CN103421802A - 控制水稻粒重、粒长和每穗颖花数的多效性基因gds7 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。公开了分离克隆的调控水稻千粒重、粒长和每穗颖花数的多效性基因GDS7，以及它的等位基因（GDS7-C7）的DNA序列，该多效性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该多效性基因的等位基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。在水稻南洋占品种和川7品种中，对GDS7相应的基因组比较测序，发现两品种间存在2个碱基差异，其中1个位于启动子区；另外1个位于编码区，导致1个氨基酸变化。利用转基因技术获得了转GDS7基因的水稻植株，转基因植株都表现出比对照千粒重、粒长显著提高和每穗颖花数显著下降。这些性状变化与GDS7近等基因系两基因型的表现非常吻合。

Description

控制水稻粒重、粒长和每穗颖花数的多效性基因GDS7

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个控制水稻谷粒重，谷粒长和每穗颖花数的多效性基因GDS7及等位基因与应用。

背景技术

随着世界人口的不断增长和人们生活水平的不断提高，粮食产量的提高和品质的改良显得日益迫切。水稻产量主要由分蘖数，每穗颖花数和千粒重三个主要组成因子构成；每穗颖花数通常跟穗长，一次枝梗数，二次枝梗数及着粒密度密切相关。千粒重主要取决于粒形（粒长，粒宽和粒厚）。而粒形又是水稻的外观品质性状，不同消费群体有着不同的偏爱性。

目前，大多研究者经研究认为：每穗颖花数和粒重或者粒形是由多个数量性状位点控制，并分主效基因和微效基因。它们都可以通过构建近等基因系F₂，利用图位克隆技术将其分离并克隆。1986年，剑桥大学的Alan Coulson首先提出了图位克隆技术（map-based cloning）（Coulson et al.1986），通过构建F₂分离群体，利用分子标记跟基因位点的连锁关系，根据重组单株逐步把候选区段缩小到很小的区段甚至单个基因。进而通过遗传转化来互补验证，本发明应用了类似的技术路线（如图1所示）。Gn1a是首个被成功图位克隆的水稻穗粒数基因(Ashikari M et al.,2005)，其研究者利用约13,000个F₂单株的分离群体将Gn1a定位到6.3kb的区域并发现改区间含有一个编码细胞分裂素氧化脱氢酶的基因（cytokinin oxidase/dehydrogenase,OsCKX2）。它突变后使得处在分化期的幼穗中细胞分裂素积累，进而促进了枝梗的发生来产生更多的颖花数。2006年，GS3作为首个控制粒重和粒形的基因利用图位克隆手段被成功克隆（Fan et al.,2006）。它编码一个含有PEBP-like domain蛋白。具体由于第二个外显子处的一个碱基变异（C-A）导致编码蛋白的提前终止，进而产生大粒形谷粒。此外该基因的定位群体是来源于水稻大粒品种明恢63和极小粒品种川7杂交后代，该研究者还发现大多数水稻大粒形品种都是由于该突变导致。

本发明利用水稻品种“南洋占”（极大粒）与“川7”（极小粒）衍生的重组自交系F₇代中，其RIL76家系中出现粒长和每穗颖花数的分离，具体为大粒少颖花株数与小粒多颖花株数接近3：1分离。以此分离群体为近等基因系，利用图位克隆策略，最终将这个同时控制水稻粒重/粒长和每穗颖花数的多效性QTL-GDS7克隆。该基因的近等基因系两等位基因型之间由于粒重和每穗颖花数对产量的贡献相互抵消，而致使它们之间单株产量没有显著差异。但是来自南洋占基因型的粒长（粒长为7.4mm）显著大于川7等位基因型的粒长（粒长为6.8mm）。它的克隆将有助进一步改良水稻的外观品质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，分离克隆一个控制水稻谷粒重，谷粒长和每穗颖花数的多效性基因GDS7及等位基因与应用。该基因及等位基因不影响产量的前提下，通过减少每穗颖花数来增加粒重和粒长。申请人将克隆获得的这个多效性基因命名为GDS7。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明通过植物基因工程技术和转基因技术从水稻品种“南洋占”中获得一个控制水稻谷粒千粒重、粒长和每穗颖花数的多效性基因GDS7，其核苷酸序列如序列表“SEQ ID NO：1”所示，其编码的蛋白质的序列如“SEQ ID NO：2”所示。从水稻品种“川7”中克隆获得基因GDS7的等位基因，其核苷酸序列如序列表“SEQ ID NO：4”所示，其编码的蛋白质的序列如“SEQ ID NO：5”所示。

申请人通过转基因方法，将上述多效性基因转化到GDS7近等基因系川7等位基因型（该近等基因系来源于水稻品种南洋占和川7衍生的重组自交系F₇，技术路线如图1所示），其转基因阳性单株的粒重和粒长增加而每穗颖花数减少，符合转基因预期的表型。

本发明的优点在于：

（1）本发明利用一种基于QTL定位的结果，结合高世代重组自交系中残余杂合位点的筛选来获得了近等基因系的一种新方法；该方法操作省时高效，避免了多世代回交方法耗时缺点。

（2）本发明克隆了一个影响水稻千粒重、粒长和每穗颖花数的一因多效基因GDS7。GDS7的功能被本发明首次报道，具有极高的首创性；该基因调控粒形对改良水稻稻米外观品质进一步打下基础。同时GDS7编码一个保守未知蛋白，在其他植物或者作物中具有高度保守的同源基因（如在玉米中的“LOC100382978”基因及高粱中的“SORBIDRAFT 02g042410”）。因此，GDS7的克隆对它在其他植物中的同源基因的功能注释奠定了一定基础。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是多效性基因GDS7的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，序列全长为522bp。

序列表SEQ ID NO：2是多效性基因GDS7蛋白质的序列，编码173个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：3是多效性基因GDS7的转化序列。

序列表SEQ ID NO：4是多效性基因GDS7的等位基因（来自水稻川7）的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，其核苷酸序列全长为522bp。

序列表SEQ ID NO：5是多效性基因GDS7等位基因（来自水稻川7）蛋白质的序列，其编码173个氨基酸.

图1.是本发明的总体技术路线图。

图2.是本发明中GDS7的精细定位和候选基因的预测。

图3.用于克隆GDS7转化序列的载体“pCAMBIA1301S”

图4.在表达水平上检测GDS7转基因阳性单株，Actin1基因表达量为对照。

图5.是近等基因系两基因型（南洋占，即NZY和川7，即C7）和超表达转基因阴性（OX-GDS7（-））和阳性（OX-GDS7(+)）株系粒形照片；转基因的水稻受体基因型是近等基因系川7基因型。

具体实施方式

根据图1所述的的技术路线，利用水稻品种南洋占和川7（上海市农业生物基因中心罗利军研究院赠送）衍生的重组自交系F₇代群体构建遗传连锁图谱并收集表型进行了数量性状位点分析后，根据在第7染色体长臂下端（RM22065-RM5720）定位到的千粒重、粒长和每穗颖花数数量性状位点。对185个重组自交系进行筛选并发现RIL76株系在区间“RM22065-RM5720”呈杂合状态。收获该株系种子进行种植来获得F₂分离群体。该分离群体即为GDS7的近等基因系。

种植GDS7的近等基因系F₂大群体（6890株）利用有关SSR公用标记和新开发的InDel和SNP标记（见表四）进行重组单株筛选，最终将GDS7定位到17.8-kb。该区间存在二个基因“LOC_Os07g47340”和“LOC_Os07g47350”；前者编码一个未知蛋白，而后者编码一个钾转运蛋白（OsHAK7）（http://www.ricedata.cn/gene/list/1682.htm）与本发明的表型不相关。因此，将“LOC_Os07g47340”作为GDS7的候选基因（图2）。

以南洋占的幼穗总RNA利用反转录手段获得其cDNA并作为模板进行PCR扩增，将GDS7cDNA（925bp）分离并克隆至表达载体质粒“pCAMBIA1301S”（图4，该载体被公开报道和广泛使用（Zhou et al.,TheorAppl Genet.2009,118(7):1381-90)，其基本骨架起源于“pCAMBIA1301”，介入35S启动子调控转化基因的表达），并转化其到受体GDS7近等基因系川7基因型水稻中使GDS7实现组成型表达。进而获得转基因单株来验证GDS7功能。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了GDS7基因的分离克隆及功能验证。

实施例1：GDS7近等基因系构建及效用评价

种植水稻“南洋占”和“川7”（前述量品种由上海市农业生物基因中心罗利军研究院惠赠）构建的185个重组自交系F₇家系（Bai et al.,BMC Genetics 2010,11:16），并利用几乎覆盖整个基因组的分子标记构建遗传连锁图进而结合表型进行QTL定位分析，其结果发现：在第7染色体长臂末端“RM22065-RM5720”区间存在三个QTL分别控制千粒重、粒长和每穗颖花数。鉴于这个结果，我们对所有的重组自交系家系排查在区段“RM22065-RM5720”为杂合状态，而在其他基因组位置为纯合状态的株系，结果发现“RIL76（Bai et al.,BMC Genetics 2010,11:16）”株系属于该种情况；因此，将该RIL76株系的后代收获并种植，发现其后代中出现千粒重、粒长和每穗颖花数的分离，分离比接近3：1；因此，由“RIL76”的后代群体视为GDS7的近等基因系（Bai et al.,BMC Genetics 2010,11:16），在该群体中QTL效应和表型值如表1和表2所示。

表1近等基因系F₂群体三个性状QTL效应

表2GDS7近等基因系F₂表型值

实施例2：GDS7的精细定位和候选基因确定

1．重组单株筛选和GDS7的精细定位

2009年的生长季节（5月至10月）在中国湖北武汉种植6890株GDS7近等基因系分离群体。利用该基因定位区段的SSR分子标记“RM22065”、“RM5720”、“RM6389”和“RM22115”（见http://www.gramene.org/markers/）及自创多态性标记“RID76”、“RID712”和“RS1-RS8”（引物序列见表4）来筛选重组单株并最终将该基因定位到“RS4-RS8”（17.8kb）的区段中（图2）。

2．候选基因的确定

上述候选区段包含一个保守的未知蛋白（LOC_Os07g47340）和一个钾转运蛋白（OsHAK7）。鉴于钾转运蛋白跟本发明中的表型（千粒重、粒长和每穗颖花数）关联不大，推断“LOC_Os07g47340”为GDS7候选基因；此外利用引物“X2”-“X4”（序列见表4）对该候选基因进一步测序发现在其5’UTR（UntranslatedRegions）区（ATG上游76-bp处）有一个SNP位点（C-G）和第5个外显子的第23个碱基处（在基因组上，从起始密码子ATG起始的第2298碱基）有一个SNP（G-A），并导致了一个氨基酸的变异（G-E），为此该基因被认为是GDS7。

实施例3：GDS7的转基因互补试验

根据水稻日本晴（已公布基因组序列）的序列为参照来设计引物，并分别在扩增引物序列两端接上“BamH1”和“Pst1”酶切位点进而形成引物“OEGDS7”（序列见表4）。在液氮碾磨亲本南洋占新鲜幼穗组织后用RNA提取试剂盒（TRIzol reagent,Invitrogen，）提取其总RNA（具体方法见http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf）；大约3ug总RNA为模板，利用III Reverse Transcriptase（Invitrogen）和引物Oligo(dT)₁₅（Promega）在50℃下反转录2小时，再70℃变性15分种，进而获得总cDNA；再以2μl该cDNA为模板，利用引物工作液2μl“OEGDS7”、20μl GCI buffer（TakaraBio Inc）、6μl dNTP和0.5μl“r-Taq（TAKARABIO INC）”酶和双蒸馏水混合成50μl的体系，通过PCR扩增（1：95℃3分钟；2：95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒；3：重复2步骤33次；4：72℃10分钟；25℃1秒）得到GDS7的CDS初级产物；经双酶切（BamH1和Pst1）此PCR扩增产物和pCAMBIA1301S，并分别纯化和回收（Fermentas*Genomic DNA Purification Kit，Thermo Fisher Scientific Inc）进而分离出925-bp的DNA转化片段（含GDS7完整的编码序列）和双酶切开的空载体，进而用T4-DNA连接酶（Promega）将该转化片段连接克隆到“pCAMBIA1301S”表达载体（见图3）；经引物“X2”-“X4”测序发现其编码的蛋白正确后，利用农杆菌介导的遗传转化方法（见下所述）将转化载体携带着候选基因一起转化至GDS7近等基因系川7基因型水稻中。所得转基因阳性单株（T1代）表现型与GDS7近等基因系南洋占基因型单株表现型极为相似（图5，表3）。因此认为GDS7被成功克隆。

表3GDS7超表达转化转基因单株考种

表4GDS7定位、克隆和测序所设计的相关引物序列

本发明的转基因具体步骤如下：

将正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到GDS7近等基因系川7基因型中，经过愈伤诱导，继代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法（参见：Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6:271-282）基础上进行优化。

遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

（1）试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；CN（Carbenicillin，羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）；2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH（Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）；HN（HygromycinB，潮霉素）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）；N6max（N6大量元素成分溶液）；N6mix（N6微量元素成分溶液）；MSmax（MS大量元素成分溶液）；MSmix（MS微量元素成分溶液）

（2）主要溶液配方

1）N6培养基大量元素母液（按照10倍浓缩液（10X）配制）：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2）N6培养基微量元素母液（按照100倍浓缩液（100X）配制

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3）铁盐（Fe₂EDTA）贮存液（按照100X浓缩液配制）

将3.73克乙二铵四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H2O）和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4）维生素贮存液（按照100X浓缩液配制）

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5）MS培养基大量元素母液（MSmax母液）(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6）MS培养基微量元素母液（MSmin母液）(按照100X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7）2,4-D贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8）6-BA贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9）萘乙酸（NAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10）吲哚乙酸（IAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11）葡萄糖贮存液（0.5克/毫升）的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12）AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13）1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

（3）用于水稻遗传转化的培养基配方

1）诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口后按常规方法灭菌（例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同）。

2）继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

3）预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

4）共培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/每皿）。

5）悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6）选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN（50毫克/毫升）和400微升CN（250毫克/毫升）分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。（注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升）。

7）预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN（50毫克/毫升）250微升CN（250毫克/毫升），分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

8）分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（50毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

9）生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中（25毫升/管），封口，按上述方法灭菌。

（4）农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

将成熟的GDS7近等基因系川7基因型种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15%氯化汞（HgCl₂）种子表面消毒15分钟；

用灭菌水洗种子45次；

将种子放在诱导培养基上；

将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京）上预培养农杆菌EHA105（该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株）两天，温度28℃；

将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养23小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；

将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素（CN）的灭菌水中30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养57天；

转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田隔离环境，田间管理同普通大田。

通过以上转基因方法，成功获得三株转基因水稻阳性植株，对转基因阳性植株的进一步考察表明，本发明获得的转基因植株的每穗颖花数显著减少，而千粒重和粒长显著增加（见表3，图4和图5）。

主要参考文献

1、Xufeng Bai,Lun Luo,Wenhao Yan,Mallikarjuna Rao Kovi,Wei Zhan and Yongzhong Xing Geneticdissection of rice grain shape using a recombinant inbred line population derived from two contrasting parents andfine mapping a pleiotropic quantitative trait locus qGL7.BMC Genetics 2010,11:16.

Claims (2)

1.GDS7基因在控制水稻谷粒千粒重、粒长和每穗颖花数中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.GDS7基因的等位基因在控制水稻谷粒千粒重、粒长和每穗颖花数中的应用，其特征在于该等位基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

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