菌GV3101菌液；
转基因植株的构建：剪取烟草无菌苗幼叶，切成1 cm×1 cm 的小叶盘，并在每个叶盘上制造伤口，切取100 个叶盘备用。将切好的叶盘转入灭菌的小烧杯，加入活化的农杆菌GV3101菌液（菌液浓度OD 值为0.5～0.6），避光条件下侵染10 min。将侵染后的叶盘放在灭菌滤纸上吸去多余菌液并迅速将其转入共培养培养基（MS 4.4 g/L、蔗糖30.0 g/L、6-BA1.0 mg/L、琼脂7.0 g/L，pH 值为5.8）上，25 ℃暗培养3 d。将其培养3 d 的叶盘转入筛选培养基（MS4.4 g/L、蔗糖30.0 g/L、6-BA 1.0 mg/L、头孢250.0 mg/L、Kan 50.0 mg/L、琼脂7.0 g/L，pH 值为5.8）中诱导不定芽产生，每隔两周转接一次。待丛生芽长到1~2 cm 时从叶盘上切下移入生根培养基（MS 2.2 g/L、蔗糖15.0 g/L、Kan 50.0 mg/L、头孢250.0 mg/L、琼脂7.0 g/L，pH 值为5.8）中诱导生根。待小苗生根后，将其进行驯化移栽。
检测了转基因型及野生型烟草卡那霉素抗性基因NPT，检测结果转基因型（OE）为阳性条带，野生型（WT）没有条带，成功获得了2个转基因植株（图3）。
二、转基因烟草接种白粉病菌后表型及生理生化指标分析
方法如下：
1、白粉病菌处理：收集实验室发病烟草叶片上的白粉病菌（纯化3代），将白粉病菌溶于蒸馏水中，再滴加1滴2%的吐温-20（Tween-20），制成浓度为1×106/mL的孢子悬浮液，喷施于具有2叶1心的转基因烟草及野生型烟草上。
2、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）及丙二醛（MDA）含量测定方法参照李合生植物生理学实验指导。
在转基因烟草接种白粉病菌10d后，与野生型相比，CpVQ20转基因烟草无白粉病发生，野生型烟草老叶发病严重，新叶同样出现白粉病菌斑（图4）。表型分析结果表明，过表达CpVQ20基因提高了烟草对白粉病的抗性。
白粉病菌处理后，转基因烟草SOD活性0～24h低于野生型，48～120h高于野生型（图5的A）；转基因烟草POD活性0～24h高于野生型，48～120h低于野生型（图5的B）；转基因烟草CAT活性在24～120h均高于野生型（图5的C），推测CpVQ20转基因烟草在白粉病菌处理后早期POD起到清除活性氧（ROS）作用，处理后期SOD起到清除ROS作用，CAT在整个处理期起清除ROS作用。白粉病菌处理后整个时期，转基因烟草MDA含量均低于野生型（图5的D），转基因烟草受胁迫伤害程度较野生型更轻微。以上结果表明：过表达CpVQ20基因提高了烟草对白粉病的抗性。
三、转基因烟草接种白粉病菌后DAB、台盼蓝染色及番红固绿染色切片观察
具体方法如下：
乳酚水：乳酸/苯酚/水=1：1：1；
1、二氨基联苯胺（DAB）染色：1mg/mL DAB溶液：0.1g DAB，溶于100mL蒸馏水，pH调至3.8。
（1）将接菌后的转基因烟草叶片放入1mg/ml DAB，浸泡8h；
（2）取出叶片，置于96%乙醇中，煮沸30min，脱色；
（3）将脱色后的叶片置于乳酚水中，透明处理后，照相。
2、台盼蓝染色：0.5mg/mL台盼蓝溶液：0.05g台盼蓝，溶于100mL蒸馏水。
（1）将接菌后的马铃薯叶片置于 96%乙醇中，煮沸 30min，脱色；
（2）0.5mg/mL的台盼蓝溶液染色 4h；
将染色后的叶片置于乳酚水，透明处理后，在显微镜（40X）下观察菌丝的生长情况，照相。
3、番红固绿染色切片观察
由武汉赛维尔生物科技有限公司提供番红固绿染色及切片技术支持。
白粉病接种后1d、3d、5d进行了DAB、台盼蓝染色，处理10d后进行了番红固绿染色切片观察（图6）。DAB染色反映H2O2积累量，H2O2为活性氧ROS，染色越深表明ROS积累量越多，细胞坏死越严重。DAB染色结果显示（图6的A），烟草接种白粉病菌后，随着接种时间的增加，叶片染色面积逐渐增大，颜色逐渐加深，表明H2O2积累量逐渐增加。同期，CpVQ20转基因烟草染色比同期野生型更浅，活性氧积累量比野生型更慢。台盼蓝染色（40×目镜，图6的C）结果显示，烟草接种白粉病菌12h时，白粉病菌开始着生。随着胁迫时间的增加，菌丝迅速生长，快速积累。在接种48h后，转基因烟草菌丝与野生型存在明显不同。转基因烟草没有形成菌丝，只着生单个菌丝，野生型烟草已发育成条行菌丝体。在接种后72～120h，野生型烟草菌丝大量生长，大面积积累，伴有游动孢子囊的出现，逐渐发育成网状结构，与同期转基因型相比，菌丝的生长量和游动孢子囊数目多很多。接种白粉病菌10d后进行了番红固绿染色（10X，图6的B），切片观察结果显示，转基因烟草叶片解剖结构更紧密，栅栏组织与海绵组织较厚，野生型烟草叶片解剖结构破坏严重，栅栏组织与海绵组织排列疏松。以上结果说明CpVQ20基因的过表达提高了转基因烟草对白粉病菌抗性。
四、转基因烟草接种白粉病菌后抗病相关基因表达量分析
具体包括以下步骤：
以cDNA第一链为模板，按照实时定量试剂盒TB Green™ Premix Ex Taq™ II(Tli RNaseH Plus)的操作说明，在定量PCR仪上进行qRT-PCR扩增。实时定量引物如下：
表 1 实时定量特异引物序列
反应程序：95℃预变性 30s，40个循环：95℃变性5s，50℃退火30s。在50℃退火过程中采集荧光，4℃停止反应。NtEF1-α为内参基因，计算方法采用2−ΔΔCT法，实验重复3次。
将对照组不接菌，处理组白粉病菌胁迫3d。由图7可知，转基因株系烟草抗病相关基因NtNPR1、NtPAL、NtPDF1.2、NtPR1a及NtPR5相对表达量极显著高于野生型株系，白粉病菌处理3d后，转基因烟草及野生型烟草抗病相关基因相对表达量均显著上调，但转基因株系显著高于野生型株系，与野生型相比，转基因株系NtNPR1上调表达14.5倍，NtPAL上调表达25.53倍，NtPDF1.2上调表达55.7倍，NtPR1a上调表达808.83倍，NtPR5上调表达203.59倍。
综上所述，本发明中籽用美洲南瓜CpVQ20基因在根、茎、叶中均有表达；白粉病及激素处理后，CpVQ20基因上调表达。CpVQ20基因遗传转化烟草后，白粉病菌丝积累量减少，发育变慢；抗氧化酶活性上升，ROS积累量减少，叶片解剖结构更紧密，细胞受白粉病菌胁迫伤害减弱；抗病基因相对表达量升高。过表达CpVQ20基因提高了烟草对白粉病的抗性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，所述CpVQ20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，其特征在于，所述CpVQ20基因用于抑制烟草中的白粉病生长发育。
3.根据权利要求1所述的CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，其特征在于，所述CpVQ20基因用于清除烟草中的ROS。
4.根据权利要求1所述的CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，其特征在于，所述CpVQ20基因用于烟草的抗病性品种培育。
5.根据权利要求1所述的CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，其特征在于，所述CpVQ20基因能够促进烟草抗病相关基因的表达。
6.根据权利要求5所述的CpVQ20基因在提高烟草对白粉病的抗性中的应用，其特征在于，所述抗病相关基因包括NtNPR1、NtPAL、NtPDF1.2、NtPR1a及NtPR5。
7.CpVQ20基因的过表达载体，其特征在于，由权利要求1所述的CpVQ20基因构建获得。
8.根据权利要求7所述的CpVQ20基因的过表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
通过PCR扩增如SEQ ID NO.1所示的ORF两端含有 BamHI 和 KpnI 的酶切位点的目的基因CpVQ20；
将目的基因CpVQ20与pMD19-T载体进行连接得到重组产物后，大肠杆菌感受态细胞转化，获得质粒；
用限制性内切酶 BamHI 和 KpnI 分别酶切质粒和p1301载体，并分别回收目的基因片段和p1301载体线性片段；
将目的基因片段和p1301载体线性片段进行连接，获得连接产物；
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，获得CpVQ20基因的过表达载体。
9.根据权利要求8所述的CpVQ20基因的过表达载体的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：premix Taq 25 μL，上游引物2.5μL下游引物2.5μL，ddH2O 15μL，cDNA5 μL。
10.权利要求8所述的CpVQ20基因的过表达载体在提高烟草对白粉病的抗性中的应用。
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|---|
| KE XU 等: "Genome-wide identi fi cation and expression analysis of the VQ gene family in Cucurbita pepo L.", PEERJ, 21 January 2022 (2022-01-21), pages 1 - 26 * |
| KE XU等: "Genome-wide identification and expression analysis of the VQ gene family in Cucurbita pepo L.", PEERJ, 21 January 2022 (2022-01-21), pages 1 - 26 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117887757B (zh) | 2024-05-10 |
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