CN104341517B - 水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。

Description

水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。

在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。

近些年，有关籽粒大小性状的分子遗传调控机制研究，已取得了一定进展，如：研究者们利用QTL定位了一些籽粒大小相关基因，其中GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和器官大小的负调控因子；张启发等（Yibo Li,Chuchuan Fan,QIfa Zhang.et al.(2011)Natural variation in GS5plays an important role in regulating grain size andyield in rice.Nature Gennetics）研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶，是控制籽粒大小的正调节因子，过表达GS5可使水稻籽粒明显变大；转录因子在调控籽粒大小方面起着非常重要的作用，OsWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，OsWRKY78突变 体可以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)类转录因子能通过调控外稃和内稃细胞的长度影响谷粒的大小；PGL1碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH）异源二聚体作为结合DNA的bHLH的抑制子过表达后可增加籽粒长度和重量。

VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。

目前FAR家族转录因子Os09g14040对种子大小形状调控机制的研究及认识很少，因此该转录因子的研究在理论上为进一步理解植物种子和器官发育调控的分子机理提供了新的线索；在实践上也将为作物高产育种提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的应用。

本发明首先提供了一种组成型水稻转录因子，即融合蛋白（VP16）₄-Linker-Os09g14040。

其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，将4个VP16功能域基序融合在一起可构成一类增强子，增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。上述融合蛋白中涉及的（VP16）₄，即VP64是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和4所示。

上述融合蛋白中涉及的Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQ IDNo.9所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

上述融合蛋白中涉及的水稻转录因子Os09g14040CDS序列的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。

所述载体的构建方法如下：

（1）在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/ana lyses_search_locus.shtml）中找到Os09g14040基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTT CATGCCAGATGAACTCCCG-3'和反向引物R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCAAAAAAAGTAAGCATGTCATACTTC-3'；

（2）以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得Os09g14040全序列；

（3）将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列；

（4）以双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubipromoter-VP64-Gateway表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No.5所示；

（5）通过LR反应将Os09g14040的CDS序列构建到其目地基因的N端融合了VP64标签的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得获得携带有编码所述组成型水稻转录因子VP64-Linker-Os09g14040基因的表达载体ubi：VP64-Os09g14040，载体全序列如SEQ ID No.6所示。

携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition）。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。

本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方法，将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液。进行转化，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。

本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性状（如增加水稻粒宽）中的应用。

本发明还提供了用于扩增水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列的引物对，其为正向引物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTTC ATGCCAGATGAACTCCCG-3'和反向引物R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCAAAAAAAGTAAGCATGTCATACTTC-3'。

本发明还进一步提供水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列在调控水稻籽粒性状中的应用。

前述的应用，是将水稻转录因子Os09g14040基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。

本发明首次利用转录因子激活基序VP64（即4个转录因子激活基序VP16）与水稻转录因子Os09g14040基因CDS序列融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如水稻籽粒宽度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中nVP64-hyg-asRED载体图谱。

图2为本发明实施例1中ubi：VP64-Os09g14040载体图谱。

图3为本发明PCR检测VP64-Os09g14040转基因阳性株系，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，V1613H-05、V1613H-06为 VP64-Os09g14040转基因水稻株系。

图4为本发明转基因材料籽粒性状的表型宽度的比较，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，V1613H-05、V1613H-06为转基因水稻株系。

图5为本发明转基因材料籽粒性状数据统计分析，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，V1613H-05、V1613H-06为转基因水稻株系。

图6为载体pCambia1301-UbiN图谱。

图7为GCS-2*FLAG+en35s-asRED-pCambia1301-UbiN的构建示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1Os09g14040基因CDS序列的分离和植物表达载体构建

在植物转录因子数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml）中找到Os09g14040基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物，根据其序列设计PCR扩增引物（F：5'-CAAAAAAG CAGGCTTCATGCCAGATGAACTCCCG-3'和反向引物R：5'-CAAG AAAGCTGGGTCAAAAAAAGTAAGCATGTCATACTTC-3'）。

以野生型日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得Os09g14040基因的CDS全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2、植物表达载体的构建

将水稻转录因子Os09g14040基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16编码基因（SEQ ID No.4）的下游。

2.1将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上

按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F和R），而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5'adaptor：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体（购自Invitrogen）上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

2.2植物表达载体的构建

以植物双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubipromoter-VP64-Gateway表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No.5所示，载体图谱见图1。

上述植物双元表达载体的构建方法为：以载体pCambia1301-UbiN为骨架(图6)，SpeI和PstI之间的序列换成了GCS-2*FLAG，将HindIII和BstEII之间的序列换成了35senhancer+P35s-AsRed，完成GCS-2*FLAG+en35s-AsRed-pCambia1301-UbiN的构建（图7）。合成5’和3’端均带有KpnI酶切位点的双链DNA序列VP64-2*HA。通过KpnI位点将片段VP64-2*HA插入到载体（图7），最终获得表达载体nVP64-hyg-asRED-pCambial1301-Ubi。目的基因通过LR反应构建到植物表达载体上。

表达载体均含有Gateway重组系统，pDONR带有目的基因的质粒作为入门载体（Entery vector），通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。

LR反应体系：

25℃反应过夜。反应液转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

通过LR反应将Os09g14040基因的CDS序列构建到其目的基因的5’端连有VP64编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携 带有编码所述组成型水稻转录因子VP64-Linker-Os09g14040基因的表达载体ubi：VP64-Os09g14040，其全序列如SEQ ID No.6所示，载体图谱见图2。

实施例2转基因水稻植株的获得

取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将ubi：VP64-Os09g14040转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和OD值为0.7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。最终获得12株水稻植株，分别命名为V1613H-01/02/03/04/05/06/07/08/09/10/11/12。

其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS（乙酰丁香酮）100～200μg/mL。

筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素（购自上海纽津生物技术有限公司）。

分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/LNAA+2.0mg/L Kinetin（激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

实施例3转基因阳性株系的鉴定

为检测实施例2获得的VP64-Os09g14040转基因水稻株系在载体ubi：VP64-Os09g14040基因在T2代转基因水稻中（V1613H-05、V1613H-06）的过表达情况，本实施例在载体上设计引物（正向引物：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）进行PCR检测，得到了明显的特异性条带。由图3可见，实施例2获得的转基因水稻株系V1613H-05、V1613H-06中含有Os09g14040基因。上述引物是在目的基因和载体接头处设计的，图3显示扩增的片段大小与目的基因（1179bp）基本一致。

实施例4转基因水稻表型分析和考种分析

将实施例2获得的转基因和野生型水稻种子进行比较，从表型上可以明显的看出，本发明的转基因材料V1613H-05、V1613H-06的籽粒较野生型水稻‘kitaake’明显变宽（见图4）。考种数据分析表明（图5），转基因水稻籽粒的宽显著大于野生型水稻籽粒。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.水稻转录因子Os09g14040基因的CDS序列在增加水稻籽粒宽度中的应用，所述水稻转录因子Os09g14040基因的CDS序列核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。