JP5633999B2

JP5633999B2 - 高リジントウモロコシ（ｍａｉｚｅ）組成物およびその検出のための方法

Info

Publication number: JP5633999B2
Application number: JP2006543899A
Authority: JP
Inventors: マーク・アンソニー・ディジガン; デイル・エイ・ボイルズ; キャスリーン・ピー・マロイ; レベッカ・エイ・ケリー; トーマス・マルバー; マイケル・ハンス・ルーシー
Original assignee: モンサントテクノロジーエルエルシー
Priority date: 2003-12-11
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: CN102115761B; KR100863376B1; PE20050707A1; JP2007513629A; PE20171797A1; US8236938B2; CN102115761A; UA93654C2; AU2004303836B2; MY142780A; TR200602960T2; AR047142A1; EP1697528A2; US7157281B2; CN1950509A; TR200800453T1; US20050132437A1; US7615621B2; EP1697528B1; DE602004030277D1

Description

発明の詳細な説明

本出願は、その全文において本明細書中に引用によって援用される2003年１２月11日に出願された米国仮出願第60/529,182号の35 USC § 119(e)下で、利益を主張する。

発明の分野
本発明は、植物分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、増加したリジンを有するトランスジェニックトウモロコシ（maize）、および増加したリジンを提供する特異的な外生DNAを同定するためのアッセイおよび方法に関する。

発明の背景
トウモロコシ（maize）およびコーン（corn）として一般的に知られるZea maysは、動物飼料において広く使用される粒である。粒、つまり、穀粒は、豚、牛、および家禽用の蛋白質、澱粉、および油の源である。混粒飼料源において必須であると考えられる１０のアミノ酸のうち、コーン（corn）は、特に、リジン、スレオニン、およびメチオニンにおいて制限される。これらのアミノ酸、特にリジンの欠乏は、飼料コーン（corn）またはコーン（corn）食物が、しばしば大豆飼料の添加によって提供されるこれらの栄養素で補われることを必要とする。種子および食物を、動物飼料として、より栄養のあるものにする手段として、コーン（corn）穀粒中のリジンのレベルを増加することは、当該分野にとって有効であろう。

分子生物学的アプローチを用いて、リジンのレベルを増加するために、リジン経路酵素のうちの少なくとも１つのフィードバック−無感覚バージョン、つまりジヒドロジピコリン酸シンターゼ（本明細書においてDHDPSと呼ぶ)が同定され、使用されている。E. coliから単離された細菌DHDPS遺伝子が、トランスジェニックタバコに導入されると、リジンレベルの増加による阻害に対して約200倍感度が低下することが、インビトロで示されており、E. coli DHDPSの過剰発現は、結果的に、葉組織中のリジンのレベルを増加させた(Glassman et al., 米国特許5,288,300)。Falco et al.は、そのようなトランスジェニック植物の生産に有用な種子および遺伝子中の増加したレベルのリジンを有するトランスジェニック植物を開示する(米国特許5,773,691および6,459,019; 米国特許出願公報2003/0056242、各々は、その全文において、本明細書中に、引用によって援用される)。これらの報告において、Falco et al.は、種子中に増加したレベルのリジンを有するトランスジェニックナタネ、タバコ、トウモロコシ（maize）、および大豆植物を発生させるためのE. coliからのフィードバック−無感覚なDHDPSおよび(cordapAとしても知られる)CorynebacteriumからのDHDPSの単離および使用を記載する。トウモロコシ（maize）について、Falco et al.は、形質転換されていない穀粒に対して、cordapA遺伝子で形質転換された穀粒中の遊離リジンの約130%の増加を報告する。

トランスジーンそのものに関してだけでなく、宿主植物または種子のゲノムにおけるその位置に関しても、植物または種子中の特定のトランスジーン、またはそのような植物または種子中の子孫の存在または不存在を検出可能であることは有利であろう。さらに、位置に関する同定は、遺伝子工学者が、植物または種子の先祖植物にトランスジーンを挿入したトランスジェニック事象の同定を提供する。

発明の概要
本発明は、トランスジェニック事象を発生させるのに有用な構築体および該構築体を含まない近縁の植物よりも高いレベルのリジンを蓄積するトランスジェニック植物を生じる特定のトランスジェニック事象を同定するのに有用な物質および方法を提供する。特に、本発明は、本明細書において「LY038事象」または「事象LY038」と呼ばれる標準的トウモロコシ（maize）形質転換を介して導入された特異的な外生DNAを含む、マーカーフリートランスジェニックトウモロコシ（maize）の系統を含む。本発明は、さらに、トウモロコシ（maize）植物、種子、または組織試料から得られたDNA中のLY038事象の存在または不存在を検出するための方法を提供する。事象LY038を含む本発明のトウモロコシ（maize）植物は、先祖または他の実質的に関連した植物に対して、穀粒中の増加したリジンを呈する。加えて、本発明は、トウモロコシ（maize）グロブリン 1 プロモーター、コメアクチン1 イントロン、トウモロコシ（maize）ジヒドロジピコリン酸シンターゼ葉緑体輸送ペプチド-コードDNA分子、Corynebacterium ジヒドロジピコリン酸シンターゼ-コードDNA分子、およびトランスジェニック植物細胞および植物において操作可能に連結され発現されると、穀粒またはその部分または穀粒または植物から由来する加工製品中のリジン含有量を増加させるトウモロコシ（maize）グロブリン 1 3' 非翻訳領域を含む外生DNA構築体を提供する。もう１つの具体例において、構築体は、さらに、上手くいく形質転換体を同定するのに使用するマーカー遺伝子を除去するためのメカニズムの要素として存在するlox部位を含む。

特定のトランスジェニック事象から由来する植物または種子の同定に関して、組成物および方法は、事象LY038を含む新規なトウモロコシ（maize）植物からのゲノム挿入領域、つまり構築体が存在するゲノム中の部位の存在を検出するために提供される。少なくとも、ゲノムに挿入された外生DNAの一部および挿入部位に隣接したトウモロコシ（maize）ゲノムからのDNAの一部(本明細書において「結合配列」と呼ぶ)を含むDNA分子が提供される。

さらに本発明のもう１つの具体例において、それぞれ塩基対 1781-1782または200-201が含まれる配列番号:1または2の少なくとも約20の塩基対を含む新規なDNA分子が提供される。さらに、本発明によって、配列番号:3および4のプライマーを用いるDNA増幅方法によって得られた配列番号:6の配列を有するアンプリコンの配列を含むDNA分子; および配列番号:5の配列を有する該アンプリコンに相補的なハイブリダイゼーションプローブおよびその相補体が、提供される。配列番号:5または6の配列を有するDNA分子は、外生DNAおよびフランキングトウモロコシ（maize）ゲノムDNAの間の接合部に及び、適当な分析テストと使用する時、事象LY038 DNAに対して診断的である。事象LY038の外生DNA/ゲノム挿入領域の接合部におよぶ本発明の他の好ましいDNA分子は、配列番号:1、2、および11の配列を有する分子、およびその相補体である。これらの分子を含む安定して形質転換されたトウモロコシ（maize）植物または種子は、本発明のもう１つの態様である。

プライマーは、PCR反応において機能し、標的配列を特異的に増幅することが可能な長さである時、「十分な長さ」であると言われる；約11ヌクレオチド以上の長さが十分であり、より好ましくは約18 ヌクレオチド以上、さらにより好ましくは約24 ヌクレオチド以上、さらにより好ましくは約30 ヌクレオチドが、実行し、標的配列を特異的に増幅するのに十分である。当業者は、さらに約30 ヌクレオチド以上の長さのプライマーが、PCR反応において有用に使用でき、従って、十分な長さであることが分かるであろう。

事象LY038を同定するのに有用なPCRプライマーは、配列番号:1のDNA配列のトランスジーン部分の十分な長さおよび配列番号:1の5'フランキングトウモロコシ（maize）DNA配列の十分な長さ、または配列番号:2のDNA配列のトランスジーン部分の十分な長さおよび配列番号:2の3' フランキングトウモロコシ（maize） DNA配列の十分な長さを含む。これらのプライマーは、事象LY038およびその子孫に対して診断的であるDNAアンプリコン産物を提供するためのPCR方法において有用である。事象LY038に対して診断的なアンプリコンまたはプローブを生成することができる配列番号:1および2のいずれかの適当な長さに相同的または相補的なPCRプライマーは、本発明のもう１つの態様である。例えば、事象LY038に対して診断的な好ましいプライマーは、制限なしに、配列番号:3または4の配列のいずれかの少なくとも約18の連続したヌクレオチドを有するものを含む。事象LY038およびその子孫に対して診断的なDNAプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本発明の１つの態様である。事象LY038に対して診断的な好ましいアンプリコンは、配列番号:6の配列を有する。

本発明のもう１つの態様は、試料において事象LY038に対応するDNAの存在または不存在を検出する方法を提供する。そのような方法は、トウモロコシ（maize）植物、種子、または組織からDNAを得、試料DNAをPCRプライマー組と接触させ、PCRを実施し、アンプリコンの存在または不存在を検出することを特徴とする。事象LY038に対して診断的な好ましいPCRプライマーは、配列番号:3および4の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、これは、例えば、配列番号:5の配列を有するLY038事象-特異的プローブによって検出可能な、例えば、配列番号:6の配列を有するLY038事象-特異的アンプリコンを生成する。

事象LY038の存在を示すプローブの事象LY038に特異的なDNAを含むアンプリコンへのハイブリダイゼーションを、TaqMan（登録商標）アッセイ、分子生物学の当業者に知られた他の方法のなかでもサザンブロット法を含む核酸操作分野に入手可能ないずれかの適当な手段によって検出し得る。当業者は、アンプリコンの検出が、アクリルアミドゲルまたはアガロースゲル分析のようなプローブのアンプリコンへのハイブリダイゼーションを含まない検出の手段によって実施できることが分かるであろう。また、プライマーおよびプローブ両方の長さおよび配列の両方が、配列番号:3、4、および5に示される例示的な配列から変動し、それでもなお事象LY038に対して診断的なPCR アンプリコン、またはアンプリコンおよびプローブ組を生成し得ることが分かるであろう。

もう１つの態様において、本発明は、事象LY038 DNAを含む子孫植物を生産するための方法を提供する。子孫植物は、同系交配または交配植物であってもよい。さらなる適用において、本発明は、事象LY038 DNAに対して、マーカー補助育種を実行するための方法を提供する。本発明のもう１つの態様によると、事象LY038 DNAを含み、さらに穀粒またはその部分に増加したリジンを含む安定して形質転換されたトウモロコシ（maize）植物が提供される。

本発明は、さらに、事象LY038またはその子孫に特異的なDNAプライマーまたはプローブとして機能する配列番号:1または2に相同的または相補的な連続したヌクレオチドの十分な長さの少なくとも１つのDNA分子を含むDNA検出キットに関する。

本発明は、さらに、ATCC受託番号PTA-5623として寄託された代表的な種子を有する事象LY038を含む高リジントウモロコシ（maize） (Zea mays)の植物および種子およびその加工製品およびその由来する子孫に関する。加えて、例えば、事象LY038 DNAを含む植物を成長させることによって生成される花粉または種子を含むトウモロコシ（maize）植物またはその一部が、本発明によって提供される。本発明のDNAプライマー分子が、事象-特異的配列の検出に通常使用される事象LY038 DNAを含むトウモロコシ（maize）植物および種子は、本発明のさらなる態様である。

LY038事象の加工製品は、例えば、内胚乳といったトウモロコシ（maize）穀粒の一部を含む。本発明のトウモロコシ（maize）食物は、LY038のトランスジェニック DNA分子を含む穀粒から作成することができ、ここに食物は、DNA分子を含有しない他のトウモロコシ（maize）食物と比較して、リジンが多い。

本発明の前述および他の態様は、以下の詳細な記載、実施例、および添付の図面からより明白になるであろう。以下の実施例は、本発明の特定の好ましい具体例の実施例を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において上手く機能すると発明者らが発見したアプローチを表し、従って、その実施に好ましいモードの例を構成すると考えることができることは、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示された特定の具体例において多くの変更をなすことができ、なお本発明の精神および範囲から逸脱せずに、類似したまたは同様の結果を得ることができることを理解するべきである。

配列の簡単な説明
本発明の内容において使用される規定された配列を有する分子は、本出願と同時に提出した配列表に記載される。配列表の概要は以下のとおりである：

配列番号:1は、LY038事象DNAの挿入部位およびトランスジーン挿入部分(bp 1782-1961)の5'側に隣接したトウモロコシ（maize）ゲノム部分(bp 1-1781)を含む5' DNAの1961 塩基対 (bp) ポリヌクレオチド配列である。

配列番号:2は、LY038事象DNAの挿入部位およびトランスジーン挿入配列(bp 1-200）の3'側に隣接した3' トウモロコシ（maize）ゲノム部分(bp 201-867)を含む3' DNAの867bp ポリヌクレオチド配列である。

配列番号:3および4は、事象LY038 DNAに対して診断的なアンプリコンを生成するのに有用なPCRプライマーのポリヌクレオチド配列である。

配列番号:5は、事象LY038 DNAを検出するためのアンプリコンにハイブリダイズするのに有用なオリゴヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド配列である。

配列番号:6は、事象LY038 DNAに診断的なアンプリコンのポリヌクレオチド配列である。

配列番号:7は、トウモロコシ（maize）グロブリン 1 プロモーター (bp 48ないし1440; Kriz, Biochem. Genet., 27:239-251, 1989; Belanger and Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991; その全文において本明細書中に引用によって援用される米国特許6,329,574)、コメアクチン1 イントロン (bp 1448ないし1928; McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990)、トウモロコシ（maize）DHDPS葉緑体輸送ペプチド (bp 1930ないし2100; Frisch et al., Mol. Gen. Genet., 228:287-293, 1991)、Corynebacterium DHDPS 遺伝子(bp 2101ないし3003; Bonnassie et al., Nucleic Acids Research, 18:6421, 1990); Richaud et al., J. Bacteriol., 166:297-300, 1986)、トウモロコシ（maize）グロブリン 1 3' 非翻訳領域(bp 3080ないし4079; Belanger and Kriz, supra)、およびlox P部位(bp 4091ないし4124; Russell et al., Mol. Gen. Genet., 234:45-59, 1992)のポリヌクレオチド配列である。

配列番号:8は、Corynebacterium DHDPS遺伝子のポリヌクレオチド配列である(Bonnassie et al., Nucleic Acids, 18:6421, 1990; Richaud et al., J. Bacteriol., 166:297-300, 1986)。

配列番号:9は、LY038事象の挿入部位の5'側に隣接したさらなるトウモロコシ（maize）ゲノムDNAの1736 塩基対ポリヌクレオチド配列である(図2A参照)。

配列番号:10は、LY038事象の挿入部位の3'側に隣接するさらなるトウモロコシ（maize）ゲノムDNAの359 塩基対ポリヌクレオチド配列である(図2A参照)。

配列番号:11は、図2Cに示された結合配列のトランスジーン挿入DNAの10の連続ヌクレオチドおよびトウモロコシ（maize）ゲノムDNAの10の連続ヌクレオチドよりなる20の塩基対ポリヌクレオチド配列である。

発明の詳細な説明
本明細書において使用されるように、「外生DNA」は、DNAが発見される特定の構築体、細胞、または生物から天然に生じないDNAを指す。外生DNAは、ゲノムに対して天然であるが、ゲノムにおける新たな位置においてまたはその天然の状態において外生DNAと天然に関連していない他の配列要素に連結したDNAまたはRNA配列を含み得る。植物細胞を形質転換するのに使用される組換えDNA構築体は、外生DNAおよび大抵下記で論議されるような他の要素を含む。本明細書において使用されるように、「トランスジーン」は、宿主ゲノムに組み込まれたあるいは宿主細胞において自己複製可能であり、1以上の細胞産物の発現を引き起こすことが可能な外生DNAを意味する。例示的なトランスジーンは、対応する非形質転換子孫細胞または植物、あるいは問題の特定のトランスジーンではなく他のトランスジーンを含む対応する形質転換された前駆細胞または植物に対して、新規の表現型を有する、それから再生された宿主細胞または植物を提供する。トランスジーンは、遺伝子形質転換によって植物に直接的に導入されてもよく、あるいは外生DNAによって形質転換されたいずれかの先の世代の植物から遺伝されてもよい。

本明細書において使用されるように、「遺伝子」または「コード配列」は、RNA分子が転写されたDNA配列を意味する。RNAは、蛋白質産物をコードするmRNA、アンチセンス分子として機能するRNA、またはtRNA、rRNA、snRNA、または他のRNAのような構造RNA分子であってもよい。本明細書において使用されるように、「発現」は、遺伝子のようなDNA分子を使用して、ポリペプチドまたはRNA分子を生成する転写および翻訳を含む細胞内プロセスの組合せを指す。例示的なコード配列は、増加したリジンによるトウモロコシ（maize）穀粒の生産に有用なCorynebacteriumジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(DHDPS; Bonnassie et al., Nucleic Acids Research, 18:6421, 1990; Richaud et al., J. Bacteriol., 166:297300, 1986;配列番号:7および8のbp2101ないし3003)である。また、穀粒組織においてリジンを増加させるCorynebacterium DHDPS遺伝子を含有し発現するように形質転換されたトウモロコシ（maize）植物を、高リジントウモロコシ（maize）植物という。

本明細書において使用されるように、「プロモーター」は、DNAの転写の開始に重要であり、転写されたDNAに相補的なRNAの世代を生じるDNA配列の領域を意味し；また、この領域は、「5' 制御領域」として呼ばれてもよい。プロモーターは、転写されるコード配列の上流に位置し、RNA ポリメラーゼに対する結合部位として作用する領域を有し、他の因子と働く領域を有して、RNA 転写を促進する。有用な植物プロモーターは、構造性、誘導性、組織特異的、時間的に制御された、日周性で制御された、乾燥で誘導された、ストレスに誘導された、発生学的に調節された、低温に誘導された、明期に誘導されたもの等を含む。本発明にとって特に重要なのは、制限なしに、トウモロコシ（maize）グロブリン 1 プロモーター (Kriz, Biochem. Genet., 27:239251, 1989; Belanger and Kriz, Genetics, 129:863872, 1991;配列番号:7のbp48ないし1440)のような胚芽特異的プロモーターである。

また、当該分野でよく知られるように、組換えDNA構築体は、典型的には、(ポリアデニル化部位または転写終了シグナルのような)3'非翻訳領域、輸送またはシグナルペプチド、イントロン、およびマーカー遺伝子要素に制限されないが、それらのようなプロモーターに加えて、他の制御要素を含む。本発明の実施において有用な3' 非翻訳領域 (3' UTR)は、グロブリン 1 3' UTR (Kriz, Biochem. Genet., 27:239251, 1989; Belanger and Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991;配列番号:7のbp3080ないし4079)である。特定の有用な輸送ペプチドは、トウモロコシ（maize）DHDPS 輸送ペプチド (Frisch et al., Mol. Gen. Genet., 228:287293, 1991;配列番号:7 のbp1930ないし2100)である。本発明の内容において有用なイントロンは、コメアクチン1 イントロン 1である(McElroy et al., Plant Cell, 2:163171, 1990;配列番号:7のbp1448ないし1928)。

本明細書において使用されるように、用語「トウモロコシ（maize）」は、Zea maysを意味し、これはコーン（corn)としても知られ、野生型トウモロコシ（maize）種を含むトウモロコシ（maize）と育種可能な全植物種を含む。本発明の実施において、植物ゲノムに外生DNAを導入することによって植物を形質転換するための方法および組成物は、よく知られており、実施された方法のいずれかを含み得る。現在まで、微粒子およびAgrobacterium媒介遺伝子送達は、２つの最も一般的に使用される植物形質転換法である。微粒子媒介形質転換は、いくつかの方法によって標的組織へと推進される微粒子上に被覆されたDNAの送達を指す。Agrobacterium媒介形質転換は、Agrobacterium属に属する遺伝子操作された土壌細菌の使用を介して達成される。いくつかのAgrobacterium種は、「T-DNA」として知られる特異的DNAの移動を媒介し、これは、遺伝子操作して、多くの植物種に、いずれかの所望の片のDNAを運ぶことができる。植物形質転換の好ましい方法は、そのすべてが引用によって本明細書中に援用される米国特許5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; および6,403,865に示されるようなマイクロプロジェクタイル衝撃；および米国特許5,635,055; 5,824,877; 5,591,616; 5,981,840;および6,384,301に示されるようなAgrobacterium媒介形質転換である。

本明細書において使用されるように、「トランスジェニック」生物は、ゲノムが外来遺伝物質の組み込みまたは天然遺伝物質のさらなるコピーによって、例えば、形質転換または組換えによって改変されたものである。トランスジェニック生物は、植物、哺乳類、真菌、細菌、またはウイルスであってもよい。本明細書において使用されるように、「トランスジェニック植物」は、それから由来するいずれかの次の世代の安定して形質転換された植物または子孫植物を意味し、ここに、該植物またはその子孫のDNAは、同じ株の非トランスジェニック植物中に元来存在しない導入された外生DNAを含有する。トランスジェニック植物は、形質転換された植物に対してナイーブな配列を含有し得るが、ここに、外生DNAは、遺伝子の発現のレベルまたはパターンを改変するために改変されている。

本明細書において使用されるように、「安定して」形質転換される植物は、外生DNAが遺伝性である植物である。外生DNAは、植物細胞中に維持されるが、宿主ゲノムに挿入されないDNAの断片として遺伝性であってもよい。好ましくは、安定して形質転換される植物は、核、ミトコンドリア、または葉緑体、最も好ましくは核染色体DNAにおいて、染色体DNAに挿入される外生DNAを含む。

本明細書において使用されるように、「R_oトランスジェニック植物」は、外生DNAによって直接的に形質転換されたあるいは、外生DNAによって形質転換された細胞または細胞クラスターから再生された植物である。本明細書において使用されるように、「子孫」は、特定の親植物または親植物の組から由来する、それからの種子および植物を含むいずれかの次の世代を意味し;得られた子孫系統は、同系交配またはハイブリッドであってもよい。本発明のトランスジェニック植物の子孫は、例えば、自家交配、トランスジェニック植物に交配、非-トランスジェニック植物に交配、および／または戻し交配することができる。

本発明の植物の種子は、繁殖性トランスジェニック植物から収穫することができ、これを使用して、トウモロコシ（maize）穀粒において、増加したリジンの利益を提供する事象LY038の外生DNAを含むハイブリッド植物系統を含む本発明の植物の子孫世代を成長させることができる。トウモロコシ（maize）穀粒は、食物および油製品へと加工してもよく、あるいは穀粒は、加工せずに動物に食べさせることができる。特に食料品は、高められた農業形質、増加したリジンを含有する。本発明は、他のトウモロコシ（maize）食物に対して増加したリジンを有するトウモロコシ（maize）食物を考慮し、ここに、該トウモロコシ（maize）食物は、事象LY038の外生DNAを含む。

用語「事象LY038 DNA」は、外生DNAを含有する親植物から子孫植物に移されることが予測されるであろうゲノムおよび隣接したフランキングゲノムDNAにおいて、特定の位置に挿入された外生DNAを含むDNAセグメントを指す。より具体的には、事象LY038 DNAは、R_o形質転換体のゲノムにおけるゲノムDNAおよび挿入された外生DNAのインターフェイス、例えば、5'末端がゲノムDNAにあり、3'末端が外生DNAにある１つのインターフェイスの周りの領域を含むDNA領域の各々を指す。加えて、宿主ゲノムにおけるその特定の位置にありつつ、事象DNAを含む外生DNAの配列を改変することができ、例えば、配列の一部を変化、欠失または増幅することができ、依然として該事象DNAを構成するが、該外生DNAはゲノムにおいて継続して同一位置にあるものとする。

トランスジェニック「事象」は、外生DNA構築体による植物細胞の形質転換、植物のゲノムへの外生DNAの挿入から得られる植物の再生、および事象DNAによって特徴付けられる特定の植物の選択によって生成される。典型的には、多くの植物細胞は形質転換されて、特定の植物が選択される植物の集団を生成する。用語「事象」は、ゲノム、つまり、事象DNAにおいて特定かつ独特の位置に挿入された外生DNAを含む形質転換体の元来のR_o形質転換体および子孫を指す。また、用語「事象」は、性的外部交配、自家交配、または繰り返し戻し交配によって生成された子孫を指し、ここに、育種において使用される少なくとも１つの植物は、事象DNAを含有する元来のR_o形質転換体のいずれかの世代のものである。

従って、トランスジェニック「事象」は、「事象DNA」を含み、これによって定義される植物である。このように、「事象LY038」は、「LY038事象DNA」を含む。植物は、２以上の異なる事象DNAを含み得、従って、２以上の異なる事象を含む。加えて、所与のトランスジーン事象Xを欠く植物は、問題の該事象DNA Xを含まない。事象DNAは、トウモロコシ（maize）育種の当業者に知られるいずれかの育種スキーム、方法、またはツールによって、植物から植物へ、世代から世代へと移り得る。

植物の形質転換は、典型的には、形質転換されていない細胞からの培養液の形質転換された細胞を識別するための選択可能なマーカーおよび選択方法を利用する。いくつかの例において、選択可能なマーカー遺伝子は、トランスジェニック植物中に留まり；他の例において、外生DNAに導入された選択可能なマーカー遺伝子または他の配列を除去することが望ましい。相同的組換えは、トランスジェニック植物内にあるマーカー遺伝子の欠失に有用な１つの方法である(米国特許6,580,019, その全文において本明細書中に引用によって援用される)。植物から配列を除去するのに有用なもう１つのツールは、部位特異的リコンビナーゼ酵素およびそれぞれの部位特異的標的部位の使用を含む。

バクテリオファージ P1のCre/loxシステム、および酵母のFLP/FRTシステムを含むがこれらに制限されない多くの異なる部位特異的リコンビナーゼシステムは、本発明に従い使用することができるであろう。バクテリオファージ P1 Cre/loxおよび酵母FLP/FRTシステムは、トランスジーンの部位特異的統合または切除のための２つの特定の有用なシステムを構成する。これらのシステムにおいて、リコンビナーゼ(CreまたはFLP)は、そのそれぞれの部位特異的組換え配列(それぞれ、loxまたはFRT)と特異的に相互作用して、介在配列を反転または切除するであろう。これらの２つのシステムの各々に対する配列は比較的短く(loxにつき34bpおよびFRTにつき47bp)、従って、形質転換ベクターとの使用に便利である。FLP/FRTおよびCre/loxリコンビナーゼシステムは、植物細胞中で効率よく機能するように示されている。好ましい具体例において、Cre/lox リコンビナーゼシステムを使用して、選択可能なマーカー配列、特にlox P 組換え部位によってフランクされたNPTIIマーカー遺伝子 (図1参照)を除去する(bp 4091ないし4124 配列番号:7; Russell et al., Mol. Gen. Genet., 234:45-59, 1992)。

高められた所望の特徴、例えば、「増加したリジン」を示すトランスジェニック植物、種子またはその部分は、所望の外生DNAを欠く実質的に同一の遺伝子型の植物と比較して、特徴において所望の、測定可能な変化を授与する外生DNAを含む植物である。好ましくは、促進された所望の特徴と関連した外生DNAを有するトランスジェニック植物における特徴を、実質的に同一遺伝子型であるが該外生DNAを欠く植物における特徴と比較することによって、該高められた所望の特徴を測定する。外生DNAを欠くそのような植物は、天然の野生型植物またはトランスジェニック植物、好ましくはトランスジェニック植物と同じ種であり得る。好ましくは、外生DNAを欠く植物は、所望の外生DNAを含む植物の所望の外生DNAを欠く同胞である。そのような同胞植物は、他の外生DNAを含んでもよい。増加したリジンは、穀粒中の増加した量のアミノ酸の蓄積によって、植物によって呈されてもよく、質量分光測光のものまたは適切に抽出された組織の高性能液体クロマトグラフィーのようないずれかの適当な方法によって測定されてもよい。

本明細書において使用されるように、「プローブ」は、例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、色素、または酵素といった検出可能な標識または輸送体分子に結合し得る単離されたオリゴヌクレオチドである。そのようなプローブは、標的核酸の鎖に対して相補的である。本発明のケースにおいて、そのようなプローブは、事象LY038からのゲノムDNA、例えば、トウモロコシ（maize）植物または種子または事象LY038の他の植物部分からのゲノムDNAの鎖に相補的である。本発明によるプローブは、標的DNA配列に特異的に結合するDNA、RNA、およびポリアミドを含む物質であり、これを使用して、該標的DNA配列の存在を検出することができる。

「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的DNA鎖にアニールし、次いでポリメラーゼ、例えば、DNAポリメラーゼによって標的DNA鎖に沿って延長できる単離されたオリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用されるように、本発明のプライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的核酸配列のDNA増幅に使用され、「PCRプライマー」とも呼ばれてもよい。

プローブおよびプライマーは、当業者によって決定されたハイブリダイゼーション条件または反応条件下で特異的に標的DNA配列に結合するのに十分なヌクレオチドの長さである。この長さは、選択された検出方法において有用であるのに十分な長さであるいずれかの長さであってよい。一般的には、長さ約11ヌクレオチドまたはそれ以上、好ましくは約18ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは約24ヌクレオチドまたはそれ以上、および最も好ましくは約30 ヌクレオチドまたはそれ以上を使用する。そのようなプローブおよびプライマーは、標的に特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列を有する連続ヌクレオチドの完全なDNA配列類似性を有するが、標的DNA配列とは異なり、標的DNA配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブを、慣用的な方法によって設計してもよい。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989等に公開されたプロトコルを用いるプローブおよびプライマーを調製し使用するための方法は、当業者に知られている。

トランスジェニック事象の挿入部位を取り囲むフランキングゲノムDNA配列の同定によって、ゲノムにおいて特定の位置に挿入された所与のトランスジェニック事象に対して特異的な検出法の設計が可能になる。ゲノムにおいて異なる挿入部位に位置した同一または同様のトランスジーンの間を識別することができるそのような検出法は、事象-特異的DNA検出法、例えば、事象-特異的アッセイと呼ばれる。例えば、グリフォセート耐性トウモロコシ（maize）事象nk603に対する事象-特異的アッセイが記載されている(米国特許出願公報2002/0013960, その全文において本明細書中に引用によって援用される)。

好ましい具体例において、本発明の核酸プローブは、配列番号:3ないし6、またはその相補体、最も好ましくは配列番号:5またはその相補体の核酸配列を有するLY038事象特異的アンプリコンに、特異的にハイブリダイズする。本発明のもう１つの態様において、本発明の好ましい核酸プローブ分子は、１以上の配列番号:3ないし6に記載された核酸配列、またはその相補体または断片に対して約80%、好ましくは約90%、より好ましくは約95%、さらにより好ましくは約98%、および最も好ましくは約99%の配列同一性を有する。事象LY038に診断的な例示的プローブは、配列番号:6の配列を有する。そのようなプローブ分子を、植物育種方法におけるマーカーとして当業者によって使用して、遺伝子交配の子孫を同定してもよい。プローブの標的DNA分子へのハイブリダイゼーションを、当業者に知られたいずれかの数の方法によって検出することができる。これらの検出方法は、蛍光タグ、放射性タグ、抗体系タグ、および化学発光タグを含み得るが、これらに限定されるものではない。

本明細書中で使用されるように、「相同的」は、高ストリンジェンシー条件下で比較される核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列を指す。DNAハイブリダイゼーションを促進する、時間、温度、および塩条件の条件を含む適切なストリンジェンシー条件は、当業者に知られている。温度および塩の両方は変動し得、あるいは温度または塩濃度のいずれかは一定に維持し、他の変数を変化させてもよい。好ましい具体例において、本発明のポリ核酸は、配列番号:1または2に記載の１以上の核酸分子、あるいはその相補体または強ないし中程度のストリンジェント条件下のいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、配列番号:1または2に記載の１以上の核酸分子または相補体または高ストリンジェンシー条件下のいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするであろう。プローブの標的DNA分子へのハイブリダイゼーションは、当業者に知られたいずれかの数の方法によって検出可能であり、これらは、蛍光タグ、放射性タグ、抗体系タグ、および化学発光タグを含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書中において使用されるように、「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物を指す。例えば、性的交配から生じるトウモロコシ（maize）植物が、外生LY038 DNAを含むトウモロコシ（maize）植物からのトランスジェニック事象ゲノムDNAを含有するかを決定するために、トウモロコシ（maize）植物組織試料から抽出されたDNAを、挿入された異種DNAの挿入部位に隣接する植物のゲノムにおけるフランキング配列から由来する第１のプライマー、および挿入された異種DNAから由来する第２のプライマーを含むDNAプライマー対を用いて、事象DNAの存在に対して診断的なアンプリコンを生成する核酸増幅方法に付してもよい。アンプリコンは、事象に対しても診断的である長さおよび配列を有する。アンプリコンは、アンプリコンを検出するのに使用される方法によって、プライマー対プラス１ヌクレオチド塩基対、好ましくはプラス約20ヌクレオチド塩基対、より好ましくはプラス約50ヌクレオチド塩基対、さらにより好ましくはプラス約150ヌクレオチド塩基対およびそれ以上の組み合わされた長さからの長さの範囲であり得る。別法として、プライマー対は、全挿入ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するために、挿入されたDNAの両側上のフランキング配列から由来することができる。植物ゲノム配列から由来するプライマー対の員は、挿入されたDNA配列から離れて位置していてもよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から増幅反応の制限、または約20,000ヌクレオチド塩基対の範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、DNA温熱増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを特異的に排除する。

核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を含む当該分野で知られる種々の核酸増幅方法のいずれかによって達成することができる。異種DNAインサートの配列または事象LY038からのフランキングDNA配列を、本明細書中に提供される配列から由来するDNAプライマーを用いて、ATCC寄託受託番号PTA5623種子または植物から抽出されたDNAからのそのような配列を増幅し、その後、PCRアンプリコンまたはクローン化されたDNAを標準DNA配列決定することによって確証（所望により修正）することができる。

本明細書中に開示されたフランキングゲノムDNAおよび挿入配列に基づくプライマーおよびプローブを使用して、慣用的な方法によって、例えば、そのようなDNA分子を再クローン化および配列決定することによって、開示されたDNA配列を確認（所望により、修正する）ことができる。

増幅方法によって生成されたアンプリコンは、ゲルベースの分析、遺伝子ビット（genetic bit）分析 (Nikiforov et al., Nucleic Acid Res., 22:41674175, 1994)、ピロシーケンシング (Winge, M., Pyrosequencing - a new approach to DNA analysis, (2000), Innovations in Pharmaceutical Technology, vol 00, 4, p18-24)、蛍光偏光(Chen et al., Genome Res., 9:492498, 1999)、および分子ビーコン（molecular beacons） (Tyangi et al., Nature Biotech., 14:303308, 1996)を含むがこれらに限定されるものではない複数の技術によって検出され得る。

本発明によって特に興味深いのは、Taqman（登録商標）アッセイ (Applied Biosystems, Foster City, Californiaから入手可能)による検出である。Taqman（登録商標）アッセイは、当該分野でよく知られたDNA配列の存在を検出し定量化する方法であり、製造者によって提供される指示書に完全に記載されている。この方法は、特別なFRETオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ハイブリダイゼーションによるPCR 増幅の使用および増幅産物の検出を含む。FRET オリゴヌクレオチドプローブを、プローブの5'および3'末端に共有結合した5'蛍光輸送体色素および3'クエンチャー色素を有するように設計する。プローブを、ゲノムDNAおよび挿入されたDNAの接合部を重複するように設計する。FRET プローブおよびPCRプライマー (外生トランスジーンDNA配列に１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列に１つ)を、熱安定性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で回転させる。FRETプローブのハイブリダイゼーションは、FRET プローブ上のクエンチング部位から離れた蛍光部位の開裂および放出を招く。蛍光シグナルは、首尾良い増幅およびハイブリダイゼーションのため、フランキング/トランスジーン挿入配列の存在を示す。

Taqman（登録商標）アッセイとの使用に好ましいPCRプライマーは、(a)18ないし25塩基の範囲の大きさの長さおよびフランキングゲノムDNAおよびトランスジーン挿入におけるマッチング配列を有し、(b)例えば、約52ないし約55℃の最適なPCRアニーリング温度に対応する約57ないし約60℃の範囲の計算された融解温度を有し、次いで(c)フランキングゲノムDNAおよびトランスジーン挿入の間の接合部を含み、約75ないし約250塩基対の範囲の大きさの長さを有する生成物を生成するように設計される。PCRプライマーは、好ましくは、結合配列が各PCRプライマーの3'末端から少なくとも１塩基離れているように、遺伝子座に位置する。PCRプライマーは、広範囲に自己相補的または相互相補的である領域を含んではならない。

FRETプローブを、結合配列の配列に及ぶように設計する。好ましい具体例において、FRETプローブは、該プローブが鋳型DNAにアニールし、DNAの副溝に結合して、プローブ-鋳型複合体の安定性を高める時、3'末端にて化学部位を組み込んでいるであろう。好ましくは、プローブは、3'副溝結合部位を含んだ約12ないし約17塩基の範囲の長さを有し、PCRプライマーの融解温度を約5ないし約7℃超える計算された融解温度を有する。プローブ設計は、米国特許5,538,848; 6,084,102; および6,127,121に開示される。

本発明の配列を使用するもう１つのアッセイは接合状態アッセイのものである。接合状態アッセイは、事象を含む植物が、染色体対の各染色体上の同一の位置において外生DNAを含む事象DNAに対してホモ接合性であるか、あるいは、染色体対の１つのみの染色体上に外生DNAを含む事象DNAに対してヘテロ接合性であるかを決定するのに有用である。１つの具体例において、プライマー1が挿入された外生DNAから特異的にハイブリダイズし延長する、プライマー2が挿入された外生DNAの5'側をフランキングするDNAから特異的にハイブリダイズし延長する、およびプライマー3が挿入された外生DNAの3'側をフランキングするDNAから特異的にハイブリダイズし延長する３つのプライマーアッセイを使用する。３つのプライマーは事象に診断的である。典型的には、外生DNAは、プライマー1およびプライマー3が最早PCR反応においてアンプリコンを生成しないような大きさ、例えば、約3ないし約7キロベースまたはそれ以上である。３つのプライマーを、PCR反応において、所与の事象に対してホモ接合性の植物から抽出されたDNAと混合すると、単一のアンプリコンは、プライマー 1およびプライマー 2によって生成され、そのサイズおよび配列は、事象DNAの指標となり、それに対して診断的になるであろう。３つのプライマーを、PCR反応において、所与の事象を含まない植物から抽出されたDNAと混合すると、単一のアンプリコンがプライマー 1およびプライマー 3によって生成され、そのサイズおよび配列は、外生DNAを欠くトウモロコシ（maize）ゲノムDNAの指標となり、それに対して診断的になるであろう。３つのプライマーを、PCR反応において、所与の事象に対してヘテロ接合性である植物から抽出されたDNAと混合すると、2つのアンプリコンが生成される: 1) アンプリコンがプライマー 1およびプライマー 3によって生成され、そのサイズおよび配列は、外生DNAを欠くトウモロコシ（maize）ゲノムDNAの指標となりそれに対して診断的になるであろう、ならびに2) アンプリコンがプライマー 1およびプライマー 2によって生成され、そのサイズおよび配列は、事象DNAの指標となり、それに対して診断的になるであろう。接合状態アッセイによって生成された種々のアンプリコンの検出方法は、当業者に知られており、ゲル電気泳動法、TaqMan（登録商標）アッセイ、サザンブロット、Invader Technology、配列決定、分子ベーコン（molecular beacon）、ピロシーケンシング等を含むが、これらに限定されるものではない。

DNA検出キットを、本明細書に開示された組成物およびDNA検出の分野でよく知られた方法を用いて開発することができる。キットは、試料中のトウモロコシ（maize）事象LY038 DNAの同定に有用であり、事象LY038 DNAを含有するトウモロコシ（maize）植物を育種するための方法に適用することができる。該キットは、プライマーまたはプローブとして有用であり、配列番号:1または2のいずれかの部分、またはトウモロコシ（maize）植物ゲノムに挿入されて、事象LY038 (図2)を形成するpMON55221 (図1)のトランスジーン遺伝子要素のいずれかにおいて含有されたDNAに対して相同的または相補的なDNA配列に対して相同的または相補的であるDNA配列を含有する。これらのDNA配列は、DNA増幅方法(PCR)において、またはポリ核酸ハイブリダイゼーション方法、つまり、サザーン分析、またはノーザン分析においてプローブとして使用することができる。LY038事象ゲノム中に含有されたDNA分子 (配列番号:7)は、トウモロコシ（maize）グロブリン 1 プロモーター (P-ZM glob1)、コメアクチン 1 イントロン (I-Os アクチン)、DNA分子をコードするトウモロコシ（maize）ジヒドロジピコリン酸シンターゼ葉緑体輸送ペプチド(Zm DHDPS CTP)、DNA分子をコードするCorynebacteriumジヒドロジピコリン酸シンターゼ (DHDPS)、トウモロコシ（maize）グロブリン1 3'非翻訳領域(T-Zm glob1)、およびlox P部位を含む異種トランスジーン遺伝子要素を含み、DNA 増幅に対する鋳型として使用することができ、あるいは、DNA検出方法においてDNAプライマーまたはプローブとして使用可能な同種または相補的DNA分子を選択するのに使用することができる。本発明は、DNA検出の当業者が、LY038のゲノムおよびその子孫においてトランスジェニック DNAを検出する方法において有用である配列番号:7のトランスジェニック DNAに対して同種または相補的な１以上のDNA分子を選択することができることを考慮する。

以下の実施例は、本発明の特定の好ましい具体例の実施例を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、発明者らが本発明の実施において上手く機能すると発見したアプローチを表し、従って、その実施に好ましいモードの実施例を構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、本発明の開示に鑑みて、当業者は、開示された特異的な具体例において多くの変更をなすことができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱せずに、類似したまたは同様の結果を得ることができることを理解するべきである。

実施例１
トランスジェニック植物の調製
トウモロコシ（maize）系統H99の未成熟な胚芽は、形質転換のために単離した。トウモロコシ（maize）グロブリン 1 プロモーター (Kriz (1989), supra; Belanger and Kriz (1991), supra; 米国特許番号6,329,574, その全文において本明細書中に引用によって援用される;配列番号:7のbp48ないし1440)、コメアクチン 1 イントロン (McElroy et al. (1990), supra;配列番号:7のbp1448ないし1928)、DNA分子をコードするトウモロコシ（maize）DHDPS葉緑体輸送ペプチド (Frisch et al. (1991), supra;配列番号:7のbp1930ないし2100)、DNA分子をコードするCorynebacterium ジヒドロジピコリン酸シンターゼ (Bonnassie et al. (1990), supra; Richaud et al. (1986), supra;配列番号:7のbp2101ないし3003)、トウモロコシ（maize）グロブリン 1 3'非翻訳領域(Belanger and Kriz (1991), supra;配列番号:7のbp3080ないし4079)、lox P部位(米国特許5,658,772, 本明細書中に引用によってその全文において、具体的に援用される;配列番号:7のbp4091ないし4124)、ならびに35S プロモーター (Kay et al., Science, 236:12991302, 1987; 米国特許5,164,316)、DNA分子をコードするNPTII選択可能マーカー(Potrykus et al. (1985), supra)、nos 3' UTR (Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 80:48034807 (1983), supra)、およびlox P部位 (米国特許5,658,772,その全文において、本明細書中に引用によって具体的に援用される)を含むベクター pMON55221 (図1参照)から単離されたカセットDNAを、金粒子に付着させた。マイクロプロジェクタイル衝撃を使用して、当業者に知られる方法を用いて、外生DNAを未成熟トウモロコシ（maize）に導入した。形質転換された細胞を、カナマイシン選択図式を用いて選択した。カナマイシン耐性カルスを入手し、標準的な方法を用いて、いくつかの繁殖性、R_o トランスジェニック植物を再生した。

実施例２
育種図式およびリジン分析
表１は、トウモロコシ（maize）穀粒組織において高リジンを呈するトウモロコシ（maize）事象LY038の成長に使用された育種図式および遊離リジンデータを要約する。実施例1に記載の形質転換方法によって生産された植物を、PCRを用いて、Corynebacterium DHDPS配列の存在または不存在につき、最初にスクリーンした。Taqman（登録商標）アッセイ技術を使用して、トランスジェニック挿入のコピーの数を決定した。実施例1および図1に記載のように操作可能に連結したCorynebacterium DHDPS配列を有するDNA分子を含む植物を、成熟させ、F_1A種子を生成した。F_1A種子を生成するために、第１トランスジェニック R_o植物を、非-トランスジェニック優良トウモロコシ（maize）近交系と交配させた。

F_1A植物を、農場で評点可能なカナマイシン耐性テストを用いることによって証明されるように、NPTII配列の存在または不在についてスクリーンした。カナマイシンに対する非感受性は、植物が、図1に示され、実施例1に記載のように、NPTIIマーカー遺伝子を含み、NPTIIマーカー遺伝子を発現していたことを示し; これらの植物を、以下、NPTII+と呼ぶ。

NPTII+ 植物を、細菌Creリコンビナーゼを発現するトランスジェニックトウモロコシ（maize）系統と交配させて、F_1B種子を生成した。各穂から収集した得られたF_1B種子の試料において遊離リジンのレベルを決定した。約1000 ppm 遊離リジン以上を呈する同胞 F_1B穀粒を農場育種場に進めた。F_1B子孫植物をPCRおよび／またはサザンブロットによってアッセイして、DHDPS遺伝子配列、Creリコンビナーゼコード配列およびNPTII選択可能マーカー遺伝子配列の存在または不存在を決定した。NPTII選択可能マーカー遺伝子は、lox P部位(組換え部位)によってフランクされ、そのようなものとして、Creリコンビナーゼの活性は、NPTIIコード配列を切除した。以下、マーカー-切除植物と呼ぶDHDPSおよびCreリコンビナーゼ配列を含み、NPTII配列を欠く植物を、自家受粉させて、F_2A種子を生産した。陽性および陰性F_2A種子中の遊離リジンを決定した。

関心のある外生DHDPS遺伝子を含み、NPTII選択可能なマーカー遺伝子を欠くF_2A種子を得たら、Creリコンビナーゼ配列を離れて育種することが必要であった。マーカー切除された植物からのF_2A種子を農場に植え、PCRおよび／またはサザンブロットによってもう一度アッセイして、DHDPS遺伝子配列、Creリコンビナーゼコード配列およびNPTII選択可能なマーカー遺伝子配列の存在または不存在を決定した。DHDPS配列を含みCreリコンビナーゼおよびNPTIIの両方に対する配列を欠く植物を、「陽性」植物として選択した。DHDPS、Creリコンビナーゼ、およびNPTII配列を欠く同胞植物を、「陰性」植物として選択して、陰性対照とした。DHDPS配列を含む植物を自家受粉して、F₃種子を作り出し、農場において次の世代に進めた。同様に、DHDPS、Creリコンビナーゼ、およびNPTII配列を欠く陰性植物を自家受粉させて、F₃種子を作り出した。陽性および陰性F₃種子中の遊離リジンを決定した。

陽性植物を、F₃種子から、農場で成長させた。Taqman（登録商標）アッセイによってホモ接合性と決定された単一の植物を選択し、LY038と名付けた。F₃植物は、A)自家受粉してF₄₋₃₈穂を生成したか、あるいはB) 近交系と交配して、陽性および陰性選択の両方のF_1−38A穂を生成したかのいずれかであった。陽性および陰性F_4-38種子中の遊離リジンを決定した。

事象LY038のF_1-38A 種子を農場で成長させ、自家受粉させて、遊離リジンが決定されたF_2B 種子を生成した。

事象LY038のF_4-38種子を農場で生育して、F_4-38植物を生成して、A)自家受粉して、F_5-38種子を生成するか、あるいはB) 近交系に交配して、農業評価に使用されるハイブリッドF_1-38B種子を生成するかした。事象LY038のF_5-38種子を農場で生育して、A)自家受粉して、F_6-38 種子を生成するか、あるいはB) 近交系トウモロコシ（maize）種に交配して、さらなる農業評価に使用されるさらなるハイブリッドF_2C種子を生成するかした。

上記開示の事象LY038のMonsanto Company トウモロコシ（maize）種子の寄託を、F_6-38種子を生成するためのF_5-38植物の自家受粉およびF_7-38種子を生成するためのF_6-38植物の自家受粉を介して発生させた。事象LY038のThe American Type Culture Collection (Manassas, VA) 受託番号は、PTA-5623である。

遊離リジン蓄積を、事象LY038トウモロコシ（maize）系統の成長の間、モニターした。リジン蓄積値は、表1に要約され、100万分の1で、乾燥重量による成熟した粒中に存在する遊離リジンの量を表す。

異なる方法は、事象LY038を含む成熟な穀粒のリジン含有量を評価するのに有用である。リジンを検出し定量化するのに有用な当該分野で知られる他の方法が、本発明の発明者らによって考えられて、LY038の種子のリジン含有量の増加の同様の発見を提供する。

液体クロマトグラフィー-質量分光測光/質量分光測光(LCMS/MS)を使用して、事象LY038のトウモロコシ（maize）穀粒中の遊離リジンを分析した。事象LY038の個々の成熟したトウモロコシ（maize）穀粒試料を、まず、重さを量り、微細な、均質の粉末にし、メタノール、水、およびギ酸を含む抽出溶媒で抽出した。穀粒を重み付けした状況において、約30 mgの細かくした粉末を使用した。液体クロマトグラフィーおよび複数-反応-モニタリング(MRM) 質量分析技術の両方を使用して、試料抽出物中のリジンを分離した。分離後、リジンを、重水素化d₄-リジン内部標準(IS)を用いて調製されたその対応する標準較正曲線に対するその質量分光分析ピーク領域を用いて定量化した。

もう１つの方法において、トウモロコシ（maize）穀粒のリジン含有量は、高性能液体クロマトグラフィー (HPLC)による遊離アミノ酸の評価に基づいた。個々のトウモロコシ（maize）穀粒または事象LY038の穀粒のプールを、この例において、記載したとおりに、微細な、均質な粉末にし、約30 mgの粉末を、分析に使用した。アミノ酸を5% トリクロロ酢酸アミノ酸で抽出し、アミノ酸検出をo-フタルアルデヒド(OPA)によるプレカラム一級アミン誘導化を通して達成した。得られたアミノ酸付加化合物、イソインドールは疎水性であり、優れた蛍光特徴を有し、これは、次いで、蛍光検出器上で検出することができる。逆相クロマトグラフィーを用いて、分離を、各アミノ酸に位置するR基の疎水性を通して達成する。フルオロフォアを安定させるのを助けるために、2-メルカプトエタノール(SHCH₂CH₂OH)または3-メルカプトプロピオン酸(SHCH₂CH₂COOH)のようなチオールを添加する。

*は、事象LY038を含む成熟した穀粒中のppm 遊離リジンを表す
ND = 決定されず
-は、約400 ppm未満の遊離リジンを示す
+は、約1000ないし約1200 ppmの遊離リジンを示す
++は、約1200ないし約1400 ppmの遊離リジンを示す
+++は、約1400 ppmを超える遊離リジンを示す
i = 同系交配の穀粒データ

本明細書に記載した実験に基づき、LY038構築体を含有するトウモロコシ（maize）穀粒中の遊離リジンは、約200% (例えば、なかでもF_1B)および300%近く (例えば、F_1A)の間、増加した。また、遊離リジンの中間の増加も観察された(例えば、F_1-38A)。

実施例 3
フランキング配列の決定
ゲノムDNAを、LY038として示されたトウモロコシ（maize）植物から単離し、実験で使用して、トランスジェニックDNA挿入をフランキングするトウモロコシ（maize）ゲノム配列を決定した。ゲノムフランキング配列およびトランスジェニック挿入の間の接合部のフランキング配列および配列を決定するための３つの異なる方法:テイルPCRおよびClonTech (カタログ番号 K18071, ClonTech Laboratories, Palo Alto, California)からのGenome Walker^TMキット、および逆PCRを使用した。

テイルPCRは、変性プライマーおよびビオチン捕獲工程を使用する既知の挿入された配列をフランキングするゲノムDNA配列を単離するための方法である。外生DNAに対して相補的なプライマーを、種々の変性プライマーと一緒に、一次PCR反応で使用する。典型的には、外生DNAに対して特異的なプライマーおよび縮重プライマーを、プールではなく、対で使用した。縮重プライマーは、挿入されたDNAをフランキングするトウモロコシ（maize）ゲノム配列に、ある程度までハイブリダイズして、PCRアンプリコンを発生させる。第１のPCRアンプリコンを、アンプリコンのトランスジーン部に相補的なビオチン標識されたプライマーと混合し、アニールさせる。ビオチンプライマーにアニールしたアンプリコンを、ストレプトアビジンを用いて捕獲し、非結合アンプリコンを洗い流した。アニールされたアンプリコンを、アンプリコンおよび種々の縮重プライマーの外生DNA部分に相補的な入れ子プライマーを利用して、二次PCR反応に付した。二次PCR反応のPCRアンプリコンをアガロースゲル電気泳動法に付し、バンドをゲルから切断し、単離した。単離されたPCRアンプリコンを配列決定した。事象LY038の3'フランキングゲノムDNAの配列を、テイルPCRおよび配列決定を用いて同定した。

フランキングDNAの単離のためのGenome Walker方法を、製造者が示唆した状況に従って、行った。テイルPCRおよびGenome Walker Kitの両方を使用して、事象LY038の5'フランキングDNAの配列を同定した。Genome Walkerにつき、制限酵素 ScaIの産物を増幅して、事象LY038の5'フランキングゲノムDNA配列を同定するのに有用なアンプリコンを生成した。

テイルPCRおよびGenome Walker方法の使用によって、事象LY038において、DNA構築体の挿入部位をフランキングする数百の塩基対またはそれ以上のDNA配列が生じた。逆PCRおよび生物情報学分析およびトウモロコシ（maize）ゲノムDNA配列データベースとの比較を使用して、これらの事象をフランキングするさらなるゲノムDNAを得た。組合せた方法を用いて、フランキング配列を、配列番号:1、2、9、および10の配列において同定する。トウモロコシ（maize）植物は、そのトウモロコシ植物が、DNA増幅反応で鋳型として用いて、本発明で記載した接合DNA分子を含むアンプリコンを供することができるDNA分子をそのゲノム内に含有する場合の本発明の態様であり、ここに、該接合DNA分子はトウモロコシ（maize）組織試料から抽出されたDNA試料におけるコーン（corn）事象LY038 DNAに対して診断的である。

実施例4
事象特異的プライマーおよびプローブアッセイ情報
各事象につき、Taqman（登録商標）アッセイにおいて有用なPCRプライマーおよびプローブ、特に配列番号:3および4を設計した。Taqman（登録商標）アッセイにおいて配列番号:3および4の配列を有するPCRプライマーを用いた結果、事象LY038に対して診断的なアンプリコンが生じた;アンプリコンは配列番号:6の配列を有し、このアンプリコンの検出に有用なプローブは、配列番号:5の配列を有する。プライマーおよびプローブを、表2に概略したPCR条件に付すと、蛍光シグナルは、プローブによって検出されたアンプリコンが生成されることを示した。適切な対照試料、例えば、種々の陰性および陽性DNA対照を含むことによって、PCRプライマーおよびプローブが意図された事象に対して特異的であることが分かった。

プライマーおよびプローブ組に加えて、PCR増幅反応で用いた場合に、事象LY038 DNAについてのDNAアンプリコン診断剤を生じる事象LY038 DNAに特異的な、配列番号:1または2に由来するいずれのプライマーおよびプローブ組も本発明の態様であって、当業者によって容易に調製される。事象LY038 DNAに対して診断的なTaqman（登録商標）アッセイを生成するためのPCR条件は、表2に含まれる。

本発明に記載されたPCRまたはTaqman（登録商標）アッセイを実施する際、当業者は適切な対照試料を含むであろう。陽性対照DNA試料、陰性対照DNA試料、および他の対照を含むことが適切であり、結果の解釈に役立つ。加えて、当業者は、(例えば、Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって公開されるように)公開された、標準的な方法を用いるTaqman（登録商標）PCR反応に対する内部対照プライマーおよびプローブを調製する方法を知っているであろう。また、当業者は、本明細書中に明記された特定のプライマー配列、プローブ、および反応条件を修飾して、事象LY038 DNAに対して診断的なアッセイを生成してもよいことを認識するであろう。加えて、当業者は、PCR反応の産物を、分析のためのゲル電気泳動法によって分析してもよいことが分かるであろう。

*混合プライマーを18 メグオームの水に、20μM各プライマーの濃度まで再懸濁させる。例： 100μMの濃度の100μlの第１のプライマー、100μMの濃度の100μlの第２のプライマー、300μlの18 メグオーム水。
**プローブを18 メグオーム水に10μMの濃度まで再懸濁させる。
***陰性DNA対照 (例えば、非-トランスジェニックDNA)
陰性水対照(鋳型DNA無し)
陽性対照(事象LY038)
(葉、種子、他の植物部分試料からの)試料DNA
を含んでもよいが、それに限定されない。
＾内部対照プライマーおよびプローブの組合せを種々の範囲の遺伝子またはゲノム領域に対して行うことができ、その設計は当業者に知られている。

上記に開示した事象LY038を代表するMonsanto Company トウモロコシ（maize）種子の寄託は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110と、ブダペスト条約の下に２００３年１０月２９日になされている。事象LY038のATCC受託番号は、PTA-5623である。寄託は、30年、または最終の要求後5年の期間、あるいは特許の有効期限の間、いずれかより長い方の期間、保管場所に維持され、該期間の間、必要に応じて、置き換えられるであろう。

本発明の原理を説明および記載してきて、本発明が、そのような原理を逸脱せずに、整然とおよび詳細に修飾可能であることが、当業者には明白であるはずである。我々は、付属の請求の範囲の精神および範囲内である全ての修飾を主張する。

図1は、pMON55221のプラスミドマップである。図2Aは、外生DNA挿入事象LY038の略図である。外生DNAおよび関連塩基対を、イタリック字体で示し、トウモロコシ（maize）ゲノムDNAおよび関連塩基対を、レギュラー字体で示す。図2Bは、5'接合部の配列である。図2Cは、3'接合部の配列である。

Claims

事象ＬＹ０３８の子孫トウモロコシ（maize）植物を生産する方法であって、
ａ）そのゲノム中の事象ＬＹ０３８ＤＮＡの第１の親トウモロコシ（maize）植物を、第２の親トウモロコシ（maize）植物と交雑させ；
ｂ）工程ａからの子孫植物を得；次いで、
ｃ）少なくとも１つの子孫植物を選択する工程を含み、
ここに、該子孫植物は配列番号：５および配列番号：１１を含み、かつ非−トランスジェニックトウモロコシ（maize）植物と比較して増大したリジンを有し、
ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されていることを特徴とする該方法。
さらに：
(a)該第１の子孫植物を、それ自体または第３のトウモロコシ（maize）植物と交雑させて、次の世代の第２の子孫植物の種子を生産し;
(b)該種子から次の世代の第２の子孫植物を成長させ、次の世代の該第２の子孫植物をそれ自体または第４のトウモロコシ（maize）植物と交雑させて、次の世代の第３の子孫植物の種子を生産し;次いで
(c)工程(a)および(b)を、少なくとも１つのさらなる世代にかけて繰り返して、事象LY038を含む該トウモロコシ（maize）植物から由来する同系交配のトウモロコシ（maize）植物を生成する工程を含む請求項１記載の方法。
さらに；
a)いずれかの世代の子孫トウモロコシ（maize）植物からDNA試料を得；
b)該該子孫植物からのＤＮＡ試料における配列番号：５および配列番号：１１のヌクレオチド配列を検出し；次いで、
(c)高リジン含有量を持つ該植物を選択することを特徴とする請求項１記載の方法。
第１のDNA分子および第２のDNA分子を含み、ここに分子は、各々、配列番号:1の少なくとも12の連続したヌクレオチドを含み、ここに該第１のDNA分子は、配列番号:1のトウモロコシ（maize）ゲノム部分に対して相同的または相補的であり、該第２のDNA分子は、配列番号:1のトランスジーン挿入部分に対して相同的または相補的であって、
ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されていることを特徴とするトウモロコシ（maize）事象ＬＹ０３８の検出用の一対のDNAプライマー分子。
該プライマーが配列番号:3および配列番号:4である請求項４記載のDNAプライマー分子の対。
第１のDNA分子および第２のDNA分子を含み、ここに分子は、各々、配列番号:2の少なくとも12の連続したヌクレオチドを含み、ここに該第１のDNA分子は、配列番号:2のトウモロコシ（maize）ゲノム部分に対して相同的または相補的であり、該第２のDNA分子は、配列番号:2のトランスジーン挿入部分に対して相同的または相補的であって、
ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されていることを特徴とするトウモロコシ（maize）事象ＬＹ０３８の検出用の一対のDNAプライマー分子。
トウモロコシ（maize）組織試料におけるＬＹ０３８を検出する方法であって：
(a)トウモロコシ（maize）組織試料からDNAを得;
(b)該DNAをPCRプライマー対と接触させ、ここに該PCRプライマー対の第１のプライマーは、配列番号:1の塩基対1ないし1781内の配列またはその相補体にハイブリダイズし、ここに該PCRプライマー対の第２のプライマーは、配列番号:1の塩基対1782ないし1961内の配列またはその相補体にハイブリダイズし、
(c)DNAを該PCRプライマー対で増幅させ、それにより、配列番号:1の少なくとも塩基対1781ないし1782またはその相補体を含むDNAアンプリコン分子を生成し、
(d)該DNAアンプリコン分子を検出する工程を含み、
ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されていることを特徴とする該方法。
トウモロコシ（maize）組織試料におけるＬＹ０３８を検出する方法であって：
(a)トウモロコシ（maize）組織試料からDNAを得；
(b)該DNAをプライマー対と接触させ、ここに、該プライマー対の第１のプライマーは、配列番号:2の塩基対 1ないし200内の配列または相補体にハイブリダイズし、該プライマー対の第２のプライマーは、配列番号:2の塩基対 201ないし867内の配列またはその相補体にハイブリダイズし；
(c)該プライマー対で該DNAのDNA増幅方法を実施し、それにより、配列番号:2の少なくとも塩基対 200ないし201またはその相補体を含むDNAアンプリコン分子を生成し；
(d)該DNAアンプリコン分子を検出する工程を含み、
ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されていることを特徴とする該方法。
少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むトウモロコシ（maize）事象ＬＹ０３８の検出用のＤＮＡ検出キットであって、該分子が、試料DNA中のトウモロコシ（maize）事象LY038を検出するように特異的に設計された方法において、DNAプライマーまたはプローブとして機能する配列番号:1ないし配列番号:2の少なくとも12以上の連続したヌクレオチドを含み、
ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されていることを特徴とする該ＤＮＡ検出キット。
事象ＬＹ０３８のトウモロコシ（maize）種子に由来するトウモロコシ（maize）食物であって、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されており、ここに、該トウモロコシ（maize）食物は配列番号：５および配列番号：１１を含む該トウモロコシ（maize）食物。
事象ＬＹ０３８のトウモロコシ（maize）種子に由来するトウモロコシ（maize）内胚乳であって、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されており、ここに、該トウモロコシ（maize）内胚乳は配列番号：５および配列番号：１１を含む該トウモロコシ（maize）内胚乳。
事象ＬＹ０３８のトランスジェニックトウモロコシ（maize）植物であって、ここに、該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託され、ここに、該植物はその植物のゲノム配列番号：５および配列番号：１１を内包して含む該トランスジェニックトウモロコシ（maize）植物。
花粉、胚珠、種子、根、または葉を含む請求項１２記載のトウモロコシ（maize）植物またはその部分。
事象ＬＹ０３８のトウモロコシ（maize）植物細胞であって、ここに該事象ＬＹ０３８の代表的な試料は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託され、ここに、該植物細胞はその細胞のゲノム配列番号：５および配列番号：１１を内包して含む該トウモロコシ（maize）植物細胞。
配列番号:１、２、５、６または１１を含む単離されたＤＮＡ分子であって、該分子は、トウモロコシ（maize）中の高リジン特徴に連結した該単離されたＤＮＡ分子。
事象ＬＹ０３８のトランスジェニックトウモロコシ（maize）植物であって、該植物は配列番号：５および配列番号：１１を含むＤＮＡ分子をＤＮＡ増幅反応において生産することができ、ここに、該トウモロコシ（maize）事象ＬＹ０３８は受託番号ＰＴＡ−５６２３としてAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されている該トランスジェニックトウモロコシ（maize）植物。