CN103421815B - 一个水稻粒宽新基因qGS5dl及其分子标记方法 - Google Patents

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本发明涉及一个同时增加水稻粒宽、粒厚和粒重的新基因qGS5dl及其分子标记方法，属于水稻高产优质育种和分子遗传学领域。本发明实质是根据连锁分离规律，利用“大粒突变体”和原始亲本农垦58的F2群体及其衍生的F3家系，通过单标记分析，定位第5染色体上的粒长新基因qGS5dl，获得与之紧密连锁的基于PCR扩增的实用经济型标记MGW5。将本发明应用于稻米外观品质和产量的辅助选择育种和聚合育种，能够有效的弥补以往自然变异基因的不足，可以在苗期对低世代的育种群体进行基因型选择，获得大粒形个体，便于及时的杂交转育，省去成株期籽粒鉴定的过程，提高育种效率，加快育种进程。

Description

一个水稻粒宽新基因qGS5dl及其分子标记方法
技术领域
本发明涉及一个水稻粒宽新基因qGS5dl及其分子标记，该基因增加水稻籽粒宽度，同时增加粒厚和粒重，属于水稻高产育种和分子遗传学领域，适用于在水稻高产育种中引入新的粒形基因qGS5dl，并利用分子标记对该基因进行辅助选择育种。
背景技术
水稻粒形主要取决于粒长、粒宽和粒厚，而且与产量组分之一的粒重直接呈正相关。分子遗传学研究表明，水稻粒形和粒重及其组分表现为受多基因控制的数量性状。迄今为止，已有110多个影响水稻粒形、粒重及其组分性状的主效QTL被鉴定出来，主要分布在第1、2、3和5染色体上，其中影响粒宽和粒重的GW2、影响粒长、粒宽和粒厚的GS3、影响粒长和粒重的GL3.1、影响粒宽和粒重的qSW5/GW5、影响籽粒大小的GS5、影响粒宽的GW8及影响粒厚的GIF1等均已被克隆。此外，还有影响粒长的qGL-3a和qGL7、影响粒重的gw3.1和GW3、影响粒长和粒宽的qGL1、qGW1、GS7和qSS7及影响粒长和粒重的gw8.1等主效QTL被精细定位。上述影响粒形或粒重的等位基因主要来源于自然变异，这些基因的定位和克隆有助于我们了解水稻粒形或粒重形成的遗传基础，但其真正在育种实践中成功应用的事例仍十分有限。
拓宽遗传变异进而鉴定和挖掘有利变异的基因是开展突破性育种的先决条件。实践证明，诱变处理是获得农作物新变异的一种有效途径。采用地面γ辐射和各种化学诱变剂处理农作物种子的诱变育种在我国取得了丰硕成果，已选育出了一大批农作物新品种。我国于1987年开始，着手利用返回式卫星等航天器搭载生物体进行外太空环境(具有高能重粒子辐射和高真空等特点)诱变处理及其育种应用研究，迄今完成了多达21批次的生物材料包括不同植物干种子、微生物等搭载处理，获得了一大批具有育种利用价值的突变体材料。
本课题组在国内较早开展空间诱变育种研究，选用我国晚粳主体育种亲本农垦58纯系干种子，于1988年搭载我国“8885”返回式卫星进行空间诱变处理，从诱变后代选育出稳定遗传的大粒突变体，其籽粒特别细长，3粒种子累加长达1寸，故有“3粒寸”之称，千粒重高达43g，精米透明无心腹白，带有芳香味，是一份难得的育种资源。2002年，本课题组通过初步的遗传研究发现，其粒形性状(长、宽、厚)在农垦58/大粒突变体的F2群体中呈现正态分布，很可能受多个位点的控制。本发明通过分子标记定位发现了一个位于第5染色体上的主效位点qGS5dl，来源于大粒突变体的等位基因同时增加粒宽、粒厚和千粒重，在农垦58/大粒突变体的F2群体中分别解释10.0％、6.2％和4.2％的粒宽、粒厚和千粒重变异，并获得了紧密连锁的遗传标记MGW5，有望用于新基因qGS5dl的标记辅助选择育种。经比较作图发现，这个位点上尚未有控制粒宽、粒厚和粒重的基因报道，因此qGS5dl可能是一个控制粒宽、粒厚和粒重的新基因。
发明内容
(一)技术问题
本发明针对上述研究背景，利用大粒突变体和原始对照品种农垦58配制的F2分离群体，通过连锁分析，定位第5染色体上的粒形新基因(qGS5dl)，获得与之紧密连锁的基于PCR的实用经济型标记MGW5，该标记可以有效的进行粒形的辅助选择，主要应用于粳稻高产育种。
(二)技术方案
水稻粒宽新基因qGS5dl，其特征在于：在水稻基因组第5染色体18,000,000-20,000,000bp的区间内存在一个与稻谷粒长粒重相关的一个新基因位点qGS5dl，航天诱变品种“大粒突变体”在该位点上的等位基因能够显著增加粒宽。
qGS5dl的分子标记方法，其特征在于：用一对特异的PCR引物对MGW5，其中正向引物序列为：CATGCAACAACGTCACCTTC，反向引物序列为：ATGGTTGGTAGGCACCAAAG，共同PCR扩增带有品种“大粒突变体”血缘的育种材料基因组DNA，如果引物对MGW5的能够PCR扩增出与“大粒突变体”类似的145bp左右大小的片段，那么推测该育种材料很可能含有qGS5dl的宽粒等位基因。
水稻粒宽新基因qGS5dl及其分子标记方法可以应用于水稻育种。
(三)有益效果
通过本发明鉴定到第5染色体上的粒宽新基因(qGS5dl)以及可对其进行基因型鉴别的共显性分子标记。
本发明与现有技术相比具有以下优点及效果：
1.与目前报道的影响粒宽基因GW2、GS3、GL3.1、qSW5/GW5和GW8基因不同，qGS5dl是源于航天诱变的一个同时控制粒宽、粒厚和粒重的新基因位点，丰富了自然变异基因的多样性。
2.通过新基因标记的筛选，能够获得粒宽、粒厚和粒重均增加的高产育种材料。
3.本发明的分子标记可用于苗期育种群体的基因型选择，有效地鉴别带有该基因的大粒形个体，便于及时的杂交转育，加快育种进程。
附图说明
图1“大粒突变体”/农垦58的F3后代株系的SSR标记MGW5的PCR扩增产物在5％聚丙烯酰胺凝胶电泳的带型图谱及其对应的表型(1-28为随机选取的F3代株系；M为DNALadder；P1为长粒亲本；P2为正常亲本；a为145bp，b为165bp)。
图2“大粒突变体”/农垦58的F3后代株系根据SSR标记MGW5进行选择后的两种纯合基因型个体的平均谷粒宽度。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。
(一)粒宽新基因的单标记法定位
1.供试材料
利用引自日本的粳稻推广品种农垦58与来自农垦58经空间诱变处理筛选出来的遗传稳定的大粒突变体构建杂交组合，收获杂种一代自交种子形成281个体的F2代分离群体。
2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。选取双亲间有多态的46个SSR标记，合成引物。以各个单株的基因组DNA为模板进行聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，溴化乙啶染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代单株的带型进行判别记录。
3.单标记分析
根据后代单株的扩增条带所表示的基因型，将其对应的籽粒的粒宽、粒厚和千粒重考查的结果作为表型值，输入由中国农业科学院作物科学研究所王建康课题组所发展的完备区间作图软件(ICIMappingV3.0，免费软件)，进行表型与标记的单向方差分析，定位到影响粒宽、粒厚和千粒重的QTL区间及相关标记。
筛选效应较大的主效基因位点。我们共获得了2影响粒宽的主效QTL，4个影响粒厚和千粒重的主效QTL，其中在第5染色体18,000,000-20,000,000bp区间定位到1个同时影响粒宽、粒厚和粒重的qGS5dl位点，该位点来自大粒突变体的等位基因增加粒宽0.08cm、粒厚0.05cm和千粒重1.84g，分别解释F2群体中粒宽、粒厚和粒重变异的10.0％、6.2％和4.2％。该基因的作用以加性效应为主，该位点与MGW5的距离仅为2.0cM，与前人定位到影响粒宽的GS5、GWS/qSW5均不等位，是一个同时影响粒宽、粒厚和粒重的新的主效基因。
表1利用农垦58/大粒突变体F2群体检测到影响粒形(粒宽、粒厚和粒重)的主效QTL
注：a表示农垦58等位基因被大粒突变体等位基因替代后的加性效应，h为显性效应，d为显性度，R2(％)表示QTL解释群体中该性状变异的百分比。
(二)F3群体qGS5dl及标记验证分析
1.供试材料
从农垦58/大粒突变体F2群体中，选择与qGS5dl紧密连锁的MGW5基因型杂合的个体收获自交种子，发展成F3群体，该群体计224株，用于qGS5dl及连锁标记的验证。
2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。以各个单株的基因组DNA为模板对MGW5标记进行聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，溴化乙啶染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代单株的带型进行判别记录。
3.t测验分析
根据后代单株的MGW5标记扩增条带所表示的基因型，将F3群体中的个体分成两组，一组是带有农垦58纯合基因型的个体，共计54株，记作NN基因型组；另一组是带有大粒突变体纯合基因型的个体，共计48株，记作DD基因型组。将两组个体考察所得的粒宽、粒厚和千粒重均值进行t测验(表2)，结果表明两组个体间的粒宽、粒厚和千粒重均达到0.001水平的极显著差异，表明MGW5标记附近确实存在一个影响粒宽、粒厚和千粒重的主效基因qGS5dl，而且与MGW5标记紧密连锁。
表2农垦58/大粒突变体F3群体在MGW5标记位点双亲纯合个体粒宽、粒厚和粒重的表现
性状 NN基因型组均值 DD基因型组均值 DD-NN
GW(mm) 3.1 3.3 0.2***
GT(mm) 2.2 2.3 0.1***
TGW(g) 26.1 30.2 4.1***
注：NN-农垦58纯合基因型；DD-大粒突变体纯合基因型
上述实施不以任何形式限定本发明。

Claims (2)

1.一种分子标记方法，其特征在于：用一对特异的PCR引物对MGW5，其中正向引物序列为：CATGCAACAACGTCACCTTC，反向引物序列为：ATGGTTGGTAGGCACCAAAG，共同PCR扩增带有品种“大粒突变体”血缘的育种材料基因组DNA。
2.权利要求1所述的分子标记方法在水稻育种中的应用。
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