CN111363751A

CN111363751A - 水稻粒宽和粒重基因gw5．1的克隆与应用

Info

Publication number: CN111363751A
Application number: CN202010244075.XA
Authority: CN
Inventors: 李一博; 樊亚伟
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: CN111363751B

Abstract

本发明属于植物功能基因组和基因工程技术领域，具体涉及水稻粒宽和粒重基因GW5.1的克隆与应用，本发明所述的GW5.1的基因登录号为NCBI accession：LOC4338398，该基因是一个对粒宽和粒重具有很大负调控效应的基因，其功能缺失的等位基因可以增加水稻谷粒粒宽和粒重，为水稻产量和品质的遗传改良提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供新的线索。

Description

水稻粒宽和粒重基因GW5．1的克隆与应用

技术领域

本发明涉及植物功能基因组和基因工程技术领域。具体涉及到一个位于水稻第5染色体着丝粒附近控制粒宽和粒重的主效QTL基因GW5.1的克隆与应用。

背景技术

水稻是全球主要粮食作物，对其产量和品质的遗传改良，具有重要意义。(1)粒形由粒长、粒宽和粒厚构成，通过决定千粒重而影响水稻的谷粒产量。适当增加种子大小，是实现稻米增产和稳产的一条重要途径。(2)粒形是稻米外观品质的一个重要性状，不同的消费者对细长型和短圆型的大米有迥异的偏好性；同时，粒形可影响糙米率和整精米率等加工碾磨品质。(3)粒形是水稻驯化的重要靶标性状，粒形基因的鉴定和克隆可以为禾本科的进化研究提供线索(Tan等，2000，Theor.Appl.Genet.101:823-829；Huang等，2013，TrendsPlant Sci 18:28-226；Shomura等，2008，Nat Genet 40:1023–1028)。

粒形性状属于典型的数量性状，对其控制基因的克隆存在相当的难度。一般的常规策略是，利用分子标记技术对初级作图遗传群体中控制粒形的QTL(Quantitative TraitLoci)进行初步定位和遗传效应分析，进而通过构建高级作图群体(如染色体片段代换系、近等基因系等)，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子来进行精细定位和克隆(方宣钧等，2000)。借助这种策略，分子遗传学家们已经克隆了一系列水稻粒形QTL基因(Fan andLi,2019， Mol.Breeding 39:163–187；Li等，2019，Annu Rev Plant Biol 70:435–463；Zuoand Li,2014, Annu Rev Genet 48:99–118)，这些基因编码的蛋白主要涉及到：(1)植物生长发育相关的信号物质的生物合成、稳态调节和信号转导：G蛋白信号途径、激素(BR、IAA和CK)途径，多肽信号途径和MAPK信号途径。(2)蛋白水平的调控，主要是蛋白的泛素化修饰介导的蛋白降解途径和蛋白磷酸化修饰介导的相关信号分子的激活/失活。(3)转录水平的调控：包括转录因子的调控和表观调控(miRNA降解靶基因mRNA、DNA修饰和组蛋白修饰)。然而，这些已克隆的粒形基因对揭示粒形遗传和生化调控机制来说，仍然是零散化和碎片化的。因此，迫切需要克隆更多的粒形基因，以全面解析粒形形成的分子机制。在此背景下，QTL-Seq和QTG-seq等QTL基因克隆方法被开发出来(Takagi等，2013,Plant J.74:174–183；Zhang等，2019，Mol.Plant 12:426–437)，但仍不能满足快速和大批量鉴定克隆QTL基因的需要。

申请人开发了RapMap技术，集成了BSA(Bulked Segregant Analysis)和芯片技术/ 二代测序技术的优点，并引入共分离标准的图位克隆新方法，大大加快了QTL基因克隆的效率，为快速大批量克隆自然变异调控基因提供了可能。

本发明利用RapMap的方法分离克隆一个控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因GW5.1，为水稻产量和品质的遗传改良提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供新的线索。

发明内容

本发明的目的在于提供了水稻GW5.1基因及其等位基因在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用；所述的GW5.1基因的NCBI accession为LOC4338398。

本发明的另一个目的在于提供了SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或是编码SEQ IDNO.3 所示序列的核苷酸序列在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了一段分离自Iksan438的基因序列，所述序列为SEQ I D NO.1所示，其CDS序列为SEQ ID NO.2所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明以宽粒品种ZS97和窄粒品种Iksan438为双亲得到F₂随机小群体(图1)，将极端表型单株按BSA方法混合建池后，进行RICE6K育种芯片分析，最终发现了一个新的QTL，命名为GW5.1。根据当代的重组单株以及筛选后代大群体得到的重组单株及其后代测验结果，我们将GW5.1精细定位在28kb的染色体区段。根据RAP-DB数据库网站注释，该区段有两个候选基因ORF1和ORF2。其中ORF2基因在幼穗时期几乎不表达，而珍汕97 的ORF1基因与Iksan438相比，在第2外显子上有一个11.8kb反转录转座子插入，导致基因功能缺失。因此，我们将ORF1初步确定为GW5.1候选基因，通过进一步的敲除和过表达实验，最终确定，该基因是一个负调控水稻粒宽的主效基因。在水稻Iksan438中该基因的序列为SEQ ID NO.1所示，CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码蛋白质序列为SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或是编码SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用，包括利用本领域的常规方式，将窄粒水稻中的该基因敲除，可获得粒宽更宽的水稻；或是在宽粒水稻中超表达该基因，可获得粒宽更窄的水稻。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明在水稻中克隆了一个对粒宽和粒重具有很大负调控效应的基因GW5.1，其功能缺失的等位基因可以增加水稻谷粒粒宽和粒重，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源，也为作物的进化研究提供线索。

附图说明

图1为GW5.1基因克隆的技术路线示意图。

图2.本发明克隆的GW5.1的比较测序示意图和11.8kb反转录转座子插入在DNA和mRNA水平的验证。

图3.是本发明CRISPR敲除转基因和互补转基因粒宽表型分析示意图；

其中：ZH11为中花11；CR4-4，CR4-8和CR9-3为中花11敲除了GW5.1基因的阳性株；AA是珍汕97背景的近等基因系；Com.是complementation代表互补转基因阳性单株。

图4是本发明在阳性敲除转基因单株中，有三株独立阳性单株不同类型的纯合移码突变体的核苷酸序列。

图5本发明中的部分CRISPR敲除T₀代转基因阳性、阴性单株的粒宽表型图；

其中，CR(+)表示CRISPR敲除T₀代转基因阳性株，CR(-)表示CRISPR敲除T₀代转基因阴性株。

图6本发明中的GW5.1近等基因系的粒宽和千粒重统计。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：GW5.1的初定位

1.GW5.1定位遗传群体构建及两个极端粒宽表型混池的芯片检测

初定位流程如附图1所示，用珍汕97与Iksan438杂交，得到F₁，再自交产生F₂随机群体。对F₂群体各个单株粒宽表型进行考察，每个单株选取有代表性的饱满的10粒种子，按照同样的方向肩并肩依次排列，不重叠且不留缝隙的紧靠在一起，用游标卡尺读取十粒宽数据，进行3次重复后取其平均值。根据得到的粒宽表型频数分布图，构建极端高低混池，极端池里每株随机选择10粒饱满的种子代表该F₂单株的基因型。高低池分别混合发芽，两周后取等量叶片用液氮研磨，送中国种子集团(武汉)进行Rice6K芯片检测。

2.分子标记的开发

使用RiceVarMap数据库(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)寻找在目标物理位置附近的InDel 多态性变异的“variation ID”，并根据“variation ID”在“Search forGenotype With Variation ID”中查询该检测该Indel在双亲中的基因型。将在双亲中基因型有差异的Indel的“variation ID”通过“Design Primer by Variation ID”功能设计InDel引物。设计上优先选择InDel差异3-8bp 缺失的、PCR片段大约有100-200bp。然后用4％PAGE胶电泳验证设计好的分子标记在双亲珍汕97与Iksan438之间是否存在多态性。PCR产物在4％的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等,1991,Anal.Biochem.196:80-83)。双亲中显示出条带差异的引物可以用来进一步检测群体单株的分子标记基因型。

3.分子标记基因型的鉴定

以群体单株的DNA为PCR扩增模板，同时用双亲DNA模板为对照，PCR反应体系和程序以及4％的聚丙烯酰胺胶检测依照上述分子标记的开发中采用的方法进行。检测单株分子标记的的带型:若与亲本珍汕97的带型相同,则记为A；若与亲本Iksan438的带型相同则记为B；若同时显示两种亲本的带型，则记为H。

实施例2：GW5.1的精细定位及候选基因确定

1.重组单株筛选及后代测验

选择目标区段杂合的F₂单株的种子发展成包含7872株的F_2:3大群体，用初定位最小区间两侧的InDel标记InD1和InD6筛选重组单株，两端标记基因型不同的单株即为重组单株。共得到得到32株重组单株。将每个重组单株的后代种植36株，考察36株粒宽表型确定该重组单株目标基因的基因型：若后代粒宽表型不分离且都表现为高值，则该重组单株的GW5.1的两个等位基因均来自珍汕97；若后代粒宽表型不分离且都表现为低值，则该重组单株的GW5.1的两个等位基因均来自Iksan438；若后代粒宽表型出现明显分离，则该重组单株的GW5.1的两个等位基因为杂合。

2.GW5.1精细定位和候选基因确定

利用在初定位区间内部发展的8个InDel标记分析这32个重组单株，根据标记基因型和重组单株后代测验结果，我们将GW5.1精细定位在28kb的染色体区段。。根据RAP-DB 数据库网站注释，该区段有两个候选基因ORF1和ORF2。其中ORF2基因在已公开的珍汕 97和日本晴的表达数据库(http://crep.ncpgr.cn/；http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)在幼穗时期均几乎不表达，而珍汕97的ORF1基因与Iksan438相比，在第2外显子上有一个11.8kb反转录转座子插入，导致基因功能缺失(图2)。因此本发明将ORF1确定为GW5.1候选基因。该基因在Iksan438中的序列为SEQ ID NO.1所示，CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

对珍汕97和Iksan438进行比较测序发现，除11.8kb反转录转座子变异外，起始密码子上游3.5kb和编码区存在14处多态性变异，这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型。此外，近等基因系比较中，NIL(gw5.1)比NIL(GW5.1)粒宽增加14.9％，千粒重增加12.9％(图6)。根据上述结果，GW5.1是一个负调控水稻谷粒粒宽的主效基因。

实施例3：

水稻GW5.1基因在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用：

(1)GW5.1敲除载体的构建：

利用重叠PCR的方法将GW5.1靶点序列引入到U6启动子中，以携带U6启动子的质粒(U6 promoter-sgRNA with a gene-specific target sequence cloned in pER8-CAS9,He,Y.等， 2017，J.Genet.Genomics 44:469–472)为模板，分别以GW5.1CR-F/U6R和GW5.1CR-R/U6F 为引物进行常规PCR扩增，并将两者扩增产物纯化混收后等比例混合作为模板，再以 U6F/U6R引物扩增,对得到的PCR产物进行纯化回收。将其与KpnI线性化后的pCXUN-CAS9 载体连接，通过Gibson一步连接法(Gibson,D.等，2009,Nat.Methods 6:343–345；He,Y. 等，2017，J.Genet.Genomics 44:469–472)连接，终载测序无误后，即成功构建GW5.1的 CRISPR/Cas9载体，即敲除载体质粒。

(2)GW5.1互补载体的构建：

从Iksan438基因组DNA中利用GW5.1-EcoRI-F/GW5.1-KpnI-R引物将包含GW5.1整个编码区及上游3.5kb总共6kb片段克隆出来，利用Gibson一步连接法，连接到经KpnI 和EcoRI线性化后的pCAMBIA 1301，测序正确后，即成功构建GW5.1互补载体(Gibson, D.等，2009,Nat.Methods 6:343–345)。

(3)采用农杆菌介导的转基因方法，将得到的正确克隆的敲除载体质粒，通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到GW5.1有功能水稻品种中花11(GW5.1基因型与Iksan438一样，均为有功能的等位基因)；

同时，将得到的测序正确克隆的GW5.1互补载体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻目标区段片段都来自珍汕97的GW5.1无功能的AA愈伤中。经过诱导、继代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因的水稻小植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6:271-282)基础上进行优化。

(4)本发明获得转基因敲除T₀代独立29株，经过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳和一代测序检测，确认其中22株为阳性，7株为阴性。敲除转基因T₀代粒宽表型统计如图5，阳性敲除植株的粒宽明显高于阴性植株。其中，在阳性敲除转基因单株中，有三株独立阳性单株为三种不同类型的纯合移码突变体(图4)，其粒宽表型均比对照显著变宽(图3)(P<0.01)，表明GW5.1是一个负调控水稻谷粒粒宽的基因。

在GW5.1互补的实验中，由于转化受体为籼稻背景，只得到了一棵阳性单株，且该互补转基因阳性植株粒宽比对照变窄(图3)，这与敲除转基因结果一致，都证明了GW5.1负调控水稻谷粒粒宽。同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来改良水稻品种。

本发明所用到的引物如下：

表1用于本发明图位克隆和基因功能分析的引物/分子标记

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 水稻粒宽和粒重基因GW5.1的克隆与应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6268

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacgaatttc ggattaagcg acaaattgag agactcagta aacttattcc taataatcta 60

accgattttg cggttcagag acaccgataa aactcgatca tggacttttc cttagcagcc 120

cacagctccc acacggccac accagctggg tccgaaacat aggcccaaca aggagcaaca 180

accctgttct agcccaccac tcgacgccga cggccgacac cgctgacacg ctgtccgcgg 240

tccgcggtcc gccgacgctt gcctcccgca gccgccgccc gtcggccctc ccccctcccc 300

tcgctggcac ggcggctcgg cggtcgccga gcactgaccc gatgctgcga cctagccatc 360

ggaggaagag atccttagcc gatgccgtga agaagctggt gaagcaagag gaggagtgga 420

gctggggaga aaaggtcaac ttcgtggggg taaggatcag aatatcatat ccaccacttt 480

ctttttacag gcgtatttaa ctgtacatga tctttggtta ggtaagacaa acaacacaat 540

tagtcaaagt ttttagtatg aagcattgaa gttccctaat tcttccaata aaatgcaatc 600

ggacttgcaa tattaacttg aactgcacag tttacctgtt ttggagaagt atacaatttc 660

ttggccctgc ccttttcaga tgttttccag aaaaaaaaaa caatgccttg gccctggatg 720

accgtccaaa agaatactca atactgtatt caacaaaata caaaacacaa aaaataaaaa 780

ttggaccgat ttggaacccg agaaaagttt tctgatgttg atctgtgggg actcaggtac 840

aatttcttat gtcctggaaa attactatag aactcctaac ttccgaatag gagatatttt 900

ctaatgttca tgataacaac atttgtcaat actctatatt tccaggagta caaaatggtg 960

ggctcgatgt ctttctctat taatgtgttt cagtgtacag acgggtccac tagaagtctc 1020

agtctcctta gcaccacagg gaaatgatta ttaaagatca tatactttgt ttaaatttat 1080

tttgacctga tgagacgact ttgactactg gctgaagcca gctacctgtt ggaaaattga 1140

ttggctggtg gccatagaag gagaacgaaa atatgggttg gtggagttct catatggctc 1200

agacatggtc tcatggtgtg gagagaagca tgagaaagga gagagtagat cagcaatacg 1260

ttgtttctat tcattgatat cttgacatct tgtttctatt cagtgatcat aaccagtcca 1320

atccagttta tgcagttttc tccccttcgc gatggagttt tcatgcatct ggagtgatct 1380

tatcaggtaa gttctttcca cgttgtctca tcattttgtt ctccaggttt cctgtaatca 1440

tatttgatat aaggtagtgc taaccttctc tccagatcat ggcttcattt ttagaaataa 1500

gctctgccct ttatttgata tcttcttttc ctgcttcgta gagttgtttg tgatcttaca 1560

gttttacagg cttcaaaacc cagctatttt ggcttcaatt ttttcccatt acagttattt 1620

aattaattta tgatctacct tatgttgctt ttgtatgttt tcctcttgaa gttaaattag 1680

gggatgttcg gcacctagat ttgctttaaa ccaattcgac tttaattcag aattccaatt 1740

agagtaaatt taataaaacc ccatgtttta ttaccaaagt taaaaaaatg cgttattgta 1800

gcatgtactt tgatgctaaa gtttcacaaa atctcaaccc tatttaaatt ccagacaatg 1860

tagcatgtat ttacttaatt tttgccatta taaaatgtct atagaatttg aattacgaat 1920

ttcttggtta aaatgtttca ttatattgaa cccttcatta ctctgaacaa tattgtttta 1980

aatatttaaa atttgctaag agttgaataa gggcgggact ttatgaaaat tttaacctat 2040

atgctaccag ctataactcc cagagtttat agcaagtttg acaatgaata acctatagtt 2100

tactgtgaaa tttgttcttg tatttacttt gatatttttg aaatttgaat ggaaaaccat 2160

acaattattt tttagattta atatgaattc cttttttctt ggttgcttga catggactct 2220

ttacttttaa atttgtaatc ccaatttgaa cacagagtct tattaatgaa actgtttcga 2280

ggactggatt ggaacacaga ggagatctgc ctaaacagga ttggactggt tatgatcact 2340

gaatagaaac cagagtctta ttaatgaaac catacaattt gaacgcagat ctcctgcgtg 2400

caaaaaaagt tattgaacat aggctttttg gggtcgcggg agggggttgc tacacatagg 2460

ccattgagct caattgaggc ctgcacacaa acatttgttt tagtgcttga gctgaaagaa 2520

tgtgatggaa ctgtttcgag aaaatcacta agtggggatg aactgtaaat gttatataga 2580

atttgtagcc ttttaaacat ctaggactat attcttgaag gactctaatt aatattcttt 2640

gtacaggagt gcaaaaattg tcttttgatg acctagacat atcgttaatc tgcggcaacc 2700

acatagacaa tgttgcattt tctttcttta atcatgtgcc tgtagatgct actgtcctga 2760

taccatccaa tggcttgttc tggagtcttt gttttgttct ttcttttatt catcctatat 2820

tggtcatttt cttctcatta caaatttgtg acctttaacc tgatgatttt ttttggcaaa 2880

aaaaactcgt cacattaagt gtaatagaac aggagctcct agtagttcat gcaaatattc 2940

tattctccca tacctctctt tttgaaaatg taacgaatat ttgagcaaat agttaaatat 3000

gagatcgtga gtaatatgtg ttaaactaga agatggatca agccaaaatg ttttgccata 3060

atattcaact ctgttctctt ctgcagaatt tactagcggt ttttcatagt acttggtaca 3120

atgtatatta ttttggtgtg ttttcttcca tgatgaatta ttgatgttgc ttcaatcttc 3180

agtttgatta taatttctta agcagaaact tacaatacaa ttagctgaat ttccaaattc 3240

tttgtttctt gtgattgcag ggaagtctat agctatctgg acatgatttc tccataaaaa 3300

acagttcaat tcctcaaaca ctccaatttc cttgccccaa gtcccaccca tagaaaacat 3360

tacgcaatcg ttcccaccta tcttatagca atttgttagc cggtaatttt atagcattga 3420

tgtgaaggaa ccttcaaact tccatatttt catacaaaac aacaatcatt acctatgata 3480

cacccaagcc tactaactac catccaatgg gtcgcactgt ctaccctcat attgatcacc 3540

atagcggctg ataactactc atcatcctct agcccaatct ttctaaattg tggagcctcc 3600

accatgcaac ttgatatcaa taatcggagt tgggaggggg acactagatc caagtttgca 3660

tcagcaatga atggaattgc agctagtgct acataccaag acccttcact cccatctctt 3720

gtgccttaca tgacatcccg tatattcatt tcaaattaca cctattcctt cccaattagc 3780

ccagggcgga tattcgtgcg cctttacttc tatccagtgg cctatggcta ctatgcttct 3840

gaagatgctt actttggtgt caaaacaaac aatttgattc ttttagacaa cttcaatgct 3900

tcacaaactg ctcaggcagc aaactatgcc tacatccttc gagaattctc gctgaacgtc 3960

actttaggta gtctagacct cacctttttc ccatccacac agaatggttc ttatgcattt 4020

gtgaatggga ttgagattgt gcccacgcct gacatcttca caacacgaac acctacacat 4080

aacaccgaag ggaaccttga tccatccgat atagattcta tgaccagttt ccaaacgatg 4140

taccgtctca atgttggggg ccaggcgatc attccacaag gtgattctag gttctatcgt 4200

tcatgggagg atgactctcc atacatatat ggtgctgcct ttggggtgac cttcggcaaa 4260

gatagtaatg tcaccatcac atatccaggt actatgccaa actacactgc acctgctgat 4320

gtgtatgcaa cagcacgatc aatgggccca aattggcaga tcaacctgaa ctacaatctt 4380

acatggatct tatcggttga cgcagggttt tactacctct taaggttcca tttctgtgag 4440

atccagtatc ctataaccaa gatgaatcag aggtcattct tcatttacat caataatcag 4500

acggtgcagg atcaaatgga tgttattcgt tggagtggag gaattggcat ggcaacatat 4560

gctgactatc ttatcgtcac agttggttcc ggtcagatgg atttgtgggt tgcacttcat 4620

cctgatcttt caagtagacc acagtattat gatgcaatac taaatggcct tgaggtcttc 4680

aagctatggg acattgggaa aaaaaacctt gctgggctta accctccact tccaccacaa 4740

ccaaagactg atgtgaaccc taaaggggtg tctggtggag ggaaattaaa ggctgctgtc 4800

ccagcagcca tatgtgccgt ggttgtgctg attacagctt gtttttgtgt gtgcatcatc 4860

tgtagacgaa agaaagtggc aaagcattct ggcaagactg acaaaaagtg cttgacttat 4920

caaactgaat tatacaaatc accatcaaat ctttgtcgga acttcacctt ccatgaaatg 4980

caaatagcaa ctagtagctt tgatgaaacc cttctgcttg gtagaggtgg atttggtgat 5040

gtgtaccgtg gagagataga taatggtaca acggtggcga tcaaacggag caacccattg 5100

tccctgcagg gtgttcatga gttccagacc gagattgaga cgctgtccaa ggtcagacat 5160

ggccatcttg tgtctctaat cggatactgc caggaaaaaa atgagatgat tttggtgtat 5220

gaatacatgg cccgtggaac acttcgggag cacctgtaca gcaccaagag gccaccatta 5280

ccatggaagg agcgcctcaa gatctgcatt ggtgcagccc gagggctgta ttacctgcac 5340

acgggcccga aagaaacaat catccatcgt gacgtgaaga ctgccaacat tctactagat 5400

gacaagtggg tggcaaaggt ttcagacttt gggttgtcca aggttaatcc ggacattgac 5460

gccacccatg ttagcactgt tgtgaagggt acattcggat atttcgaccc tgagtatttt 5520

cggttgaagc aacttaccca aaggtcagat gtgttctctt ttggggttgt gttgtttgag 5580

atcctgtgcg ctcgccctcc agtaaacact gagcttccag aagagcaagt gagcttgcgt 5640

gaatgggcat tgtcttgcaa gaagataggc actcttggtg aaattataga tccctatctt 5700

cagggagaaa tcgctcctga ttgcctcaag aagtttgctg attgtgcaga acaatgtgtt 5760

gctgatcgaa gcatcgacag gccagagatg ggtgatgttc ttcggaacct agaggttgct 5820

ctgaagatgc aggagtgtgc agagaacaat agcaaattca gtgaagaaac aacatcgtcg 5880

aagacaacac cagacatgat gaccatcatg gatactgaca aacaatccac ctactcgaca 5940

atgagcatca ctggacaaag gaccatattc tctgatatga tggatccgca ggcccgatga 6000

aacacaacag ttaatgtttc aactaatttc agatccatag ttcatgtcct ggtgatcttt 6060

tgatcgcaat cactctagta tgttgaataa ttagttgttt cagatttttc atactagttc 6120

caaatctaag catagttaga cttatcaagt aaataattct gcataccatt tttaagaagt 6180

aatgctactg tttgagtggt tattttgttg cttttggata gtatagttta cccaatctat 6240

ctacatacga aggtgctgtt aatgcagt 6268

<210> 2

<211> 2526

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatacacc caagcctact aactaccatc caatgggtcg cactgtctac cctcatattg 60

atcaccatag cggctgataa ctactcatca tcctctagcc caatctttct aaattgtgga 120

gcctccacca tgcaacttga tatcaataat cggagttggg agggggacac tagatccaag 180

tttgcatcag caatgaatgg aattgcagct agtgctacat accaagaccc ttcactccca 240

tctcttgtgc cttacatgac atcccgtata ttcatttcaa attacaccta ttccttccca 300

attagcccag ggcggatatt cgtgcgcctt tacttctatc cagtggccta tggctactat 360

gcttctgaag atgcttactt tggtgtcaaa acaaacaatt tgattctttt agacaacttc 420

aatgcttcac aaactgctca ggcagcaaac tatgcctaca tccttcgaga attctcgctg 480

aacgtcactt taggtagtct agacctcacc tttttcccat ccacacagaa tggttcttat 540

gcatttgtga atgggattga gattgtgccc acgcctgaca tcttcacaac acgaacacct 600

acacataaca ccgaagggaa ccttgatcca tccgatatag attctatgac cagtttccaa 660

acgatgtacc gtctcaatgt tgggggccag gcgatcattc cacaaggtga ttctaggttc 720

tatcgttcat gggaggatga ctctccatac atatatggtg ctgcctttgg ggtgaccttc 780

ggcaaagata gtaatgtcac catcacatat ccaggtacta tgccaaacta cactgcacct 840

gctgatgtgt atgcaacagc acgatcaatg ggcccaaatt ggcagatcaa cctgaactac 900

aatcttacat ggatcttatc ggttgacgca gggttttact acctcttaag gttccatttc 960

tgtgagatcc agtatcctat aaccaagatg aatcagaggt cattcttcat ttacatcaat 1020

aatcagacgg tgcaggatca aatggatgtt attcgttgga gtggaggaat tggcatggca 1080

acatatgctg actatcttat cgtcacagtt ggttccggtc agatggattt gtgggttgca 1140

cttcatcctg atctttcaag tagaccacag tattatgatg caatactaaa tggccttgag 1200

gtcttcaagc tatgggacat tgggaaaaaa aaccttgctg ggcttaaccc tccacttcca 1260

ccacaaccaa agactgatgt gaaccctaaa ggggtgtctg gtggagggaa attaaaggct 1320

gctgtcccag cagccatatg tgccgtggtt gtgctgatta cagcttgttt ttgtgtgtgc 1380

atcatctgta gacgaaagaa agtggcaaag cattctggca agactgacaa aaagtgcttg 1440

acttatcaaa ctgaattata caaatcacca tcaaatcttt gtcggaactt caccttccat 1500

gaaatgcaaa tagcaactag tagctttgat gaaacccttc tgcttggtag aggtggattt 1560

ggtgatgtgt accgtggaga gatagataat ggtacaacgg tggcgatcaa acggagcaac 1620

ccattgtccc tgcagggtgt tcatgagttc cagaccgaga ttgagacgct gtccaaggtc 1680

agacatggcc atcttgtgtc tctaatcgga tactgccagg aaaaaaatga gatgattttg 1740

gtgtatgaat acatggcccg tggaacactt cgggagcacc tgtacagcac caagaggcca 1800

ccattaccat ggaaggagcg cctcaagatc tgcattggtg cagcccgagg gctgtattac 1860

ctgcacacgg gcccgaaaga aacaatcatc catcgtgacg tgaagactgc caacattcta 1920

ctagatgaca agtgggtggc aaaggtttca gactttgggt tgtccaaggt taatccggac 1980

attgacgcca cccatgttag cactgttgtg aagggtacat tcggatattt cgaccctgag 2040

tattttcggt tgaagcaact tacccaaagg tcagatgtgt tctcttttgg ggttgtgttg 2100

tttgagatcc tgtgcgctcg ccctccagta aacactgagc ttccagaaga gcaagtgagc 2160

ttgcgtgaat gggcattgtc ttgcaagaag ataggcactc ttggtgaaat tatagatccc 2220

tatcttcagg gagaaatcgc tcctgattgc ctcaagaagt ttgctgattg tgcagaacaa 2280

tgtgttgctg atcgaagcat cgacaggcca gagatgggtg atgttcttcg gaacctagag 2340

gttgctctga agatgcagga gtgtgcagag aacaatagca aattcagtga agaaacaaca 2400

tcgtcgaaga caacaccaga catgatgacc atcatggata ctgacaaaca atccacctac 2460

tcgacaatga gcatcactgg acaaaggacc atattctctg atatgatgga tccgcaggcc 2520

cgatga 2526

<210> 3

<211> 841

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ile His Pro Ser Leu Leu Thr Thr Ile Gln Trp Val Ala Leu Ser

1 5 10 15

Thr Leu Ile Leu Ile Thr Ile Ala Ala Asp Asn Tyr Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Pro Ile Phe Leu Asn Cys Gly Ala Ser Thr Met Gln Leu Asp Ile

35 40 45

Asn Asn Arg Ser Trp Glu Gly Asp Thr Arg Ser Lys Phe Ala Ser Ala

50 55 60

Met Asn Gly Ile Ala Ala Ser Ala Thr Tyr Gln Asp Pro Ser Leu Pro

65 70 75 80

Ser Leu Val Pro Tyr Met Thr Ser Arg Ile Phe Ile Ser Asn Tyr Thr

85 90 95

Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Pro Gly Arg Ile Phe Val Arg Leu Tyr Phe

100 105 110

Tyr Pro Val Ala Tyr Gly Tyr Tyr Ala Ser Glu Asp Ala Tyr Phe Gly

115 120 125

Val Lys Thr Asn Asn Leu Ile Leu Leu Asp Asn Phe Asn Ala Ser Gln

130 135 140

Thr Ala Gln Ala Ala Asn Tyr Ala Tyr Ile Leu Arg Glu Phe Ser Leu

145 150 155 160

Asn Val Thr Leu Gly Ser Leu Asp Leu Thr Phe Phe Pro Ser Thr Gln

165 170 175

Asn Gly Ser Tyr Ala Phe Val Asn Gly Ile Glu Ile Val Pro Thr Pro

180 185 190

Asp Ile Phe Thr Thr Arg Thr Pro Thr His Asn Thr Glu Gly Asn Leu

195 200 205

Asp Pro Ser Asp Ile Asp Ser Met Thr Ser Phe Gln Thr Met Tyr Arg

210 215 220

Leu Asn Val Gly Gly Gln Ala Ile Ile Pro Gln Gly Asp Ser Arg Phe

225 230 235 240

Tyr Arg Ser Trp Glu Asp Asp Ser Pro Tyr Ile Tyr Gly Ala Ala Phe

245 250 255

Gly Val Thr Phe Gly Lys Asp Ser Asn Val Thr Ile Thr Tyr Pro Gly

260 265 270

Thr Met Pro Asn Tyr Thr Ala Pro Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ala Arg

275 280 285

Ser Met Gly Pro Asn Trp Gln Ile Asn Leu Asn Tyr Asn Leu Thr Trp

290 295 300

Ile Leu Ser Val Asp Ala Gly Phe Tyr Tyr Leu Leu Arg Phe His Phe

305 310 315 320

Cys Glu Ile Gln Tyr Pro Ile Thr Lys Met Asn Gln Arg Ser Phe Phe

325 330 335

Ile Tyr Ile Asn Asn Gln Thr Val Gln Asp Gln Met Asp Val Ile Arg

340 345 350

Trp Ser Gly Gly Ile Gly Met Ala Thr Tyr Ala Asp Tyr Leu Ile Val

355 360 365

Thr Val Gly Ser Gly Gln Met Asp Leu Trp Val Ala Leu His Pro Asp

370 375 380

Leu Ser Ser Arg Pro Gln Tyr Tyr Asp Ala Ile Leu Asn Gly Leu Glu

385 390 395 400

Val Phe Lys Leu Trp Asp Ile Gly Lys Lys Asn Leu Ala Gly Leu Asn

405 410 415

Pro Pro Leu Pro Pro Gln Pro Lys Thr Asp Val Asn Pro Lys Gly Val

420 425 430

Ser Gly Gly Gly Lys Leu Lys Ala Ala Val Pro Ala Ala Ile Cys Ala

435 440 445

Val Val Val Leu Ile Thr Ala Cys Phe Cys Val Cys Ile Ile Cys Arg

450 455 460

Arg Lys Lys Val Ala Lys His Ser Gly Lys Thr Asp Lys Lys Cys Leu

465 470 475 480

Thr Tyr Gln Thr Glu Leu Tyr Lys Ser Pro Ser Asn Leu Cys Arg Asn

485 490 495

Phe Thr Phe His Glu Met Gln Ile Ala Thr Ser Ser Phe Asp Glu Thr

500 505 510

Leu Leu Leu Gly Arg Gly Gly Phe Gly Asp Val Tyr Arg Gly Glu Ile

515 520 525

Asp Asn Gly Thr Thr Val Ala Ile Lys Arg Ser Asn Pro Leu Ser Leu

530 535 540

Gln Gly Val His Glu Phe Gln Thr Glu Ile Glu Thr Leu Ser Lys Val

545 550 555 560

Arg His Gly His Leu Val Ser Leu Ile Gly Tyr Cys Gln Glu Lys Asn

565 570 575

Glu Met Ile Leu Val Tyr Glu Tyr Met Ala Arg Gly Thr Leu Arg Glu

580 585 590

His Leu Tyr Ser Thr Lys Arg Pro Pro Leu Pro Trp Lys Glu Arg Leu

595 600 605

Lys Ile Cys Ile Gly Ala Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Leu His Thr Gly

610 615 620

Pro Lys Glu Thr Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Ala Asn Ile Leu

625 630 635 640

Leu Asp Asp Lys Trp Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys

645 650 655

Val Asn Pro Asp Ile Asp Ala Thr His Val Ser Thr Val Val Lys Gly

660 665 670

Thr Phe Gly Tyr Phe Asp Pro Glu Tyr Phe Arg Leu Lys Gln Leu Thr

675 680 685

Gln Arg Ser Asp Val Phe Ser Phe Gly Val Val Leu Phe Glu Ile Leu

690 695 700

Cys Ala Arg Pro Pro Val Asn Thr Glu Leu Pro Glu Glu Gln Val Ser

705 710 715 720

Leu Arg Glu Trp Ala Leu Ser Cys Lys Lys Ile Gly Thr Leu Gly Glu

725 730 735

Ile Ile Asp Pro Tyr Leu Gln Gly Glu Ile Ala Pro Asp Cys Leu Lys

740 745 750

Lys Phe Ala Asp Cys Ala Glu Gln Cys Val Ala Asp Arg Ser Ile Asp

755 760 765

Arg Pro Glu Met Gly Asp Val Leu Arg Asn Leu Glu Val Ala Leu Lys

770 775 780

Met Gln Glu Cys Ala Glu Asn Asn Ser Lys Phe Ser Glu Glu Thr Thr

785 790 795 800

Ser Ser Lys Thr Thr Pro Asp Met Met Thr Ile Met Asp Thr Asp Lys

805 810 815

Gln Ser Thr Tyr Ser Thr Met Ser Ile Thr Gly Gln Arg Thr Ile Phe

820 825 830

Ser Asp Met Met Asp Pro Gln Ala Arg

835 840

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtcggaac ttcaccttcc atg 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctctaggt tccgaagaac atcac 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgtcggaac ttcaccttcc atg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgtggagtg gagttgccat agc 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattgacgcc acccatgtta gc 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcatgtctgg tgttgtcttc gacg 24

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggtagacag tgcgacccat gttttagagc tagaaatagc aagtta 46

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgggtcgca ctgtctaccc aacctgagcc tcagcgcagc 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccctttcgc caggggtacc tatgtacagc attacgtagg 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tacgaattcg agctcggtac cgatggtgct tactgtttag 40

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cattacgcaa tcgttcccac c 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agtagccata ggccactgga tag 23

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgaccatga ttacgaattc gggacgaatt tcggattaag cgac 44

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctagaggatc cccgggtacc tcgggcctgc ggatccatca tat 43

Claims

1.一种分离的水稻基因及其等位基因在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用；所述的基因NCBI accession为LOC4338398。

2.SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或是编码SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列在控制水稻粒宽和/或粒重性状中的应用。

3.一段分离自Iksan438的基因序列，所述序列为SEQ ID NO.1所示，其CDS序列为SEQID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，是通过缺失该基因在水稻中的功能来增加水稻的粒宽和/或粒重。