CN104830968A - 一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记，分为上游分子标记Ind1529和下游分子标记Ind1561，其中分子标记Ind1529和Ind1561分别针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性插入/缺失位点多态，还公开了用于扩增分子标记特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。本发明的分子标记或特异引物可应用于含qPNL-12基因的后代及其衍生材料穗颈长度性状的标记辅助选择育种中，节约了成本，提高了育种和选择效率。

Description

一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记

技术领域

本发明属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域，涉及一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记，尤其涉及与qPNL-12基因紧密连锁分子标记的核苷酸序列及用于扩增分子标记的正、反向特异引物。

背景技术

穗颈长度又称为穗抽出度，指剑叶叶鞘到穗基部的距离，它作为连接茎秆和穗的一个重要农艺性状，在营养物质和水分从茎秆和叶片到穗部的运输过程中发挥着极其关键的作用。目前生产上所用的大多数水稻不育系具有不同程度的包穗特征(由穗抽出度过短导致)，大大影响了杂交稻制种产量的提高。二十世纪八十年代，水稻长穗颈基因eui的发现被认为是三系杂交水稻种子生产中继不育系、保持系和恢复系后的第四要素。导入eui基因的不育系从遗传水平上缓解了其包穗现象，提高了其对外源GA3的敏感性(Rutger J N,et al.,Crop Sci,1981,21:373-376)。然而，单基因的使用并不能完全解除不育系的包穗问题(梁康迳等,福建农学院学报,1992,21:380-385；何祖华等,中国水稻科学,1991,5:1-6)。杨仁崔等(中国工程科学，2005，7(8):26-30)利用携带eui1基因的协青早eA不育系育成的杂交稻在生产上却出现生长过快、植株偏高和叶面积较大等不良性状。因此，挖掘更多有用的穗颈长度基因对更好地改良杂交稻不育系或恢复系的穗颈长度具有重要意义，也可为研究穗颈伸长的遗传机制奠定基础。

迄今为止，有多个穗颈长度相关基因已经被克隆或精细定位。EUI1和EUI2为两个已克隆的控制水稻穗颈伸长的基因，EUI1基因编码一个细胞色素P450单加氧酶(Luo A,et al.,Plant Cell Physiol,2006,47:181-191；Zhu Y Y,et al.,Plant Cell,2006,18:442-456)，位于水稻第5染色体上。EUI2基因编码一个环氧化物酶的同源蛋白，位于水稻第10染色体上(朱宏波,福建农林大学博士论文，2003；黄伟素，浙江大学硕士论文，2006)。EUI1和EUI2基因在水稻内源赤霉素合成途径中起负调控功能，功能缺失后会造成赤霉素在最上节间大量积累，从而使水稻穗颈极具伸长。目前仅有1个短穗颈或包穗基因SUI1被克隆。SUI1位于水稻第1染色体上，编码一个磷脂酰丝氨酸合成酶，通过调节倒一节的细胞长度来调控水稻穗颈长度(Zhu L,etal.,Plant Mol Biol,2011,77:475-487)，该基因突变后导致包穗特征，并引起突变体的谷粒产量明显下降。已经精细定位或初步定位的短穗颈基因的研究则相对较多，ESP2、SHP6、SUI4分别被精细定位于水稻第1、2和7染色体上(朱克明,扬州大学硕士论文,2006；官华忠等,科学通报,2011,56:741-745；Ji H,et al.,Plant Biotechnol Rep,2014,8:125-134)，SHP1，SHP3，SHP4和SHP5分别被初定位于水稻第1，5，3和4染色体上(刘庄等,中国农学通报,2006,22(12):409-412；王伟平等,中国农学通报,2008,24(6):212-216)。基于以上表述，尚未有关于水稻穗颈长度相关基因定位于第12条染色体上的报道。

申请工作人员前期以籼稻品种9311为受体亲本、粳稻品种日本晴为供体亲本经过杂交、多代回交和自交，构建了一套高代回交置换系群体，并建立了高密度物理图谱(赵春芳等，植物学报,2012,47:594-601)，为农艺性状的QTL定位奠定了基础。随后，申请工作人员对置换系群体中穗颈长度性状进行调查，鉴定出一个极短穗颈表型的置换系C115，与受体亲本9311的穗颈长度具有极显著差异(P<0.01)。以C115和9311为亲本，构建了F2分离群体，利用遗传分析和基因连锁分析，初步定位了C115短穗颈表型的控制基因，将其定位于水稻第12染色体的两个SSR标记RM7102和RM277之间，两标记间的物理距离为5.10Mb，命名为qPNL-12(赵春芳等,植物学报,2015)。经与已克隆的穗颈长度相关基因比较，该基因为一个新的穗颈长度基因。在此基础上，本发明进一步寻找更加逼近目标基因qPNL-12的分子标记，实现对qPNL-12基因的精细定位，筛选到了比通用SSR标记更紧密连锁甚至共分离的分子标记。这些紧密连锁标记将为qPNL-12基因的克隆奠定基础，同时为水稻育种中穗颈长度的标记辅助选择提供更有效的分子标记。

发明内容

本发明针对目前杂交稻生产上利用的穗颈长度基因过于单一，而且EUI基因的使用还带来了不利效应，因此本发明提供了一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明以水稻为物种，通过对qPNL-12初定位区间内籼粳稻的基因组序列差异性比较，在碱基插入/缺失处设计InDel分子标记，确定了Ind1529和Ind1561是与qPNL-12基因连锁最紧密的两个分子标记，并克隆测序了这两个标记的核甘酸序列，其中分子标记Ind1529的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；分子标记Ind1561的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

基于上述发现，本发明提供了一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记，分为上游分子标记Ind1529和下游分子标记Ind1561，其中分子标记Ind1529和Ind1561分别基于核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性插入/缺失位点多态。

所述的水稻穗颈长度基因qPNL-12分子标记的引物组合物，用于扩增分子标记Ind1529的特异性正反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，用于扩增分子标记Ind1561的特异性正反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明分子标记的核苷酸序列还包括在SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的衍生序列。

本发明还提供了所述的分子标记的引物组合物用于水稻穗颈长度新基因qPNL-12的精细定位或克隆的应用，还用于含qPNL-12基因的水稻材料穗颈长度性状的标记辅助选择育种的应用。

本发明的有益效果为：

1)本发明方法中的分子标记进一步定位了水稻穗颈长度新基因qPNL-12。标记的特异性强、稳定性高，并且标记的使用方法简便快捷，不涉及DNA测序、限制性内切酶等的使用，不存在费时费力、价格昂贵等弊端。

2)本发明方法中的分子标记均为扩增短片段的PCR标记，具有试验试剂用量少、速度快、成本低、高通量等优点，并且对DNA模板质量和检测设备要求不高，非常适合现代农业中的分子育种趋势。

3)本发明方法中的分子标记是共显性标记，可以实现分离群体中短穗颈单株、长穗颈单株以及杂合单株的同时鉴定。

4)本发明方法中的分子标记可以为水稻穗颈长度新基因qPNL-12的克隆以及通过基因工程技术改良水稻穗颈长度性状提供重要的分子遗传学信息。

5)本发明方法中的分子标记可以有效地用于qPNL-12基因的标记辅助选择，可以对含该基因的后代及其衍生品种(系)在早代苗期进行筛选，节约了成本，提高了育种和选择效率。

附图说明

图1是本发明实施例中亲本9311和置换系C115的穗颈及其它农艺性状的比较；a：9311和C115的植株及穗颈表型；b-g：9311和C115的穗颈长度及株高、穗长、穗数、每穗粒数、结实率等农艺性状的比较；h：9311和C115中每茎节占株高的相对长度；

图2是本发明实施例中5个分子标记在亲本9311、C115及F2植株中的PCR扩增效果；1:长穗颈亲本9311；2:短穗颈亲本C115；3:F1；4-15:部分F2植株；

图3是本发明实施例中5个分子标记在水稻12号染色体上的相对位置及qPNL-12基因的精细定位区域；

图4是本发明实施例中与qPNL-12基因紧密连锁分子标记Ind1529和Ind1561在F3植株中的检测及穗颈长度预测；1:长穗颈亲本9311；2:短穗颈亲本C115；3:F1；4-33:F3植株；黑色下箭头表示两标记的扩增谱带均为9311带型，该单株被预测为长穗颈表型，白色上箭头表示两标记的扩增谱带均为C115带型，该单株被预测为短穗颈表型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1与水稻穗颈长度新基因qPNL-12紧密连锁分子标记的开发

1)置换系C115表型及其分离群体构建

利用以籼稻品种9311为受体亲本、粳稻品种日本晴为供体亲本构建的一套含119个株系的高代回交置换系为材料，通过穗颈长度性状调查，检测到一个极短穗颈表型的置换系C115，与9311的穗颈长度具有极显著差异(图1a，b)，另外C115与9311的株高也存在显著差异(图1c)，其他农艺性状如穗长、穗数、每穗粒数及结实率差异不显著(图1d-g)，C115的倒I茎节与株高的相对长度有极显著差异，其余各茎节则无明显差异(图1h)，说明C115穗颈的缩短是由倒1茎节变短所致，并导致了株高的降低。将C115与9311杂交获得F1，F1经自交得到F2分离群体；F3群体是利用单粒传法，将F2植株成熟种子再种植而获得的。

2)水稻穗颈长度基因qPNL-12的初步定位

本研究室前期研究中对置换系C115中穗颈长度性状在F2群体中的分离比例进行了遗传分析，符合单基因遗传规律；根据连锁分析结果，将控制C115中极短穗颈表型的新基因qPNL-12进行了初步定位，qPNL-12被定位于第12染色体上的RM7102(物理位置：13.36Mb)和RM277(物理位置：18.46Mb)之间约5.10Mb的物理区域(赵春芳等，植物学报，2015)。经比较，该位点未有关于穗颈长度相关基因的报道，说明qPNL-12为一个控制水稻穗颈长度的新基因。

3)分子标记的开发

根据上述两标记之间的基因组序列信息设计碱基插入/缺失(InDel)标记，对穗颈长度新基因qPNL-12进行精细定位。InDel标记具体的设计方法为：根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查出当前置换片段的物理位置，下载目标区域内的日本晴基因组序列，分别从序列两端间断性选取约2kb的序列，利用NCBI的BLAST分析功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，与网站含有的9311序列进行比对，找到两者序列中有插入/缺失差异的位点，然后在该位点两端利用Primer premier5.0软件设计InDel引物对。为了更好地获得电泳效果，要求引物对所扩增的片段长度为90bp～250bp。正向、反向引物序列由上海英俊生物公司合成。在qPNL-12基因的初步定位区间，共开发22个InDel标记，设计了对应的特性引物(表1)。

表1 用于qPNL-12基因紧密连锁的分子标记筛选的22对InDel引物序列

实施例2与水稻穗颈长度新基因qPNL-12紧密连锁分子标记的多态性检测及连锁分析

1)基因组DNA提取

在水稻分蘖盛期对待提取DNA的水稻材料进行叶片取样。分别提取亲本9311、C115和30株F2单株的基因组DNA，用于22个InDel标记的多态性筛选；提取F2群体中短穗颈表型单株306株，用于多态标记的连锁分析和qPNL-12基因的精细定位；提取100株F3单株，用于后续分子标记的效应验证。

水稻叶片基因组DNA的提取采用SDS法，操作步骤参照Dellaporta S L,et al.,Plant Mol Biol Rep,1983,1(1):19221。

具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5mL离心管；加入600uL提取液(20％SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5M NaCl，65℃预热)，摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；加入1/4体积5M KAC,摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异戊醇(24:1)300～400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；8000～10000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400uL左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；8000rpm离心15分钟，转移上清(400uL左右)至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70％乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200uLTE，-20℃保存。

2)分子标记的PCR扩增及多态性检测

以亲本9311和日本晴植株的基因组DNA为模板，以22个InDel标记的正、反向引物分别组合成22对引物对，进行PCR扩增。

20μL PCR反应体系包括：20ng/μL的DNA 2.0μL，4nmol/L的正向引物F、反向引物R各0.5μL，含25mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，2U/μL的Taq 0.5μL和ddH₂O 14.6μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；然后94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，循环33次；然后72℃后延伸10min，16℃保存，最后加入上样缓冲液终止反应。扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(非变性)上检测，每孔点样2μL，180V恒压电泳1.5h。电泳后银染法显示电泳图谱。

检测结果表明，22对引物中有18对引物能扩增出条带，但只有5个分子标记Ind1499、Ind1529、Ind1561、Ind1594和Ind1714对应的引物对，能扩增出明显的多态性。以30株F2植株为模板，对这5对引物对的多态性进一步扩增检测，均检测到良好多态性，图2为5个分子标记在两亲本及部分F2植株中的扩增结果。

3)5个多态分子标记的连锁性分析及qPNL-12的精细定位

利用上述表现多态性的5个分子标记对应的特异引物，对306株短穗颈表型的F2植株进行PCR扩增，结果显示5个标记与qPNL-12基因存在不同程度的连锁关系。具体统计结果为：利用Ind1499引物进行扩增，在306个单株中，只有2号、11号、160号、289号和295号5个单株发生了交换；利用Ind1529引物进行扩增，则只有11号和289号2个单株发生了交换；利用Ind1561引物进行扩增，有1号、4号和117号3个单株发生了交换；利用Ind1594引物进行扩增，1号、4号、58号、117号和295号5个单株发生了交换；利用Ind1714引物，有1号、4号、58号、84号、117号和295号6个单株发生了交换。根据交换株的数目和类型，将目标基因qPNL-12精细定位在分子标记Ind1529和Ind1561之间约0.32Mb的区域(图3)，其中分子标记Ind1529和Ind1561与qPNL-12基因为最紧密连锁关系。

实施例3分子标记Ind1529和Ind1561的克隆测序

以亲本9311和C115基因组DNA为模板，分别以分子标记Ind1529和Ind1561的正、反向引物作为Ind1529-F/Ind1529-R和Ind1561-F/Ind1561-R引物对，用高保真酶进行PCR扩增。各取1μL PCR产物与pMD19-T载体室温连接10分钟，热击转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化菌在100ml的LB液体培养基低俗振荡培养1h后，涂布在含100μg/ml氨苄霉素的LB固体平板上，于37℃倒置培养14h。菌落PCR检测后，挑选阳性克隆送上海英俊生物公司进行DNA序列的测定。

测序结果表明，引物Ind1529-F/Ind1529-R在C115中的扩增谱带长度为172bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。引物对Ind1529-F/Ind1529-R在9311中的扩增谱带长度为178bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.47。

引物Ind1561-F/Ind1561-R在C115中的扩增谱带长度为146bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；

引物Ind1561-F/Ind1561-R在9311中的扩增谱带长度为151bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.48。

与NCBI数据库提交的粳稻基因组序列相比，两标记在C115中的扩增片段长度及核苷酸序列，均与网站预测一致；而在9311中的扩增片段长度及核苷酸序列，均与网站的预测不一致，网站预测Ind1529和Ind1561在籼稻品种中的扩增片段长度分别为168bp和141bp，而实际测序得到的扩增片段长度分别为178bp和151bp。

实施4紧密连锁分子标记Ind1529和Ind1561在F3群体中的应用

利用上述两个标记Ind1529和Ind1561，在9311和C115杂交后代F3群体的部分植株中进行了穗颈长度预测。提取F3植株苗期叶片中的基因组DNA，利用两标记的特异引物Ind1529-F/Ind1529-R和Ind1561-F/Ind1561-R，分别对这些DNA进行PCR扩增和电泳检测，根据电泳谱带长度及亲本来源推断短穗颈单株和长穗颈单株。具体推断依据是：将两标记的扩增谱带均与短穗颈亲本C115一致的单株预测为短穗颈；将两标记的扩增谱带均与长穗颈亲本9311一致的单株预测为长穗颈，如果一个标记的扩增谱带与C115一致，另一个标记的扩增谱带与9311一致，该单株则不做穗颈长度的预测；如果两标记中任一个标记出现杂合带型，该单株也不做穗颈长度的评估。图4为两个引物对在F3群体的部分植株中的扩增结果及穗颈长度的预测。随后在植株的抽穗后期进行穗颈长度的实际测量，并与预测结果进行比对，预测结果与实测结果达到了100％的吻合率。从而说明了与qPNL-12基因紧密连锁分子标记Ind1529和Ind1561，亦可用于穗颈长度性状的标记辅助选择育种过程中，可以节约成本，提高育种和选择效率。

Claims (5)

1.一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记，其特征在于：包括上游分子标记Ind1529和下游分子标记Ind1561，所述的分子标记Ind1529和Ind1561分别基于核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的特异性插入/缺失位点多态。

2.根据权利要求1所述的一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记，其特征在于：所述的水稻穗颈长度基因qPNL-12分子标记的引物组合物，用于扩增分子标记Ind1529的特异性正反向引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，用于扩增分子标记Ind1561的特异性正反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述的一种水稻穗颈长度基因qPNL-12的分子标记，其特征在于：所述分子标记核苷酸序列还包括在SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的衍生序列。

4.根据权利要求2所述的引物组合物用于水稻穗颈长度新基因qPNL-12的精细定位和克隆的应用。

5.根据权利要求2所述的引物组合物用于含qPNL-12基因的水稻材料穗颈长度性状的标记辅助选择育种的应用。