CN102177242A - 植物结构的变化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过将可用于产生特征为植物结构改变、碳和氮分配改变、生物量提高和/或可收获产量提高的植物的分离核酸分子引入植物，产生结构改变的植物的方法，也涉及如此产生的植物或其部分。更具体说，本发明涉及修饰植物以产生表型改变的植物的方法。还提供编码GAD多肽的核酸序列，能表达这类核酸分子的载体，包含此类载体的宿主细胞和此类核酸编码的多肽。

Description

植物结构的变化
发明领域
本发明总地涉及产生结构改变的植物的方法，以及如此产生的植物和这些植物的部分。更具体说，本发明涉及修饰植物以产生表型改变的植物的方法。植物和植物部分，如开花和生殖部分包括种子，也是本发明的一部分。修饰植物表型的能力可用于产生具有更加需要特征的植物。
发明背景
操纵植物结构是植物改良的最大支柱之一，也许仅次于发现植物的营养需求。随着“基因革命”的到来，对于选择性修饰植物结构有着不计其数的新机遇。
植物是复杂的结构，可根据应用需求，例如生物力学、水力结构、微气象学或植物生长模拟以多种方式对其进行描述。公认可认为植物是特定形态特征的组件以多种比例组合的集合(White，1979；Barthelemy，1991)。植物结构是应用于植物组件的空间组织的术语，可随时间变化。在给定时间，可用拓扑和几何信息定义植物结构。拓扑学解决植物组件间的物理连接，而几何学包括组件的形状、尺寸、取向和空间位置。
将植物结构定义为植物体的三维组织。对于地上部分，包括茎上的叶片和其它光合作用器官以及花器官的排列，以及分枝格局。迄今为止植物结构仍是鉴定植物种类的最佳方式，并在很长时间内是系统分类的唯一标准(Reinhardt和Kuhlemeier，2002)。由于叶片收集太阳能并作为气体交换表面，它们在植物冠层的排布是光截获和光合作用的关键。植物的光截获取决于其结构。在天然和农业系统中，植物结构影响植物健康和产量。为了使冠层最大程度截获光，植物已进化出不同的适应性性状，其中最主要的适应性性状之一是植物结构。.为了最大限度地提高光截获，改进的植物结构包括大小、形状、叶角度、株高、分枝和分蘖的改进。一些植物能够短时间改变其冠层结构以截获最大量的光。
植物结构是遗传学控制的性状，因此是可遗传的，不过环境因素，包括非生物的和生物的，都可以改变冠层结构。影响冠层结构的非生物因素包括土壤含水量、营养程度、温度和光。而生物因素包括食草动物、病原体以及与其它植物竞争。
植物结构对于农业生产非常重要，极大影响植物对于栽培和野外条件的适合程度。农业中，野外改良的植物结构能够提高作物的潜能。在不同作物中，已经开发出矮化品种，它们具有改良的冠层结构，能够更好的截获光(Coyne，1980)。使生产力大幅度增加的绿色革命的最大成果之一是基于对植物结构的改造，其中选择茎短且粗壮的矮化小麦变种的选择有助于植物抵抗风雨的伤害，从而更高产(Peng等，1999)。
影响植物结构的非生物因素包括植物生长的资源，如土壤含水量、温度和光照，在这些资源供应充足的条件下，植物的生长速度接近其遗传最大潜能，并表现典型的结构。然而，在这些资源稀缺的条件下，植物的生理和生长特性发生变化，从而改变结构，提高适应性。
现有技术
植物结构中的基因
植物持续不断形成以规则方式排列的新叶子，这种方式称为叶序。无论是通过对植物生长素运输蛋白PIN1进行突变或化学抑制植物生长素运输，对植物生长素运输的抑制会特异性抑制茎端分生组织(SAM)的器官形成，而不影响茎生长和分生组织的延续，从而形成松样秸秆(Okada等，1991；Reinhardt等，2000)。P-糖蛋白PGP是质膜阴离子转运子，拟南芥中的PGP转运植物生长素，植物生长素控制细胞的延长、植物形状、根分支和果实的发育，迄今为止检查的pgp突变子减少了植物生长素的转运，是表现为不同程度热带反应的矮化株(Murphy等，2000；Noh等，2001)。
AVP1，一种焦磷酸驱动的质子泵，对于建立和维持根生长发育所需的植物生长素梯度很重要。过表达AVP1的植物(AVP1OX)的芽和根的质量和表面积较大。植物王国中AVP1高度保守，在拟南芥、番茄和稻中高表达观察到相似的效应(Gaxiola等，2001；Drozdowicz等，200)。
TWD是含有推定质膜GPI锚的亲免素样蛋白。植物中TWD与多种蛋白，包括PGP相互作用。Pgp1 pgp19双突变体类似于twd突变体，表明TWD介导PGP与其它蛋白质的相互作用，twd突变体是矮化株，并且所有的解剖学特征具有超级扭转(hypernutation)，得到器官扭曲，尤其是茎、叶和花扭曲的较矮植株，得到让人高兴的不同寻常外观的植物(Kamphausen等，2002；Geisler等，2003)。
最近的证据表明海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)基因是植物发育和花序结构的重要调节物。在一个实施例中，海藻糖似乎调节玉米的花序分枝(Satoh-Nagasawa等，2006).。RAMOSA基因控制玉米的花序分支，其中一种基因(RAMOSA3)编码海藻糖生物合成基因，该基因通过调节转录因子RAMOSA1发挥功能(Satoh-Nagasawa等，2006)。Chary等，2008提供的证据表明II型TPS基因除了作为整体植物发育表型的调节物之外，还能控制细胞的形态。他们鉴定出细胞形态表型-1(csp-1)突变体，对叶片表皮细胞具有显著影响，引起铺列细胞叶丢失。此外，还表明csp-1影响毛状体(trichome)细胞形态，使分枝模式改变。突变体显示出一系列发育缺陷，包括植株变矮，茎分枝改变和显著的叶片锯齿。
GABA旁路
γ-氨基丁酸(GABA)是含四个碳原子的非蛋白质氨基酸，在细菌、植物和脊椎动物中具有保守性。GABA是游离氨基酸池的重要组分。GABA在γ碳而非α碳上具有氨基，以未结合的形式存在。它具有高水溶性。就结构而言，它是柔性分子，可在溶液中采取若干构象，包括与脯氨酸1类似的环状结构。GABA在生理pH值(pK值为4.03和10.56)下为两性离子(同时携带正电荷和负电荷)。
这于半个多世纪前在植物中发现，但揭示GABA在大脑中以高水平产生并在神经传递中发挥主要作用时，对GABA的兴趣转移到了动物上。此后，在脊椎动物中对GABA的研究就主要集中在其作为信号传导分子特别是在神经传递中的作用上。在植物和动物中，GABA主要经包含三种酶的短途径进行代谢，所述短途径称为GABA旁路，因为它绕过了三羧酸(TCA)循环中两个步骤。所述途径包含胞质酶谷氨酸脱羧酶(GAD)与线粒体酶GABA氨基转移酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)。该保守代谢途径的调节在植物中似乎具有特定特征。
经GABA将谷氨酸转化为琥珀酸的途径称为GABA旁路。该旁路的第一步是通过谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)对谷氨酸进行直接和不可逆的α-脱羧化。已在多个植物种类和组织的粗提物中对体外GAD活性进行了表征(Brown和Shelp，1989)。GAD对L-谷氨酸具有特异性，具有吡多醛5’-磷酸依赖性，受已知与巯基反应的试剂的抑制作用，具有钙调蛋白结合结构域，显示约5.8的明显酸性的最适宜pH。已鉴定了来自矮牵牛花(Baum等，1993)、番茄(Gallego等，1995)、烟草(Yu和Oh，1998)和拟南芥(Zik等，1998)的GAD基因。参与GABA旁路的第二个酶是GABA氨基转移酶(GABA-T；EC 2.6.1.19)，其将丙酮酸或a-酮戊二酸作为氨基受体，催化GABA可逆地转化为琥珀酸半醛。在粗提物中，相对于α-酮戊二酸，体外GABA-T活性似乎更优选丙酮酸。然而，烟草叶的粗提物中存在不同的丙酮酸依赖性和α-酮戊二酸依赖性活性，它们可通过离子交换色谱进行相互分离(Van Cauwenberghe和Shelp)。两种活性显示的最适宜pH很宽，为8-10。来自烟草的纯化约1000倍的丙酮酸特异性线粒体GABA-T的米氏常数(Km)就GABA为1.2mM，就丙酮酸为0.24mM(Van Cauwenberghe和Shelp)。
GABA旁路的最后一步由琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH；EC 1.2.1.16)催化，不可逆地将琥珀酸半醛氧化为琥珀酸。所述部分纯化的植物酶具有约为9的碱性最适宜pH，与NAD的活性最多是与NADP的活性的20倍(Shelp等，1995)。
实际上，对植物中GABA旁路的兴趣主要来自关于GABA主要在对生物性胁迫和非生物性胁迫作出应答时快速产生的实验观察。从此将GABA旁路与各种生理应答联系起来，包括胞质pH调节、TCA循环碳流入、氮代谢、阻止昆虫、针对氧化应激的保护作用、渗透调节和信号传导。
本文首次报道利用谷氨酸脱羧酶基因改变植物形态结构的方法。出于该目的，尝试使用基因如P-糖蛋白、植物生长素转运蛋白、植物激素和质子泵。迄今为止没有人尝试过使用参与GABA旁路的相关基因，尤其是谷氨酸脱羧酶来改变植物结构。之前的尝试涉及来自水稻的两种谷氨酸脱羧酶基因OsGAD1和OsGAD2，经土壤杆菌将二者同时引入水稻愈伤组织以建立转基因细胞系。再生的水稻植物具有异常表型，如矮态、黄化叶和不育(Akama和Takaiwa，2007)。
发明目的
本发明涉及使用谷氨酸脱羧酶基因通过土壤杆菌介导的转化改变植物结构的方法(包括单子叶植物和双子叶植物)。此外，本发明涉及一种修饰植物以表达与植物结构有关的基因的方法，以及采用该方法产生的植物。
提供了在转基因植物中通过操纵GAD基因家族改变植物结构的组合物和方法。
本发明提供了GAD基因的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列和多肽包括GAD基因、其蛋白质和功能性片段或其变体。
本发明的方法包括在植物中引入核苷酸序列并表达对应多肽。本发明的序列可用于在植物中改变植物结构、改变碳和氮分配、增加生物量和或提高可收获产量。本发明的方法具有提高植物的生物量和可收获产量的用途。
还提供了转化的植物、植物组织、植物细胞、种子和叶片。此类转化的植物、组织、细胞、种子和叶片包含稳定插入其基因组的至少一个拷贝的本发明核苷酸序列。。
本发明的一个实施方式是一种表征植物的方法，包括：
a.将包含核苷酸序列的重组表达盒引入植物细胞，所述核苷酸序列的单独表达或与其它多核苷酸联合表达在植物中发挥氮使用效率效应物的功能；
b.在植物形成条件下培养所述植物细胞产生植物；和
c.诱导所述核苷酸序列表达以改变所述植物的结构。
序列表
SEQ ID 1显示水稻(Oryza Sativa)谷氨酸脱羧酶基因的核酸序列。起始密码子和终止密码子用斜体表示。
SEQ ID 2显示水稻谷氨酸脱羧酶基因的氨基酸序列。星号表示终止密码子。
附图简要说明
图1显示携带谷氨酸脱羧酶编码DNA序列的植物转化载体。
图2显示通过土壤杆菌介导的基因转移用GAD基因转化烟草叶的不同阶段。
图3显示用以下不同引物组合对转化和再生的烟草T0幼苗中的GAD基因进行PCR证实，：-a)HygR基因的正向和反向引物；b)基因特异性正向和反向引物和c)基因正向和Nos反向引物。
图4显示了用GAD基因特异性正向和反向引物，用RT-PCR在cDNA模板上分析GAD基因，从而确认T0烟草幼苗中引入基因(GAD)的表达。
图5显示对于温室中生长的T0 GAD转基因烟草、野生型植物以及转入非GAD基因的转基因植物的叶片大小进行比较。
图6显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的植株高度的比较。
图7显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的节间距的比较。
图8显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的叶片数目的比较。
图9显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的茎周长或茎粗的比较。
图10显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗节的a)叶片长度；b)叶片宽度和c)叶片面积的比较。
图11显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的总生物量的比较。
图12显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的总谷物产量的比较。
图13显示对于温室罐中生长的潮霉素阳性GAD转基因植物的T1幼苗(D1A、E2和H1)与野生型幼苗的种子饱满度(100粒种子的重量)的比较。
发明详述
提供以下对本发明的详细说明来协助本领域技术人员实施本发明。即使如此，不应将对本发明的详细说明理解为对本发明构成不适当的限制，因为本领域普通技术人员可对本文所讨论的实施方式中作出修改和变动，而不背离本发明的精神或范围。
本发明涉及一种具有谷氨酸脱羧酶特征的纯化分离的DNA序列。
如本发明所述，所述纯化分离的DNA序列通常由谷氨酸脱羧酶核苷酸序列或其片段组成。
本发明还包括上述序列或片段的互补序列，其可通过任何手段产生。
本发明包括上述序列的变体，即通过保守核苷酸取代而不同于参考序列的核苷酸序列，由此一个或多个核苷酸被其它具有相同特征的核苷酸取代。
如本发明所述，上述核苷酸序列可位于表达载体中包含启动子和感兴趣基因的序列的5’和3’端。
本发明包括上述序列在改变所产生植物的结构中的用途，“植物结构”指在合适的条件下将DNA序列引入宿主植物后，与未用所述DNA序列转染的对照植物相比，所述序列能够增加植物的叶片大小、节间距、茎粗、生物量和可收获产量。
以下定义用来帮助理解本发明。
“染色体”是在细胞内发现的DNA和蛋白质的有序结构。
“染色质”是在真核细胞的细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体，其组成染色体。
“DNA”或脱氧核糖核酸包含遗传信息。其由不同的核苷酸构成。
“基因”是编码成熟蛋白质的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，“基因”不应包含不翻译侧翼序列如RNA转录起始信号、多聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。
“启动子”是控制基因表达的核酸序列。
“增强子”指不依赖基因位置或取向而启动基因转录的基因序列。
本文定义的“载体”指可向其中插入外源DNA片段的DNA分子。载体通常衍生自质粒，其作用类似“分子运载体”，携带DNA片段进入宿主细胞。
“质粒”是在细菌和一些其它生物体中发现的小环状DNA。质粒可独立于宿主细胞染色体进行复制。
“转录”指从DNA模板合成RNA。
“翻译”指从信使RNA合成多肽。
“取向”指DNA序列中核苷酸的次序。
“基因扩增”指对某个基因进行重复复制而不引起其它基因拷贝数量成比例增多。
“转化”指通过任何转移手段向植物细胞引入外源遗传材料(DNA)。不同的转化方法包括基因枪轰击(生物射弹)、电穿孔、土壤杆菌介导的转化等。
“转化植物”指将外源DNA引入其中的植物。该DNA将成为宿主染色体的一部分。
“稳定的基因表达”指制备永久性表达感兴趣基因的稳定的转化植物取决于质粒稳定整合到宿主染色体中。
尽管本发明如上述定义广泛，但本发明的熟练技术人员应当了解本发明并不限于此，还包括下文中包含的实施例的实施方式。
实施例1
从水稻分离和纯化GAD基因核苷酸序列并构建植物转化载体
在35S花椰菜花叶病毒启动子下游克隆GAD基因，用NOS终止子终止，全部为操作性连接。
植物材料
将水稻(Rasi栽培变种)用于制备核酸。种子萌发后，将其置于培养室的水栽溶液中培育。用150mM NaCl对幼苗处理7-16小时。
RNA抽提和EST文库构建
从整株幼苗中提取RNA。构建受盐胁迫的RASI cDNA的EST文库。从EST文库中鉴定显示与谷氨酸脱羧酶具有相同性的EST。
鉴定和分离GABA旁路中的基因
在高等植物中GABA在各种应激开始之后发生累积，所述应激如酸化作用、缺氧、低温、热激、机械性刺激、病原体侵袭、干旱和盐胁迫。已从水稻的盐胁迫文库中分离出GABA旁路中的谷氨酸脱羧酶基因。
克隆谷氨酸脱羧酶基因
已将谷氨酸脱羧酶基因克隆到克隆载体和植物转化载体中(生物射弹和二元载体)，使其位于组成型启动子之下。使用下述BglII和EcoR1限制性酶切位点(有下划线的核苷酸序列)标记的引物对从籼稻(RASI栽培变种)的cDNA中扩增编码谷氨酸脱羧酶完整基因序列的cDNA：
正向：5′-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-3′
反向：5′GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-3′
采用以下PCR条件：94℃ 1分钟；94℃ 30秒；75℃ 3分钟(循环5次)；94℃ 30秒；68℃ 3分钟(循环30次)，68℃最后延伸7分钟。
扩增的cDNA由1479个核苷酸碱基对组成，编码成熟的谷氨酸脱羧酶。
将扩增的片段克隆到pGEMT轻便(pGEMT easy)载体中。用限制酶在BamHI和EcoRI位点消化所述基因，并连接到生物射弹载体pV1中。在BglII和EcoRI限制性位点酶切该生物射弹载体(BglII和BamHI酶是同切酶)，以确认该基因的存在。还通过测序证实所述基因。所得载体(pV1-GAD)具有受35S花椰菜花叶病毒(35S CaMV)启动子驱动且包含NOS终止子的GAD基因(1.479kb)和作为选择性标记的氨苄青霉素抗性基因。
在HindIII和BamHI位点限制性消化来自pV1-GD的由35S CaMV启动子驱动和由NOS终止子终止的GAD基因的基因盒。将该基因盒连入在HindIII和BamHI位点限制性消化的pCAMBIA 1390pNG15。所得载体(pAPTV1390-GAD)具有由35S花椰菜花叶病毒(35S CaMV)启动子驱动和由NOS终止子终止的GAD基因(1.479kb)，以及作为选择性标记的nptII(卡那霉素抗性)基因和hph(潮霉素抗性)基因(图1)。
实施例2
产生具有改变的GAD基因的植物
植物转化
通过土壤杆菌将谷氨酸脱羧酶基因转化入烟草(模式植物)和稻(作物植物)以验证鉴定的基因。
土壤杆菌介导的用携带GAD基因的二元载体转化烟草叶外植体的详细步骤如下：
1.将土壤杆菌的阳性菌落接种到含50mg/L卡那霉素(Kan)和10mg/L利福霉素(Rif)的LB肉汤中，因为载体主链上含有Kan和Rif抗性基因，这可作为一次进行的双重选择。
2.然后在振荡器28℃培养肉汤。
3.将过夜生长的菌落在早上接种到含50mg/L Kan和10mg/L Rif的50mLLB肉汤中，在28℃培育3-4小时，检测600nm的OD，并使其继续生长到OD为0.6-1。
4.一旦所述肉汤达到所需OD，将其在5000rpm离心5分钟。
5.弃去上清液，将细胞沉淀溶解在穆拉什格斯固格(Murashige和Skooge，MS)液体培养基(Agro-MS肉汤)中。
6.将烟草叶切为小方片作为不携带中脉的外植体，小心地在所有四条边上对叶进行破坏而不损伤接种物的中心部分。
7.将这些叶样品置于MS普通培养基中，在BOD培育箱中放置两天。接种两天后，用现处于Agro-MS肉汤中的转化的土壤杆菌细胞感染这些叶样品。
8.将所述叶外植体在该Agro-MS肉汤中放置30分钟，然后将其在共培养培养基上放置两天，所述共培养培养基由MS+1mg/L盐酸6-苄氨基嘌呤(BAP)+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+250mg/L头孢噻肟组成(图2a)。
9.在共培育后，将外植体放置在MS+1mg/L BAP+0.2mg/L NAA+40mgHyg+250mg/L头孢噻肟组成的第一选择培养基中培养15天，当愈伤组织开始从这些外植体伸出时，再次将这些样品置于第一选择培养基中亚培养，使愈伤组织足够成熟(图2b)。
10.一旦发现所述愈伤组织达到成熟，就将这些愈伤组织接种到第二选择培养基上，所述第二选择培养基由MS+1mg/L BAP+0.2mg/L NAA+50mgHyg+250mg/L头孢噻肟组成。随着潮霉素浓度增大，从第一选择逃离的愈伤组织受到抑制，仅有转化的愈伤组织开始在该培养基上存活。
11.随后10天中在该第二选择培养基上进行一次亚培养。
12.这时候愈伤组织开始出苗。取出来自第二次选择的小植株置于生根培养基上，所述生根培养基由1/2MS+0.2mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)组成。此处的小植株在12-15天时开始伸出根部。由于也可在该阶段鉴定逃离例，所以一旦形成成熟的根，就将所述植物在含20mg/L潮霉素的生根培养基上进行亚培养(图2c)。
13.使该阶段的植物习服，其中将瓶盖开放保持两天，使植物适应其生长空间环境。之后将植物从琼脂培养基上移出并在1/4MS液体培养基上放置两天。再将这些植物转移到蛭石上，每天浇水，持续一周。
14.根据植物的条件，将合适的植物转移到温室中。
15.在将植物送到温室之前的习服期间收集植物的老叶。
16.从各叶样品提取DNA，用基因特异性引物和选择性标记如潮霉素的引物进行PCR。再将PCR证实的阳性植物转移到温室中。
用引入的GAD基因证实植物
提取GAD烟草转基因品系的基因组DNA
收集转基因GAD烟草植株的叶样品，提取基因组DNA。
基因组DNA提取的步骤：
·从各植株收集约1gm叶。
·在研钵和臼中用液氮研磨所述样品。
·向所述样品中加入1ml提取缓冲液(0.2M Tris Cl pH-8.0；2M NaCl；0.05M EDTA；2％CTAB)，在13K离心10分钟。
·收集上清液。加入RNA酶[1ml加入3μl(1mg/mL)]，在37℃培育半小时。
·加入等体积的氯仿-异戊醇，13k离心10min。
·将上清液收集在新试管中，加入相等体积的冷异丙醇，在13k离心10分钟。
·用70％的醇洗涤沉淀，将沉淀干燥并溶解在30μl温热的高压灭菌水中。
·将1μl DNA上样于凝胶并检测。
用不同引物组合进行PCR证实转基因植物：
1.用潮霉素正向(Hyg F)和潮霉素反向(Hyg R)引物进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   1μL
  Hyg F   10pM   0.5μL
  Hyg R   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液A   10X   3μL
  MilliQ水   24.2μL
  总体积   30μL
PCR条件：(艾本德机器(Eppendorf Machine))
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   50℃   50秒
  4   72℃   1分钟  转到第2步，30次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3a中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
2.用基因特异性引物GAD正向(GD F)引物和GAD反向(GD R)引物进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μL
  GD F   10pM   0.5μL
  GD R   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液A   10X   2μL
  MilliQ水   14.2μL
  总体积   20μL
PCR条件：(艾本德机器)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   69℃   50秒
  4   72℃   1.30分钟  转到第2步，35次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3b中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
3.用GD F和Nos MR进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μL
  GD F   10pM   0.5μL
  Nos MR   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液A   10X   2μL
  MilliQ水   14.2μL
  总体积   20μL
PCR条件：(艾本德机器)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   67℃   50秒
  4   72℃   2分钟  转到第2步，35次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3c中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
不同PCR反应中采用的引物序列如下所示：
Hyg F：5′-CTGAACTC ACCGCGACGTCT-3′
Hyg R：5′-CCACTATCGGCGAGTACTTC-3′
GD F：5′-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-3′
GD R：5′-GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-3′
NOS MR：5′-GATAATCATCGCAAGACCGGCAAC-3′
Tub F：5′-GACGAGCACGGCGTTGATCCTA-3′
Tub R：5′-CCTCCTCTTCATACTCTTCCT-3′
证实引入的GAD基因在转基因植物中表达
对引入的GAD基因表达的证实包括诸如提取RNA、合成cDNA和逆转录PCR等步骤。
分离转基因GAD烟草植株和对照植株(野生型)的RNA。
提取RNA包括的详细步骤：
1.取500mg叶组织放入预冷的臼中，用液氮研磨成细粉末。
2.用预冷的刮刀将粉末转移到预冷的艾本德管中。
3.在匀浆样品中加入1ml Trizol溶液。充分混合并在室温(RT)下培育5分钟。
4.向其加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，在室温下培育5分钟。
5.将样品13000rpm 4℃离心15min。
6.将上部水相收集在新管中(约60％，即600μl)。
7.向收集的上部相中加入500μl冷异丙醇，在室温下培育10分钟。
8.将样品13000rpm 4℃离心15min。
9.倾去上清液，用500μl 70％的醇(DEPC H2O)洗涤沉淀，并在10000rpm、4℃离心5分钟。
10.弃去上清，将沉淀在室温下干燥15分钟。
11.在设定在55℃的水浴或干浴中将团块溶解于20μl DEPC处理的H2O中。
12.将2μl样品上样于凝胶。将样品存储于-80℃备用。
合成cDNA包括的详细步骤：
合成转基因GAD烟草植株和野生型植株的cDNA：
1.按照下列顺序加入组分：
总RNA：               4μl(1μg)
寡dT：                0.5μl
0.1％DEPC/无核酸酶水：6.5μl
总共：                11μl
2.在PCR仪上将上述成分加热至70℃ 5分钟，冰上迅速冷却。
3.同时将以下组分加入另一个管中制备下一个混合物：
5x反应缓冲液：        4μl
dNTP混合物(10mM)：    2μl
RNA酶抑制剂(20U/ul)： 0.5μl
0.1％DEPC/无核酸酶水：2μl
总共：                8.5μl
4.将该8.5ul混合物加入迅速冷却的PCR管的内容物中，并轻轻拍匀。
5.用PCR机将PCR管中的组分在37℃培育5分钟。
6.向所述管中加入0.5μl M-MuLV RT酶，继续进行PCR机中设定的程序(25℃ 10分钟，37℃ 60分钟，70℃ 10分钟)。
7.将cDNA存储于-20℃，准备用于PCR。
通过RT-PCR分析引入的GAD基因在转基因烟草植株中的表达
通过用基因特异性引物进行PCR来分析来自GAD转基因烟草和野生型植株的cDNA，以检测引入的GAD在烟草中的表达。
用基因特异性引物对cDNA进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μL
  GD F   10pM   0.5μL
  GD R   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液A   10X   3μL
  MilliQ水   24.2μL
  总体积   30μL
PCR条件：(艾本德机器)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   69℃   50秒
  4   72℃   1.30分钟  转到第2步，30次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图4中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
实施例3
具有改变的GAD基因的植物在T0代表现出改变的植物结构的证据
植物材料
该实验使用野生型和和T0转基因烟草植物。在温室中含有野外土壤混合物的罐中培养幼苗。用不含有任何外源肥料的普通水浇灌植物。土壤中混合的FYM作为植物的唯一营养来源。
叶片尺寸
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的叶片尺寸。T0转基因植物的叶片大于对照植物叶片。叶片尺寸比对照植物增大至少20％，最大比野生型植物增加160％(表1和图5)
表1：野生型和T0 GAD烟草转基因植物之间叶片大小比较
  SL号   植株   叶片直径(cm)   比对照增加％
  1   D-1   19.5   95
  2   E-1   13   30
  3   E-2   12   20
  4   G-1   17.5   75
  5   H-1   12   20
  6   H-2   12.5   25
  7   I-1   18   80
  8   I-2   14   40
  9   J-1   10   -
  10   J-2   26   160
  11   野生型   10   -
实施例4
具有改变的GAD基因的植物在T1代表现出改变的植物结构的证据
研究T1代转基因植物的表型以评价涵盖植物整个生命周期的成年植物阶段期间的植物结构。
选择三个转基因事件D1A、E2和H1评价温室罐中培养的植物的结构变化。该实验使用野生型和转基因烟草进行。在含有潮霉素(50mg/L)的潮湿滤纸片上使T1种子萌发；选择萌发并生长的阳性幼苗，将其与野生型幼苗一起置于大罐子中(11英寸直径)的土壤中。在温室中含有野外土壤和厩肥(FYM)的混合物的罐中培育幼苗。用普通水或200mM NaCl盐水灌溉植物。用表1中四种基因型的植物(野生型以及D1A、E2和H1转基因烟草)一式三份进行实验。
表1：用于评价植物结构改变的实验设计
用四种基因型的植物一式三份进行实验以便比较
Figure BPA00001331009600171
表型评价：
观察表型特征，记录有关植物结构的参数如植株高度、节间距、分枝数目、叶片数目、叶面积、茎粗(周长)、总生物量、谷物产量等。
植株高度
记录转基因植物和野生型植物(没有引入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的植株高度。用从土壤水平开始到植物顶端包括花序和分枝在内的尺寸作为植物高度。三个事件中的转基因植物比野生型植物高(图6)。植物高度至少增加10％(H1)，最多增加23％(D1A)。
节间距
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的茎上两节间距离。测量第5、6片叶和第6、7片叶之间的节间距。从顶端开始对叶片计数，完全伸展的叶片记为叶片1。用线测量距离，然后测量线的长度，用cm表示。转基因植物(H1)比野生型的节间距至少增加44％(图7)。
叶片数目
记录每一转基因植物和野生型植物(没有引入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的叶片数目。转基因植物比野生型叶片数增加35％(图8)。
茎周长(茎周或茎粗)
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的茎粗。测量土壤水平以上5-6cm处的茎周长。在合适高度用线环绕茎，然后测量线的长度，并用cm表示。转基因植物比野生型植物的茎粗(图9)。转基因植物的茎至少粗28％，最粗可至47％(E2)。
叶片面积
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的叶片大小。从节到叶尖垂直测量叶片长度。转基因植物叶片比野生型长27％-37％(图10a)。在最宽点水平测量叶片宽度。转基因植物比野生型植物的叶片宽42％-65％(图10b)。用上述长度x宽度计算叶片面积，用cm2单位表示。转基因植物的叶片面积比野生型显著增加(80％-129％)(图10c)。叶片面积增加的效果至少在所测试两代(T0和T1)中保持稳定。
植物生物量
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)所产生的生物量。用整个植株的干重评价植物生物量。来自转基因植物的总生物量显著高于野生型植物(22％-88％)(图11)。这可能是因为其它表型特征，如叶片大小和茎粗等的显著增加。
谷物产量
转基因植物的总谷物产量显著高于野生型植物(多50％以上)(图12)。来自转基因植物的谷粒或种子更加饱满且更大，表现为种子测试重量更大(图13)。
总之，来自所有三个事件的受试GAD转基因植物显示出阳性的表型改变或植物结构改变。就不同的农艺学和生理状态而言，GAD转基因植物的性能优于野生型植株，从而表明GAD基因在改变转基因植物的植物结构，从而提高其性能中的作用。
Figure IPA00001331009200011
Figure IPA00001331009200021
Figure IPA00001331009200031
Figure IPA00001331009200041
Figure IPA00001331009200051

Claims (20)

1.一种产生表现出植物结构改变的转化植物的方法，包括：将包含与编码功能性谷氨酸脱羧酶(GAD)的核酸序列操作性连接的组成型或非组成型启动子的DNA构建物掺入植物基因组中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码功能性谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列包含SEQ ID No.1所列核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子选自操作性连接于SEQ ID No.1所列核苷酸序列的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和细胞类型特异性启动子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子选自诱导型启动子，能够对选自下组的信号产生响应：机械性刺激、热、冷、盐、洪水、干旱、创伤、缺氧、病原体、紫外线B、营养耗竭、开花信号、结果信号，细胞特化及其组合。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子选自组织特异性启动子，在选自下组的植物组织中表达：叶、茎、根、花、花瓣、花药、胚珠等，及其组合。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子选自细胞类型特异性启动子，在选自下组的植物细胞中表达：薄壁组织、叶肉、木质部、韧皮部、保卫细胞、气孔细胞等，及其组合。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶包含SEQID NO：2所列的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID No.2所列的氨基酸序列可有效催化谷氨酸到γ-氨基丁酸(GABA)的反应。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化植物表达SEQ ID No.1所列谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，其表达水平高于相同条件下同种非转化植物表达GAD基因的水平。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶植物选自单子叶植物、双子叶植物、谷类、饲料作物、豆科植物、豆类植物、蔬菜、水果、油料种子、纤维作物、花卉、园艺植物、药用植物和芳香植物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将DNA构建物掺入植物基因组的方法包括；
I.用所述DNA构建物转化来自宿主植物的细胞、组织或器官；
II.选择包含所述DNA构建物的转化细胞、细胞愈伤组织、体细胞胚或种子；
III.从所选的转化细胞、细胞愈伤组织、体细胞胚或种子再生完整植株；和
IV.选择表达所述多核苷酸的再生完整植株。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，使用颗粒枪、生物射弹或土壤杆菌介导将所述DNA构建物转化到宿主植物的细胞组织或器官中。
13.一种根据权利要求1-12中任一项所述方法获得的转化植物及其后代。
14.如权利要求13所述的转化植物，其特征在于，将SEQ ID No.1所列的DNA构建物掺入杂合或纯合状态的植物中。
15.如权利要求1-14中任一项所述的转化植物，其特征在于，所述植物的选自下组的植物结构特征发生显著改变：植株高度、节间距、茎粗、叶片数目、叶片尺寸、生物量、可收获产量及其组合。
16.如权利要求15所述的转化植物，其特征在于，所述植物的叶片数目和/或叶片尺寸显著增加。
17.如权利要求16所述的转化植物，其特征在于，所述植物的叶片长度和/或宽度显著增加。
18.如权利要求15所述的转化植物，其特征在于，所述植物的生物量显著增加。
19.如权利要求15所述的转化植物，其特征在于，所述植物的可收获产量显著增加。
20.一种用包含与编码GAD酶的多核苷酸操作性连接的组成型启动子的载体转化的植物或其后代；其中所述植物表达所述多核苷酸；并且与非转化植物相比，所述植物的植物结构、植株高度、节间距、茎粗、叶片数目、叶片尺寸、生物量、可收获产量、繁殖功能或其它形态学或农艺学特征显著改善。
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