CN101880671A

CN101880671A - 一种控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因gs5的克隆与应用

Info

Publication number: CN101880671A
Application number: CN 201010188458
Authority: CN
Inventors: 何予卿; 李一博; 邢永忠; 范楚川; 张启发
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2010-05-27
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2030-05-27
Also published as: CN101880671B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。公开了分离克隆的控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5，以及它的等位基因的DNA序列，所述序列如SEQ ID NO：1(珍汕97B)和SEQ ID NO：3(H94)所示，包含10个外显子。它们的氨基酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4所示。利用水稻两个大粒品种和两个小粒品种比较测序，发现在约6.1kb范围内大、小粒品种间存在22个共同的碱基差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区，导致5个氨基酸变化。利用转基因技术获得了转GS5基因的水稻植株，转基因植株都表现出比对照粒宽和粒重显著提高。这些性状变化与珍汕97的GS5近等基因系两基因型的表现非常吻合。本发明还公开了近等基因系选育、基因克隆和转基因的方法即应用。

Description

一种控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因GS5的克隆与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及到一个位于水稻第五染色体短臂上控制谷粒粒宽和粒重的主效QTL(GS5)的基因克隆与应用。

背景技术

水稻谷粒大小是一个重大的农艺性状：(1)谷粒大小由粒长、粒宽、粒厚三个子性状控制，是千粒重的主要决定因素，而粒重又是水稻产量的三个主要构成因子之一。因此，谷粒大小是一个重要的产量性状；(2)粒重和粒长、粒宽、粒厚等性状呈极显著正相关(邢永忠等，2001，植物学报43：840-845)，所以谷粒大小还是一个重要的稻米外观品质性状。稻谷品质越来越被世人所关注，人们对稻米米质的要求不仅是口味的舒适，还要求外型的美观，因此稻米外观品质的好坏直接关系稻米商品性的好坏，而在我国国家优质稻谷标准中还对稻米粒长与粒宽的比值作了具体规定，认为优质的籼稻品种的稻米长宽比不能低于2.8。(3)谷粒大小在作物的进化研究中具有重要的意义。一般认为野生种具有小而圆的谷粒粒形以适应自然选择，经过人类长期的驯化和选择，现有栽培种的谷粒粒形明显变大。因此，阐明谷粒大小的遗传基础和分子机理有利于同时改良水稻的产量和品质，还可为禾本科的进化研究提供线索。

谷粒大小的遗传基础比较复杂，是典型的数量性状。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL(Quantitative Trait Loci)进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行研究。利用这种方法，近年来已经发现了许多控制谷粒大小的QTLs。其中位于水稻第五染色体短臂上控制谷粒粒宽和粒重的主效QTL，(该QTL在本发明中被命名为GS5)在许多研究中都能检测到(林鸿宣等，1995，中国农业科学28：1-7；Wan等，2005，Theor.Appl.Genet.110：1334-1346)。本实验室利用珍汕97/明恢63衍生的F_2-3和重组自交系群体也多次检测到GS5区域存在一个主效QTL同时控制着谷粒粒宽和粒重，并且可以揭示粒宽总变异的30％以上以及粒重总变异的10％以上(Yu等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：9226-9231；Li等，2000，Theor.Appl.Genet.101：248-254；Tan等，2000，Theor.Appl.Genet.101：823-829；Xing等，2001，Acta.Bot.Sin.43：721-726；Xing等，2002，Theor.Appl.Genet.105：248-257；Hua等，2002，Genetics 162：1885-1895)。这些结果表明GS5基因可以在不同的遗传背景以及不同环境下都能稳定表达，因此GS5对于水稻产量和品种性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，对GS5基因进行克隆可以为水稻的产量和品质育种提供新的重要的基因资源。

在遗传上，QTL与控制质量性状的基因一样会通过遗传重组进行分离，差异只是遗传效应的大小方面，因此QTL同样可以进行精细定位。但在初级群体中QTL与其它许多非QTL位点一起同时发生分离，这些非QTL位点和环境因素一样都会对QTL的表型性状产生极大的干扰作用。因此，在利用初级群体进行QTL定位时，QTL的置信区间通常在10cM以上(Darvasi等，1992，Theor.Appl.Genet.85：353-359)，很难确定检测到的一个主效QTL到底是一个还是多个微效QTL(Yano and Sasaki，1997，Plant MolecularBiology 35：145-153)。因此有必要在初级定位的基础上，对QTL进行高分辨率的精细定位(＜1cM)。通常，用于QTL精细定位的最好办法就是构建含有目标QTL的染色体片段替代系(Chromosome segmentsubstitution line，CSSL)或近等基因系(Nearly isogenic line，NIL)等次级定位群体(Secondary population)，使群体中只有单个的QTL位点发生分离，极大限度地减少了个体间由于遗传背景和环境不同造成的对目标性状产生的干扰，使该位点表现为简单的孟德尔因子遗传，从遗传和统计上为QTL的精细定位创造便利条件。这种方法已经在许多QTL的精细定位和基因克隆研究中发挥了重要的作用(Yano等，2000，PlantCell，12：2473-2484；Frary等，2000，Science 289：85-88)。这些方法为采用图位克隆的策略分离、克隆GS5的基因提供了依据。

本发明利用图位克隆的方法分离克隆一个控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因GS5，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供线索。

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个同时控制谷粒粒宽和粒重的主效基因的完整编码区段DNA片段，利用这个基因改良水稻产量和品质的能力。申请人将克隆的这个基因命名为GS5。本发明涉及分离和应用一个水稻粒形和千粒重的基因GS5，其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1-6所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1-6所示的高度同源DNA序列。

具体地，本发明分离克隆的基因或等位基因以及调控上述基因或等位基因的启动子的核苷酸序列的信息如下所示：

一种控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

上述主效基因GS5的编码序列如序列表SEQ ID NO：1中第2001-3449位对应的核苷酸所示。

与此同时，申请人得到一种控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

上述等位基因的编码序列如序列表SEQ ID NO：3中第2004-3446位对应的核苷酸所示。

其中调控主效基因GS5的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中1-1834位对应的核苷酸所示。

其中调控主效基因GS5的等位基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3中1-1837位对应的核苷酸所示。

本发明从珍汕97B和H94组合衍生的双单倍体群体里选择含有GS5基因且55％遗传背景与珍汕97B一致的材料，与珍汕97B回交三代，自交，构建GS5的近等基因系(图2)。利用近等基因系群体分析，发现该基因对粒宽和粒重都有很大的效应(表1)，后代测验表明，该基因呈现孟德尔基因分离比(图3)。利用GS5近等基因系的遗传大群体和图位克隆的方法，将GS5精细定位到8.0kb的染色体区段内(图4)，然后结合该区段内的一个全长cDNA的序列信息，对GS5的基因结构和编码的蛋白质产物进行预测和分析，发现该基因包含10个外显子，共编码481个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质具有PF00450保守结构域。Real-Time PCR表达分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，并且在颖壳胚乳中宽粒品种(珍汕97B)比小粒(H94)的表达量高(图5)。预测表达量起重要作用，于是利用RT-PCR获得H94的cDNA阳性克隆，亚克隆后，进行转基因超表达验证，将该基因转入水稻宽粒品种中花11中，转基因T0代阳性超表达单株均表现出更宽的粒形(图7)，并且其T1代共分离检测发现，粒宽和表达量正相关(表2)。此外，利用水稻两个大粒品种(珍汕97和特青)和两个小粒品种(H94和明恢63)进行比较测序，发现在3.9kb的启动子和cDNA范围内大小粒品种间存在22个共同的SNP和InDel差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区的第1、第2和第9个外显子，导致了5个氨基酸替换(图8)。由于超表达窄粒的等位基因可以使宽粒变得更宽，所以编码区的5个氨基酸替换不是等位基因变异的原因，进而说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致粒宽变异，同时说明GS5是一个正调控种子大小和粒重的基因。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次在水稻中克隆了一个对粒宽和粒重具有很大正调控效应的基因，为水稻等禾谷类作物的高产优质育种提供了新的基因资源，也为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴；

(2)本发明中克隆的基因也可以为水稻等禾谷类作物以及油菜等双子叶作物的分子进化研究提供证据。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的来源珍汕97B的GS5等位基因的DNA序列(其中包含其启动子序列、5’UTR、不包含内含子的CDS、3’UTR)。序列表SEQ ID NO：2显示的是本发明分离克隆的来源珍汕97B的GS5蛋白的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO：3显示的是本发明分离克隆的来源H94的GS5等位基因的DNA序列(其中包含其启动子序列、5’UTR、不包含内含子的CDS、3’UTR)。序列表SEQID NO：4显示的是本发明分离克隆的来源H94的GS5蛋白的氨基酸序列。

图1.是本发明的技术流程图。

图2.是本发明的近等基因系构建流程图。回交时，以珍汕97作为母本。

图3.BC₃F₂随机群体中谷粒粒宽的频率分布。图中黄色、灰色和白色棒分别表示GS5位点珍汕97基因型，杂合基因型和H94基因型，GS5的三种基因型是通过分子标记检测得到的。

图4.是本发明的近等基因系的粒型表现以及GS5基因的图位克隆。标记间的数字代表各标记与GS5位点间发生的重组次数。

图5.GS5基因在水稻全生育期不同组织中表达水平示意图。使用材料是NIL(ZS97)和NIL(H94)GS5基因纯合材料。

图6.是本发明的转基因所用的功能性载体图pCAMBIA1301骨架。

图7.是本发明的转基因单株的粒型和粒重的表现和表型统计分析。A图左为中花11阴性单株粒型，右为阳性单株粒型；B图为阴性与阳性转基因单株的粒宽统计结果；C和D图为阴性与阳性转基因单株的粒宽和千粒重统计结果。

图8.本发明克隆的GS5基因的结构示意图和其自然变异分析。黑色的方框代表外显子，细线代表内含子，“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码，ATG前的粗线代表2000bp的启动子，大小粒型形品种间的22个SNP和InDel变异位于GS5基因的启动子和编码区(SNP替换均用相应的碱基代表，InDel缺失均用相应的圆点代表)，编码区有5个氨基酸变异，内含子有4个SNP变异。

具体实施方式

根据图1的技术路线，从水稻品种珍汕97B(江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠)和H94(上海市农业生物基因中心的罗利军研究员惠赠)组合衍生的双单倍体群体里选择含有GS5基因且55％遗传背景与珍汕97B一致的家系(DH27)，与珍汕97B杂交，珍汕97B为轮回亲本，连续回交3代，自交，构建了水稻GS5基因的近等基因系BC₃F₁。利用一个含有288个BC₃F₂单株的随机群体对GS5进行了定位和遗传效应分析；利用目标区间公共SSR标记对来自于9639个单株的大遗传群体筛选重组单株，最终将GS5定位到C62和C63区间，两者物理距离为8.0kb(图4)；然后结合该区段内的一个全长cDNA的序列信息，对GS5的基因结构和编码的蛋白质产物进行预测和分析，发现该基因包含10个外显子，共编码481个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质具有PF00450保守结构域。Real-Time PCR表达分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，并且在颖壳胚乳中宽粒品种(珍汕97B)比小粒(H94)的表达量高。预测表达量起重要作用，于是利用RT-PCR获得H94的cDNA阳性克隆，亚克隆后，进行转基因超表达验证，将该基因转入水稻宽粒品种中花11中，转基因T₀代阳性超表达单株均表现出宽的粒形(图7)，并且其T₁代共分离检测发现，粒宽和表达量正相关。此外，利用水稻两个大粒品种(珍汕97B和特青)和两个小粒品种(H94和明恢63)进行比较测序，发现在3.9kb的启动子和cDNA范围内大小粒品种间存在22个共同的SNP和InDel差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区的第1、第2和第9个外显子，导致了5个氨基酸替换(图8)。由于超表达窄粒的等位基因可以使宽粒变得更宽，所以编码区的5个氨基酸替换不是等位基因变异的原因，进而说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致粒宽变异。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离克隆GS5基因，遗传转化，比较测序验证GS5等位基因之间序列差异的方法和该基因时空表达谱。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明本质和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：构建GS5近等基因系

1 回交与选择

如附图2所示，从宽粒水稻品种珍汕97B和窄粒品种H94组合衍生的双单倍体群体里选择含有GS5基因且55％遗传背景与珍汕97B一致的家系，与珍汕97B杂交，珍汕97B为轮回亲本，连续回交3代，在BC₁F₁以及BC₂F₁代对GS5只进行正向选择，即选择目标区段为珍汕97B/H94杂合基因型的单株用于下一轮的回交。目标区段参照前人的QTL定位结果确定在两个SSR(Simple Sequence Repeat)标记RM593和RM574(参见：(http://www.gramene.org/)所界定的区间内。存BC₃F₁代，除进行正向洗择外，还对目标区段以外的遗传背景进行扫描，从中选择遗传背景与珍汕97B最为相近的单株的后代(BC₃F₂，NIL(H94)用于后续的实验。该近等基因系材料NIL(H94)于2010年5月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC P201007。

2 微卫星标记基因型鉴定方法(SSR技术)

PCR标准程序参见参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。

PCR采用20μl的反应体系，包含：20-50ng DNA模板，10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1.8mM MgCl₂，0.1mM dNTP，0.2μm引物(如上所述的RM593和RM574的引物，参见http：//www.gramene.org/)和1U Taq DNA polymerase。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物在6％的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等，1991，Anal.Biochem.196：80-83)。

实施例2：GS5的精细定位和图位克隆

1 粒宽的表型测量

谷粒自然干燥后置于室温下至少放置3个月以上以保证谷粒的干燥和各株系间含水量的相对一致。从每单株中随机选取饱满谷粒10粒，按照同一个方向肩并肩，不重叠、不留隙的方式，紧靠摆成一行，用游标卡尺读出宽度，求其平均值即为谷粒宽度。谷粒千粒重根据随机挑选的200粒饱满谷粒的重量来估算。

从BC₃F₁单株衍生的BC₃F₂群体中随机挑选了288单株构成一个随机群体。考察珍汕97B、H94以及随机群体中每个单株的谷粒宽度等性状，并用两端分子标记RM593和RM574确定各株基因型，结果发现该性状在两亲本间都具有显著差异。在随机群体中，谷粒宽度表现为半不连续分布(图3)。以3.14mm的谷粒宽度为分界线，可分为两类，即大粒和小粒类型(表1和图3)，且对粒重和单株产量均有显著影响。本发明中将宽而重的谷粒称之为大粒，另外一种短而轻的谷粒类型称之为小粒。卡方测验表明三种类型符合单个孟德尔因子的1∶2∶1分离比窄粒∶宽粒＝222∶66，X²＝0.51＜X² _005，1)，表明在此BC₃F₂群体中，粒大小是由一个主效基因控制的，并且小粒等位基因对大粒等位基因表现为半显性作用。

表1近等基因系中GS5的对产量性状的影响分析

2 分子标记的开发

本发明中所用到的SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http://www.gramene.org/).此外，还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)以及籼稻品种93-11的基因组序列(http://rise.genomics.org.cn/)设计和鉴定多态性标记，设计原则是在两者间有2-6bp缺失的、PCR片段大约有100-200bp长度、目标片段上平均分布了，用设计的引物扩增珍汕97B和H94模板DNA，4％PAGE胶电泳检测，最终设计了13对在珍汕97B和H94间具有多态性的Indel(Insert/Deletion)标记，用于GS5的精细定位分析。这些标记的序列信息见表4。

3 重组单株的后代测验分析和GS5的精细定位及候选基因确定

为进一步缩小GS5的定位区间，从9639株由BC₃F₁单株衍生的BC₃F₂大群体中挑选出重组单株。

首先用SSR标记RM593和RM574标记进行筛选，从4374个单株中共找到94个重组单株，这些单株经过后代测验确认其上一代的表型：每个重组单株种植24株后代作为一个家系，性状分离的家系说明上一代表型是杂合的，后代性状不分离且是高值性状的说明上一代表型是来至珍汕97B纯合的，低值说明上一代表型是来至H94纯合的。然后，利用发展的13个InDel标记分析这94个重组单株，结果发现在RM574和GS5间存在4个重组单株，在RM593和GS5存在90个重组单株，特别是在C53和GS5间只发生1次重组，在C62和GS5间只存在2次重组，而且在C53和C62之间还存在C10和C23两个标记与GS5共分离(图4)。因此，GS5最终被定位于C53和C62间，该区间对应于Nipponbare和93-11的基因组序列上的约8.0kb的物理范围(图4)。在C53和C62间(由申请人自己设计，参见表4)所界定的8.0-kb范围内找到一条全长cDNA，编号为AK106800，来自于日本晴的小花组织，本发明克隆的GS5基因的cDNA序列全长1449bp，与8.0-kb范围内的0.3kb至6.9kb区段完全匹配，因此该cDNA是GS5的唯一可靠候选基因。

实施例3：GS5的转基因互补试验

1 GS5转基因技术路线：

Real-Time PCR表达谱分析发现，该基因全生育期在各个组织表达，并且在颖壳胚乳中宽粒品种(珍汕97B)比小粒(H94)的表达量高(图5)，预测表达量起重要作用，于是根据预测的候选基因全长cDNA序列，设计一对带有限制性核酸内切酶BamHI和PstI接头的RT-PCR特异引物(表4)扩增H94的cDNA片段，连接到TA克隆Promega T载体上，挑选出含有候选基因的无突变的正确克隆，利用限制性核酸内切酶BamHI and PstI酶切阳性克隆，进行亚克隆，再连接到双元超表达载体pCAMBIA1301S)(pCAMBIA1301多克隆位点旁加一35S强启动子)上；另外，用同样的方法将珍汕97B启动子融合H94编码区的转基因(ZpHc)连接到双元超表达载体pCAMBIA1301(图6)上。采用转基因的方法，将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过诱导、继代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因的水稻小植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativaL.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJournal 6：271-282)基础上进行优化。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N_6max培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃) 28.3克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)1.66克或者CaCl₂ 1.25克

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

2)N_6min培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制)：

碘化钾(KI) 0.08克

硼酸(H₃BO₃) 0.16克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.44克或者MnSO₄·2H₂O 0.3335克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15克

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

3)铁盐(Fe²⁺EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)：

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

烟酸(Nicotinic acid) 0.1克

维生素B₁(Thiamine HCl) 0.1克

维生素B₆(Pyridoxine HCl) 0.1克

甘氨酸(Glycine) 0.2克

肌醇(Inositol) 10克

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MS_max母液)(按照10X浓缩液配制)：

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5克

硝酸钾(KNO₃) 19.0克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 1.7克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 3.7克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 4.4克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

6)MS培养基微量元素母液(MS_min母液)(按照100X浓缩液配制)：

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86克

硼酸(H₃BO₃) 0.62克

碘化钾(KI) 0.083克

钼酸钠(Na2MoO₄·2H₂O) 0.025克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025克

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，-20℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方：

1)诱导培养基

N_6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同) 100毫升

N_6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的) 2.5毫升

脯氨酸(Proline) 0.3克

CH 0.6克

蔗糖(Sucrose) 30克

Phytagel(分开加，需加热溶解，下同) 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌15分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基：

N_6max母液(10X) 100毫升

N_6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

2，4-D贮存液 2.0毫升

脯氨酸 0.5克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基(粳稻可以不做这一步)：

N_6max母液(10X) 12.5毫升

N_6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.15克

蔗糖 5克

琼脂粉(Agar) 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)悬浮培养基：

N_6max母液(10X) 5毫升

N_6mix母液(100X) 0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5毫升

维生素贮存液(100X) 1毫升

2，4-D贮存液 0.2毫升

CH 0.08克

蔗糖 2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

5)共培养基：

N_6max母液(10X) 12.5毫升

N_6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.2克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

6)筛选培养基：

N_6max母液(10X) 25毫升

N_6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.625毫升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(10克CN/36毫升水)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基(粳稻可以不做这一步)：

N_6max母液(10X) 25毫升

N_6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

6-BA贮存液 0.5毫升

KT贮存液 0.5毫升

NAA贮存液 50微升

IAA贮存液 50微升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基：

N_6max母液(10X) 100毫升

N_6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

6-BA贮存液 2毫升

KT贮存液 2毫升

NAA贮存液 0.2毫升

IAA贮存液 0.2毫升

CH 1克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到100毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MS_max母液(10X) 50毫升

MS_mix母液(100X) 5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5毫升

维生素贮存液(100X) 5毫升

蔗糖 20克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。(4)农杆菌介导的遗传转化步骤：

3.1愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将8-10粒种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-5周，温度26±1℃。

3.2愈伤继代：

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养：

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

3.4农杆菌培养：

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上划线预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两大，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染：

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养：

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中摇30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周至长出好的抗性愈伤。

3.7分化：

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，每瓶平均分布三个独立的愈伤，光照下培养5周-6周至长出大的苗子，温度26℃。

3.8生根与炼苗：

1)剪掉分化时产生的老根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周至长出大的苗子后去掉封口膜加部分自来水炼苗一周再移栽，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润，等长势很壮再移栽至大田。

本发明共获得独立转基因Over-expression T₀代水稻植株37株，包括18株阳性单株和19株阴性单株。所获得的T₁代水稻植株以Z3-22家系为例；珍汕97启动子融合H94编码区(ZpHc)独立转基因T₀代水稻植株28株，包括18株阳性单株和10株阴性单株。两种转基因水稻阳性和阴性植株的粒宽和粒重(图7)有差异显著(P＜0.001)。根据转基因T₀代阳性超表达单株均表现出更宽的粒形(图6)，并且其T₁代共分离检测发现，粒宽和表达量正相关(表2)，证明了该唯一的候选基因就是GS5 QTL.另外，珍汕97B启动子融合H94编码区的转基因和上述结果一致，均能增加粒宽和粒重这一表型(图7)，互补成功，该QTL基因被成功克隆，并且说明启动子区是GS5遗传变异的原因。由于该基因超标达使得种子变大，说明GS5是一个粒形和粒重的正调控因子，这和其控制粒形的基因(GS3，GW2，qSW5)不同，它们多是负调控种子大小(Fan等，2006，Theor.Appl.Genet.112：1164-1171；Takano-Kai等，2009，Genetics 182：1323-34；Song等，2007，Nature Genetics 39：623-630；Shomura等，2008，Nature Genetics 40：1023-1028；Weng等，2008，CellRes.18：1199-209)。同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来改良水稻品种。

2 GS5功能预测

根据InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)对蛋白质结构进行预测，GS5基因(H94)编码的蛋白质由480个氨基酸组成，包含一个大的保守的PF00450结构域。利用BLASTp对GS5基因编码的由480个氨基酸组成的蛋白质结构进行搜索，发现该基因编码一丝氨酸羧肽酶，属于S10蛋白家族，，以前的研究表明该酶家族参与种子的萌发和发育、植株的生长与发育、植株次级代谢以及植物的生物和非生物胁迫反应(Degan等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8209-8213；Washio等，1994，Plant Physiol.105：1275-1280；Li等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，5916-5921；Shirley等，2003，J.Biol.Chem.278：19870-19877；Mehta等，1996，Plant Physiol.110；883-892)。

实施例5：比较测序确定GS5等位基因间的自然变异

1 序列测定

两个大粒品种(珍汕97B和特青)和两个小粒品种(明恢63和H94)进行目标区段的测序。利用10对PCR产物相互部分重叠的引物(表3)，采用高保真度的LA-Taq和rTag(购自日本TakaRa公司)从这些品种的基因组中进行PCR扩增，然后按照美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)进行PCR测序。使用Sequencher 4.5软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。该两个等位基因的DNA序列如SEQ ID NO：1(珍汕97B)和SEQ ID NO：3(H94)所示。

表2GS5转基因T₁代共分离检测分析

2 发生自然变异的序列比较

目标区段间的序列比较分析在两个大粒品种(珍汕97B和特青)和两个小粒品种(明恢63和H94)间进行(图8)，发现在3.9kb的启动子和cDNA范围内大小粒品种间存在20个共同的SNP和InDel差异，其中18个突变位于启动子区，4个突变位于编码区的第1、第2和第9个外显子，导致了5个氨基酸变异(图8)，还有4个突变位于内含子区。由于超表达窄粒的等位基因可以使宽粒变得更宽，所以编码区的5个氨基酸替换不是等位基因变异的原因，ZcHp转化片段进而说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致粒宽和千粒重的变异。

表3用于本发明比较测序的引物

表4用于本发明图位克隆和基因功能分析的引物

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因GS5的克隆与应用

<130>

<141>2010-05-27

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3656

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3656)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1835)..(2000)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(3450)..(3656)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1834)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2001)..(3449)

<223>

<400>1

tcgtatggaa ttacctagct atgcacaatt ttgtccaatg tcaaaaacat ctcctatgga 60

attacctacg cacattgttg tctaatgtca aaataactcc tacgctatca tatcgttttc 120

gttttccatc gttgtcacgc tgtcaatttt gcaggcctgc aaaaactact agagtacaaa 180

agttaaaact attttttcac catggatgga tggatagatt tatatatgca agtcctccaa 240

gatgtatacc agtccaaacc aaaaactcca actcgcaata ttaattcaca ctgaaaaatt 300

tggggaagat tcaatatata atttccactc ttttaattta atttcctatc taatcttgac 360

tgattcccgt ttcaactgga gaggagatgg gagtagatgc acggtgccac aatcgcgaaa 420

cgtgaataat gaaacgagcg aagaagttag gcagactgaa ggccatatga gtatatgaca 480

tacacacgtg acgtcgggta caatatactc cctccgtccc aaaaaaaagg caaaccctgt 540

atttgcgtgt ccaactttga ctgtccgtct tatatgaaat ttttttataa ttcgtatttt 600

tattgttgtt ggatgataaa acatgattaa tactttgtgt gtgacttgtc tttttaattt 660

ttttcataat tttttaaata agacggacgg tcaaaaatta agcacggaaa ccagggtttg 720

tctttttttt tttgggacgg agggagtaca aagtaaaatt tgacgagagg caaggacccc 780

acttgtcata cactaaatcc accctggtat acatgacact aaaagtaggc aaggacccca 840

cttgtcatac agtaagggct catttgaatc gcaggaatga aaaaacacag gattctgaca 900

ggaatacaat tgtaaaacag aggatttata aaacacagga aaaacacagg aatggccgtt 960

tgattggacc acagaaaaaa cataggaagc agatgggaga gatagataga ctcagaggaa 1020

atgttccaag aggttagacc tcttgctaac tttcctccaa aatatgcata agattaccca 1080

ttccatagaa attttaaagg attggataag attcaatcct tcgtttcaaa ggccttcgta 1140

ggattttttt tttccataga attgaaatcc tccaaaattc ctacattttt tctacaaatc 1200

aaaggtgcca taaatccacc atggtataca tgacactgaa agtatatatt aattatatga 1260

tagcaataga ttttctatcg ttttctttac aatgtcatgg aggttgaact ttcaactaaa 1320

gtgatattac ctcatcaaag aaaaagtgat atcacctcca tctcaaaata ttgcaacccg 1380

gatctggaca gatatctaga tttattatag taggaacaaa ttacatccta aattacaata 1440

ttttggaatg gaggaagtaa taagagtaat ttgaaagtgt gtggaaaagg aaactttagc 1500

tctttatgtg cggaacgcag cctaactacc taagtagata ctacaggaat attggcacgc 1560

atgttcaaaa aataataaat atggtacctg tgaaaaacag acttttaata gacaatgaga 1620

gagataggta actgagtcat ctctaatttc taactcccat ggaattacta gagaagccaa 1680

actgactcta atgtcaatca gtttcgcttt ccatccttct catgctgtca atttatcagt 1740

caatcacact acaaaattaa cataatctct tttttttttc ttcaccatgg acgatggata 1800

tatagataga tagatatatt tatccgagtc ctccaagaac accaaacgag aagctccaag 1860

ctcgcaataa ttcaccaaga atcgcaccac ttttcacctt ttcttctcct cctccatttc 1920

catccatggc gacgctgctg ctgctgctgc acacggcgca acagtgagct atagctagag 1980

ctcggcacca cgggttagca atg gcg gtg gcg gcg gcg gcg gcg gcg gcg gcg 2033

Met Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10

agg cgg cga gat gtc tct tgt ctt ctc ctc ctc ctg tgc ttc agc tcg 2081

Arg Arg Arg Asp Val Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Phe Ser Ser

15 20 25

tca atg gcg gcg acc ggc ggc ggc ggc ggc gag cag gag gct gac agg 2129

Ser Met Ala Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gln Glu Ala Asp Arg

30 35 40

gtg gcg cgg ctc ccg ggg cag ccg gcg agc ccc gcc gtg tcg cag ttc 2177

Val Ala Arg Leu Pro Gly Gln Pro Ala Ser Pro Ala Val Ser Gln Phe

45 50 55

gcc ggc tac gtc ggc gtc gac gag cgg cac ggc agg gcg ctg ttc tac 2225

Ala Gly Tyr Val Gly Val Asp Glu Arg His Gly Arg Ala Leu Phe Tyr

60 65 70 75

tgg ttc ttc gag gcg cag gcg tcg ccg gcg ccg gag aag aag ccg ctg 2273

Trp Phe Phe Glu Ala Gln Ala Ser Pro Ala Pro Glu Lys Lys Pro Leu

80 85 90

ctc ctc tgg ctc aat gga gga cct ggt tgc tct tcc att ggc tat ggt 2321

Leu Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Ile Gly Tyr Gly

95 100 105

gct gca tca gag cta ggg cct ctc aga gtt gca aga caa gga gca gca 2369

Ala Ala Ser Glu Leu Gly Pro Leu Arg Val Ala Arg Gln Gly Ala Ala

110 115 120

cta gag ttc act aag tat ggc tgg aac aaa gag gct aac ctc ctg ttc 2417

Leu Glu Phe Thr Lys Tyr Gly Trp Asn Lys Glu Ala Asn Leu Leu Phe

125 130 135

ttg gag tct cct gtt ggg gtc ggc ttc tcc tac acc aac aca tcc tct 2465

Leu Glu Ser Pro Val Gly Val Gly Phe Ser Tyr Thr Asn Thr Ser Ser

140 145 150 155

gac ctc tcc aat ctt aat gat gat ttt gta gct gag gat gct tat agt 2513

Asp Leu Ser Asn Leu Asn Asp Asp Phe Val Ala Glu Asp Ala Tyr Ser

160 165 170

ttc ctg gtg aac tgg ttc aag aga ttt cct cag tac aag gac aat gag 2561

Phe Leu Val Asn Trp Phe Lys Arg Phe Pro Gln Tyr Lys Asp Asn Glu

175 180 185

ttc tac atc tca ggg gag agc tat gca ggt cac tat gtg ccc caa ctt 2609

Phe Tyr Ile Ser Gly Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr Val Pro Gln Leu

190 195 200

gct gac ctt gtc tat gag agg aac aaa gac aaa agg gcc agc aca tat 2657

Ala Asp Leu Val Tyr Glu Arg Asn Lys Asp Lys Arg Ala Ser Thr Tyr

205 210 215

atc aac ctc aag ggg ttc att gta ggc aac cct ctc acc gat gat tac 2705

Ile Asn Leu Lys Gly Phe Ile Val Gly Asn Pro Leu Thr Asp Asp Tyr

220 225 230 235

tat gat tca aaa ggt ttg gct gag tat gcc tgg agc cat gca att gtg 2753

Tyr Asp Ser Lys Gly Leu Ala Glu Tyr Ala Trp Ser His Ala Ile Val

240 245 250

tcg gat caa gtt tac gag cgc atc aag aaa act tgc aac ttc aag aac 2801

Ser Asp Gln Val Tyr Glu Arg Ile Lys Lys Thr Cys Asn Phe Lys Asn

255 260 265

tcc aac tgg act gac gat tgc aat gct gca atg aac ata atc ttc agt 2849

Ser Asn Trp Thr Asp Asp Cys Asn Ala Ala Met Asn Ile Ile Phe Ser

270 275 280

cag tac aat cag ata gat ata tac aac att tat gcc cca aag tgc ctt 2897

Gln Tyr Asn Gln Ile Asp Ile Tyr Asn Ile Tyr Ala Pro Lys Cys Leu

285 290 295

cta aac agt act tca gca tct tca cct gat cgt gca ttc ttc gca aat 2945

Leu Asn Ser Thr Ser Ala Ser Ser Pro Asp Arg Ala Phe Phe Ala Asn

300 305 310 315

aac cag gaa caa ttc agg tgg aga atc aag atg ttt tca ggc tat gat 2993

Asn Gln Glu Gln Phe Arg Trp Arg Ile Lys Met Phe Ser Gly Tyr Asp

320 325 330

cca tgc tac tca tcc tat gct gag gac tac ttc aat aag cat gat gtg 3041

Pro Cys Tyr Ser Ser Tyr Ala Glu Asp Tyr Phe Asn Lys His Asp Val

335 340 345

caa gaa gca ttc cat gca aat gcc agt gga ctg ctt cca ggg aag tgg 3089

Gln Glu Ala Phe His Ala Asn Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Lys Trp

350 355 360

caa gtt tgc agt gac caa atc ctc aac tct tac aat ttc tca gta ctt 3137

Gln Val Cys Ser Asp Gln Ile Leu Asn Ser Tyr Asn Phe Ser Val Leu

365 370 375

tcc atc cta cct ata tac tcc aag ctc atc aaa gca ggg ctg aga gtt 3185

Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Ser Lys Leu Ile Lys Ala Gly Leu Arg Val

380 385 390 395

tgg ctc tac agc ggt gat gct gac ggc agg gtc ccg gtt atc agt tct 3233

Trp Leu Tyr Ser Gly Asp Ala Asp Gly Arg Val Pro Val Ile Ser Ser

400 405 410

cgg tac tgc gtg gac gca ctc ggc cta ccg atc aag acc gat tgg caa 3281

Arg Tyr Cys Val Asp Ala Leu Gly Leu Pro Ile Lys Thr Asp Trp Gln

415 420 425

tct tgg tac ctt gac aag cag gtt gct ggg agg ttt gtg gag tac cat 3329

Ser Trp Tyr Leu Asp Lys Gln Val Ala Gly Arg Phe Val Glu Tyr His

430 435 440

gga atg aca atg gtg act gtc aga ggg gca ggt cac ctg gtt ccc ctc 3377

Gly Met Thr Met Val Thr Val Arg Gly Ala Gly His Leu Val Pro Leu

445 450 455

aac aaa cct gct gaa ggg ctt atg ctg ata aat gca ttc ctt cat ggt 3425

Asn Lys Pro Ala Glu Gly Leu Met Leu Ile Asn Ala Phe Leu His Gly

460 465 470 475

gag aag ctt ccg aca agc aga tga tatgcgctgc tgatgaagct ttggaggtac 3479

Glu Lys Leu Pro Thr Ser Arg

480

aagatggcat gagatacagg catggacatc aattttcatt gaaaggcgcc aatcggatag 3539

atttgatatg gtagtatcca aatcaatttc aagtgcgccg taaattcagt actctgttga 3599

acattctttt aaatctgttg ttgactatga ctttcttctt ttgtgttttt tttactc 3656

<210>2

<211>482

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Asp Val

1 5 10 15

Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Phe Ser Ser Ser Met Ala Ala Thr

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gln Glu Ala Asp Arg Val Ala Arg Leu Pro

35 40 45

Gly Gln Pro Ala Ser Pro Ala Val Ser Gln Phe Ala Gly Tyr Val Gly

50 55 60

Val Asp Glu Arg His Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Trp Phe Phe Glu Ala

65 70 75 80

Gln Ala Ser Pro Ala Pro Glu Lys Lys Pro Leu Leu Leu Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Ile Gly Tyr Gly Ala Ala Ser Glu Leu

100 105 110

Gly Pro Leu Arg Val Ala Arg Gln Gly Ala Ala Leu Glu Phe Thr Lys

115 120 125

Tyr Gly Trp Asn Lys Glu Ala Asn Leu Leu Phe Leu Glu Ser Pro Val

130 135 140

Gly Val Gly Phe Ser Tyr Thr Asn Thr Ser Ser Asp Leu Ser Asn Leu

145 150 155 160

Asn Asp Asp Phe Val Ala Glu Asp Ala Tyr Ser Phe Leu Val Asn Trp

165 170 175

Phe Lys Arg Phe Pro Gln Tyr Lys Asp Asn Glu Phe Tyr Ile Ser Gly

180 185 190

Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr Val Pro Gln Leu Ala Asp Leu Val Tyr

195 200 205

Glu Arg Asn Lys Asp Lys Arg Ala Ser Thr Tyr Ile Asn Leu Lys Gly

210 215 220

Phe Ile Val Gly Asn Pro Leu Thr Asp Asp Tyr Tyr Asp Ser Lys Gly

225 230 235 240

Leu Ala Glu Tyr Ala Trp Ser His Ala Ile Val Ser Asp Gln Val Tyr

245 250 255

Glu Arg Ile Lys Lys Thr Cys Asn Phe Lys Asn Ser Asn Trp Thr Asp

260 265 270

Asp Cys Asn Ala Ala Met Asn Ile Ile Phe Ser Gln Tyr Asn Gln Ile

275 280 285

Asp Ile Tyr Asn Ile Tyr Ala Pro Lys Cys Leu Leu Asn Ser Thr Ser

290 295 300

Ala Ser Ser Pro Asp Arg Ala Phe Phe Ala Asn Asn Gln Glu Gln Phe

305 310 315 320

Arg Trp Arg Ile Lys Met Phe Ser Gly Tyr Asp Pro Cys Tyr Ser Ser

325 330 335

Tyr Ala Glu Asp Tyr Phe Asn Lys His Asp Val Gln Glu Ala Phe His

340 345 350

Ala Asn Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Lys Trp Gln Val Cys Ser Asp

355 360 365

Gln Ile Leu Asn Ser Tyr Asn Phe Ser Val Leu Ser Ile Leu Pro Ile

370 375 380

Tyr Ser Lys Leu Ile Lys Ala Gly Leu Arg Val Trp Leu Tyr Ser Gly

385 390 395 400

Asp Ala Asp Gly Arg Val Pro Val Ile Ser Ser Arg Tyr Cys Val Asp

405 410 415

Ala Leu Gly Leu Pro Ile Lys Thr Asp Trp Gln Ser Trp Tyr Leu Asp

420 425 430

Lys Gln Val Ala Gly Arg Phe Val Glu Tyr His Gly Met Thr Met Val

435 440 445

Thr Val Arg Gly Ala Gly His Leu Val Pro Leu Asn Lys Pro Ala Glu

450 455 460

Gly Leu Met Leu Ile Asn Ala Phe Leu His Gly Glu Lys Leu Pro Thr

465 470 475 480

Ser Arg

<210>3

<211>3653

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3653)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(3447)..(3653)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1838)..(2003)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2004)..(3446)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1837)

<223>

<400>3

tcgtatggaa ttacctagct atgcacaatt ttgtccaatg tcaaaaacat ctcctatgga 60

attacctacg cacattgttg tctaatgtca aaataactcc tacgctatca tatcgttttc 120

gttttccatc gttgtcacgc tgtcaatttt gcaggcctgc aaaaactact agagtacaaa 180

agttaaaact attttttcac catggatgga tggatagatt tatatatgca agtcctccaa 240

gatgtatacc agtccaaacc aaaaactcca actcgcaata ttaattcaca ctgaaaaatt 300

tggggaagat tcaatatata atttccactc ttttaattta atttcctatc taatcttgac 360

tgattcccgt ttcaactgga gaggagatgg gagtagatgc acggtgccat aatcgcgaaa 420

cgtgaataat gaaacgagcg aagaagttag gcagactgaa ggccatatga gtatatgaca 480

tacacacgtg acgtcgggta caatatactc cctccgtccc aaaaaaaaag gcaaacccag 540

ggtttgcgtg tccaactttg actgtccgtc ttatatgaaa tttttttata attcgtattt 600

ttattgttgt tgaatgataa aacatgatta atactttgtg tgtgacttgt ctttttaatt 660

tttttcataa ttttttaaat aagacggacg gtcaaaaatt aggcacggaa accagggttt 720

gtcttttttt tttgggacgg agggagtaca aagtaaaatt tgacgagagg caaggacccc 780

acttgtcata cactaaatcc accctggtat acatgacact aaaagtaggc aaggacccca 840

cttgtcatac agtaagggct catttgaatc gcaggaatga aaaaacacag gattttgaca 900

ggaatacaat tgtaaaacag aggatttgta aaacacagga aaaacacagg aatggccgtt 960

tgattggacc actgaaaaaa cataggaatc agatgggaga gatagataga ctcagaggaa 1020

atgttccaag aggttagacc tcttgctaac tttcctccaa aatatgcata agattaccca 1080

ttccatagaa attttaaagg attggatagg attcaatcct tcgtttcaaa ggccttcgta 1140

ggattttttt ttccatagaa ttgaaatcct ccaaaattct tacatttttt ctacaaatca 1200

aaggtgccat aaatccaccc tggtatacat gacactgaaa gtatatatta attatatgat 1260

agcaatagat tttctatcgt tttctttaca atgtcatgga ggttgaactt tcaactaaag 1320

tgatattacc tcgtcaaaga aaaagtgata tcacctccat ctcaaaatat tgcaacccgg 1380

atctggacag atatctagat ttattatagt aggaacaaat tacatcctaa attacaatat 1440

tttggaatgg aggaagtaat aagagtaatt tgaaagtgtg tggaaaagga aactttagct 1500

ctttatgtgc ggaacgcagc ctaactacct aagtagatac tacaggaata ttggcacgca 1560

tgttcaaaaa ataataaata tggtacctgt gaaaaacaga cttttaatag acaatgagag 1620

agataggtaa ctgagtcatc tctaatttct aactcccatg gaattactag agaagccaaa 1680

caaactgact ctaatgtcaa tcagtttcgc tttccatcct tctcatgctg tcaatttatc 1740

agtcaatcac actacaaaat taacataatc tctttttttt ttcttcacca tggacgatgg 1800

atatatagat agatagatat atttatccga gtcctccaag aacaccaaac gagaagctcc 1860

aagctcgcaa taattcacca agaatcgcac cacttttcac cttttcttct cctcctccat 1920

ttccatccat ggcgacgctg ctgctgctgc tgcacacggc gcaacagtga gctatagcta 1980

gagctcggca ccacgggtta gca atg gcg gtg gcg gcg gcg gcg gcg gcg agg 2033

Met Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg

1 5 10

cgg cga gat gtc tct tgt ctt ctc ctc ctc ctg tgc ttc agc tcg tca 2081

Arg Arg Asp Val Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Phe Ser Ser Ser

15 20 25

atg gcg gcg acc ggc ggc ggc ggc ggc gag cag gag gct gac agg gtg 2129

Met Ala Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gln Glu Ala Asp Arg Val

30 35 40

gcg cgg ctc ccg ggg cag ccg gcg agc ccc gcc gtg tcg cag ttc gcc 2177

Ala Arg Leu Pro Gly Gln Pro Ala Ser Pro Ala Val Ser Gln Phe Ala

45 50 55

ggc tac gtc ggc gtc gac gag cgg cac ggc agg gcg ctg ttc tac tgg 2225

Gly Tyr Val Gly Val Asp Glu Arg His Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Trp

60 65 70

ttc ttc gag gcg cag gcg tcg ccg gcg ccg gag aag aag ccg ctg ctc 2273

Phe Phe Glu Ala Gln Ala Ser Pro Ala Pro Glu Lys Lys Pro Leu Leu

75 80 85 90

ctc tgg ctc aat gga gga cct ggt tgc tct tcc att ggc tat ggt gct 2321

Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Ile Gly Tyr Gly Ala

95 100 105

gca tca gag cta ggg cct ctc aga gtt gca aga caa gga gca gca cta 2369

Ala Ser Glu Leu Gly Pro Leu Arg Val Ala Arg Gln Gly Ala Ala Leu

110 115 120

gag ttc aac cag tat ggc tgg aac aaa gag gct aac ctc ctg ttc ttg 2417

Glu Phe Asn Gln Tyr Gly Trp Asn Lys Glu Ala Asn Leu Leu Phe Leu

125 130 135

gag tct cct gtt ggg gtc ggc ttc tcc tac acc aac aca tcc tct gac 2465

Glu Ser Pro Val Gly Val Gly Phe Ser Tyr Thr Asn Thr Ser Ser Asp

140 145 150

ctc tcc aat ctt aat gat gat ttt gta gct gag gat gct tat agt ttc 2513

Leu Ser Asn Leu Asn Asp Asp Phe Val Ala Glu Asp Ala Tyr Ser Phe

155 160 165 170

ctg gtg aac tgg ttc aag aga ttt cct cag tac aag gac aat gag ttc 2561

Leu Val Asn Trp Phe Lys Arg Phe Pro Gln Tyr Lys Asp Asn Glu Phe

175 180 185

tac atc tca ggg gag agc tat gca ggt cac tat gtg ccc caa ctt gct 2609

Tyr Ile Ser Gly Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr Val Pro Gln Leu Ala

190 195 200

gac ctt gtc tat gag agg aac aaa gac aaa agg gcc agc aca tat atc 2657

Asp Leu Val Tyr Glu Arg Asn Lys Asp Lys Arg Ala Ser Thr Tyr Ile

205 210 215

aac ctc aag ggg ttc att gta ggc aac cct ctc acc gat gat tac tat 2705

Asn Leu Lys Gly Phe Ile Val Gly Asn Pro Leu Thr Asp Asp Tyr Tyr

220 225 230

gat tca aaa ggt ttg gct gag tat gcc tgg agc cat gca att gtg tcg 2753

Asp Ser Lys Gly Leu Ala Glu Tyr Ala Trp Ser His Ala Ile Val Ser

235 240 245 250

gat caa gtt tac gag cgc atc aag aaa act tgc aac ttc aag aac tcc 2801

Asp Gln Val Tyr Glu Arg Ile Lys Lys Thr Cys Asn Phe Lys Asn Ser

255 260 265

aac tgg act gac gat tgc aat gct gca atg aac ata atc ttc agt cag 2849

Asn Trp Thr Asp Asp Cys Asn Ala Ala Met Asn Ile Ile Phe Ser Gln

270 275 280

tac aat cag ata gat ata tac aac att tat gcc cca aag tgc ctt cta 2897

Tyr Asn Gln Ile Asp Ile Tyr Asn Ile Tyr Ala Pro Lys Cys Leu Leu

285 290 295

aac agt act tca gca tct tca cct gat cgt gca ttc ttc gca aat aac 2945

Asn Ser Thr Ser Ala Ser Ser Pro Asp Arg Ala Phe Phe Ala Asn Asn

300 305 310

cag gaa caa ttc agg tgg aga atc aag atg ttt tca ggc tat gat cca 2993

Gln Glu Gln Phe Arg Trp Arg Ile Lys Met Phe Ser Gly Tyr Asp Pro

315 320 325 330

tgc tac tca tcc tat gct gag gac tac ttc aat aag cat gat gtg caa 3041

Cys Tyr Ser Ser Tyr Ala Glu Asp Tyr Phe Asn Lys His Asp Val Gln

335 340 345

gaa gca ttc cat gca aat gcc agt gga ctg ctt cca ggg aag tgg caa 3089

Glu Ala Phe His Ala Asn Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Lys Trp Gln

350 355 360

gtt tgc agt gac caa atc ctc aac tct tac aat ttc tca gta ctt tcc 3137

Val Cys Ser Asp Gln Ile Leu Asn Ser Tyr Asn Phe Ser Val Leu Ser

365 370 375

atc cta cct ata tac tcc aag ctc atc aaa gca ggg ctg aga gtt tgg 3185

Ile Leu Pro Ile Tyr Ser Lys Leu Ile Lys Ala Gly Leu Arg Val Trp

380 385 390

ctc tac agc ggt gat gct gac ggc agg gtc ccg gtt atc agt tct cgg 3233

Leu Tyr Ser Gly Asp Ala Asp Gly Arg Val Pro Val Ile Ser Ser Arg

395 400 405 410

tac tgc gtg gaa gca ctc ggc cta ccg atc aag acc gat tgg caa tct 3281

Tyr Cys Val Glu Ala Leu Gly Leu Pro Ile Lys Thr Asp Trp Gln Ser

415 420 425

tgg tac ctt gac aag cag gtt gct ggg agg ttt gtg gag tac cat gga 3329

Trp Tyr Leu Asp Lys Gln Val Ala Gly Arg Phe Val Glu Tyr His Gly

430 435 440

atg aca atg gtg act gtc aga ggg gca ggt cac ctg gtt ccc ctc aac 3377

Met Thr Met Val Thr Val Arg Gly Ala Gly His Leu Val Pro Leu Asn

445 450 455

aaa cct gct gaa ggg ctt atg ctg ata aat gca ttc ctt cat ggt gag 3425

Lys Pro Ala Glu Gly Leu Met Leu Ile Asn Ala Phe Leu His Gly Glu

460 465 470

aag ctt ccg aca agc aga tga tatgcgctgc tgatgaagct ttggaggtac 3476

Lys Leu Pro Thr Ser Arg

475 480

aagatggcat gagatacagg catggacatc aattttcatt gaaaggcgcc aatcggatag 3536

atttgatatg gtagtatcca aatcaatttc aagtgcgccg taaattcagt actctgttga 3596

acattctttt aaatctgttg ttgactatga ctttcttctt ttgtgttttt tttactc 3653

<210>4

<211>480

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>4

Met Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Asp Val Ser Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Cys Phe Ser Ser Ser Met Ala Ala Thr Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Glu Gln Glu Ala Asp Arg Val Ala Arg Leu Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Ala Ser Pro Ala Val Ser Gln Phe Ala Gly Tyr Val Gly Val Asp

50 55 60

Glu Arg His Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Trp Phe Phe Glu Ala Gln Ala

65 70 75 80

Ser Pro Ala Pro Glu Lys Lys Pro Leu Leu Leu Trp Leu Asn Gly Gly

85 90 95

Pro Gly Cys Ser Ser Ile Gly Tyr Gly Ala Ala Ser Glu Leu Gly Pro

100 105 110

Leu Arg Val Ala Arg Gln Gly Ala Ala Leu Glu Phe Asn Gln Tyr Gly

115 120 125

Trp Asn Lys Glu Ala Asn Leu Leu Phe Leu Glu Ser Pro Val Gly Val

130 135 140

Gly Phe Ser Tyr Thr Asn Thr Ser Ser Asp Leu Ser Asn Leu Asn Asp

145 150 155 160

Asp Phe Val Ala Glu Asp Ala Tyr Ser Phe Leu Val Asn Trp Phe Lys

165 170 175

Arg Phe Pro Gln Tyr Lys Asp Asn Glu Phe Tyr Ile Ser Gly Glu Ser

180 185 190

Tyr Ala Gly His Tyr Val Pro Gln Leu Ala Asp Leu Val Tyr Glu Arg

195 200 205

Asn Lys Asp Lys Arg Ala Ser Thr Tyr Ile Asn Leu Lys Gly Phe Ile

210 215 220

Val Gly Asn Pro Leu Thr Asp Asp Tyr Tyr Asp Ser Lys Gly Leu Ala

225 230 235 240

Glu Tyr Ala Trp Ser His Ala Ile Val Ser Asp Gln Val Tyr Glu Arg

245 250 255

Ile Lys Lys Thr Cys Asn Phe Lys Asn Ser Asn Trp Thr Asp Asp Cys

260 265 270

Asn Ala Ala Met Asn Ile Ile Phe Ser Gln Tyr Asn Gln Ile Asp Ile

275 280 285

Tyr Asn Ile Tyr Ala Pro Lys Cys Leu Leu Asn Ser Thr Ser Ala Ser

290 295 300

Ser Pro Asp Arg Ala Phe Phe Ala Asn Asn Gln Glu Gln Phe Arg Trp

305 310 315 320

Arg Ile Lys Met Phe Ser Gly Tyr Asp Pro Cys Tyr Ser Ser Tyr Ala

325 330 335

Glu Asp Tyr Phe Asn Lys His Asp Val Gln Glu Ala Phe His Ala Asn

340 345 350

Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Lys Trp Gln Val Cys Ser Asp Gln Ile

355 360 365

Leu Asn Ser Tyr Asn Phe Ser Val Leu Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Ser

370 375 380

Lys Leu Ile Lys Ala Gly Leu Arg Val Trp Leu Tyr Ser Gly Asp Ala

385 390 395 400

Asp Gly Arg Val Pro Val Ile Ser Ser Arg Tyr Cys Val Glu Ala Leu

405 410 415

Gly Leu Pro Ile Lys Thr Asp Trp Gln Ser Trp Tyr Leu Asp Lys Gln

420 425 430

Val Ala Gly Arg Phe Val Glu Tyr His Gly Met Thr Met Val Thr Val

435 440 445

Arg Gly Ala Gly His Leu Val Pro Leu Asn Lys Pro Ala Glu Gly Leu

450 455 460

Met Leu Ile Asn Ala Phe Leu His Gly Glu Lys Leu Pro Thr Ser Arg

465 470 475 480

Claims

1.一种控制水稻谷粒粒宽和粒重性状的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的基因GS5，它的编码序列如序列表SEQ ID NO：1中第2001-3449位对应的核苷酸所示。

3.如权利要求1所述的基因GS5的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求3所述的等位基因，它的编码序列如序列表SEQ ID NO：3中第2004-3446位对应的核苷酸所示。

5.适用于权利要求1所述基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中1-1834位对应的核苷酸所示。

6.适用于权利要求3所述基因的启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3中1-1837位对应的核苷酸所示。

7.权利要求1或2所述的基因在作物遗传改良中的应用。

8.权利要求3或4所述的基因在作物遗传改良中的应用。

9.权利要求5所述的启动子在作物遗传改良中的应用。

10.权利要求6所述的启动子在作物遗传改良中的应用。