CN117510603A - 剪接因子蛋白GmRSZ22在提高植物抗碱性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种剪接因子蛋白GmRSZ22在提高植物抗碱性中的应用，属于植物育种技术领域。本发明为了解决解决如何提高植物的抗碱性胁迫的技术问题。本发明提供一种GmRSZ22蛋白在提高植物抗碱性胁迫中的应用，所述GmRSZ22蛋白的序列如SEQ ID NO.21所示。过表达GmRSZ22能显著提高碱胁迫下大豆抗氧化酶活性，因而降低了叶片中O2‑和H2O2活性氧的积累，从而正调控大豆碱胁迫应答，为植物抗碱性育种提供新的解决途径。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及剪接因子蛋白GmRSZ22在提高植物抗碱性中的应用。
背景技术
盐碱胁迫是影响世界很多地区农作物产量的主要环境胁迫因子之一。从类型上看，盐碱地可以分为以中性盐(NaCl、Na2SO4等)为主要盐碱成分的盐土和以碱性盐(Na2CO3、NaHCO3)为主要盐碱成分的碱土。相比NaCl等中性盐，Na2CO3和NaHCO3等碱性盐胁迫除了导致离子毒害、渗透胁迫和氧化胁迫等，还产生高pH胁迫，因而对作物产量影响更大。
栽培大豆(Glycine max)作为我国广泛种植的重要农作物，是人类食物蛋白和食用油的重要来源。近年来，通过基因工程技术改良大豆耐盐碱性，进而提高大豆产量已成为可能。然而，其实现的重要前提是大豆耐盐碱分子机制的阐明和耐盐碱关键调控基因的挖掘和鉴定。目前，我国大多数栽培大豆品种对盐碱的适应性较弱，因此本领域对提高农作物的耐盐碱性存在非常迫切的需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决如何提高植物的抗碱性胁迫的技术问题。
本发明提供一种GmRSZ22蛋白在提高植物抗碱性胁迫中的应用，所述GmRSZ22蛋白的序列如SEQ ID NO.21所示。
本发明提供一种GmRSZ22基因在提高植物抗碱性胁迫中的应用，所述GmRSZ22基因序列如SEQ ID NO.22所示。
本发明提供一种含GmRSZ22基因或含有GmRSZ22基因的重组载体或重组微生物细胞在提高植物抗碱性胁迫中的应用，所述GmRSZ22基因序列如SEQ ID NO.22所示。
本发明提供一种超表达GmRSZ22基因的植物在提高植物抗碱性胁迫中的应用，所述GmRSZ22基因序列如SEQ ID NO.22所示。
进一步地限定，所述植物为大豆或拟南芥。
进一步地限定，抗碱性胁迫是抗NaHCO3胁迫。
进一步地限定，大豆嵌合体植株胁迫处理的条件是50mM NaHCO3处理10天。
本发明提供一种育种抗碱性胁迫的大豆或拟南芥的方法，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：扩增SEQ ID NO.22所示的GmRSZ22基因序列，将基因序列插入到表达载体；
步骤2：将步骤1获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆或拟南芥中得到转基因大豆或拟南芥；
步骤3：鉴定步骤2获得的转基因大豆或拟南芥得到阳性转基因植株。
进一步地限定，步骤1中的表达载体为pBWA(V)BS-3301-GFP。
本发明提供一种提高大豆或拟南芥抗碱性胁迫的方法，将大豆的SEQ ID NO.22所示的GmRSZ22基因序列在大豆或拟南芥中超表达获得大豆或拟南芥转基因植株。
有益效果：本发明发现了一种与植物提高耐碱性相关的剪接因子蛋白GmRSZ22，通过转录组数据和RT-qPCR分析表明GmRSZ22基因在大豆根、幼叶、花、未成熟荚果和种子中显性表达，且在根组织中，GmRSZ22受碱胁迫诱导后3h和6h表达量均显著增加，能应答碱胁迫反应。亚细胞定位分析表明GmRSZ22定位于细胞核。通过酵母双杂交、荧光素酶互补实验和荧光双分子互补实验(BiFC)证实了GmRSZ22和剪接过程重要成分GmU1-70K存在物理互作关系，说明GmRSZ22在剪接过程中可能参与5’-剪接位点的识别和剪接作用。在野生型拟南芥中异源表达GmRSZ22基因能显著增强植株对碱胁迫的应答，表现为幼苗期过表达GmRSZ22基因植株在5mM NaHCO3胁迫下根长相对于野生型更长，成苗期过表达GmRSZ22基因植株在50mM NaHCO3胁迫下存活率更高。通过毛状根转化获得的过表达GmRSZ22大豆嵌合体植株也表现出更强的耐碱性，表现为在50mM NaHCO3处理下，过表达植株比转空载体对照植株具有更高的叶绿素和脯氨酸含量，更低的丙二醛积累；NBT、DAB、台盼蓝染色表明过表达嵌合体大豆植株叶片中积累的活性氧更少，因而细胞的伤害程度更轻；直接测定叶片中的O2-和H2O2含量也发现过表达嵌合体植株中的O2-和H2O2含量显著低于作为对照的转空载体植株，进一步通过测定转基因大豆中植株的CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性发现，过表达嵌合体植株中的各种抗氧化酶活性均显著高于作为对照的转空载体植株。上述结果说明过表达GmRSZ22能显著提高碱胁迫下大豆抗氧化酶活性，因而降低了叶片中O2-和H2O2等活性氧的积累，从而正调控大豆碱胁迫应答。
附图说明
图1为pBWA(V)BS-3301-GFP载体图谱。
图2为GmRSZ22基因的序列分析结果图。图中A为GmRSZ22基因的基因结构模式图；B为GmRSZ22蛋白的结构域分布；C为GmRSZ22蛋白的进化树分析；
图3为GmRSZ22基因的表达模式图。图中A为eFP Browser提供的GmRSZ22基因在大豆植株中不同组织(根尖、茎尖分生组织、根、幼荚、花、叶、根瘤)的表达量热图；B为eFPBrowser提供的GmRSZ22基因在大豆植株中不同组织(根尖、茎尖分生组织、根、幼荚、花、叶、根瘤)的表达量统计；C为RT-qPCR技术测定在50mM NaHCO3处理0h，3h和6h下的GmRSZ22基因的表达量统计；
图4为GmRSZ22基因的亚细胞定位结果图；
图5为酵母双杂交技术鉴定GmRSZ22与GmU1-70K蛋白的相互作用图；
图6为双分子荧光互补(BiFC)技术鉴定GmRSZ22与GmU1-70K蛋白的相互作用图；
图7为荧光素酶互补技术鉴定GmRSZ22与GmU1-70K蛋白的相互作用图；
图8为超表达GmRSZ22基因拟南芥植株的分子鉴定图；图中A为超表达GmRSZ22基因拟南芥植株的PCR鉴定；B为激光共聚焦显微镜观察超表达GmRSZ22基因拟南芥植株根尖的荧光信号；
图9为转GmRSZ22基因拟南芥植株NaHCO3胁迫下的表型鉴定图；图中A为5mM NaHCO3胁迫下超表达GmRSZ22基因拟南芥幼苗期主根伸长表型鉴定；B为50mM NaHCO3胁迫下超表达GmRSZ22基因拟南芥成苗期表型鉴定；
图10为转GmRSZ22基因大豆毛状根的分子鉴定图。图中A为转GmRSZ22基因大豆毛状根的PCR鉴定；B为转GmRSZ22基因大豆毛状根的RT-qPCR鉴定；
图11为转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下的表型鉴定和生理指标测定图；图中A为转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下的表型鉴定；B为叶绿素含量测定结果；C为脯氨酸含量测定结果；D为丙二醛(MDA)含量测定结果；
图12为转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株叶片在NaHCO3胁迫下的组织化学染色结果图；图中A为NBT染色结果；B为DAB染色结果；C为台盼蓝染色结果；
图13为转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株叶片中活性氧及其清除相关酶活测定结果图；图中A为超氧阴离子(O2-)含量测定结果；B为过氧化氢(H2O2)含量测定结果；C为CAT酶活性测定结果；D为POD酶活性测定结果；E为SOD酶活性测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell和克隆载体试剂盒pEASY-Blunt Simple Cloning Kit是全式金公司的产品。
下述实施例中的pGADT7及pGBKT7载体在文献“Yang Yu,Xiangbo Duan,XiaodongDing,Chao Chen,Dan Zhu,Kuide Yin,Lei Cao,Xuewei Song,Pinghui Zhu,Qiang Li,Zaib_un Nisa,Jiyang Yu,Jianying Du,Yu Song,Huiqing Li,Beidong Liu,YanmingZhu.A novel AP2/ERF family transcription factor from Glycine soja,GsERF71,isa DNA binding protein that positively regulates alkaline stress tolerance inArabidopsis.Plant Mol Biol(2017)94:509–530”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的酿酒酵母感受态Y2H Gold Chemically Competent Cell是上海唯地生物技术有限公司的产品。
下述实施例中的双元表达载体pBWA(V)BS-3301-GFP是本实验室委托武汉伯远生物科技有限公司定制的双元表达载体，图谱见图1。该载体以武汉伯远生物科技有限公司的pBWA(V)BS载体为骨架，在CaMV 35S启动子和NOS终止子之间引入3×HA标签和GFP蛋白标签，两者之间有多克隆位点MCS用于插入目的基因。插入的目的基因与这两个标签融合表达，方便对外源基因表达产物的检测。
下述实施例中的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)在文献“Chen J,Li Q,Zhang P,et al.·Cloning and functional characterization of two GsSnRK1 genepromoters from wild soybean[J].Plant Biotechnology Reports,2021,15(5):627-639.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的农杆菌GV3101在文献“李慧卿，陈超，陈冉冉，宋雪薇，李佶娜，朱延明，丁晓东。利用CRISPR/Cas9双基因敲除系统初步解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应。遗传。2018,40(6):496-507”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中涉及到的引物对应的核苷酸序列见表1。
表1引物对应的核苷酸序列
实施例1：大豆剪接因子蛋白GmRSZ22基因的克隆及其表达模式分析
一、植物材料的处理
选取饱满均匀且无病斑的栽培大豆品种合丰55的种子，在5％的次氯酸钠溶液中消毒5min，自来水冲洗3次、去离子水冲洗3次后，将种子均匀铺在湿润的滤纸上，22℃暗培养2-3d进行催芽，待芽长到2cm左右时，将萌发的幼苗转移到含有霍格兰营养液的烧杯中，置于人工培养箱中进行水培(培养箱的温度设置为26℃、60％相对湿度、光周期为16h光照/8h黑暗)，之后每三天更换一次霍格兰营养液。待大豆生长至V1期(第一个三出复叶完全展开)，用50mM NaHCO3进行碱胁迫处理，在胁迫处理3h、6h时分别收集不同材料幼苗的地下部分(根组织)，同时收集未进行胁迫处理(0h)的幼苗的地下部(根组织)，取样之后立即用液氮将植物材料速冻，并保持于-80℃冰箱备用。
二、RNA提取
使用研磨机对-80℃冰箱保存的植物材料进行充分研磨后，参见Plant RNA Kit(OMEGA)说明书提取野生大豆幼苗的总RNA。将提取的总RNA立即进行反转录或置于-80℃保存备用。
三、GmRSZ22基因的克隆
以上述总RNA为模板，采用cDNA逆转录试剂盒(TOYOBO)进行反转录得到cDNA。以cDNA为模板，采用GmRSZ22-Clone-F(SEQ ID NO.1)和GmRSZ22-Clone-R(SEQ ID NO.2)引物及使用PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶，对其进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约500bp的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(全式金)回收PCR扩增产物，将其与pEASY-Blunt Simple Cloning Kit载体(全式金))连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-Blunt Simple-GmRSZ22，并将其转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为537bp的扩增产物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示，将其命名为GmRSZ22基因，ORF为SEQ ID NO.21的第1-537位，编码GmRSZ22蛋白长度为178个氨基酸。GmRSZ22基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
SEQ ID NO.21：
MSRVYVGNLDSRVTERDLEDEFRVFGVIRSVWVARRPPGYAFIDFDDRRDAQDAIRELDGKNGWRVELSHNSRGGGGGRGGRSGGSDLKCYECGEPGHFARECRMRGGSGRRRSRSPPRFRRSPSYGRRSYSPRGRSPRRRSLSPRGRSYSRSPPYRGREEVPYANGNGLRERRRSRS；
SEQ ID NO.22：
ATGTCTCGCGTGTATGTTGGTAACTTGGATTCACGAGTCACCGAGAGAGATCTCGAAGACGAATTCCGTGTTTTCGGAGTTATTCGGAGTGTTTGGGTTGCACGTAGACCACCTGGTTATGCTTTTATTGACTTTGATGACCGCAGAGATGCACAGGATGCTATCCGTGAATTGGATGGCAAGAATGGTTGGAGGGTTGAGCTTTCTCACAACTCTAGAGGTGGAGGTGGTGGTCGTGGTGGTCGCTCTGGTGGTTCTGATTTGAAATGTTACGAGTGTGGTGAACCTGGTCATTTTGCTCGTGAATGTCGCATGCGTGGTGGTTCAGGAAGACGCCGTAGCCGTAGTCCACCCAGATTCCGTAGGAGCCCAAGTTATGGGCGAAGGAGTTACAGTCCTCGTGGGCGGTCCCCTAGGCGCCGTAGTTTGTCACCTCGTGGACGTAGCTACAGCAGGTCACCTCCTTATCGTGGGCGTGAGGAGGTCCCATATGCTAATGGAAATGGCCTTAGGGAACGACGCAGAAGCAGAAGTTGA；
序列分析表明，GmRSZ22属于剪接因子SR蛋白家族中的RSZ亚家族成员，该基因中包括了5个内含子(图2中的A)；GmRSZ22蛋白序列中包括RRM、ZnK和RS三个结构域，符合RSZ亚家族成员的结构特征(图2中的B)；通过与模式植物拟南芥和水稻中已鉴定的RSZ亚家族蛋白进行进化树分析表明，GmRSZ22与拟南芥剪接因子RSZ22和RSZ22a相似性最高，表明GmRSZ22在进化上比较保守(图2中的C)。
四、GmRSZ22的表达模式
1.GmRSZ22的组织表达模式
大豆eFP Browser(https://bar.utoronto.ca/eplant_soybean/)组织表达模式分析表明(图3中的A和B)，GmRSZ22基因在根尖(Root tip)的组织表达量最高，其次是茎顶端分生组织(SAM),而在根瘤(Nodule)中相对表达量最低。
2.GmRSZ22在大豆根中受碱胁迫诱导的表达模式
利用引物GmRSZ22-qPCR-F(SEQ ID NO.3)和GmRSZ22-qPCR--R(SEQ ID NO.4)对上述步骤一中受碱胁迫处理后0h，3h，6h的大豆根总RNA进行反转录成cDNA，并分别以不同时间点的cDNA作为模板进行RT-qPCR扩增。根据RT-qPCR结果可知GmRSZ22基因在的表达能够受到碱胁迫的诱导，碱胁迫处理后3h和6h GmRSZ22基因的表达量均显著高于对照(图3中的C)。
实施例2：GmRSZ22的亚细胞定位和蛋白互作分析
一、GmRSZ22的亚细胞定位分析
1.GmRSZ22基因的获得
以实施例1中获得的GmRSZ22全长CDS为模板，采用SmaⅠ-pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22-F(SEQ ID NO.5)和SmaⅠ-pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22-R(SEQ ID NO.6)引物及PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmRSZ22基因。
2.重组载体pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22的构建
用限制性内切酶Sma I(New England Biolabs)对pBWA(V)BS-3301-GFP载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pBWA(V)BS-3301-GFP载体和PCR产物GmRSZ22进行无缝克隆，得到pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22重组载体，对pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22重组载体为将pBWA(V)BS-3301-GFP载体的Sma I酶切位点切开，插入GmRSZ22基因，且保持pBWA(V)BS-3301-GFP载体的其它序列不变得到的载体。pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22重组载体能够表达与GFP蛋白融合表达的剪接因子蛋白GmRSZ22。
3.农杆菌转化
利用冻融法将构建好的pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22重组载体转化农杆菌GV3101感受态，待抗性平板长出单克隆后挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR鉴定。鉴定为阳性克隆后存菌备用。
4.烟草侵染和荧光信号观察
取出含有测序正确的pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22质粒的农杆菌液，接种于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，于28℃进行两次活化培养后，继续震荡培养至OD600＝0.6；用浸染液(10mM MgCl2、10mM MES、150μM乙酰丁香酮)将菌体重悬，调节OD值到OD600＝1.0，采用无菌注射器将菌液注射进本氏烟草，进行12h的避光处理，浸染后48-72h期间使用激光共聚焦显微镜进行荧光信号的观察，并拍照记录。
亚细胞定位结果如图4所示，与GmRSZ22蛋白融合表达的GFP信号只定位于细胞核，且与细胞核染料DAPI信号重合，表明GmRSZ22蛋白定位于细胞核，这与GmRSZ22蛋白作为剪接因子的功能是吻合的。
二、GmRSZ22与GmU1-70K的蛋白互作分析
U1-70K作为U1 snRNP复合物的关键亚基和细胞内剪接体的重要成分，已有研究表明能够与RSZ22剪接因子蛋白相互作用并特异性识别5’端剪接位点。本实施例采用酵母双杂交实验、荧光双分子互补实验(BiFC)以及荧光素酶互补实验来确定GmRSZ22与GmU1-70K之间的互作关系。
(一)酵母双杂交鉴定GmRSZ22与GmU1-70K之间的蛋白互作
1.GmRSZ22基因的获得
以实施例1中获得的GmRSZ22全长CDS为模板，采用EcoRⅠ-pGBKT7-GmRSZ22-F(SEQID NO.7)和EcoRⅠ-pGBKT7-GmRSZ22-R(SEQ ID NO.8)引物及PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmRSZ22基因。
2.重组载体pGBKT7-GmRSZ22的构建
用限制性内切酶EcoR I(New England Biolabs)对pGBKT7载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pGBKT7载体和PCR产物GmRSZ22进行无缝克隆，得到pGBKT7-GmRSZ22重组载体，对pGBKT7-GmRSZ22重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGBKT7-GmRSZ22重组载体为将pGBKT7载体的EcoR I酶切位点切开，插入GmRSZ22基因，且保持pGBKT7载体的其它序列不变得到的载体。pGBKT7-GmRSZ22重组载体能够表达剪接因子蛋白GmRSZ22。
3.GmU1-70K基因的获得
以实施例1中的大豆(合丰55)cDNA为模板，采用EcoRI-pGADT7-GmU1-70K-F(SEQID NO.9)和EcoRI-pGADT7-GmU1-70K-R(SEQ ID NO.10)引物及PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmU1-70K基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，该基因ORF为SEQ ID NO.23的第1-1443位，编码GmU1-70K蛋白长度为480个氨基酸。GmU1-70K基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
SEQ ID NO.23：
ATGGGGGACAACAACAGCAACAACGATGCCTTCATGCGCAACCAAAACGCCGCCGTTCAGGCCCGC
ACCAAAGCGCAGAACCGCTCCAACGTCCTTCAGCTCAAACTGATTGGACAGAGTCACCCAACCGGT
CTCACAGCGAACCTGTTGAAGCTCTTCGAGCCTAGGCCTCCGTTGGAGTACAAGCCACCTCCGGAG
AAACGAAAATGCCCACCGTTATCAGGGATGGCACAATTTGTGAGCAAGTTTGCCGAGCCTGGCGAG
CCAGAATACGCTCCACCTGTCCCAGAAACTGAGACTCCTGCACAAAAAAGAGCCAGAATACACAAG
CTAAGGCTTGAGAAGGGAGCTGCAAAGGCTGCTGAGGAGCTTGAGAAATATGATCCACATAATGAC
CCAAATGTGTCGGGAGATCCATACAAGACATTGTTTGTGGCTAAACTCAGTTACGAGACCACTGAGA
GCAGAATCAAAAGGGAGTTTGAGTCATATGGTCCAATCAAACGGGTTCGATTAGTTGCTGACAAAGA
TATAAATAAGCCCAGGGGTTATGCTTTCATTGAGTATCTGCATACAAGAGACATGAAAGCTGCTTATA
AACAAGCTGATGGTAGGAAAATTGATGGTAGAAGGGTGCTTGTGGATGTTGAGCGTGGGAGGACTG
TTCCAAATTGGAGACCCCGTCGCTTAGGTGGTGGACTTGGTACCACTAGAGTTGGAGGTGAAGAAG
TTAATCAGCGACATTCTGGGAGGGAGCAACAACAGTCTCGTTCTGAAGAACCGAGAGTGCGAGAGG
ACCGACACGCTGATAGGGAAATATCACGTGAAAGAGGTAGGGACAAAGACAGAGAACGGGAGCGA
TCACGTGAACATTCTCATGAAAGGGTCAGGGATCGTGATCATAGGGAGGATAGGCACCACAGAGAC
CGGGATAGGAACAGGGACAGAGACCGAGACAGGGAAAGAGATAGAGATCGTGGGCGTGATCGAGA
TAGAACACGGGACCGTGATCGTGAGCGAGGGAGGGACCGTGATCGGGATCGAGAATATGATCGACA
TCGTGAGAGGGATAGAGATTATGAAGTTGGTGACCCTGATCGAGGACGCTCACGTGATAGGGAGTCT
GATTATGATCGTGTTGAATCTAAACATGGGGAAAGGAATCATGACTATGAACCTGAGGATGATCGTGG
TAGGCATAACCAGTATGAACATGGACGTAGGCATGCAGACCCTGATCATGACCCTGAGCGGTATGAC
CACTACAATCATGGAGATGACCATGGTGACCATTACAATCAGTATCGTGACCATGATGGGATGGAAGA
TGACTACCATGCTGGACGTGCAACATCTGAATCGCATGAAAAGGAGAGAAGTCATGATGTGGACCGTGAATATCAACGCTCAGAGAGATCACATTCCCGGGAGTATGATTATTAG；
SEQ ID NO.24：
MGDNNSNNDAFMRNQNAAVQARTKAQNRSNVLQLKLIGQSHPTGLTANLLKLFEPRPPLEYKPPPEKR
KCPPLSGMAQFVSKFAEPGEPEYAPPVPETETPAQKRARIHKLRLEKGAAKAAEELEKYDPHNDPNVSG
DPYKTLFVAKLSYETTESRIKREFESYGPIKRVRLVADKDINKPRGYAFIEYLHTRDMKAAYKQADGRKI
DGRRVLVDVERGRTVPNWRPRRLGGGLGTTRVGGEEVNQRHSGREQQQSRSEEPRVREDRHADREISR
ERGRDKDRERERSREHSHERVRDRDHREDRHHRDRDRNRDRDRDRERDRDRGRDRDRTRDRDRERGR
DRDRDREYDRHRERDRDYEVGDPDRGRSRDRESDYDRVESKHGERNHDYEPEDDRGRHNQYEHGRR
HADPDHDPERYDHYNHGDDHGDHYNQYRDHDGMEDDYHAGRATSESHEKERSHDVDREYQRSERSHSREYDY；
4.重组载体pGADT7-U1-70K的构建
用限制性内切酶EcoRI(New England Biolabs)对pGADT7载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pGADT7载体和上述PCR扩增产物进行无缝克隆，得到pGADT7-GmU1-70K重组载体，对pGADT7-GmU1-70K重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGADT7-GmU1-70K重组载体为将pGADT7载体的EcoRI酶切位点切开，插入GmU1-70K基因，且保持pGADT7载体的其它序列不变得到的载体。pGADT7-GmU1-70K重组载体能够表达GmU1-70K蛋白。
5.酵母转化
将重组质粒pGADT7-GmU1-70K与pGBKT7-GmRSZ22共转化Y2HGold酵母感受态细胞(转化酵母感受态细胞的具体步骤参见唯地生物Y2H Gold Chemically Competent Cell转化的具体操作)，并分别在SD二缺和三缺培养基上培养，以验证两者之间的物理相互作用关系。
结果如图5所示，在SD/-Trp-Leu二缺培养基中的酵母菌株均能正常生长，表明转化成功。在SD/-Trp-Leu-His三缺培养基上进行培养，发现除正对照的pGBKT7-SnRK1α/pGADT7-SnRK1β重组质粒的酵母菌株能正常生长外，实验组的pGBKT7-GmRSZ22/pGADT7-GmU1-70K也能够正常生长，证明了GmRSZ22与GmU1-70K存在物理互作关系。
(二)BiFC鉴定GmRSZ22与GmU1-70K之间的蛋白互作
1.GmRSZ22基因的获得及BiFC-YFPN-GmRSZ22载体的构建
以实施例1中获得的GmRSZ22全长CDS为模板，采用KpnⅠ-YFPN-GmRSZ22-F(SEQ IDNO.11)和KpnⅠ-YFPN-GmRSZ22-R(SEQ ID NO.12)引物及PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmRSZ22基因。
用限制性内切酶Kpn I(New England Biolabs)对BiFC-YFPN载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的BiFC-YFPN载体和上述PCR扩增产物进行无缝克隆，得到BiFC-YFPN-GmRSZ22重组载体，对BiFC-YFPN-GmRSZ22重组载体进行测序验证。
测序结果表明：BiFC-YFPN-GmRSZ22重组载体为将BiFC-YFPN载体的Kpn I酶切位点切开，插入GmRSZ22基因，且保持BiFC-YFPN载体的其它序列不变得到的载体。BiFC-YFPN-GmRSZ22重组载体能够表达YFPN-GmRSZ22融合蛋白。
2.GmU1-70K基因的获得及BiFC-YFPC-GmU1-70K载体的构建
以本实施例的(一)中获得的GmU1-70K全长CDS为模板，采用KpnⅠ-YFPC-GmU1-70K-F(SEQ ID NO.13)和KpnⅠ-YFPC-GmU1-70K-R(SEQ ID NO.14)引物及PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmU1-70K基因。
用限制性内切酶Kpn I(New England Biolabs)对BiFC-YFPC载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的BiFC-YFPC载体和上述PCR扩增产物进行无缝克隆，得到BiFC-YFPC-GmU1-70K重组载体，对BiFC-YFPC-GmU1-70K重组载体进行测序验证。
测序结果表明：BiFC-YFPC-GmU1-70K重组载体为将BiFC-YFPC载体的Kpn I酶切位点切开，插入GmU1-70K基因，且保持BiFC-YFPC载体的其它序列不变得到的载体。BiFC-YFPC-GmU1-70K重组载体能够表达YFPC-GmU1-70K融合蛋白。
3.农杆菌转化
利用冻融法将构建好的BiFC-YFPN-GmRSZ22、BiFC-YFPC-GmU1-70K和空载体BiFC-YFPN、BiFC-YFPC转化农杆菌GV3101感受态，待抗性平板长出单克隆后挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR鉴定。鉴定为阳性克隆后存菌备用。
4.烟草叶片侵染和YFP荧光信号观察
利用注射器吸取含有上述质粒的农杆菌菌液，从叶片伤口处把菌液注射到本氏烟草叶片中，继续培养2天后，撕取烟草叶片背面标记区域的叶片表皮，通过激光共聚焦显微镜观察YFP黄色荧光。结果如图6所示，GmRSZ22与GmU1-70K在体内发生互作且荧光信号分布在细胞核内，表明GmRSZ22与GmU1-70K在细胞核内具有互作关系。
(三)荧光素酶互补实验鉴定GmRSZ22与U1-70K之间的蛋白互作
1.GmRSZ22基因的获得及cLUC-GmRSZ22重组载体的构建
以实施例1中获得的GmRSZ22全长CDS为模板，采用KpnⅠ-pCAMBIA1300-cLUC-GmRSZ22-F(SEQ ID NO.15)和KpnⅠ-pCAMBIA1300-cLUC-GmRSZ22-R(SEQ ID NO.16)引物及PrimeSTAR Max DNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmRSZ22基因。
用限制性内切酶Kpn I(New England Biolabs)对pCAMBIA1300-cLUC载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA1300-cLUC载体和上述PCR扩增产物进行无缝克隆，得到cLUC-GmRSZ22重组载体，对cLUC-GmRSZ22重组载体进行测序验证。
测序结果表明：cLUC-GmRSZ22重组载体为将pCAMBIA1300-cLUC载体的Kpn I酶切位点切开，插入GmRSZ22基因，且保持pCAMBIA1300-cLUC载体的其它序列不变得到的载体。cLUC-GmRSZ22重组载体能够表达cLUC-GmRSZ22融合蛋白。
2.GmU1-70K基因的获得及nLUC-GmU1-70K重组载体的构建
以GmU1-70K基因全长CDS为模板，采用Sal I-pCAMBIA1300-nLUC-GmU1-70K-F(SEQID NO.17)和SalⅠ-pCAMBIA1300-nLUC-GmU1-70K-R(SEQ ID NO.18)引物及PrimeSTAR MaxDNA(TAKARA)高保真聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GmU1-70K基因。
用限制性内切酶Sal I(New England Biolabs)对pCAMBIA1300-nLUC载体进行酶切获得线性化载体，利用重组酶(Vazyme)对线性化的pCAMBIA1300-nLUC载体和上述PCR扩增产物进行无缝克隆，得到nLUC-GmU1-70K重组载体，对nLUC-GmU1-70K重组载体进行测序验证。
测序结果表明：nLUC-GmU1-70K重组载体为将pCAMBIA1300-nLUC载体的Sal I酶切位点切开，插入GmU1-70K基因，且保持pCAMBIA1300-nLUC载体的其它序列不变得到的载体。nLUC-GmU1-70K重组载体能够表达GmU1-70K-nLUC融合蛋白。
3.农杆菌转化
利用冻融法将构建好的cLUC-GmRSZ22、nLUC-GmU1-70K、pCAMBIA1300-cLUC和pCAMBIA1300-nLUC重组载体分别转化农杆菌GV3101感受态，待抗性平板长出单克隆后挑取单克隆摇菌，提取质粒进行PCR鉴定，鉴定为阳性克隆后存菌备用。
3.烟草叶片侵染和YFP荧光信号观察
利用瞬时转染技术将含有上述质粒的农杆菌转入本氏烟草叶片中进行表达，并检测荧光素酶活性。结果如图7所示，共转阳性对照质粒和共转cLUC-GmRSZ22和nLUC-GmU1-70K的烟草叶片区域有强烈荧光素信号，而对照组均没有荧光素信号，说明GmRSZ22与GmU1-70K之间在植物细胞内存在互作。
实施例3：转GmRSZ22基因拟南芥植株的获得及其耐碱功能分析
一、转GmRSZ22基因拟南芥植株的获得和分子鉴定
取出实施例2中获得的含有pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22质粒的GV3101农杆菌液，进行活化培养后利用Floral dip法侵染哥伦比亚型拟南芥(Col-0)的花序，待种子成熟后收取T1代种子，表面消毒后种植于含50μg/mL Basta的1/2MS固体培养中进行筛选，将筛选获得的Tl代抗性苗移栽至营养钵中培养，单株收种子，继续用50μg/mL Basta进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到以Col-0为背景的T3代转基因纯合体株系用于后续实验。
利用PCR的方法对转GmRSZ22基因拟南芥中添加的标签GFP进行检测。分别采用pBWA(V)BS-GFP-FW(SEQ ID NO.19)和pBWA(V)BS-GFP-RW(SEQ ID NO.20)引物及PrimeSTARMax DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对GmRSZ22基因片段进行检测(结果如图8中的A所示)，随机挑取的10个转基因拟南芥株系均能扩增出GmRSZ22基因条带，这表明这些拟南芥株系中均成功转入了目的基因。
进一步将T3代筛选的阳性拟南芥植株根尖用激光共聚焦显微镜进行荧光信号的观察。结果如图8中的B所示，在根尖细胞中检测到大量的GFP荧光信号，进一步表明该拟南芥株系中成功转入了目的基因，且GFP荧光信号均定位于细胞核中，与用来标记细胞轮廓的PI染料标记并不重合，进一步证明了在转基因拟南芥中表达的GmRSZ22也是定位在细胞核中的。
二、转GmRSZ22拟南芥植株的耐碱功能分析
将T3代筛选的阳性拟南芥植株用NaHCO3进行胁迫处理。幼苗期实验结果如图9中的A所示，在未进行胁迫处理时，过表达GmRSZ22株系(OE)的根长相对野生型拟南芥(WT)更短，然而在5mM NaHCO3胁迫下5天，OE株系的根长则显著长于WT，表现出明显的碱胁迫适应性。成苗期实验结果如图9中的B所示，在未进行胁迫处理时，OE植株与WT植株的生长并无显著差异，然而在50mM NaHCO3胁迫处理后，WT植株明显萎蔫直至死亡，而OE植株仍保持鲜绿。以上结果说明在拟南芥中过表达GmRSZ22基因能显著提高植株对碱胁迫的抗性。
实施例4：转GmRSZ22大豆嵌合体植株的获得及其耐碱功能分析
一、转GmRSZ22大豆嵌合体植株的获得和分子鉴定
1.转GmRSZ22基因大豆毛状根的获得
取一周龄子叶尚未展开的大豆Williams 82幼苗用于K599侵染，用注射器将分别含有重组载体pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22和pBWA(V)BS-3301-GFP空载体的K599发根农杆菌菌液注射到大豆子叶节中，待长出毛状根后，将侵染位点及以下部分用蛭石埋住，保持潮湿环境。等到长出毛状根30d后，当毛状根长至约10cm时，将主根减去，将复合体植株埋入混合土中，等到长出毛状根45d后，选取大小和毛状根数相似的健康转基因嵌合体植株，用50mMNaHCO3溶液浇灌处理，10天后用于胁迫鉴定及后续表型分析。
2.转基因大豆毛状根的鉴定
利用PCR的方法对转GmRSZ22基因大豆毛状根中添加的标签GFP进行检测。分别采用pBWA(V)BS-GFP-FW(SEQ ID NO.19)和pBWA(V)BS-GFP-RW(SEQ ID NO.20)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对pBWA(V)BS-3301-GmRSZ22载体携带的GFP基因片段进行检测(结果如图10中的A所示)，在随机挑取的9个转基因大豆毛状根中，#1，#2，#3，#5，#6，#9均能扩增出GFP基因条带，这表明这些大豆毛状根中均成功转入了目的基因。
对PCR检测出的阳性毛状根利用引物GmRSZ22-qPCR-F(SEQ ID NO.3)和GmRSZ22-qPCR-R(SEQ ID NO.4)进行RT-qPCR检测，结果如图10中的B所示，可以看出4组转基因毛状根中的基因表达量明显高于WT对照组，其中株系#2、#5和#9中过表达GmRSZ22基因的表达量分别是对照的15.5、13.5和9.3倍，差异均为极显著(p<0.01)。由此表明，GmRSZ22基因在大豆毛状根中超量表达。
二、转GmRSZ22嵌合体大豆植株的耐碱功能分析
1.转GmRSZ22基因大豆嵌合体植株的表型分析及生理指标的测定
以上述经鉴定阳性的嵌合体转基因大豆为材料，以50mM NaHCO3处理48h后，如图11中的A所示，过表达空载体(EV)的转基因嵌合体大豆叶片表现出严重的萎蔫现象，而过表达GmRSZ22(OE)的转基因嵌合体大豆则状态良好，仅存在轻微萎蔫表型。这表明过表达GmRSZ22基因可提高大豆的耐碱性。
通过测定碱胁迫处理后转基因嵌合体大豆叶片中的叶绿素含量发现(图11中的B和表2所示)，在碱胁迫下，EV组的嵌合体大豆叶片叶绿素含量在碱胁迫下呈显著下降趋势(下降了35.5％)，但OE组的叶绿素含量相比未处理组(Control)仅略有下降(降低了4.7％)，这与表型分析结果相符合。
植物体内脯氨酸含量是植物对逆境环境响应的重要指标之一。如图11中的C和表3所示，在未进行碱胁迫处理时，EV组与OE组的脯氨酸含量并无显著差异，而经胁迫处理之后，OE组中的脯氨酸含量与未处理的OE株系相比显著增加(增加了31.6％)，而EV组中的脯氨酸含量与未处理的EV株系相比仅增加10.3％。这说明过表达GmRSZ22增强了植物对碱胁迫的耐受性。
膜脂过氧化的最终分解产物为丙二醛(MDA)，其含量受到逆境伤害的影响，MDA 的过量积累会对细胞造成一定程度的伤害。转基因毛状根中的MDA含量变化如图11中的D和表4所示，在未进行碱胁迫处理时，EV组与OE组的MDA含量并无显著差异，经过碱胁迫处理之后，EV组与OE组的MDA含量与未处理相比均显著增加，但OE组中MDA含量的增加幅度远小于EV组，这表明碱胁迫处理下OE组株系中积累的MDA更少，受胁迫伤害程度也更小。
2.转GmRSZ22基因大豆嵌合体植株的活性氧含量分析
植物在受到碱胁迫时，会引起氧化应激反应从而可能产生大量的活性氧，如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)等。这些活性氧对植物细胞的质膜、DNA等会造成一定的伤害；同时，作为信号分子会激发下游信号发生细胞编程性死亡。为确定碱胁迫下过表达GmRSZ22提高嵌合体转基因大豆的耐碱性是否与细胞内活性氧的动态变化有关，本实施例采用细胞活体染色技术对转基因嵌合体大豆叶片进行染色分析。氮蓝四唑(NBT)能与O2-反应形成不溶于水的蓝色甲瓒化合物；3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)可被H2O2氧化后产生红棕色化合物；而台盼蓝(Trypan Blue)染色是常用的死细胞鉴定染色方法，丧失活性或细胞膜不完整的细胞可被台盼蓝染成蓝色，正常的活细胞细胞膜结构完整，则不会被染成蓝色。如图12中的A和B所示，在未进行碱胁迫处理时，EV组与OE组的叶片NBT和DAB染色均较浅，表明EV和OE叶片中均没有明显的活性氧(ROS)积累；而在碱胁迫下，OE组叶片的NBT和DAB染色明显比EV组更浅，表明OE组叶片中积累的活性氧较少；如图12中的C所示，在碱胁迫下OE组叶片台盼蓝染色明显比EV组更浅，表明在碱胁迫下，OE组叶片中死细胞较少，即碱胁迫下OE组叶片中积累的ROS更少，因而细胞的伤害程度更轻。如图13中的A和B及表5和表6所示，碱胁迫下OE组植株叶片中的O2-和H2O2含量显著低于EV组株系，这与上述细胞活体染色的结果是一致的。
植物遭到环境胁迫后，植物细胞中各种抗氧化酶(CAT、POD、SOD等)可以在不同逆境条件下清除体内多余的ROS，从而避免植物受到伤害。如图13中的C、D和E及表7，表8和表9所示，在碱胁迫下，OE株系中的SOD、POD以及CAT酶活显著增高，这说明过表达GmRSZ22能显著提高碱胁迫下大豆抗氧化酶活性，因而降低了叶片中O2-和H2O2的积累，从而正调控大豆碱胁迫应答。
表2转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下叶绿素含量测定结果
表3转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下脯氨酸含量测定结果
表4转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下丙二醛含量测定结果
表5转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下超氧阴离子含量测定结果
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表6转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下过氧化氢含量测定结果
表7转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下SOD酶活性测定结果
表8转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下POD酶活性测定结果
表9转GmRSZ22基因大豆毛状根嵌合体植株NaHCO3胁迫下CAT酶活性测定结果
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.GmRSZ22蛋白在提高植物抗碱性胁迫中的应用，其特征在于，所述GmRSZ22蛋白的序列如SEQ ID NO.21所示。
2.GmRSZ22基因在提高植物抗碱性胁迫中的应用，其特征在于，所述GmRSZ22基因序列如SEQ ID NO.22所示。
3.含GmRSZ22基因或含有GmRSZ22基因的重组载体或重组微生物细胞在提高植物抗碱性胁迫中的应用，其特征在于，所述GmRSZ22基因序列如SEQ ID NO.22所示。
4.一种超表达GmRSZ22基因的植物在提高植物抗碱性胁迫中的应用，其特征在于，所述GmRSZ22基因序列如SEQ ID NO.22所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆或拟南芥。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，抗碱性胁迫是抗NaHCO3胁迫。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，大豆嵌合体植株胁迫处理的条件是50mMNaHCO3处理10天。
8.一种育种抗碱性胁迫的大豆或拟南芥的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：扩增SEQ ID NO.22所示的GmRSZ22基因序列，将基因序列插入到表达载体；
步骤2：将步骤1获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆或拟南芥中得到转基因大豆或拟南芥；
步骤3：鉴定步骤2获得的转基因大豆或拟南芥得到阳性转基因植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1中的表达载体为pBWA(V)BS-3301-GFP。
10.一种提高大豆或拟南芥抗碱性胁迫的方法，其特征在于，将大豆的SEQ ID NO.22所示的GmRSZ22基因序列在大豆或拟南芥中超表达获得大豆或拟南芥转基因植株。
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