CN104418955B - 水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列的应用，其是利用转录因子抑制基序EAR与水稻转录因子Os06g47150融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如增加水稻籽粒宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。

Description

水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。

在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。

生长素是植物体重要的生长调节分子，参与植物根和茎的生长和发育、器官的衰老、维管束组织的形成和分化发育，维持顶端优势，胚胎中轴的建立，植物的向地和向光反应以及刺激花器官生长等生长和发育诸多过程，在植物整个生命周期过程中发挥重要的作用。ARF做为生长素的响应因子，是一类调控生长素响应基因表达的转录因子，在生长素的信号传导过程中处于中心位置，它可与生长素响应元件特异结合，促进或抑制基因的表达。植物ARF由3个结构域组成：氨基端的DNA结合结构域（DBD），中间结构域（MR）以及羟基末端的二聚结构域（CTD）。中间结构域包括激活结构域（AD）和抑制结构域（RD）。在生长素信号转导过程中，ARF主要通过与生长素响应元件结合，早期基因转录，从而调节下游基因的表达。不同ARF在不同的组织和器官中都有特异表达。植物激素、外界环境因子和非编码区小RNA对ARF功能的发挥具有重要的调控作用。

通过拟南芥ARF家族基因AtARF1/AtARF2功能研究表明，AtARF2可调控叶片衰老,开花时间及种子体积的大小等（Ellis CM.et al.(2005)AUXIN RESPONSE FACTOR1andAUXIN RESPONSE FACTOR2regulate senescence and floral or-gan abscission inArabidopsis thaliana.）（Schruff MC.et al.(2006)The AUXINRESPONSE FACTOR2geneof Arabidopsis links auxin signalling,cell division,and the size of seeds andother organs.），arf1arf2双突变体与arf2单突变体表型相似，表现为晚花、叶片衰老延迟、黄化苗顶端玩够结构紊乱及种子体积增大(Okushima Y.et al.(2005)Functionalgenomic analysis of the AUXIN RESPONSE FACTOR gene family members inArabidopsis thaliana:unique and overlapping functions of ARF7and ARF19.)。

OsARF1是水稻中第一个克隆的ARF，受生长素快速诱导，且不依赖于蛋白质的重新合成，因此，OsARF1是生长素的原初响应因子（Waller F.et al.(2002)OsARF1,an auxinresponse factor from rice,is auxin-regulated and classifies as a primaryauxin responsive gene.）。定量RT-PCR揭示OsARF1在胚组织中的转录丰度远高于营养组织。通过构建反义OsARF1并转入水稻，发现转基因植株的生长速率和生活力极度下降，表现为叶片卷曲、分蘖芽不育等性状，因此，OsARF1对于水稻的营养生长和种子发育是必需的（Attia K.et al.,(2009)Antisense phenotypes reveal a functional expression ofOsARF1,an auxin response factor,in transgenic rice.）。ARF家族另一个基因OsARF12，是生长素应答基因的转录激活因子，参与调解水稻根的伸长并影响铁的积累。水分或营养元素的缺乏导致植物生长变缓，生长素通过维持最佳的根系结构(RSA)来减轻胁迫的影响。生长素应答因子OsARF12是RSA的一个限制因子。敲除OsARF12导致水稻主根的长度变短。作为一个转录激活子，OsARF12促进了生长素应答原件DR5::GFP的表达，在烟草或水稻愈伤中瞬时表达osa-niRNA167d可以抑制OsARF12。在osarf12和osarf12/25突变体的根伸长区，生长素浓度降低，长度也较野生型显著降低，这可能是由于生长素合成基因OsYUCCAs和生长素流出载体OsPINs和OsPGPs的表达降低引起的。因此对转录因子的研究，在理论上为进一步理解植物种子和器官发育调控的分子机理提供了新的线索，在实践上也将为作物高产育种提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种组成型水稻转录因子，即融合蛋白EAR-Linker-Os06g47150。

其中，EAR为来自植物转录因子的一段具有转录抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.4所示。

上述融合蛋白中涉及的Linker由1～40个柔性氨基酸串联而成（例如，GGGGG、GPPPG或Gatway载体重组位点编码的氨基酸序列DPAFLYKVVPR等）。

作为优选，Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，编码该Linker的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

上述融合蛋白中涉及的Os06g47150为水稻转录因子Os06g47150，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；水稻转录因子Os06g47150基因的CDS序列为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。

本发明还提供含有编码所述组成型水稻转录因子的基因的载体、工程菌及细胞系。

所述载体的构建方法如下：

（1）在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml）中找到Os06g47150基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTTTCGTGGATTC-3'和反向引物R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCCTAAAACTGGACTGACCT-3'。

（2）以野生日本晴‘kitaake’水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR，获得Os06g47150基因完整的CDS序列。

（3）将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

（4）以植物双元表达载体pCambia1301-UbiN（图6）左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-EAR-Gateway表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nEAR-hyg-asRED的全序列如SEQ IDNo.5所示。

（5）通过LR反应将Os06g47150基因的CDS序列构建到其目的基因的5’端连有EAR编码基因的植物表达载体nEAR-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因子EAR-Linker-Os06g47150基因的表达载体ubi：EAR-Os06g47150，其全序列如SEQ ID No.6所示。

上述表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant MolecularBiology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecular Biology，2nd Edition）。

本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为：采用农杆菌介导的方法，将上述表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。

本发明还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因在改良水稻籽粒性状（例如增加水稻粒宽及千粒重）中的应用。

本发明还提供了用于扩增水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列的引物对，包括正向引物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTTTCGTGGATTC-3'和反向引物R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCCTAAAACTGGACTGACCT-3'。

本发明进一步提供水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列在调控水稻籽粒性状中的应用。利用转录因子抑制基序EAR（SEQ ID No.10）与水稻转录因子Os06g47150融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中，从而改良转基因水稻籽粒的性状。

前述的应用，是将水稻转录因子Os06g47150基因的CDS序列构建到转录因子抑制基序EAR编码基因（SEQ ID No.4）的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。优选将水稻转录因子Os06g47150基因的CDS序列通过Gateway系统转录因子抑制基序EAR编码基因的下游。

本发明首次利用转录因子抑制基序EAR与水稻转录因子Os06g47150融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如水稻籽粒宽度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中nEAR-hyg-asRED载体图谱。

图2为本发明实施例1中ubi：EAR-Os06g47150载体图谱。

图3为本发明实施例3中PCR检测EAR-Os06g47150转基因阳性株系，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，E1934H-50、E1934H-65为EAR-Os06g47150转基因水稻株系。

图4为本发明实施例4中转基因水稻籽粒性状的表型宽度的比较；其中WT为野生型水稻‘kitaake’，E1934H-50、E1934H-65为EAR-Os06g47150转基因水稻株系。

图5为本发明实施例4中转基因水稻籽粒性状的数据统计分析结果；其中WT为野生型水稻‘kitaake’，E1934H-50、E1934H-65为EAR-Os06g47150转基因水稻株系。

图6为本发明实施例1中pCambia1301-UbiN载体图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

Os06g47150基因CDS序列的获得及植物表达载体的构建

1Os06g47150基因CDS序列的获得

在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml）中找到Os06g47150基因，根据其序列设计PCR扩增引物，正向引物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTTTCGTGGATTC-3'和反向引物R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCCTAAAACTGGACTGACCT-3'。以野生型日本晴‘kitaake’水稻总cDNA为模板，利用引物F和R进行PCR，获得Os06g47150基因完整的CDS序列（如SEQ ID No.1所示）。

2植物表达载体的构建

将水稻转录因子Os06g47150基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子抑制基序EAR编码基因（如SEQ ID No.4所示）的下游。

2.1将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上

按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F和R），而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5'adaptor：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3'adaptor：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。将PCR产物克隆到pDONER克隆载体（购自Invitrogen）上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

2.2植物表达载体的构建

以植物双元表达载体pCambia1301-UbiN（图6）左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-EAR-Gateway表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nEAR-hyg-asRED的全序列如SEQ IDNo.5所示，载体图谱见图1。

表达载体nEAR-hyg-asRED含有Gateway重组系统，pDONR带有目的基因的质粒作为入门载体（Entery vector），通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。

通过LR反应将Os06g47150基因的CDS序列构建到其目的基因的5’端连有EAR编码基因的植物表达载体nEAR-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因子EAR-Linker-Os06g47150基因的表达载体ubi：EAR-Os06g47150，其全序列如SEQ ID No.6所示，载体图谱见图2。

LR反应体系如下：

于25℃反应过夜。用反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

实施例2转基因水稻植株的获得

取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将ubi：EAR-Os06g47150转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和OD值为0.7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。获得70株转基因苗。

本实施例中涉及的培养基配方如下：

诱导培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

共培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS（乙酰丁香酮）100～200μg/mL。

筛选培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素（购自上海纽津生物技术有限公司）。

分化培养基：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin（激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

实施例3转基因阳性株系的鉴定

为检测实施例2获得的EAR-Os06g47150转基因水稻株系中ubi：EAR-Os06g47150基因在T2代转基因水稻（E1934H-50、E1934H-65）中的过表达情况，本实施例在载体与目的基因接头处设计引物（正向引物：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）进行PCR检测，得到了明显的特异性条带。由图3可见，扩增出的条带大小在2000bp以上，且引物是在载体与目的基因接头处设计的，扩增出的片段大小与目的基因（2049bp）基本一致。因此可以说明，实施例2获得的转基因水稻株系E1934H-50、E1934H-65中含有EAR-Os06g47150融合基因。

实施例4转基因水稻表型分析和考种分析

将实施例2获得的转基因水稻株系E1934H-50、E1934H-65和野生型水稻种子进行比较，从表型上可以明显的看出，发现转基因材料的籽粒明显变宽（图4）。考种数据分析表明（图5），本发明获得的EAR-Os06g47150转基因水稻籽粒的宽显著大于野生型水稻籽粒。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.编码融合蛋白EAR-Linker-Os06g47150的基因在改良水稻籽粒粒宽中的应用，其特征在于，EAR为来自植物转录因子的一段具有转录抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；Os06g47150为水稻转录因子Os06g47150，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列在改良水稻籽粒粒宽中的应用，其特征在于，其是利用转录因子抑制基序EAR与水稻转录因子Os06g47150融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的粒宽；

其中，所述转录因子抑制基序EAR的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；所述水稻转录因子Os06g47150的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述水稻转录因子Os06g47150基因CDS序列为所述水稻转录因子Os06g47150的编码序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子Os06g47150基因的CDS序列通过Gateway系统构建到转录因子抑制基序EAR编码基因的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的粒宽；

其中，所述转录因子抑制基序EAR编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。