CN103382479B - 水稻垩白率的主效基因Chalk5的克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。公开了分离克隆的调控水稻垩白率性状的主效基因Chalk5，以及它的等位基因（Chalk5-H94）的DNA序列，该主效基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该主效基因的等位基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。利用水稻高垩白品种和两个低垩白品种比较测序，发现在全基因范围内高、低垩白品种间存在39个共同的碱基差异，其中10个突变位于启动子区，5个突变位于编码区，导致2个氨基酸变化。利用转基因技术获得了转Chalk5基因的水稻植株，转基因植株都表现出比对照垩白率显著提高。这些性状变化与珍汕97的Chalk5近等基因系两基因型的表现非常吻合。

Description

水稻垩白率的主效基因Chalk5的克隆与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及到一个位于水稻第5染色体短臂上控制垩白率的主效QTL(Chalk5)的基因克隆与应用。

背景技术

稻米垩白是一个重要的品质性状：（1）稻米垩白是一个重要的外观品质性状(Tan等，2000，Theor.Appl.Genet.105:248-257)。稻谷品质越来越被世人所关注，人们对稻米米质的要求不仅是口味的舒适，还要求外型的美观，因此稻米外观品质的好坏直接关系稻米商品性的好坏，而在我国国家优质稻谷标准中还对稻米垩白度作了具体规定，认为一级优质米的垩白度不能高于1%。（2）稻米垩白会极大地影响稻米的加工品质、蒸煮食味品质和营养品质，是稻米品质中最重要的品质性状之一（Fitzgerald等，2009，Trends Plant Sci.14，133–139)。因此，阐明稻米垩白的遗传基础和分子机理有利于稻米品质的遗传改良。

垩白是灌浆期胚乳淀粉粒和蛋白质颗粒因排列疏松而冲气所形成的白色不透明部分，其遗传比较复杂，是典型的数量性状。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL（Quantitative Trait Loci）进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行研究。利用这种方法，近年来虽然已经克隆了许多稻米重要农艺性状的QTL基因，但还没有一个控制垩白的QTL基因被克隆。其中位于水稻第五染色体短臂上控制谷粒垩白率的主效QTL，(该QTL在本发明中被命名为Chalk5)在许多研究中都能检测到(Tan等，2000，Theor.Appl.Genet.105:248-257;Yoshida等，2002，Breeding Sci.52，309-317;Chen等，2011，Afri.J.Biotech.10，6891–6903)。本实验室利用珍汕97/明恢63衍生的F_2:3和重组自交系群体也多次检测到Chalk5区域存在一个主效QTL控制着谷粒垩白率，并且可以揭示垩白率总变异的30%以上以及垩白度总变异的20%以上(Tan等，2000，Theor.Appl.Genet.101:823-829)。这些结果表明Chalk5基因可以在不同的遗传背景以及不同环境下都能稳定表达，因此Chalk5对于水稻品质和品种性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，对Chalk5基因进行克隆可以为水稻的品质和品质育种提供新的重要的基因资源。

在遗传上，QTL与控制质量性状的基因一样会通过遗传重组进行分离，差异只是遗传效应的大小方面，因此QTL同样可以进行精细定位。但在初级群体中QTL与其它许多非QTL位点一起同时发生分离，这些非QTL位点和环境因素一样都会对QTL的表型性状产生极大的干扰作用。因此，在利用初级群体进行QTL定位时，QTL的置信区间通常在10cM以上（Darvasi等，1992，Theor.Appl.Genet.85:353-359），很难确定检测到的一个主效QTL到底是一个还是多个微效QTL（Yano and Sasaki，1997，Plant MolecularBiology 35:145-153）。因此有必要在初级定位的基础上，对QTL进行高分辨率的精细定位（<1cM）。通常，用于QTL精细定位的最好办法就是构建含有目标QTL的染色体片段替代系（Chromosome segmentsubstitutionline，CSSL）或近等基因系（Nearly isogenicline，NIL）等次级定位群体（Secondary population），使群体中只有单个的QTL位点发生分离，极大限度地减少了个体间由于遗传背景和环境不同造成的对目标性状产生的干扰，使该位点表现为简单的孟德尔因子遗传，从遗传和统计上为QTL的精细定位创造便利条件。这种方法已经在许多QTL的精细定位和基因克隆研究中发挥了重要的作用（Yano等，2000，PlantCell，12:2473-2484;Frary等，2000，Science，289:85-88）。这些方法为采用图位克隆的策略分离、克隆Chalk5的基因提供了依据。

本发明利用图位克隆的方法分离克隆一个控制水稻谷粒垩白率的主效基因Chalk5，为水稻的品质育种提供新的基因资源。

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个控制谷粒垩白率的主效基因的完整编码区段DNA片段，利用这个基因提高改良水稻品质的能力。申请人将克隆的这个基因命名为Chalk5。本发明涉及分离和应用一个水稻垩白率的基因Chalk5，其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1-4所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1-4所示的高度同源DNA序列。

具体地，本发明分离克隆的基因或等位基因以及上述基因或等位基因的氨基酸序列的信息如下所示：

一种控制水稻谷粒垩白率性状的主效基因Chalk5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

上述主效基因Chalk5的编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

与此同时，申请人得到一种调控水稻谷粒垩白率性状的主效基因Chalk5的等位基因(Chalk5-H94)，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

上述等位基因的编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

本发明从水稻珍汕97B和H94组合衍生的双单倍体群体里选择含有Chalk5基因且55%遗传背景与珍汕97B一致的材料，再与珍汕97B回交三代并自交一代，构建Chalk5的近等基因系（技术流程见图1）。利用近等基因系群体分析，发现该基因对垩白率都有很大的效应（见表1），对稻米的加工品质、蒸煮食味品质与营养品质性状有重要的影响。随机遗传群体分析表明，该基因呈现孟德尔的基因分离比（图3），且珍汕97B等位基因是显性的。利用Chalk5近等基因系的遗传大群体和图位克隆的方法，将Chalk5精细定位到16.8kb的染色体区段内（图4），该区段有两个候选基因ORF，其中一个ORF1转基因没有表型表明与垩白无关，于是只关注ORF2，然后结合该ORF2内的一个全长cDNA的序列信息，对Chalk5的基因结构和编码的蛋白质产物进行预测和分析，发现该基因包含4个外显子，共编码770个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质具有H⁺-PPase保守结构域。Real-Time PCR表达分析发现，该基因在胚乳组织中特异性表达，并且在受精后5天的胚乳中高垩白品种（珍汕97B）比低垩白品种（H94）的表达量高（见图5）。PCR获得珍汕97B的编码区阳性克隆，亚克隆后（结果见图6），进行转基因超表达验证，将该基因转入无垩白水稻品种中花11中，转基因T₀代阳性超表达单株均表现出更高的垩白率（见图7和图8），并且其T₁代共分离检测发现，垩白率和表达量正相关（表2）。利用珍汕97B启动子启动珍汕97B的编码区的转基因表现同样的结果（见图7和图8，表2）。此外，利用水稻高垩白品种（珍汕97）和两个低垩白品种（H94和明恢63）对Chalk5基因进行比较测序，发现在1.9kb的启动子和cDNA范围内高低垩白品种间存在39处多态性变异，其中10处变异发生在翻译起始位点上游1.9kb的启动子上，这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型（见图9），其中在珍汕97翻译起始位点上游约1kb处有一12bp的大的缺失；5处变异发生在外显子上（见图9），但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换，其它3个外显子SNP变异并不导致氨基酸变化；内含子上有24处SNP变异（见图9）。由于转基因较高的表达量导致较高的垩白率，说明Chalk5是一个正调控稻米垩白率的主效基因。

本发明的优点在于：

本发明首次在水稻中克隆了一个对垩白率具有正调控效应的主效基因，为水稻等禾谷类作物的优质育种提供了新的基因资源，也为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97B的Chalk5等位基因的DNA序列(其中包含其启动子序列、5’UTR、包含内含子的CDS、3’UTR)。

序列表SEQ ID NO:2显示的是本发明分离克隆的来源于水稻珍汕97B的Chalk5基因的蛋白蛋白质的序列。

序列表SEQ ID NO:3显示的是本发明分离克隆的来源于水稻H94的Chalk5等位基因的DNA序列（其中包含其启动子序列、5’UTR、包含内含子的CDS、3’UTR）。

序列表SEQ ID NO:4显示的是本发明分离克隆的来源于水稻H94的Chalk5基因的蛋白质的序列。

图1.是本发明的近等基因系构建流程图。图1中第二步杂交亲本“DH27”为海市农业生物基因中心罗利军教授提供的其中一个家系。回交时，以水稻品种珍汕97作为母本。

图2.是本发明的技术流程图（显示Chalk5基因克隆的技术路线）。

图3.BC3F2随机群体中垩白率的频率分布（显示288株随机小群体中三种基因型的垩白率频率分布

）。图中黑色、灰色和白色棒分别表示Chalk5位点珍汕97基因型，杂合基因型和H94基因型，Chalk5的三种基因型是通过分子标记检测得到的。

图4.是本发明的Chalk5基因的图位克隆，图中（A）为Chalk5 QTL在水稻第5染色体遗传连锁图上的位置（B）至(D）分别利用两个作图群体来精细定位Chalk5 QTL。）。标记间的数字代表各标记与Chalk5位点间发生的重组次数。

图5.Chalk5基因在水稻全生育期时空表达谱分析。使用材料是NIL（ZS97即珍汕97)和NIL(H94)Chalk5基因纯合材料。

图6.是本发明的Chalk5转基因互补验证的载体图，即，所用的功能性载体为pCAMBIA1301的图谱。

图7.是本发明的T0代转基因单株的粒型和粒重的表现和表型统计分析。图中：A图为阳性单株鉴定；B图为阳性转基因单株的表达量检测；C和D图为各个独立的阴性与阳性转基因单株的垩白率频率分布；E阴性与阳性转基因单株的垩白率统计结果。

图8.本发明的两个T1代转基因单株的垩白率表型图。

图9.本发明克隆的Chalk5基因结构示意图和其自然变异分析（显示Chalk5主效基因及其等位基因

的比较测序）。图中：黑色的方框代表外显子，细线代表内含子，“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码，ATG前的粗线代表2000bp的启动子，高低垩白率品种间的39个SNP和InDel变异位于Chalk5基因的启动子和编码区（SNP替换均用相应的碱基代表，InDel缺失均用相应的圆点代表），编码区有2个氨基酸变异，内含子有24个SNP变异。

具体实施方式

根据图2的技术路线，从水稻品种珍汕97B（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）和H94（上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠）组合衍生的双单倍体群体里选择含有Chalk5基因且55%遗传背景与珍汕97B一致的家系（DH27），与珍汕97B杂交并连续与珍汕97回交3代，自交1代，构建了水稻Chalk5基因的近等基因系BC₃F₂，该近等基因系材料即水稻（Oryza sativa L.）NIL（H94），于2010年5月27日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCCNO：P201007。利用这个含有288个BC₃F₂单株的随机群体对Chalk5进行了定位和遗传效应分析；利用目标区间公共SSR标记对来自于9639个单株的大遗传群体筛选重组单株，最终将Chalk5定位到C181和C35区间，两者物理距离为16.8kb（图4）；该区段有两个候选基因ORF，其中一个ORF1转基因没有表型，于是只关注ORF2，然后结合该ORF2内的一个全长cDNA的序列信息，对Chalk5的基因结构和编码的蛋白质产物进行预测和分析，发现该基因包含4个外显子，共编码767个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质具有H⁺-PPase保守结构域。Real-Time PCR表达分析发现，该基因在胚乳组织中特异性表达，并且在受精后5天的胚乳中高垩白品种（珍汕97B）比低垩白（H94）的表达量高（图5）。PCR获得珍汕97B的编码区阳性克隆，亚克隆后（图6），进行转基因超表达验证，将该基因转入无垩白水稻品种中花11中（中国农业科学院作物科学研究所），转基因T₀代阳性超表达单株均表现出更高的垩白率（图7和图8），并且其T₁代共分离检测发现，垩白率和表达量正相关（表2）。利用珍汕97B启动子启动珍汕97B的编码区的转基因表现同样的结果（图7和图8，表2）。此外，利用水稻高垩白品种（珍汕97）和两个低垩白品种（H94和明恢63）对Chalk5基因进行比较测序，发现在1.9kb的启动子和ORF2范围内高低垩白品种间存在39处多态性变异，其中10处变异发生在翻译起始位点上游1.9kb的启动子上，这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型（图9），其中在珍汕97翻译起始位点上游约1kb处有一12bp的大的缺失；5处变异发生在外显子上（图9），但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换，其它3个外显子SNP变异并不导致氨基酸变化；内含子上有24处SNP变异（图9）。由于转基因较高的表达量导致较高的垩白率，说明Chalk5是一个正调控稻米垩白率的主效基因。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离克隆Chalk5基因、遗传转化，比较测序验证Chalk5等位基因之间序列差异的方法和该基因时空表达谱。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明本质和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：构建Chalk5近等基因系

1 回交与选择

如附图1所示，从高垩白率水稻品种珍汕97B和低垩白率品种H94组合衍生的双单倍体群体里选择含有Chalk5基因且55%遗传背景与珍汕97B一致的家系，与珍汕97B杂交，以珍汕97B为轮回亲本，连续回交3代，在BC₁F₁以及BC₂F₁代分别对Chalk5只进行正向选择，即选择目标区段为珍汕97B/H94杂合基因型的单株用于下一轮的回交。目标区段参照前人的QTL定位结果（范楚川，2006，博士学位论文，华中农业大学图书馆）确定在两个SSR(Simple Sequence Repeat)标记RM593和RM574（参见：(http://www.gramene.org/)所界定的区间内。在BC₃F₁代，从中选择遗传背景与珍汕97B最为相近的单株的后代BC₃F₂即NIL（H94）用于后续的实验。获得的该近等基因系材料即水稻（Oryza sativa L.）NIL（H94），于2010年5月27日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：P201007。

2 微卫星标记基因型鉴定方法（SSR技术）

PCR程序参见萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。

PCR采用20μl的反应体系，其包含：20-50ng DNA模板，10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1%Triton X-100，1.8mM MgCl₂，0.1mM dNTP，0.2μM引物（如表4所述的RM593和RM574引物）和1U Taq DNApolymerase。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物在6%的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等，1991，Anal.Biochem.196:80-83)。

实施例2：Chalk5的精细定位和图位克隆

1 垩白率的表型测量

各个转基因及近等基因系的谷粒自然干燥后置于室温下至少放置3个月以上以保证谷粒的干燥和各株系间含水量的相对一致。垩白率是用随机挑选的100粒糙米中带垩白的米粒所占百分数表示。

从BC₃F₁单株衍生的BC₃F₂群体中随机挑选了288单株构成一个随机群体。考察了珍汕97B、H94以及随机群体中每个单株的谷粒垩白率等性状，并用两端分子标记RM593和RM574（序列见表4所述）确定各株基因型，结果发现该垩白率在两亲本间都具有显著差异。在随机群体中，谷粒垩白率表现为不连续分布(图3)。以50%的谷粒垩白率为分界线，可分为两类，即高垩白率和低垩白率粒类型(见表1和图3)。卡方测验表明三种类型符合单个孟德尔因子的1:2:1分离比，低垩白率：高垩白率=64:224，表明在此BC₃F₂群体中，稻米高垩白率是由一个主效显性基因控制的。另外，Chalk5基因还显著地影响整精米率、直连淀粉含量（AC）、胶稠度（GC）和总蛋白质含量等（见表1），说明调控垩白性状的Chalk5基因不仅影响垩白率等重要外观品质性状，还对稻米的加工品质、蒸煮食味品质与营养品质性状有重要的影响。

表1 近等基因系中Chalk5的对品质性状的影响分析

2分子标记的开发：

本发明中所用到的SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http://www.gramene.org/)。此外，还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)以及籼稻品种93-11（籼稻品种93-11为公共数据库资源）的基因组序列（参见：http://rise.genomics.org.cn/)设计和鉴定多态性标记，设计原则是在上述粳稻品种Nipponbare的基因组序列与籼稻品种93-11的基因组序列两者间有2-6bp缺失的、PCR片段大约有100-200bp，长度且在目标片段上平均分布。用设计的所有引物/标记（见表4）扩增珍汕97B和H94模板DNA，4%PAGE胶电泳检测。PCR的反应体总体积为20μl，包含：20-50ng DNA模板，10mMTris-HCl，50mM KCl，0.1%Triton X-100，1.8mM MgCl₂，0.1mM dNTP，0.2μM引物和1U Taq DNApolymerase。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物在6%的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等，1991，Anal.Biochem.196:80-83)。最终设计了12对在珍汕97B和H94间具有多态性的Indel(Insert/Deletion)标记，用于Chalk5精细定位。所述的引物/分子标记的序列信息见表4。

3 重组单株的后代测验分析和Chalk5的精细定位及候选基因确定

为进一步缩小Chalk5的定位区间，从9639株由BC₃F₁单株衍生的BC₃F₂大群体中挑选出重组单株。

首先用SSR标记RM593和RM574标记（如表4）进行筛选，从4374个单株中共找到94个重组单株，这些单株经过后代测验确认其上一代的表型：每个重组单株种植24株后代作为一个家系，性状分离的家系说明上一代表型是杂合的，后代性状不分离且是高值性状的说明上一代表型是来至珍汕97B纯合的，低值说明上一代表型是来至H94纯合的。然后，利用发展的12个InDel标记分析这94个重组单株，结果发现在RM574和Chalk5间存在9个重组单株，在RM593和Chalk5存在85个重组单株，特别是在C35和Chalk5间只发生3次重组，在C181和Chalk5间只存在3次重组(图4C)。因此，Chalk5最终被定位于C35和C181间，该区间对应于Nipponbare和93-11的基因组序列上的约16.8kb的物理范围(图4)。在C35和C181间（由申请人自己设计，参见表4）所界定的16.8-kb范围内找到两条全长cDNA，编号为AK119449（ORF1）和AK107275（ORF2），由于ORF1的转基因互补没有表型，因此本发明克隆ORF2是Chalk5的唯一可靠候选基因。

实施例3：Chalk5的转基因互补试验

1 Chalk5转基因技术路线：

Real-Time PCR表达谱分析发现，Chalk5基因全生育期在胚乳组织中特异性表达，并且在受精后5天的胚乳中高垩白品种（珍汕97B）比低垩白品种（H94）的表达量高（图5）。于是根据预测的候选基因全长ORF2序列，设计一对带有限制性核酸内切酶KpnI和PstI接头的PCR特异引物Chalk5 ORF2（表4）扩增珍汕97B的ORF2片段，连接到TA克隆Promega T载体上，挑选出含有候选基因的无突变的正确克隆，利用限制性核酸内切酶KpnI和PstI酶切阳性克隆，进行亚克隆，再连接到双元超表达载体pCAMBIA1301S（即在pCAMBIA1301多克隆位点旁加上一35S强启动子，见图6）（OX）上；另外，用同样的方法将珍汕97B启动子融合珍汕97B编码区的转基因（ZpZc）连接到双元超表达载体pCAMBIA1301（图6）上。采用转基因的方法，将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11（中国农业科学院作物科学研究提供）中，经过诱导、继代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因的水稻小植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法（参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal6:271-282）基础上进行优化。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

（1）试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；CN（Carbenicillin，羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）；2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH（Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）；HN（Hygromycin B，潮霉素）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）；N6max（N6大量元素成分溶液）；N6mix（N6微量元素成分溶液）；MSmax（MS大量元素成分溶液）；MSmix（MS微量元素成分溶液）

（2）主要溶液配方

1）N_6max培养基大量元素母液（按照10倍浓缩液（10X）配制）：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

2）N_6min培养基微量元素母液（按照100倍浓缩液（100X）配制）：

碘化钾（KI）                 0.08克

硼酸（H₃BO₃）                0.16克

硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）         0.44克或者MnSO₄·2H₂O 0.3335克

硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）         0.15克

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

3）铁盐（Fe²⁺EDTA）贮存液（按照100X浓缩液配制）：

将3.73克乙二铵四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂O）和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4）维生素贮存液（按照100X浓缩液配制）：

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5）MS培养基大量元素母液（MS_max母液）(按照10X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

6）MS培养基微量元素母液（MS_min母液）(按照100X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

7）2，4-D贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8）6-BA贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9）萘乙酸（NAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

10）吲哚乙酸（IAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

11）葡萄糖贮存液（0.5克/毫升）的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12）AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，-20℃保存备用。

13）1N氢氧化钾贮存液配制：

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

（3）用于水稻遗传转化的培养基配方：

1）诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（30毫升/瓶），封口后按常规方法灭菌（例如121℃下灭菌15分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同）。

2）继代培养基：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（30毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

3）预培养基（粳稻可以不做这一步）：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

4）悬浮培养基：

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

5）共培养基：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/每皿）。

6）筛选培养基：

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN（50毫克/毫升）和400微升CN（10克CN/36毫升水）分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。（注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升）。

7）预分化培养基（粳稻可以不做这一步）：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN（50毫克/毫升）250微升CN（250毫克/毫升），分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

8）分化培养基：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到100毫升三角瓶（50毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

9）生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中（25毫升/管），封口，按上述方法灭菌。

（4）农杆菌介导的遗传转化步骤：

3.1 愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15%氯化汞（HgCl₂）种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将8-10粒种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-5周，温度26±1℃。

3.2 愈伤继代：

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3 预培养：

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

3.4 农杆菌培养：

1)在带有对应抗性选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京）上划线预培养农杆菌EHA105（该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株）两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5 农杆菌侵染：

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6 愈伤洗涤和选择培养：

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素（CN）的灭菌水中摇30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周至长出好的抗性愈伤。

3.7 分化：

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，每瓶平均分布三个独立的愈伤，光照下培养5周-6周至长出大的苗子，温度26℃。

3.8 生根与炼苗：

1)剪掉分化时产生的老根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周至长出大的苗子后去掉封口膜加部分自来水炼苗一周再移栽，温度26℃。

3.9 移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润，等长势很壮再移栽至大田。

本发明共获得独立转基因Over-expression T0代水稻植株43株，包括26株阳性单株和17株阴性单株。对所获得的T1代水稻植株进行共分离检测（结果见表2）；珍汕97启动子融合的珍汕97 ORF2（ZpZc）的独立转基因T0代水稻植株40株，包括19株阳性单株和21株阴性单株。两种转基因水稻阳性和阴性植株的垩白率（见图7和图8）有差异显著（P<0.001）。根据转基因T0代阳性超表达单株均表现出更多的垩白（见图7），并且其T1代共分离检测发现，垩白率和表达量呈正相关（表2），证明了该唯一的候选基因就是Chalk5 QTL。另外，珍汕97B启动子融合的珍汕97B编码区的转基因和上述结果一致，均能增加垩白率这一表型（见图7和图8和表2），互补转化实验成功，说明调控垩白率的Chalk5 QTL基因被成功克隆，并且说明Chalk5基因是一个控制垩白率的正调控因子，这和其它控制胚乳粉质的突变体基因，例如flo4，flo2，flo5，UGPase1，OsRab5a和PDIL1-1是不同的，它们都是负调控粉质胚乳的基因（Kang等，2005，Plant J.42，901–911;Fujita等，2007，Plant Physiol.144，2009–2023;Ryoo等，2007，Plant Cell Rep.26，1083–1095;Woo等，2008，Plant J.54，190–204;She等，2010，Plant Cell 22，3280–3294;Wang等，2010，Plant J.64，812–824;Han等，2012，J.Exp.Bot.63，121–130）。同时也证明了这个基因可以通过遗传转化水稻来改良水稻品种。

2 Chalk5基因功能预测

根据InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)对蛋白质结构进行预测，Chalk5基因编码的蛋白质由767个氨基酸组成，其包含一个大的保守的H⁺-PPase结构域。利用BLASTp对Chalk5基因编码的由767个氨基酸组成的蛋白质结构进行搜索，发现该基因编码一液泡氢离子焦磷酸酶（vacuolarH⁺-pyrophosphatase）。

表2 Chalk5转基因T₁代共分离检测分析

实施例4：比较测序确定Chalk5等位基因间的自然变异

1 序列测定

高垩白品种(珍汕97B)和两个低垩白品种(明恢63和H94)进行目标区段的测序。利用12对PCR产物相互部分重叠的引物（表3），采用高保真度的LA-Taq和rTag(购自日本TakaRa公司，宝生物工程大连有限公司代理)，从这些品种的基因组中进行PCR扩增，然后按照美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big DyeKit)进行PCR测序。使用Sequencher 4.5软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。该主效基因Chalk5及其等位基因的DNA序列分别如SEQ ID NO：1（或称为Chalk5-ZS97）和SEQ ID NO：3(或称为Chalk5-H94)所示。

2 发生自然变异的序列比较

目标区段间的序列比较分析在高垩白品种(珍汕97B)和两个低垩白品种(明恢63和H94)间进行(图9)，发现在1.9kb的启动子和ORF2范围内高低垩白品种间存在存在39处多态性变异，其中10处变异发生在翻译起始位点上游1.9kb的启动子上，这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型（图9），其中在珍汕

表3 用于本发明比较测序的引物

97翻译起始位点上游约1kb处有一12bp的大的缺失；5处变异发生在外显子上（图9），但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换，其它3个外显子SNP变异并不导致氨基酸变化；内含子上有24处SNP变异（图9）。由于转基因较高的表达量导致较高的垩白率，说明Chalk5是一个正调控稻米垩白率的主效基因，再加上其调控区的启动子上变异最多，进而说明了启动子区的变异很可能是导致表达量变化的原因，进而导致垩白率表型的变异。

表4 用于本发明图位克隆和基因功能分析的引物/分子标记

Claims (3)

1.一个调控水稻垩白率性状的主效基因Chalk5的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示。

2.核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示的主效基因Chalk5在调控水稻垩白率增加或减少的改良中的应用。

3.核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示的主效基因Chalk5的等位基因在调控水稻垩白率减少的改良中的应用。