KR20080041712A - 고(高)리신 옥수수 조성물 및 이의 검출방법 - Google Patents

고(高)리신 옥수수 조성물 및 이의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 옥수수 게놈 내로 삽입된 외인성 DNA 구조체의 DNA 서열 및 삽입부위를 접합하는 게놈 서열의 DNA에 기초를 둔, 리신이 증가된 유전자변형 계통의 존재를 검출하기 위한 분석법에 관한 것이다. 또한, 디히드로디피콜린산 신타제를 발현하는 신규의 외인성 DNA 구조체를 갖는 유전자변형 식물들이 제공되며, 상기 디히드로디피콜린산 신타제의 활성에 의해 식물 또는 식물생성물 내에서 리신이 증가된다.
유전자변형식물, 옥수수식물 계통 LY038

Description

고(高)리신 옥수수 조성물 및 이의 검출방법{HIGH LYSINE MAIZE COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTION THEREOF}
본 출원은 2003년 12월 11일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/529,182호의 35 USC§119(e)에 따른 우선권을 주장한다.
본 발명은 식물분자생물학 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 증가된 리신을 지닌 유전자변형 옥수수에 관한 것이고, 증가된 리신을 제공하는 특이적 외인성 DNA를 동정확인하기 위한 분석법 및 방법들에 관한 것이다.
통상적으로 옥수수 및 곡물로서 알려진, 지 메이스(Zea mays)는 동물사료로서 널리 사용되고 있는 곡물이다. 곡물, 즉 커널(kernel)은 돼지, 소 및 가금류를 위한 단백질, 전분 및 오일의 공급원이다. 혼합곡물사료 공급원에 필수적인 10종의 아미노산 중에서, 옥수수는 리신, 트레오닌 및 메티오닌이 특히 부족하다. 상기 아미노산들, 특히 리신이 부족할 경우, 사료용 옥수수 또는 옥수수 가루는 상기 영양소가 보충될 필요가 있으며, 이러한 영양소의 보충은 종종 대두 가루를 첨가하므로써 이루어진다. 동물사료로서 더 많은 영양분을 지닌 종자 및 가루를 제조하기 위한 수단으로서 옥수수 낟알 중의 리신 수준을 증가시키는 것이 이로울 것이다.
분자생물학적 접근방법을 사용하여 리신의 수준을 증가시키기 위해서, 리신 경로효소 중 적어도 하나의 피드백-둔감성 효소(feedback-insensitive version), 즉 디하이드로디피콜린산 신타아제(이하, DHDPS라고 함)가 확인 및 이용되었다. 대장균(E. Coli)에서 분리된 세균성 DHDPS 유전자는 시험관내에서(in vitro) 리신 수준 증가에 의한 억제에 대해 약 200배 덜 민감한 것으로 알려졌으며, 유전자변형 담배에 도입시에는, E. Coli DHDPS 유전자의 과잉발현으로 인해 잎 조직내 리신 수준이 증가되었다(글라스맨 등, 미국특허 제5,288,300호). Falco 등은 종자내 리신 수준이 증가된 유전자변형 식물 및 상기 유전자변형 식물을 제조하기 위해 사용가능한 유전자를 개시하고 있다(미국특허 제5,773,691호 및 제6,459,019호; 미국특허출원공보 2003/0056242, 각각은 그 전체내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨). 상기 문헌에서, Falco 등은 종자내 리신의 수준이 증가된 유전자변형 평지씨, 담배, 옥수수 및 대두 식물을 제조하기 위해 E. Coli로부터의 피드백-둔감성 DHDPS 및 코리네박테리움(Corynebacterium)(cordapA로도 알려져 있음)으로부터의 DHDPS의 분리와 사용을 설명하고 있다. 옥수수에 대해, Falco 등은 cordapA 유전자로 형질전환된 커널내에서 자유 리신이 비(非)형질전환 커널에 비해 약 130% 증가함을 보고하고 있다.
식물 또는 종자 또는 그러한 식물 또는 종자의 후대 개체(progeny)에서 특정 형질전환유전자의 존재 또는 부재를, 형질전환유전자 자체에 관해서 뿐만 아니라, 숙주식물 또는 종자의 게놈 내에서의 형질전환유전자의 위치에 관해서도 검출할 수 있다는 것은 이로울 것이다. 위치에 대해 확인함으로써, 형질전환유전자를 식물의 전구식물 또는 종자에 삽입하는 유전자조작에 의한 유전자변형 계통(transgenic event)을 추가로 확인할 수 있다.
본 발명은 유전자변형 계통을 발생시키기 위해 사용가능한 구조체들, 및 상기 구조체를 포함하지 않는 밀접하게 관련된 식물들보다 더 높은 수준의 리신을 축적하는 유전자변형 식물들을 생성시키는 특정 유전자변형 계통을 확인하기 위해 사용가능한 재료들과 방법들을 제공한다. 특히, 본 발명은 표준 옥수수 형질전환을 통해 도입된 특이적 외인성 DNA를 포함하는, 마커를 함유하지 않는 유전자변형 옥수수의 계통(라인)(이하, "LY038 계통" 또는 "계통 LY038"이라고 함)을 포함한다. 본 발명은 옥수수 식물, 종자 또는 조직시료로부터 얻은 DNA내 LY038 계통의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법을 또한 제공한다. 계통 LY038을 포함하는 본 발명의 옥수수 식물은 전구식물 또는 다른 실질적으로 관련된 식물에 비하여 커널 내에서 증가된 리신을 나타낸다. 더구나, 본 발명은 옥수수 글로불린 1 프로모터, 벼 액틴 1 인트론, 옥수수 디히드로디피콜리네이트 신타제 클로로플라스트 트랜시트(transit) 펩티드-인코딩 DNA분자, 코리네박테리움 디히드로디피콜리네이트 신타제-인코딩 DNA분자 및, 유전자변형 식물세포들과 식물들에서 작동가능하게 결합 및 발현될 때 커널 또는 이의 일부, 또는 커널 또는 식물로부터 유도된 가공 생성물내 리신 함량을 증가시키는 옥수수 글로불린 1 3' 비(非)번역 영역을 포함하는 외인성 DNA 구조체를 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구조체는 성공적인 형질전환체들을 확인하기 위하여 사용되는 마커유전자를 제거하기 위한 메카니즘의 성분으로서 존재하는 lox 부위를 더 포함한다.
특정 유전자변형 계통으로부터 유도된 식물 또는 종자를 확인하는 것에 관하여, 계통 LY038을 포함하는 신규의 옥수수 식물로부터의 게놈삽입영역, 즉, 구조체가 존재하는 게놈내 부위의 존재를 검출하기 위한 조성물들과 방법들이 제공된다. 삽입부위와 접하는 옥수수 게놈으로부터의 DNA의 일부 및 게놈에 삽입된 외인성 DNA의 적어도 일부를 포함하는 DNA 분자들이 제공된다(이하, "연접서열(junction sequence)"이라고 함).
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 염기쌍들 1781~1782 또는 200~201이 각각 포함된, 서열번호 1 또는 2의 적어도 약 20개의 염기쌍들을 포함하는 신규의 DNA 분자들이 제공된다. 본 발명에 의하여, 서열번호 3 및 4의 프라이머들을 사용하는 DNA 증폭방법에 의해 얻어진 서열번호 6의 서열을 갖는 증폭산물의 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 서열번호 5의 서열 및 이것의 상보체를 갖는, 상기 증폭산물에 대해 상보적인 혼성화 프로브를 포함하는 DNA 분자가 더 제공된다. 서열번호 5 또는 6의 서열을 갖는 DNA 분자들은 외인성 DNA와 접합(flanking) 옥수수 게놈 DNA 사이의 연접부(junction)를 연결시키며, 적당한 분석테스트에 사용될 시에 계통 LY038 DNA의 분석에 도움이 된다. 계통 LY038의 외인성 DNA/게놈 삽입영역의 연접부를 연결시키는 본 발명의 다른 바람직한 DNA 분자들은 서열번호 1, 2 및 11 및 이들의 상보체들을 갖는 분자들이다. 이들 분자들을 포함하는 안정되게 형질전환된 옥수수 식물 또는 종자는 본 발명의 다른 측면이다.
프라이머들은, PCR 반응에서 이들이 기능할 수 있고, 표적서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 길이일 때, "충분한 길이"를 갖는다고 말할 수 있으며; 약 11개 이상의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 약 18개 이상의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 약 24개 이상의 뉴클레오티드 길이, 아주 더 바람직하게는 약 30개의 뉴클레오티드 길이가 기능하기에 충분하고, 또한 특이적으로 표적 서열을 증폭시키기에 충분하다. 당업자는 약 30개의 뉴클레오티드보다 더 긴 프라이머도 PCR 반응에 유용하게 이용될 수 있고, 따라서 충분한 길이임을 알 것이다.
계통 LY038을 확인하기 위해 사용가능한 PCR 프라이머들은 충분한 길이의 서열번호 1의 DNA 서열의 형질전환유전자(transgene) 부분 및 충분한 길이의 서열번호 1의 5' 접합 옥수수 DNA 서열, 또는 충분한 길이의 서열번호 2의 DNA 서열의 형질전환유전자 부분 및 충분한 길이의 서열번호 2의 3' 접합 옥수수 DNA 서열을 포함한다. 상기 프라이머들은 계통 LY038과 그것의 후대 개체에 대해 진단가능한 DNA 증폭산물을 제공하는 PCR 방법들에 사용가능하다. 계통 LY038을 진단하기 위한 증폭산물 또는 프로브를 생성시킬 수 있는 적당한 길이의 서열번호 1 및 2에 대해 상동성이거나 또는 상보적인 PCR 프라이머들은 본 발명의 다른 측면이다. 예를 들면, 제한없이, 계통 LY038을 진단하기 위한 바람직한 프라이머들은 서열번호 3 또는 4의 서열들 중의 어느 하나의 약 18개 이상의 인접 뉴클레오티드를 갖는 프라이머들을 포함한다. 계통 LY038과 그의 후대 개체를 진단하기 위한 DNA 프라이머들을 사용하여 제조된 증폭산물들은 본 발명의 하나의 측면이다. 계통 LY038을 진단하기에 바람직한 증폭산물은 서열번호 6의 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 측면은 시료 내에 계통 LY038에 상응하는 DNA가 존재하는지 부재하는지를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 옥수수 식물, 종자 또는 조직으로부터 DNA를 수득하는 단계, 시료 DNA를 PCR 프라이머 셋트와 접촉시키는 단계, PCR을 실시하는 단계 및 증폭산물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 계통 LY038을 진단하기에 바람직한 PCR 프라이머들은 서열번호 3 및 4의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 포함하며, 이들은 예를 들면, 서열번호 5의 서열을 갖는 LY038 계통-특이적 프로브에 의해 검출가능한, 서열번호 6의 서열을 갖는 LY038 계통-특이적 증폭산물을 생성한다.
계통 LY038의 존재를 나타내는 프로브를 계통 LY038에 대해 특이적인 DNA를 포함하는 증폭산물에 혼성화하는 것은 분자생물학 분야의 당업자들에게 알려진 다른 방법들 가운데에서 TaqMan® 분석법, 서던 블롯(Southern blot) 방법들을 포함하는 핵산조작기술들에 사용가능한 적당한 방법들에 의해 검출될 수 있다. 당업자는 증폭산물의 검출이 아크릴아미드겔 또는 아가로즈겔 분석과 같은, 증폭산물에 프로브를 혼성화하는 것을 포함하지 않는 검출방법에 의해 실시될 수 있음을 알 것이다. 당업자는 또한 프라이머와 프로브 모두의 길이와 서열 모두가 서열번호 3, 4 및 5로 나타낸 예시 서열들로부터 변경될 수 있으며, 변경된 것들도 계통 LY038을 진단하기 위한 PCR 증폭산물, 또는 증폭산물과 프로브 셋트를 생성한다는 것을 알 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 계통 LY038 DNA를 포함하는 후대 개체 식물들을 제조하는 방법을 제공한다. 후대 개체 식물들은 동계번식계(inbred) 또는 혼성번식계(hybrid) 식물들이다. 다른 적용예에서, 본 발명은 계통 LY038 DNA에 대해 마커- 보조된 육종을 실시하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 계통 LY038 DNA를 포함하고, 커널 또는 이들의 일부내에 리신이 증가된 안정되게 형질전환된 옥수수 식물이 제공된다.
본 발명은 또한 계통 LY038 또는 이의 후대 개체에 대해 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로서 기능하는, 서열번호 1 또는 2에 대해 상동성이거나 또는 상보적인 충분한 길이의 인접 뉴클레오티드들의 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 DNA 검출 킷트(kit)에 관한 것이다.
본 발명은 ATCC 기탁 NO. PTA-5623으로 기탁된 대표적 종자를 갖는 계통 LY038과 이들로부터 유래된 후대 개체를 포함하는 고(高) 리신 옥수수(지 메이스)의 식물들 및 종자들 및 이들의 가공 생성물들에 관한 것이다. 예를 들면, 계통 LY038 DNA를 포함하는 식물을 성장시켜서 제조된 화분 또는 종자를 포함하는 옥수수 식물 또는 이의 일부분이 본 발명에 의해서 추가로 제공된다. 본 발명의 DNA 프라이머 분자들이 계통-특이적 서열들의 검출을 위하여 유용하게 이용되는 계통 LY038 DNA를 포함하는 옥수수 식물과 종자는 본 발명의 또 다른 측면이다.
계통 LY038의 가공 생성물은 옥수수 커널의 일부, 예를 들면, 내배유를 포함한다. 본 발명의 옥수수 가루는 LY038의 유전자변형 DNA 분자를 포함하는 커널로부터 제조될 수 있으며, 여기에서 상기 옥수수 가루는 상기 DNA 분자를 포함하지 않는 다른 옥수수 가루에 비하여 리신 수준이 높다.
본 발명의 전술한 측면들 및 다른 측면들은 하기 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 도면을 통해 더 분명하게 될 것이다. 하기 실시예들은 본 발명의 어떤 바람직 한 구체예들의 예를 입증하기 위해 포함된다. 하기의 실시예들에 개시된 기술내용들은, 본 발명의 실시에 있어서 잘 기능하고, 따라서 본 발명의 실시를 위하여 바람직한 방법들의 예들을 구성하는 것으로 고려될 수 있는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀진 접근방법들을 나타낸다는 것을 당업자들은 이해해야만 한다. 그러나, 당업자들은 본 발명의 개시내용에 비추어 볼 때, 개시된 특정 구체예들을 많이 변형시킬 수 있으며, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 명세서에 사용된 정의된 서열들을 갖는 분자들은 본 출원과 동시에 제출된 서열 목록에 설명되어 있다.
서열 목록의 요약은 다음과 같다;
서열번호 1은 삽입부위의 5'측에 접합하는 옥수수 게놈부분(bp 1~1781) 및 LY038 계통 DNA의 형질전환유전자 삽입부분(bp 1782~1961)을 포함하는 5' DNA의 1961 염기쌍(bp) 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 2는 삽입부위의 3'측에 접합하는 3' 옥수수 게놈부분(bp 201~867) 및 LY038 계통 DNA의 형질전환유전자 삽입서열(bp 1~200)을 포함하는 3' DNA 의 867 bp 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 3 및 4는 계통 LY038 DNA를 진단하기 위한 증폭산물을 제조하는데 사용가능한 PCR 프라이머들의 폴리뉴클레오티드 서열들이다.
서열번호 5는 계통 LY038 DNA를 검출하기 위한 증폭산물에 혼성화하기 위해 사용가능한 올리고뉴클레오티드 프로브의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 6은 계통 LY038 DNA를 진단하기 위한 증폭산물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 7은 옥수수 글로불린 1 프로모터(bp 48~1440; Kriz, Biochem. Genet., 27:239-251, 1989; Belanger와 Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991; 미국특허 제6,329,574호; 이들 문헌은 그 전체내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다), 벼 액틴 1 인트론(bp 1448~1928; McElroy 등, Plant Cell, 2:163-171, 1990), 옥수수 DHDPS 클로로플라스트 트랜시트 펩티드(bp 1930~2100; Frisch 등, Mol. Gen. Genet., 228:287-293, 1991), 코리네박테리움 DHDPS 유전자(bp 2101~3003; Bonnassie 등, Nucleic Acids Research, 18: 6421, 1990); Richaud 등, J. Bacteriol., 166: 297-300, 1986), 옥수수 글로불린 1 3' 비번역 영역(bp 3080~4079; Belanger와 Kriz, 상게서) 및 lox P 부위(bp 4091~4124; Russell 등, Mol. Gen. Genet., 234: 45-59, 1992)의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 8은 코리네박테리움 DHDPS 유전자(Bonnassie 등, Nucleic Acids Research, 18:6421, 1990; Richaud 등, J. Bacteriol, 166:297-300, 1986)의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 9는 LY038 계통의 삽입부위의 5' 측에 접합되는 추가의 옥수수 게놈 DNA의 1736 염기쌍 폴리뉴클레오티드 서열이다(도 2A 참조).
서열번호 10은 LY038 계통의 삽입부위의 3' 측에 접합되는 추가의 옥수수 게놈 DNA의 359 염기쌍 폴리뉴클레오티드 서열이다(도 2A 참조).
서열번호 11은 도 2C에 예시된 유전자변형 삽입 DNA의 10개의 인접 뉴클레오티드와 연접(junction) 서열의 옥수수 게놈 DNA의 10개의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 20개의 염기쌍 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 명세서에서 사용된 "외인성 DNA"는 DNA가 발견되는 특정의 구조체, 세포 또는 유기체로부터 자연적으로 유래하지 않는 DNA를 의미한다. 외인성 DNA는 게놈내 새로운 위치에 게놈 고유의 DNA 또는 RNA 서열을 포함하거나, 또는 게놈의 원래 상태에서는 외인성 DNA와 자연적으로 결합되지 않는 다른 서열 요소들에 결합된 게놈 고유의 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 식물세포들을 형질전환하기 위하여 사용된 재조합 DNA 구조체는 외인성 DNA 및 하기에 설명되는 다른 요소들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "형질전환유전자(transgene)"은 숙주 게놈 내로 혼입된 외인성 DNA를 의미하거나 또는 숙주세포 내에서 자율복제할 수 있으며, 1개 이상의 세포 생성물을 발현시킬 수 있는 외인성 DNA를 의미한다. 전형적인 형질전환유전자는 대응하는 형질전환되지않은 선구세포 또는 식물, 또는 다른 형질전환유전자를 포함하지만 해당 형질전환유전자를 포함하지 않는 대응하는 형질전환된 선구세포 또는 식물에 대해 새로운 표현형을 갖는 숙주세포 또는 이로부터 재생된 식물을 제공한다. 형질전환유전자는 유전자 형질전환에 의해 식물 내로 곧바로 도입될 수 있거나 또는 외인성 DNA에 의해 형질전환된 선대의 식물로부터 이어받을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "유전자" 또는 "코딩서열"은 RNA 분자가 전사되는 DNA 서열을 의미한다. RNA는 단백질 생성물을 인코딩하는 mRNA, 안티센스 분자로서 기능하는 RNA, 또는 구조 RNA 분자, 예컨대 tRNA, rRNA, snRNA 또는 다른 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "발현"은 DNA 분자, 예컨대 유전자가 폴리펩티드 또는 RNA 분자를 생성하는데 사용되는 전사와 번역을 포함하는 세포간 공정의 조합을 의미한다. 전형적인 코딩서열은 리신이 증가된 옥수수 커널을 제조하기 위해 사용가능한 코리네박테리움 디히드로디피콜리네이트 신타제 유전자(DHDPS:Bonnassie 등, Nucleic Acids Research, 18:6421, 1990; Richaud 등, J. Bacteriol, 166:297-300. 1986; 서열번호 7 및 8의 bp 2101~3003)이다. 커널 조직 내에서 리신을 증가시키는 코리네박테리움 DHDPS 유전자를 포함하고 발현하도록 형질전환된 옥수수 식물은 고(高) 리신 옥수수 식물이라고도 한다.
본 명세서에서 사용된 "프로모터"는 DNA 전사를 개시하는데 필수적인 DNA 서열의 영역을 의미하며, 이는 전사된 DNA에 대해 상보적인 RNA를 생성시키며; 이 영역은 또한 "5' 조절 영역"이라고도 한다. 프로모터들은 전사될 코딩서열의 상류에 위치하고, RNA 폴리머라제에 대한 결합부위로서 작용하는 영역을 가지며, RNA 전사를 촉진시키기 위해 다른 요소들과 함께 작동하는 영역들을 갖는다. 유용한 식물 프로모터들은 구성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직특이적 프로모터, 임시조절 프로모터, 일주기성 조절 프로모터, 한발 유도성 프로모터, 스트레스 유도성 프로모터, 성장 조절 프로모터, 저온 유도성 프로모터, 광 유도성 프로모터 등을 포함한다. 본 발명에 대해 특히 중요한 프로모터는 배유-특이적 프로모터, 예컨대 옥수수 글로불린 1 프로모터(Kriz, Biochem. Genet., 27:239-251, 1989; Belanger와 Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991: 서열번호 7의 bp 48~1440)이나, 이에 제한되지는 않는다.
당 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 재조합 DNA 구조체들은 전형적으로 프로모터 이외의 다른 조절 요소들, 예컨대 3' 비(非)번역영역들(예컨대, 폴리아데닐화 부위 또는 전사종료시그널), 트랜시트 펩티드 또는 시그널 펩티드, 인트론 및 마커 유전자 요소들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명을 실시하는데 사용가능한 3' 비번역 영역(3' UTR)은 글로불린 1 3' UTR(Kriz, Biochem, Genet, 27:239-251, 1989; Belanger와 Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991; 서열번호 7의 bp 3080~4079)이다. 특히 사용가능한 트랜시트 펩티드는 옥수수 DHDPS 트랜시트 펩티드(Frisch 등, Mol. Gen, Genet, 228:287-293, 1991: 서열번호 7의 bp 1930~2100)이다. 본 발명에 있어서 유용한 인트론은 벼 액틴 1 인트론 1(McElroy 등, Plant Cell, 2:163-171, 1990; 서열번호 7의 bp 1448-1928)이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "옥수수"는 또한 곡물로도 알려진 지 메이스(Zea mays)를 의미하고, 야생의 옥수수종들을 포함하는, 옥수수와 함께 번식될 수 있는 모든 식물변종들을 포함한다. 본 발명을 실시하는데 있어서 식물 게놈 내로 외인성 DNA를 도입시킴으로써 식물들을 형질전환하기 위한 방법들과 조성물들은 공지의 입증된 방법들이면 어느 방법이나 포함할 수 있다. 지금까지, 미립자-매개된 유전자 전달 및 아그로박테리움-매개된 유전자 전달은 2개의 가장 통상적으로 사용되는 식물 형질전환법들이다. 미립자-매개된 형질전환은 여러 방법들에 의해 표적조직들 내로 추진되는 미립자들 상에 코팅된 DNA를 전달하는 것을 뜻한다. 아그로박테리움-매개된 형질전환은 아그로박테리움 속에 속하는 유전공학적으로 처리된 토양 박테리아를 사용하여 이루어진다. 여러 아그로박테리움 종들은 "T-DNA"로 도 알려져 있는 특이적 DNA의 전달을 매개하며, 이는 수많은 식물종들 내로 어떤 원하는 DNA 조각을 운반하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 바람직한 식물 형질전환 방법들은 미국특허 제5,015,580호; 제5,550,318호; 제5,538,880호; 제6,160,208호; 제6,399,861호; 및 제6,403,865호에 개시되어 있는 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 미국특허 제5,635,055호; 제5,824,877호; 제5,591,616호; 제5,981,840호; 및 제6,384,301에 개시되어 있는 아그로박테리움-매개된 형질전환법이다.
본 명세서에서 사용된 "유전자변형" 유기체는 외부 유전물질 또는 천연 유전물질의 또다른 복제물들을 혼입시킴으로써, 예를 들면 형질전환 또는 재조합에 의해 게놈이 변형된 유기체이다. 유전자변형 유기체는 식물, 포유동물, 균류, 박테리아 또는 바이러스일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "유전자변형 식물"은 안정되게 형질전환된 식물 또는 이로부터 이후에 발생된 후대 개체 식물을 의미하며, 여기에서 식물 또는 이의 후대 개체의 DNA는 동일한 종의 비-유전자변형 식물 내에 원래 존재하지 않는 도입된 외인성 DNA를 함유한다. 유전자변형 식물은 형질전환되는 식물에 대해 천연적인 서열들을 부가적으로 포함할 수 있지만, 여기에서 외인성 DNA는 유전자의 발현수준 또는 패턴을 변경시키기 위해 변형되었다.
본 명세서에서 사용된 "안정적으로" 형질전환된 식물은 외인성 DNA가 유전성인 식물이다. 외인성 DNA는 식물 세포 내에서 유지된 DNA의 단편으로서 유전될 수 있고, 숙주 게놈 내로는 삽입되지 않는다. 바람직하게는, 안정적으로 형질전환된 식물은 핵, 미토콘드리아, 또는 엽록체, 가장 바람직하게는 핵염색체 DNA 내로 삽 입된 외인성 DNA를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "R0 유전자변형 식물"은 외인성 DNA에 의해 직접 형질전환된 식물 또는 외인성 DNA에 의해 형질전환된 세포 또는 세포 클러스터로부터 재생된 식물이다. 본 명세서에서 사용된 "후대 개체"는 특정 모식물 또는 모식물들의 세트로부터 유도된, 종자들 및 이로부터의 식물들을 포함하는 이후의 세대를 의미하고; 수득된 후대 개체 계통은 동계번식계 또는 혼성번식계이다. 본 발명의 유전자변형 식물의 후대 개체는 예를 들면, 자식성(self-crossed) 후대 개체, 유전자변형 식물에 교배된 후대 개체, 비-유전자변형 식물에 교배된 후대 개체 및/또는 역교배된 후대 개체일 수 있다.
본 발명의 식물들의 종자들은 임성(fertile) 유전자변형 식물들로부터 수확될 수 있고, 옥수수 커널 내에서 리신이 증가된다는 잇점을 제공하는, 계통 LY038의 외인성 DNA를 포함하는 혼성교배 식물계통을 포함하는, 본 발명의 식물들의 후대 개체를 성장시키는데 사용될 수 있다. 옥수수 커널은 가루 및 오일 생성물로 가공될 수 있으며, 또는 커널은 가공 없이 동물들에게 공급될 수 있다. 특히 가루 생성물은 리신 증가라는 개선된 작물학적 특성을 포함한다. 본 발명은 다른 옥수수 가루들에 비하여 리신이 증가된 옥수수 가루를 포함하며, 상기 옥수수 가루는 계통 LY038의 외인성 DNA를 포함한다.
"계통 LY038 DNA"라는 용어는 외인성 DNA를 포함하는 모식물로부터 후대 개체 식물에 전달되기를 기대하는 게놈내 특정 위치에 삽입된 외인성 DNA 및 인접한 접합 게놈 DNA를 포함하는 DNA 세그먼트를 의미한다. 좀 더 상세하게는, 계통 LY038 DNA는 게놈 DNA와 R0 형질전환체의 게놈 내에 삽입된 외인성 DNA의 계면을 포함하는 각각의 DNA 영역, 예를 들어, 5' 말단이 게놈 DNA 내에 있고, 3' 말단이 외인성 DNA 내에 존재하는 하나의 계면 주위의 영역을 의미하기도 한다. 더구나, 계통 DNA를 포함하는 외인성 DNA의 서열은 숙주 게놈 내에서 특정 위치에 존재하는 동안에 변경될 수 있으며, 예를 들면, 서열의 일부가 변환되거나, 결실되거나 또는 증폭될 수 있고, 그러나 여전히 상기 외인성 DNA가 게놈 내에서 동일한 위치에 계속 존재하도록 상기 계통 DNA를 구성한다.
유전자변형 "계통"은 외인성 DNA 구조체로 식물세포를 형질전환시킴으로써 생성되며, 식물의 재생은 식물의 게놈 내에 외인성 DNA를 삽입하고, 계통 DNA에 의해 특징화된 특정 식물을 선택함으로써 식물이 재생된다. 전형적으로, 많은 식물세포들이 형질전환되어, 특정 식물이 선택되어지는 식물들의 개체군을 형성한다. "계통"이라는 용어는 원래의 R0 형질전환체, 및 게놈내 특정의 유일한 위치에 삽입된 외인성 DNA, 즉 계통 DNA를 포함하는 형질전환체의 후대 개체를 의미한다. "계통"이라는 용어는 성적 이계교배, 자기교배 또는 반복적 역교배에 의해 생성된 후대 개체를 의미하고, 여기에서 육종에 사용된 식물들중 적어도 하나는 계통 DNA를 포함하는 원래의 R0 형질전환체 중 어느 한 세대이다.
따라서, 유전자변형 "계통(event)"은 "계통 DNA"를 포함하는 식물이며, "계통 DNA"로 정의된다. 이 방법에서, "계통 LY038"은 "LY038 계통 DNA"를 포함한다. 식물은 2개 이상의 상이한 계통 DNA들을 포함할 수 있으며, 따라서 2개 이상의 상이한 계통을 포함한다. 또한, 주어진 형질전환유전자 계통 X가 결여된 식물은 계통 DNA X를 포함하지 않는다. 계통 DNA는 옥수수 육종 분야의 당업자들에게 공지되어 있는 임의의 육종 계획, 방법 또는 수단에 의해 식물에서 식물로, 세대에서 세대로 전달될 수 있다.
식물들의 형질전환은 전형적으로 형질전환되지않은 세포들로부터 배양물 중의 형질전환 세포들을 식별하기 위하여 선택가능한 마커와 선택방법을 이용한다. 몇 가지 경우에, 선택가능한 마커 유전자는 유전자변형 식물에 남아 있으며; 다른 경우에는 선택가능한 마커 유전자 또는 외인성 DNA내에 도입된 다른 서열들을 제거하는 것이 바람직하다. 상동재조합은 유전자변형 식물 내에 내재하고 있는 마커 유전자들을 결실시키는데 사용가능한 한 방법이다(미국특허 제6,580,019호, 그 전체내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨). 식물로부터 서열들을 제거하기 위해 사용가능한 다른 수단은 부위-특이적 재조합효소들과 이들 각각의 부위-특이적 표적부위들을 사용하는 것을 포함한다.
다수의 상이한 부위-특이적 재조합효소 시스템들이 본 발명에 따라서 이용가능하고, 이는 박테리오파지 P1의 Cre/lox 시스템 및 효모의 FLP/FRT 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 박테리오파지 P1 Cre/lox 시스템과 효모 FLP/FRT 시스템은 부위-특이적 통합 또는 형질전환유전자들의 제거(excision)에 사용가능한 2개의 시스템을 구성한다. 이들 시스템에서, 재조합효소(Cre 또는 FLP)는 개재서열들을 전환 또는 제거시키기 위해서 각각의 부위-특이적 재조합 서열(각각 lox 또는 FRT)과 특이적으로 상호작용할 것이다. 상기 두 시스템들의 각각에 대한 서열은 비교적 짧으며(lox에 대해 34bp 및 FRT에 대해 47bp), 따라서 형질전환 벡터로서 사용하기에 편리하다. FLP/FRT와 Cre/lox 재조합효소 시스템은 식물 세포내에서 효율적으로 기능한다는 것이 입증되었다. 바람직한 구체예에서, Cre/lox 재조합효소 시스템은 선택가능한 마커 서열들, 특히 lox P 재조합 부위들에 의해 접합된 NPT Ⅱ 마커 유전자(도 1 참조)의 제거에 이용된다(서열번호 7의 bp 4091~4124; Russell 등, Mol. Gen. Genet., 234:45-59, 1992).
개선된 목적 형질, 즉, "증가된 리신"을 보여주는 유전자변형 식물, 이의 종자 또는 부분들은 목적하는 외인성 DNA가 결핍된 동일한 유전자형을 실질적으로 갖는 식물과 비교시에, 측정가능한 형질 변화를 부여하는 외인성 DNA를 포함하는 식물이다. 바람직하게는, 개선된 목적 형질은 개선된 목적 형질과 연관된 외인성 DNA를 지닌 유전자변형 식물의 형질을 상기 외인성 DNA가 결핍된 동일한 유전자형을 실질적으로 갖는 식물의 형질과 비교함으로써 측정된다.
상기 외인성 DNA가 결핍된 식물은 상기 유전자변형 식물과 동일한 종의 자연 야생형 식물 또는 어떤 유전자변형 식물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 외인성 DNA가 결핍된 식물은 목적하는 외인성 DNA를 포함하는 식물의, 목적하는 외인성 DNA가 결핍된 동기(sibling)이다. 상기 동기 식물은 다른 외인성 DNA를 포함할 수 있다. 증가된 리신은 커널 내에 증가된 양의 아미노산을 축적시킴에 의해 식물에 발현될 수 있고, 이는 적당한 방법, 예컨대 적당히 추출된 조직의 분광광도측정법 또는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"는 검출가능한 라벨 또는 리포터 분자(reporter molecule), 예를 들면, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제, 염료 또는 효소가 부착될 수 있는 분리형 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 프로브는 표적 핵산의 하나의 가닥에 상보적이다. 본 발명의 경우에, 이러한 프로브는 계통 LY308로부터의 게놈 DNA, 예를 들면, 계통 LY038의 옥수수식물 또는 종자 또는 다른 식물부분으로부터의 게놈 DNA의 하나의 가닥에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브들은 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고, 이 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 DNA, RNA 및 폴리아미드를 포함하는 물질들이다.
"프라이머들"은 핵산 혼성화에 의해 상보적 표적 DNA 가닥에 어닐(anneal)된후 폴리머라제, 예컨대 DNA 폴리머라제에 의해 표적 DNA 가닥을 따라서 신장될 수 있는 분리형 올리고뉴클레오티드들이다. 여기에서 사용된 본 발명의 프라이머들은 예를 들면, PCR(폴리머라제 연쇄반응)에 의한 표적핵산서열의 DNA 증폭에 사용되며, 또한 "PCR 프라이머"라고도 한다.
프로브들과 프라이머들은 당업자에 의해 결정된 혼성화 조건 또는 반응조건 하에서 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하기에 충분한 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이 길이는 선택한 검출법에서 사용되기에 충분한 길이이면 어떤 길이나 될 수 있다. 대개, 약 11개 이상의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 18개 이상의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 약 24개 이상의 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 길이가 사용된다. 이러한 프로브들과 프라이머들은 표적에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 표적 DNA 서열과 상이하 고, 표적 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 능력을 갖는 프로브는 종래의 방법에 의해서 제조될 수 있지만, 본 발명에 따른 프로브들과 프라이머들은 표적서열과 인접 뉴클레오티드가 유사한 완전한 DNA 서열을 갖는다. 프로브들과 프라이머들을 제조하고 사용하는 방법들, 예를 들면, Sambrook 등, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 등에 공개된 프로토콜을 사용한 방법들은 당업자들에 공지되어 있다.
유전자변형 계통의 삽입부위를 에워싸는 접합 게놈 DNA 서열들의 동정확인에 의해, 게놈내 특별한 위치에 삽입된 주어진 유전자변형 계통에 대해 특이적인 검출법들이 디자인된다. 게놈 내에서 상이한 삽입부위들에 위치된 동일하거나 또는 유사한 형질전환유전자들을 분별할 수 있는 상기 검출법은 계통-특이적 DNA 검출법, 예를 들면, 계통-특이적 분석법이라고 불리운다. 예를 들면, 글리포세이트 저항성 옥수수 계통 nk603을 위한 계통-특이적 분석법은 미국 특허출원공보 2002/0013960(전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)에 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 프로브는 서열번호 3~6의 핵산서열 또는 이의 상보체, 가장 바람직하게는 서열번호 5의 핵산서열 또는 이의 상보체를 갖는, LY038 계통-특이적 증폭산물에 특이적으로 혼성화한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 바람직한 핵산 프로브 분자는 서열번호 3~6 중의 어느 하나의 서열 또는 이의 상보체 또는 단편들과 약 80%, 바람직하게는 약 90%, 더 바람직하게는 약 95%, 아주 더 바람직하게는 약 98%, 및 가장 바람직하게는 약 99%의 서열 동일성을 공유한다. 계통 LY038을 진단하기 위한 프로브들은 서열번호 6의 서열을 갖는 다. 이러한 프로브 분자들은 유전 교배의 후대 개체를 확인하기 위한 식물 육종법에서 식물내 마커로서 당업자들에 의해 사용될 수 있다. 표적 DNA분자에 대한 프로브의 혼성화는 당업자들에 공지된 방법들 중의 어떤 방법에 의해 검출될 수 있다. 이들 검출방법들은, 형광성 표지(tag), 방사성 표지, 항체 기본 표지 및 화학발광 표지를 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 "상동성"은 고도의 엄격한 조건 하에서 비교되는 핵산서열의 상보체에 특이적으로 혼성화될 핵산서열을 의미한다. DNA 혼성화를 촉진시키는 시간, 온도 및 염 조건의 조건들을 포함하는 적당한 엄격한 조건들은 당업자들에 공지되어 있다. 온도와 염이 모두 변화하거나, 또는 온도 또는 염 농도가 일정하게 유지되는 반면 다른 변수가 변한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리핵산은 매우 엄격한 조건 내지 적당하게 엄격한 조건하에서, 서열번호 1 또는 2로 나타낸 1개 이상의 핵산분자들 또는 이들의 상보체들 또는 단편들에 특이적으로 혼성화할 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 매우 엄격한 조건 하에서 서열번호 1 또는 2로 나타낸 1개 이상의 핵산분자들 또는 이들의 상보체들 또는 단편들에 특이적으로 혼성화할 것이다. 표적 DNA분자에 대한 프로브의 혼성화는 당업자들에 공지된 방법들 중의 어느 한 방법에 의해 검출될 수 있으며, 이들은 형광성 표지, 방사성 표지, 항체 기본 표지 및 화학발광 표지를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
여기에서 사용된, "증폭산물(amplicon)"은 핵산 주형(template)의 일부분인 표적 핵산서열의 핵산 증폭 생성물을 의미한다. 예를 들면, 성적교배로부터 얻은 옥수수 식물이 외인성 LY038 DNA를 포함하는 옥수수 식물로부터의 유전자변형 계통 게놈 DNA를 함유하는지를 측정하기 위해, 삽입된 이종성 DNA의 삽입부위에 인접한 식물의 게놈내 접합서열로부터 유도된 제1 프라이머, 및 계통 DNA의 존재를 진단하기 위한 증폭산물을 제조하기 위해 삽입된 이종성 DNA로부터 유도된 제2 프라이머를 포함하는 DNA 프라이머 쌍을 사용하는 핵산증폭 방법으로 옥수수식물 조직샘플로부터 추출한 DNA를 처리할 수 있다. 증폭산물은 계통을 진단하기 위한 일정한 길이 및 서열을 갖는다. 증폭산물은 증폭산물을 검출하기 위하여 사용된 방법에 따라서 프라이머 쌍 + 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 바람직하게는 프라이머 쌍 + 약 20개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 더욱 바람직하게는 프라이머 쌍 + 약 50개의 뉴클레오티드 염기 쌍, 및 아주 더 바람직하게는 프라이머 쌍 + 약 150개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합 길이의 길이범위일 수 있다. 대안으로서, 프라이머 쌍은 전체 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함하는 증폭산물을 생성하기 위하여 상기 삽입된 DNA의 양쪽 측면 상의 접합서열로부터 유도될 수 있다. 식물 게놈서열로부터 유도된 프라이머 쌍의 멤버는 삽입된 DNA 서열로부터 상당한 거리에 위치될 수 있다. 이러한 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍으로부터 증폭반응의 제한에 이르는 범위일 수 있거나 또는 약 20,000개의 뉴클레오티드 염기 쌍들에 이르는 범위일 수 있다. 용어 "증폭산물"의 사용은 DNA 열적 증폭반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이합체들을 특별히 제외한다.
핵산증폭은 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 포함하는 당 기술 분야에 공지된 여러 가지의 핵산증폭 방법들 중의 어느 한 방법에 의해서 이뤄질 수 있다. 계통 LY038로부터의 이종성 DNA 삽입서열 또는 접합 DNA 서열은 본 명세서에서 제공된 서열들로부터 유도된 DNA 프라이머들을 사용하여 ATCC 기탁번호 PTA-5623 종자 또는 식물들로부터 추출된 DNA로부터의 상기 서열들을 증폭시킨 후 PCR 증폭산물 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 서열화(sequencing)에 의해 검증(및, 필요하다면 교정)될 수 있다.
본 명세서에 개시된 접합 게놈 DNA와 삽입서열들을 기초로 하는 프라이머들과 프로브들은 종래의 방법들, 예를 들면, 상기 DNA 분자들을 재-클로닝하고 서열화하는 방법에 의해 상기 개시된 DNA 서열들을 확인(및, 필요하다면 교정)하는데 사용될 수 있다.
증폭방법들에 의해 제조된 증폭산물들은 겔을 기초로 하는 분석법, 유전자 조각(bit)분석법(Nikiforov 등, Nucleic Acid Res., 22:4167-4175, 1994), 파이로시퀀싱(pyrosequencing)(Winge, M., Pyrosequencing - a new approach to DNA analysis, (2000), Innovations in Pharmaceutical Technology, vol. 00, 4, p18-24), 형광편광법(Chen. 등, Genome Res., 9:492-498; 1999) 및 분자 비콘(Tyangi 등, Nature Biotech, 14:303-308, 1996)을 포함하는 다수의 기술들에 의해 검출 가능하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 특별한 관심이 있는 방법은 Taqman®분석법(Applied Biosystems제; Foster City, California)에 의한 검출이다. Taqman®분석법은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량화하는 방법이며, 이는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 제조사에 의해 제공된 설명서에 상세히 기술되어 있다. 이 방법은 특별한 FRET 올리고뉴클레 오티드 프로브를 사용한 혼성화에 의한 PCR 증폭 및 증폭 생성물의 검출을 사용하는 것을 포함한다. FRET 올리고뉴클레오티드 프로브는 프로브의 5'와 3' 말단들에 공유결합된 5' 형광성 리포터 염료와 3' 퀀처(quencher) 염료를 갖도록 디자인된다. 프로브는 게놈 DNA와 삽입된 DNA의 연접부를 오버랩하도록 디자인된다. FRET 프로브와 PCR 프라이머들(외인성 형질전환유전자 DNA 서열내의 1개의 프라이머 및 접합 게놈 서열내의 1개의 프라이머)은 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에서 순환된다. FRET 프로브를 혼성화함으로써 FRET 프로브상의 퀀칭 부분으로부터 형광 성분이 제거 및 방출된다. 형광 시그널은 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 접합/형질전환유전자 삽입 서열이 존재함을 표시한다.
Taqman®분석법에 사용하기에 바람직한 PCR 프라이머들은
(a) 접합 게놈 DNA와 형질전환유전자 삽입체내의 서열들에 매칭되는 18개 내지 25개의 염기들의 길이를 갖도록,
(b) 예를 들면, 약 52℃ ~ 55℃의 최적의 PCR 어닐링 온도에 상응하는 약 57℃ ~ 약 60℃의 계산된 용융 온도 범위를 갖도록,
(c) 접합 게놈 DNA와 형질전환유전자 삽입체 사이의 연접부를 포함하고, 약 75개 내지 약 250개의 염기쌍 길이를 갖는 생성물을 제조하도록 디자인된다.
PCR 프라이머들은, 바람직하게는, 연접 서열이 각각의 PCR 프라이머의 3' 말단으로부터 1개 이상의 염기 만큼 거리를 두도록 로커스(locus) 상에 위치되는 것이 바람직하다. PCR 프라이머들은 광범위하게 자기-상보적 또는 내부-상보적인 영 역들을 함유하지 않아야 한다.
FRET 프로브들은 연접 서열의 서열을 연결시키기 위해 디자인된다. 바람직한 구체예에서, FRET 프로브는, 프로브가 주형 DNA에 어닐링될 때 DNA의 소홈(minor groove)에 결합하여 프로브-주형 복합체의 안정성을 개선시키는 화학 성분이 3' 말단에 혼입될 것이다. 프로브들은 바람직하게는 약 12개 ~ 약 17개의 염기들의 길이를 가지며, 3' 소홈 결합 성분과 함께, 프로브들은 PCR 프라이머들의 용융점보다 약 5℃ ~ 약 7℃ 높은 계산된 용융온도를 갖는다. 프로브 디자인은 미국특허 제5,538,848호; 제6,084,102호; 및 제6,127,121호에 개시되어 있다.
본 발명의 서열들을 이용하는 다른 분석법은 접합자(zygosity) 분석법이다. 접합자 분석법은 계통을 포함하는 식물이 계통 DNA에 대해 동형접합성(염색체 쌍의 각 염색체 상의 동일한 위치에 외인성 DNA를 포함하는 것)인지, 또는 계통 DNA에 대해 이형접합성(염색체 쌍의 단지 1개의 염색체 상에 외인성 DNA를 포함하는 것)인지를 결정하는데 사용가능하다. 한 구체예에서, 프라이머 1이 삽입된 외인성 DNA에 특이적으로 혼성화하여, 그로부터 신장하고, 프라이머 2는 삽입된 외인성 DNA의 5' 측면에 접합하는 DNA에 특이적으로 혼성화하여, 그로부터 신장하며, 그리고 프라이머 3은 삽입된 외인성 DNA의 3' 측면에 접합하는 DNA에 특이적으로 혼성화하여, 그로부터 신장하는, 3개 프라이머 분석법이 사용된다. 3개의 프라이머들은 계통을 위한 진단용이다. 전형적으로, 상기 외인성 DNA는 예를 들면, 약 3 내지 약 7 킬로베이스 이상의 크기를 가져서, 프라이머 1과 프라이머 3은 PCR 반응에서 증폭산물을 더 이상 생성하지 못한다. 주어진 계통에 대하여 동형접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 PCR 반응에서 3개의 프라이머들을 혼합시에는, 프라이머 1과 프라이머 2에 의해 단일 증폭산물이 생성되며, 이들의 크기와 서열은 상기 계통 DNA의 지표 및 진단수단이 될 것이다. 주어진 계통을 포함하지 않는 식물로부터 추출된 DNA와 함께 PCR 반응에서 3개의 프라이머들을 혼합시에는, 프라이머 1과 프라이머 3에 의해 단일 증폭산물이 생성되고, 이들의 크기와 서열은 외인성 DNA가 결핍된 옥수수 게놈 DNA의 지표 및 진단수단이 될 것이다. 주어진 계통에 대하여 이형접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 PCR반응에서 3개의 프라이머들을 혼합시에는, 2개의 증폭산물이 생성된다: 1) 증폭산물은 프라이머 1과 프라이머 3에 의해 생성되고, 이의 크기와 서열은 외인성 DNA가 결핍된 옥수수 게놈 DNA의 지표 및 진단수단이 될 것이며, 그리고 2) 증폭산물은 프라이머 1과 프라이머 2에 의해 생성되고, 이의 크기와 서열은 상기 계통 DNA의 지표 및 진단수단이 될 것이다. 접합자 분석법에 의해 생성된 여러 증폭산물들을 검출하는 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 겔 전기영동, Taqman®분석법, 서던 블롯법, 인베이더(Invader)기술, 서열화, 분자 비콘, 파이로시퀀싱 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
DNA 검출킷트는 본 명세서에 개시된 조성물들과 DNA 검출 분야에서 잘 알려진 방법들을 사용함으로써 개발될 수 있다. 킷트들은 시료 내에서 옥수수 계통 LY038 DNA를 확인하기 위해 사용가능하고, 계통 LY038 DNA를 포함하는 옥수수 식물들을 육종하는 방법에 이용될 수 있다. 킷트들은 프라이머 또는 프로브로서 사용가능하고 서열번호 1 또는 2의 어느 부분에 상동성이거나 또는 상보적인 DNA 서열들, 또는 옥수수 식물 게놈에 삽입되어 계통 LY038(도 2)을 형성하는 pMON55221(도 1)의 형질전환유전자 유전요소들 중 어느 하나에 함유된 DNA에 상동성이거나 또는 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 상기 DNA 서열들은 DNA 증폭방법들(PCR)에 사용될 수 있거나, 또는 폴리핵산 혼성화 방법들, 예를 들면, 서던 분석법 또는 노던 분석법에서 프로브로서 사용가능하다. LY038 계통 게놈내에 포함된 DNA 분자(서열번호 7)는 옥수수 글로불린 1 프로모터(P-ZM glob1), 벼 액틴 1 인트론(I-Os 액틴), 옥수수 디히드로디피콜리네이트 신타제 클로로플라스트 트랜시트 펩티드 인코딩-DNA 분자(Zm DHDPS CTP), 코리네박테리움 디히드로디피콜리네이트 신타제-인코딩 DNA 분자(DHDPS), 옥수수 글로불린 1 3' 비번역 영역(T-Zm glob1) 및 lox P 부위를 포함하는 이종성 형질전환유전자 유전요소들을 포함하며, DNA 증폭을 위한 주형으로서 사용가능하거나, 또는 DNA 검출법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있는 상동성 또는 상보적 DNA 분자들을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 DNA 검출분야의 당업자가 LY038의 게놈 및 이의 후대 개체에서 유전자변형 DNA를 검출하기 위한 방법에 사용가능한 서열번호 7의 유전자변형 DNA에 대해 상동성이거나 상보적인 1개 이상의 DNA 분자들을 선택할 수 있음을 고려하고 있다.
이하의 실시예들은 본 발명의 특정의 바람직한 구체예들의 예를 개시하기 위하여 포함되어 있다. 본 발명자들이 발견한 접근법들에 따르는 실시예에 개시된 기술들이 본 발명을 실시하는데 있어서 잘 기능하고, 따라서 바람직한 실시 방법들의 예들을 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 당업자들은 이해해야 한다. 그러나, 당업자들은 본 개시내용의 관점에서, 본 명세서에 개시된 특정 구체예를 많이 변형시킬 수 있으며, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고도 유사한 결과를 얻을 수 있다는 점을 알아야 할 것이다.
본 발명에 의해 디히드로디피콜린산 신타제를 발현하는 신규의 외인성 DNA 구조체를 갖는 유전자변형 식물들이 제공되며, 상기 디히드로디피콜린산 신타제의 활성에 의해 식물 또는 식물생성물 내에서 리신이 증가하게 된다.
실시예 1
유전자변형 식물들의 제조
옥수수 계통 H99의 미성숙배를 형질전환을 위하여 분리했다. 옥수수 글로불린 1 프로모터(Kriz(1989), 상게서; Belanger와 Kriz(1991), 상게서; 미국특허 제6,329,574호, 그 전체내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨; 서열번호 7의 bp 48~1440), 벼 액틴 1 인트론(McElroy 등(1990), 상게서; 서열번호 7의 bp 1448~1928), 옥수수 DHDPS 클로로플라스트 트랜시트 펩티드 인코딩 DNA 분자(Frisch 등(1991), 상게서; 서열번호 7의 bp 1930~2100), 코리네박테리움 디히드로디피콜리네이트 신타제 인코딩 DNA 분자(Bonnassie 등, (1990), 상게서; Richaud 등(1986), 상게서; 서열번호 7의 bp 2101~3003), 옥수수 글로불린 1 3' 비번역 영역(Belanger와 Kriz(1991), 상게서; 서열번호 7의 bp 3080~4079), lox P 부위(미국특허 제5,658,772호, 그 전체내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨; 서열번호 7의 bp 4091~4124), 뿐만 아니라 35S 프로모터(Kay 등, Science, 236:1299~1302, 1987; 미국특허 제5,164,316호), NPT II 선택가능한 마커 인코딩 DNA 분자(Potrykus 등(1985), 상게서), nos 3' UTR(Fraley 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.), 80:4803~4807 (1983), 상게서) 및 lox P 부위(미국특허 제5,658,772호, 그 전체내용이 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)를 포함하는 벡터 pMON55221(도 1 참조)로부터 추출된 카셋트 DNA를 금 입자들에 부착시켰다. 당업자들에게 공지된 방법들을 사용하여 미성숙 옥수수배에 외인성 DNA를 도입시키기 위해 미세입자투사법을 사용하였다. 형질전환된 세포들은 카나마이신 선별법을 사용하여 선택하였다. 카나마이신 내성이 있는 캘러스들이 수득되었으며, 표준방법들을 사용하여 여러개의 임성 Ro 유전자변형 식물들로 재생되었다.
실시예 2
육종 계획 및 리신 분석
표 1은 옥수수 커널 조직 내에서 높은 수준의 리신을 나타내는, 옥수수 계통 LY038을 개발하기 위하여 사용된 육종 계획 및 자유 리신 데이터를 요약하고 있다. PCR을 사용하여 코리네 박테리움 DHDPS 서열의 존재 또는 부재에 대해 실시예 1에서 설명된 형질전환법에 의해 생성된 식물들을 초기 선별했다. 유전자변형 삽입체의 복제본 수를 측정하기 위해 Taqman® 분석기술을 사용하였다. 실시예 1과 도 1에서 설명된 바와 같이 작동가능하게 연결된 코리네박테리움 DHDPS 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 식물들은 성숙도에 도달하여 F1A 종자를 생성하였다. F1A 종자를 생성시키기 위하여, 제1차 유전자변형 Ro 식물들을 비(非)-유전자변형 엘리트 옥수수 동계교배 계통과 교배시켰다.
필드 측정(field scorable) 카나마이신 내성시험을 사용하여 입증된 바에 따라, NPT II 서열의 존재 또는 부재에 대해 F1A 식물들을 선별했다. 카나마이신에 대해 둔감성이라는 것은, 도 1에 도시되고 실시예 1에 기술된 바와 같이, 식물이 NPT II 마커 유전자를 포함하며, 이를 발현한다는 것을 보여주는 것이며; 상기 식물들은 이하에 NPT II+라고 한다.
F1B 종자를 생성하기 위하여 세균성 Cre 재조합효소(recombinase)를 발현하는 유전자변형 옥수수 계통과 NPT II+ 식물들을 교배시켰다. 각 열매로부터 수집한 F1B 종자의 시료 중의 자유 리신의 수준을 측정했다. 약 1,000ppm 이상의 자유 리신을 나타내는 동기(sibling)의 F1B 커널들을 필드 양육실로 내보냈다. DHDPS 유전자 서열, Cre 재조합효소 코딩서열 및 NPT II 선별성 마커유전자 서열의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여 PCR 및/또는 서던 블롯에 의해 F1B 후대 개체 식물들을 분석평가했다. NPT II 선별성 마커유전자를 lox P 부위(재조합 부위)에 의해 접합시키고, Cre 재조합효소의 활성으로 인해 NPT II 코딩서열이 절제되었다. DHDPS와 Cre 재조합효소 서열들을 포함하고 NPT II 서열이 결핍된 식물들(이하, 마커-절제된 식물들이라고 함)을 자가수분시켜, F2A 종자를 얻었다. 양성 및 음성 F2A 종자 내 자유 리신을 측정했다.
외인성 DHDPS 유전자를 포함하고, NPT II 선별성 마커유전자가 결핍된 F2A 종자를 수득한다면, Cre 재조합효소 서열을 육종시킬 필요가 있다. 마커가 절제된 식물들로부터 얻은 F2A 종자를 필드(field)에 심고, 다시 한번 PCR 및/또는 서던 블롯에 의해 분석하여 DHDPS 유전자 서열, Cre 재조합효소 코딩서열과 NPT II 선별성 마커 유전자 서열의 존재 또는 부재를 측정하였다. DHDPS 서열을 포함하고, Cre 재조합효소와 NPT II 양쪽 모두를 위한 서열이 결핍된 식물들은 "양성(positive)"식물로서 선택되었다. DHDPS, Cre 재조합효소, 및 NPT II 서열들이 결핍된 동기 식물들은 "음성(negative)" 식물로서 선택되어, 음성대조군으로서 제공하였다. DHDPS 서열을 포함하는 식물들은 자가수분시켜 F3 종자를 제조하여, 필드에서 다음 세대로 진행시켰다. 마찬가지로, DHDPS, Cre 재조합효소, 및 NPT II 서열들이 결핍된 음성식물들도 자가수분시켜 F3 종자를 제조하였다. 양성 및 음성 F3 종자 내에서의 자유 리신을 측정했다.
양성식물들은 F3 종자로부터 필드에서 재배하였다. Taqman®분석에 의해 측정된, 동형접합성인 단일식물을 선택하고 LY038로 표시했다. F3 식물들을 A) 자가수분시켜 F4-38 이삭을 생성하거나 또는 B) 동계교배 계통과 교배시켜서 양성 및 음성 선택 양쪽 모두의 F1-38A 이삭들을 생성하였다. 양성 및 음성 F4-38 종자 내의 자유 리신을 측정했다.
계통 LY038의 F1-38A 종자를 필드재배하고, 자가수분시켜 자유 리신을 측정하 기 위한 F2B 종자를 생성하였다.
계통 LY038의 F4-38 종자를 필드재배하여 F4-38 식물들을 생성하고, A) 자가수분시켜서 F5-38 종자를 생성시키거나, 또는 B) 동계교배 계통으로 교배시켜서 작물학적 평가를 위해 사용되는 혼성의 F1-38B 종자를 생성하였다. 계통 LY038의 F5-38 종자를 필드재배하여 A) 자가수분시켜서 F6-38 종자를 생성시키거나, 또는 B) 동계교배 계통 옥수수 변종에 교배시켜서 추가의 작물학적 평가를 위해 사용되는 혼성의 F2C 종자를 생성하였다.
상기 개시된 계통 LY038의 몬산토사의 옥수수 종자의 기탁물들은 F6-38 종자를 생성시키는 F5-38 식물들의 자가수분 및 F7-38 종자를 생성시키는 F6-38 식물들의 자가수분을 통해 생성되었다. 계통 LY038에 대한 ATCC(American Type Culture Collection(Manassas, VA)) 기탁번호는 PTA-5623이다.
계통 LY038 옥수수 계통들의 개발동안 자유 리신 축적을 모니터하였다. 리신축적값은 표 1에 요약되어 있고, 성숙 곡식내에 존재하는 자유 리신의 정량을 건조 중량을 기준으로 ppm(parts-per-million)으로 나타냈다.
계통 LY038을 포함하는 성숙 커널의 리신 함량을 평가하기 위해 다른 방법들을 사용할 수 있다. 본 발명의 발명자들에 의하여, 리신을 검출하고 정량하기에 유용한 당기술 분야에 공지된 다른 방법들이 고려되어, LY038 종자의 리신함량이 증가되는 유사한 결과를 발견하였다.
액체 크로마토그래피-질량 분광광도법/질량 분광광도법(LC-MS/MS)은 계통 LY038의 옥수수 커널들내 자유 리신을 분석하기 위해 사용되었다. 계통 LY038의 각각의 성숙 옥수수 커널 시료들을 먼저 칭량하고, 미세하고 균질한 분말로 분쇄하고, 메탄올, 물 및 포름산을 포함하는 추출용매로 추출했다. 커널들이 벌크되는 경우에는, 약 30mg의 분쇄된 분말을 사용하였다. 시료추출물 내에서 리신을 분리하기 위해 액체 크로마토그래피와 다-반응-모니터링(MRM, multi-reaction-monitorng) 질량 분광측정기술 양쪽 모두를 사용하였다. 분리 후에, 중수소화 d4-리신 내부 표준물(IS)을 사용하여 제조된 이에 상응하는 표준교정곡선에 대한 질량 분광측정 피크면적을 사용하여 리신을 정량했다.
다른 방법에서, 옥수수 커널들의 리신함량은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 자유 아미노산들의 평가에 기초를 두고 있다. 계통 LY038의 각각의 옥수수 커널들 또는 커널들의 풀(pools)을 위에서 설명된 바와 같이 미세하고 균질한 분말로 분쇄하고, 이 경우 분석을 위해 분말 약 30㎎을 사용했다. 아미노산들을 5% 트리클로로아세트산으로 추출하고, o-프탈알데히드(OPA)를 이용한 전처리컬럼 일차아민 유도체화를 통해 아미노산 검출을 수행했다. 결과적으로 수득한 아미노산 부가물인 이소인돌은 소수성이고, 이후에 형광 검출기 상에서 검출될 수 있는 우수한 형광 특성들을 갖고 있다. 역상 크로마토그래피를 사용하여, 각각의 아미노산에 위치한 R 그룹들의 소수성을 통해 분리가 이뤄졌다. 형광체(fluorophor)를 안정화시키기 위해 2-머캅토에탄올(SHCH2CH2OH) 또는 3-머캅토프로피온 산(SHCH2CH2COOH)과 같은 티올을 첨가한다.
고(高)리신 옥수수 계통 LY038을 확인하기 위해 사용된 육종 계획 및 리신 분석
LY038 음성 대조군
식물 세대 분자 & 필드 분석 수분 생성된 종자 리신 효능* 리신 효능**
R0 식물 (동계번식계 A) PCR; TaqMan 복제수 측정 동계번식계 계통과 교배됨 F1A 종자 ND ND
F1A 식물 NPTII 필드분석 Cre재조합효소 계통과 교배됨 F1B 종자 ＋＋＋ －
F1B 식물 DHDPS용 PCR, Cre 재조합효소&NPTII; 서던 블롯 분석 자가수분; 양성 및 음성이 선택되고 유지됨 F2A 종자 ＋ －
F2A 식물 (양성&음성) PCR; 서던 블롯 분석 자가수분 F3 종자 ＋ －
F3 식물 (양성&음성) PCR 자가수분; 동계번식계 계통과 교배; 계통LY038 선택 F4-38 및 F1-38A 혼성번식계 종자 ＋i －
F1-38A 식물 (F3 식물× 동계번식계) 자가수분 F2B 종자 ＋＋ －
F4-38 식물 (양성&음성) 계통-특이적 PCR 자가수분 및 동계번식계와 교배함 F5-38 및 F1-38B 혼성 번식계 종자 ＋i －
F1-38B 식물 (F4-38 식물 ×동계번식계) 자가수분 F2C 종자 ＋＋ －
* 계통 LY038을 포함하는 성숙 커널들내 자유 리신(ppm)을 나타냄.
ND = 측정되지 않음
－ = 약 400ppm 미만의 자유 리신을 나타냄
＋ = 약 1000ppm 내지 약 1200ppm의 자유 리신을 나타냄
＋＋ = 약 1200ppm 내지 약 1400ppm의 자유 리신을 나타냄
＋＋＋ = 약 1400ppm을 초과하는 자유 리신을 나타냄
i = 동계번식계 커널 데이터
여기에서 설명된 실험들을 바탕으로 하여, LY038 구조체를 함유하는 옥수수커널들내 자유 리신은 약 200%(예를 들면, 다른 것들 중에서 F1B) 내지 거의 300%(예를 들면, F1A) 증가하였다. 자유 리신내 중간체 증가도 또한 관찰됐다(예를 들면, F1-38A).
실시예 3
접합 서열의 측정
LY038로 지칭된 옥수수 식물들로부터 게놈 DNA를 분리하고, 유전자변형 DNA삽입체를 접합시키는 옥수수 게놈 서열을 측정하기 위한 실험들에 사용하였다. 접합 서열들, 및 게놈 접합 서열과 유전자변형 삽입체 사이의 연접 서열을 측정하기 위하여 세 가지의 다른 방법들: 테일(tail) PCR 및 ClonTech사제 Genome WalkerTMKit(catalog NO. K1807-1, ClonTech Lab., Palo, Alto, California), 및 역 PCR을 사용하였다.
테일 PCR은 퇴화성 프라이머(degenerative primer)들과 비오틴 포획단계를 이용하는 공지된 삽입서열을 접합시키는 게놈 DNA 서열을 분리하기 위한 방법이다. 외인성 DNA에 상보적인 프라이머는 다양한 퇴화성 프라이머들과 함께 일차 PCR반응에 사용된다. 전형적으로, 외인성 DNA에 대해 특이적인 프라이머들과 퇴화성 프라이머들은 쌍(pairs)으로 사용됐고, 풀(pool)로는 사용되지 않았다. 퇴화성 프라이머들은 삽입된 DNA를 접합시키는 옥수수 게놈 서열에 어느 정도 혼성화하여 PCR 증폭산물을 생성시켰다. 일차 PCR 증폭산물들을 증폭산물의 유전자변형 부분에 상보적인 비오틴 표지된 프라이머와 함께 혼합시키고, 어닐링하였다. 비오틴 프라이머들에 어닐링된 증폭산물들을 스트렙타비딘을 사용하여 포획하고 미결합 증폭산물들을 세척제거했다. 증폭산물의 외인성 DNA부분과 다양한 퇴화성 프라이머들에 대해 상보적인 네스티드 프라이머(nested primer)를 사용하여 어닐링된 증폭산물들을 2차 PCR 반응으로 처리했다. 2차 PCR 반응의 PCR 증폭산물들을 아가로스겔 전기영동으로 처리하고, 밴드들(bands)을 겔로부터 절단하고 분리했다. 분리된 PCR 증폭산물들을 서열화했다. 테일 PCR 및 서열화를 사용하여 계통 LY038의 3' 접합 게놈 DNA의 서열을 확인했다.
접합 DNA를 분리하기 위한 게놈 워커(Genome Walker)법은 제조사의 제안된 조건들에 따라서 실시했다. 테일 PCR과 게놈 워커 킷트 모두 사용하여 계통 LY038의 5' 접합 DNA 서열을 확인하였다. 게놈 워커를 위하여, 제한효소 ScaI의 생성물들을 증폭시켜 계통 LY038의 5' 접합 게놈 DNA 서열을 확인하는데 사용가능한 증폭산물들을 생성하였다.
테일 PCR과 게놈 워커법을 사용하여 계통 LY038 내에서 DNA 구조체의 삽입부위를 접합하는 수백개 이상의 염기쌍들의 DNA 서열을 생성시켰다. 역 PCR, 생물정보학적 분석 및 옥수수게놈 DNA 서열 데이타베이스에 대한 비교를 사용하여, 상기 계통들을 접합하는 추가의 게놈 DNA를 수득하였다. 조합된 방법들을 사용하여, 접합 서열들은 서열번호 1, 2, 9 및 10의 서열로 확인됐다. 옥수수식물이 본 발명에서 설명된 연접 DNA 분자를 포함하는 증폭산물을 제공하도록 DNA 증폭반응에서 주형으로서 사용될 수 있는 DNA 분자를 게놈내에 함유하는 경우, 이러한 옥수수 식물은 본 발명의 한 측면이 되며, 여기에서, 상기 연접 DNA 분자는 옥수수조직 시료로부터 추출된 DNA 시료에서 옥수수 계통 LY038 DNA를 진단하기 위한 것이다.
실시예 4
계통 특이적 프라이머와 프로브 분석 정보
각각의 계통을 위하여, Taqman® 분석에 유용한 PCR 프라이머들과 프로브들을 서열번호 3 및 4로 지정했다. Taqman®분석에서, 서열번호 3 및 4의 서열을 갖는 PCR 프라이머들을 사용하여, 계통 LY038을 진단하기 위한 증폭산물을 얻었으며; 상기 증폭산물은 서열번호 6의 서열을 갖고, 이 증폭산물을 검출하는데 사용하기 위한 프로브는 서열번호 5의 서열을 갖는다. 상기 프라이머들과 프로브들을 표 2에 개시된 PCR 조건으로 처리했을 때, 형광시그널은 증폭산물들이 생성됐고 프로브에 의해 검출됐음을 보여주었다. 적당한 대조군 시료들, 예를 들면, 여러 음성 DNA 대조군 및 양성 DNA대조군들을 포함시킴으로써, PCR 프라이머들과 프로브들이 의도된 계통에 대해 특이적이었음을 보여주었다.
상기 프라이머와 프로브 셋트에 더해, PCR 증폭반응에 사용시에 계통 LY038 DNA를 진단하기 위한 DNA 증폭산물을 생성하는 계통 LY038 DNA에 대해 특이적인 서열번호 1 또는 2로부터 유도된 프라이머와 프로브 셋트도 본 발명의 한 측면이고, 이들은 당업자들에 의해 쉽게 제조된다. 계통 LY038 DNA를 진단하기 위한 Taqman® 분석법을 형성하는 PCR 조건들은 표 2에 포함되어 있다.
당업자는 본 발명에 기술된 PCR 또는 Taqman® 분석법을 수행할 경우 적당한 대조군 시료들을 포함시킬 수 있을 것이다. 양성 대조군 DNA 시료들, 음성 대조군 DNA 시료들 및 다른 대조군 시료들을 포함시키는 것이 적당하며, 결과들의 해석에 도움을 준다. 더욱이, 당업자는 공개된 표준 방법들(예를 들면, Applied Biosystems, Foster City, California에 의해 공개됨)을 사용하여 Taqman® PCR 반응을 위한 내부 대조군 프라이머들과 프로브들을 제조하는 방법을 알 수 있을 것이다. 당업자는 또한 본 명세서에서 특정된 특정 프라이머 서열들, 프로브들 및 반응조건들을 변형시켜, 계통 LY038 DNA를 진단하기 위하여 분석법을 고안할 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 당업자는 PCR 반응의 생성물들이 분석을 위하여 겔 전기영동에 의해 분석될 수 있음을 알 것이다.
Figure 112008020825717-PAT00001
** 20μM의 각 프라이머의 농도로 18 메그옴의 물에 혼합된 프라이머들을 재현탁함.
예: 100μM의 농도에서 100㎕ 제1 프라이머, 100μM의 농도에서 100㎕ 제2 프라이머, 300㎕ 18 메그옴 물.
** 10μM의 농도로 18 메그옴 물에 프로브를 재현탁함.
*** 음성 DNA 대조군(예컨대, 비-유전자변형 DNA), 음성 물 대조군(주형 DNA 없음), 양성 대조군(계통 LY038) 및 시료 DNA(잎, 종자, 다른 식물 부속시료들로부터의 시료 DNA)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않음.
^ 내부 대조군 프라이머 및 프로브 조합물은 광범위한 유전자 또는 게놈 영역으로 제조될 수 있으며, 이의 디자인은 당업자에게 공지되어 있음.
상기 개시된 계통 LY038의 대표적인, 몬산토사의 옥수수 종자는 부다페스트조약 하에서 ATCC(American Type Culture Collection)(10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110)에 기탁되었다. 계통 LY038을 위한 ATCC 기탁번호는 PTA-5623이다. 기탁은 30년 동안 또는 최종 신청 후 5년 동안, 또는 유효 특허기간동안 기간에 상관없이 기탁소 내에서 유지될 것이며, 그동안 필요에 따라 교체될 것이다.
본 발명의 원리들을 예시하고 설명을 했으나, 본 발명은 이러한 원리들을 벗어나지 않고서도, 배열방법과 세부사항이 변경될 수 있다는 사실은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명자들은 첨부된 청구의 범위의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형예들을 청구한다.
도 1은 pMON55221의 플라스미드 맵이다.
도 2a는 외인성 DNA 삽입 계통 LY038의 모식도이다. 외인성 DNA와 부속되는 염기쌍들은 이탤릭 폰트로 표시되고, 옥수수 게놈 DNA와 부속되는 염기쌍들은 정상 폰트로 표시된다.
도 2b는 5' 연접부에서의 서열이다.
도 2c는 3' 연접부에서의 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Dizigan, Mark Malvar, Thomas Kelly, Rebecca Voyles, Dale Luethy, Michael Malloy, Kathleen <120> High Lysine Maize Compositions and Methods for Detection Thereof <130> 06009.0030.00PC00 <150> US 60/529,182 <151> 2003-12-11 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1961 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zea mays flank and portion of transgene <400> 1 ataaaccagc tcccttcgag gggcttcaag ctcatgaaca aggcagacgg gaagcacagg 60 aacttcggta tatctcgaat ctctggcgag gcagttgcta ctcgacggaa ctagtcagct 120 gaaggtcttt ttgctattgg aattcaatag gaggcgggag ctaactgaca ccatgccgcc 180 ctagttttgt tgaactgata gtggtgctag ccttgtgcat agtaggggcc aggggagtaa 240 taatatttcc cttgtctaag gaagtgatta aggatgtagg agcacagcgc aaatgattag 300 caaaacgatc acgttcgcag tgcggcaggc attgcgcagc tggttcgttt gttcaatcag 360 tgctctcgct cacagtgacc tgacagcgtg atcactaaac ctagtagctg ggcgcgcctt 420 tctagatcag aacggaacat tggcactgga ttagattcca gtgcggcatg cttcgaaagc 480 gaggacacgg gtgctcccta agtacatgtt ttgaatggat gtggagtggc ccgtccattc 540 cgcattccaa tgggcctgtt tggttcagct tttttctgac cagcttttct gagaatctgg 600 ctgtggggag aatctggctg tgtagagaat ctgagtatca ttaggattac gtgcggagga 660 agataaaggt gtccatagga ctcaggatgt agaaagtgac ggattcctac tattgcaacg 720 actcaaccga ttatgtgttt atgttgattt tgaatggttt ttacccaaac gaattttata 780 gaagttgact gaaaagctga gcgtttggca gtccgcaaca gcttttggtg gccagaagct 840 ccaaaaagct gaaacaaaca ggggcaatag ttgacgcttt ggacgtctca agcctggccg 900 tcaggcgctg taccccagct ggctgttcag agctacaaca ctactcggga gttttttttt 960 gtctcaccta taaaaaagaa cataaaataa agaactactg ctacgactca caggccagaa 1020 gtcagaacga cgacacagtg gcaactctcg tccatcgtca ttttctgcgt ggcggtacgc 1080 atgcataggg tcgccgttga ttcctactcg tatactttac ctgaacaccg ctgcatgcac 1140 gcctggacaa agataacgag gaaacgtcca gtcgctagct ctgacagtgt tggacgtttt 1200 accgctgcaa tcactattac gggatgcatt tgatatctgg agagtacgtt gcgcgaagac 1260 gcagtttgcg aagcctggtc gtgctcgtgc acctgcattg cagttcattt cagtcgctcg 1320 agcactcctc atcccccacc atcgtcacca cttttcgggt ttggtttggt attttcccgc 1380 acgcacgggg gccccgaggt gtgtgacact gtgactggac acccaaagcc tagccaagca 1440 agcggaagaa cgcaacgcaa agcaggtcag ctcctccgtc cgaattcagc ctgttactcg 1500 ttcgctcact ttcctctccc tttctctccc cgccatcttc cttaaatctt ttcttccagt 1560 aacctttcgc cgcaaaatcc gtgcttccga gtcgagtatt ggactcgctg cctggtttcg 1620 ttttttttat gatgagagaa agagagagag gaaaggtaat ccgtcctgtt ttgatgatgt 1680 gcctgctgag atttaaggct gcattgtggg ttcagtctgc gaatgtttgg gggtgggggc 1740 caatccctgc gcagaatctc aggatccgag cggagtttat gggtcgacgg tatcgataag 1800 cttgatatcg aattcctgca gcccgggccg agtgccatcc ttggacactc gataaagtat 1860 attttatttt ttttattttg ccaaccaaac tttttgtggt atgttcctac actatgtaga 1920 tctacatgta ccattttggc acaattacat atttacaaaa a 1961 <210> 2 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zea mays flank and portion of transgene <400> 2 cgttcgttct cagcatcgca actcaatttg ttatggcgga gaagcccttg tatcccaggt 60 agtaatgcac agatatgcat tattattatt cataaaagaa ttcgaggggg atccataact 120 tcgtatagca tacattatac gaagttattc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcgg 180 atccactagt aacggccgcc ataattattg cccagtcttt cagggtatta cagtgtacaa 240 tgtttcagta ttttagactg cactactata atatcacaag aactacaaat ggagcattca 300 atactactag tacaatgagt gtgcattgcg acggcacaca aattattcaa taaaatatta 360 gtggacaata attacatgaa aacgaaccaa ttaagatgtc cgcttgaagt gccttttggg 420 tcaattacat agctcccctg caaatggagc attcaatact ttcctgtccg cttgaaatgc 480 cttttgggtc aattacatag ctcccctgca aattaagatg tcaaatatac tatcacataa 540 ccatcccaaa ggataaacca ggatcaccaa acacacaata ccaattgatc tcagacaggc 600 acatccaaca ttgcttgaat ctcaagtaaa acaattccag atctatcttg tataagtaaa 660 agagctttct gatccaagac atgcttttct gaatctcaag taaaacaata ccagacaggc 720 acattacttg ctttctgatc caagacatgc tttgactcag aatccactca agtataacac 780 catatattta tatatctttt agttgagtaa aacatgcaat catcaatgaa gataaacccc 840 ctgcttataa tgaatcaggc ttataac 867 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 aatccctgcg cagaatctca 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tgcaggaatt cgatatcaag cttat 25 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe <400> 5 cggagtttat gggtcg 16 <210> 6 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR product amplicon <400> 6 aatccctgcg cagaatctca ggatccgagc ggagtttatg ggtcgacggt atcgataagc 60 ttgatatcga attcctgca 79 <210> 7 <211> 4176 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exogenous DNA <400> 7 ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcctgcag cccgggccga gtgccatcct 60 tggacactcg ataaagtata ttttattttt tttattttgc caaccaaact ttttgtggta 120 tgttcctaca ctatgtagat ctacatgtac cattttggca caattacata tttacaaaaa 180 tgttttctat aaatattaga tttagttcgt ttatttgaat ttcttcggaa aattcacatt 240 taaactgcaa gtcactcgaa acatggaaaa ccgtgcatgc aaaataaatg atatgcatgt 300 tatctagcac aagttacgac cgatttcaga agcagaccag aattttcaag caccatgctc 360 actaaacatg accgtgaact tgttatctag ttgtttaaaa attgtataaa acacaaataa 420 agtcagaaat taatgaaact tgtccacatg tcatgatatc atatatagag gttgtgataa 480 aaatttgata atgtttcggt aaagttgtga cgtactatgt gtagaaacct aagtgaccta 540 cacataaaat catagagttt caatgtagtt cactcgacaa agactttgtc aagtgtccga 600 taaaaagtac tcgacaaaga agccgttgtc gatgtactgt tcgtcgagat ctctttgtcg 660 agtgtcacac taggcaaagt ctttacggag tgtttttcag gctttgacac tcggcaaagc 720 gctcgattcc agtagtgaca gtaatttgca tcaaaaatag ctgagagatt taggccccgt 780 ttcaatctca cgggataaag tttagcttcc tgctaaactt tagctatatg aattgaagtg 840 ctaaagttta gtttcaatta ccaccattag ctctcctgtt tagattacaa atggctaaaa 900 gtagctaaaa aatagctgct aaagtttatc tcgcgagatt gaaacagggc cttaaaatga 960 gtcaactaat agaccaacta attattagct attagtcgtt agcttcttta atctaagcta 1020 aaaccaacta atagcttatt tgttgaatta caattagctc aacggaattc tctgtttttt 1080 taaaaaaaaa ctgcccctct cttacagcaa attgtccgct gcccgtcgtc cagatacaat 1140 gaacgtacct agtaggaact cttttacacg ctcggtcgct cgccgcggat cggagtcccc 1200 ggaacacgac accactgtgg aacacgacaa agtctgctca gaggcggcca caccctggcg 1260 tgcaccgagc cggagcccgg ataagcacgg taaggagagt acggcgggac gtggcgaccc 1320 gtgtgtctgc tgccacgcag ccttcctcca cgtagccgcg cggccgcgcc acgtaccagg 1380 gcccggcgct ggtataaatg cgcgccacct ccgctttagt tctgcataca gccaacccaa 1440 ggatcccctc gaaattcggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 1500 tttccgtctc ggtctcgatc tttggccttg gtagtttggg tgggcgagag gcggcttcgt 1560 gcgcgcccag atcggtgcgc gggaggggcg ggatctcgcg gctggggctc tcgccggcgt 1620 ggatccggcc cggatctcgc ggggaatggg gctctcggat gtagatctgc gatccgccgt 1680 tgttggggga gatgatgggg ggtttaaaat ttccgccatg ctaaacaaga tcaggaagag 1740 gggaaaaggg cactatggtt tatattttta tatatttctg ctgcttcgtc aggcttagat 1800 gtgctagatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg aatccctcag ctttgttcat 1860 cggtagtttt tcttttcatg atttgtgaca aatgcagcct cgtgcggagc ttttttgtag 1920 gtagccacca tggtttcgcc gacgaatctc ctcccggcgc ggaagatcac ccctgtctca 1980 aatggcggcg cagcgacggc gagcccctct tctccctcgg tggccgcacg gccacggcga 2040 ctcccttcag gcctccaatc tgtgactggt agagggaagg tttccttggc agccatcact 2100 agtacaggtt taacagctaa gaccggagta gagcacttcg gcaccgttgg agtagcaatg 2160 gttactccat tcacggaatc cggagacatc gatatcgctg ctggccgcga agtcgcggct 2220 tatttggttg ataagggctt ggattctttg gttctcgcgg gcaccactgg tgaatcccca 2280 acgacaaccg ccgctgaaaa actagaactg ctcaaggccg ttcgtgagga agttggggat 2340 cgggcgaagc tcatcgccgg tgtcggaacc aacaacacgc ggacatctgt ggaacttgcg 2400 gaagctgctg cttctgctgg cgcagacggc cttttagttg taactcctta ttactccaag 2460 ccgagccaag agggattgct ggcgcacttc ggtgcaattg ctgcagcaac agaggttcca 2520 atttgtctct atgacattcc tggtcggtca ggtattccaa ttgagtctga taccatgaga 2580 cgcctgagtg aattacctac gattttggcg gtcaaggacg ccaagggtga cctcgttgca 2640 gccacgtcat tgatcaaaga aacgggactt gcctggtatt caggcgatga cccactaaac 2700 cttgtttggc ttgctttggg cggatcaggt ttcatttccg taattggaca tgcagccccc 2760 acagcattac gtgagttgta cacaagcttc gaggaaggcg acctcgtccg tgcgcgggaa 2820 atcaacgcca aactatcacc gctggtagct gcccaaggtc gcttgggtgg agtcagcttg 2880 gcaaaagctg ctctgcgtct gcagggcatc aacgtaggag atcctcgact tccaattatg 2940 gctccaaatg agcaggaact tgaggctctc cgagaagaca tgaaaaaagc tggagttcta 3000 taatgatcta gagcaagccg aattcctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc 3060 cgccaccgcg gtggagctcg ccaaaacgag caggaagcaa cgagagggtg gcgcgcgacc 3120 gacgtgcgta cgtagcatga gcctgagtgg agacgttgga cgtgtatgta tatacctctc 3180 tgcgtgttaa ctatgtacgt aagcggcagg cagtgcaata agtgtggctc tgtagtatgt 3240 acgtgcgggt acgatgctgt aagctactga ggcaagtcca taaataaata atgacacgtg 3300 cgtgttctat aatctcttcg cttcttcatt tgtccccttg cggagtttgg catccattga 3360 tgccgttacg ctgagaacag acacagcaga cgaaccaaaa gtgagttctt gtatgaaact 3420 atgacccttc atcgctaggc tcaaacagca ccccgtacga acacagcaaa ttagtcatct 3480 aactattagc ccctacatgt ttcagacgat acataaatat agcccatcct tagcaattag 3540 ctattggccc tgcccatccc aagcaatgat ctcgaagtat ttttaatata tagtattttt 3600 aatatgtagc ttttaaaatt agaagataat tttgagacaa aaatctccaa gtattttttt 3660 gggtattttt tactgcctcc gtttttcttt atttctcgtc acctagttta attttgtgct 3720 aatcggctat aaacgaaaca gagagaaaag ttactctaaa agcaactcca acagattaga 3780 tataaatctt atatcctgcc tagagctgtt aaaaagatag acaactttag tggattagtg 3840 tatgcaacaa actctccaaa tttaagtatc ccaactaccc aacgcatatc gttccctttt 3900 cattggcgca cgaactttca cctgctatag ccgacgtaca tgttcgtttt ttttgggcgg 3960 cgcttacttt cttccccgtt cgttctcagc atcgcaactc aatttgttat ggcggagaag 4020 cccttgtatc ccaggtagta atgcacagat atgcattatt attattcata aaagaattcg 4080 agggggatcc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattctaga gcggccgcca 4140 ccgcggtgga gctcggatcc actagtaacg gccgcc 4176 <210> 8 <211> 903 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 agtacaggtt taacagctaa gaccggagta gagcacttcg gcaccgttgg agtagcaatg 60 gttactccat tcacggaatc cggagacatc gatatcgctg ctggccgcga agtcgcggct 120 tatttggttg ataagggctt ggattctttg gttctcgcgg gcaccactgg tgaatcccca 180 acgacaaccg ccgctgaaaa actagaactg ctcaaggccg ttcgtgagga agttggggat 240 cgggcgaagc tcatcgccgg tgtcggaacc aacaacacgc ggacatctgt ggaacttgcg 300 gaagctgctg cttctgctgg cgcagacggc cttttagttg taactcctta ttactccaag 360 ccgagccaag agggattgct ggcgcacttc ggtgcaattg ctgcagcaac agaggttcca 420 atttgtctct atgacattcc tggtcggtca ggtattccaa ttgagtctga taccatgaga 480 cgcctgagtg aattacctac gattttggcg gtcaaggacg ccaagggtga cctcgttgca 540 gccacgtcat tgatcaaaga aacgggactt gcctggtatt caggcgatga cccactaaac 600 cttgtttggc ttgctttggg cggatcaggt ttcatttccg taattggaca tgcagccccc 660 acagcattac gtgagttgta cacaagcttc gaggaaggcg acctcgtccg tgcgcgggaa 720 atcaacgcca aactatcacc gctggtagct gcccaaggtc gcttgggtgg agtcagcttg 780 gcaaaagctg ctctgcgtct gcagggcatc aacgtaggag atcctcgact tccaattatg 840 gctccaaatg agcaggaact tgaggctctc cgagaagaca tgaaaaaagc tggagttcta 900 taa 903 <210> 9 <211> 1736 <212> DNA <213> Zea mays <400> 9 gaatccctca gctttgttca tcggtagttt ttcttttcat gatttgtgac aaatgcagcc 60 tcgtgcggag cttttttgta ggtagccacc atggagtgca caccggtctc tactctagtc 120 gcaacatttg caccctcacg acgctgcgac tgcgggggga tttcaacccg tcggctccta 180 tcttcggctt ctactctagt ctcatcgtgt gtggtgcccc gttgcaactg cggggggatg 240 ttagactgtg tgtgggctgg caccactgtt gggctgccga cccattaggg ttagggttaa 300 gtctctctat gtatgtaccc cttctctatg caatagatta agcattaggg tttcctacac 360 acaccaggat tttaagtgaa caaatgtgcc cctttacaaa ctaacaatga ccatgaaatg 420 cctaagatta ccaatgatcc aagaccagga atttttatta ttttgtggtg ttgcttttgt 480 aagctaatta ggttgtttat ttttggtgct ttatagttgt ccaaccttat tgccttttcc 540 accaattggg tacactcatt cttcaacaca ttcattaact atttcatgtt tttttaactt 600 gaactgcgct tatctctgtt cttttatttt atgacttgga tgaaataagt cagttagtcg 660 tattaaccat ttggctgcca ttttacatgt gatagattat ttatttcttg attcctgata 720 gtttttttta ttcgtggctt ctactgttct aatatgaact atggactaaa tattttattt 780 tgatttcctg ctacttgcag attgaaatgt cggagatacg tgctttagtc agccgagcta 840 ctgctaggag tcttgttctg attgatgaaa tatgtagagg cacagaaact gcaaaaggaa 900 catgtatagc tggtagcatc attgaaagac ttgataatgt tggctgccta ggcatcatat 960 caactcacct gcatgggatt ttcgacctgc ctctctcact tagcaacact gatttcaaag 1020 ctatgggaac tgaagtggtc gatggatgca ttcatccaac atggaaactg attgatggca 1080 tatgtagaga aagccttgct tttcaaacag caaggaggga aggcatgcct gacttgataa 1140 tcaccagggc tgaggagcta tatttgagta tgagtacaaa taacaagcag ggagcatcag 1200 tggcgcacaa tgagcctcct aatggcagcc ccagtgtaaa tggcttggtt gaggagcctg 1260 aatctctgaa gaacagactg gaaatgctgc ctggtacctt tgagccgctg cggaaggaag 1320 ttgagagtgc tgttactacg atgtgtaaga aaatactgtc ggacctttac aacaaaagta 1380 gcatcccaga actggtcgag gtggtctgcg ttgctgtagg tgctagagag caaccaccgc 1440 cttccactgt tggcagatct agcatctacg tgattatcag aagcgacaac aggctctatg 1500 ttggacaggt aaattcatga tcgcattttt ttttctgcgt tgttcattat ctcaggtgat 1560 acagccccat aaaatgccga cactgacgac agatctcctt tttttctgcc tgcagacgga 1620 cgatcttctg gggcgcttga acgccccaca gatcgaagga aggcatgcgg gacgctacgg 1680 tattatacgt cttggtccct ggcaagagcg ttgcctgcca gctggaaacc cttctc 1736 <210> 10 <211> 359 <212> DNA <213> Zea mays <400> 10 aatgaagata aaccccctgc ttataatgaa tcaggcttat aacaacaaat tataatatga 60 aggatttaat taactttagt tttcttcaaa cttgtagctg accatatatt tatatatctt 120 ttagttgagt aaaacatgca atcatttctt taggcttctc ctttctagta cttataattt 180 caccttctct ataatagtat tcagaagtaa atgtatcctt taaaatagta ctcagattta 240 tttttaattt ttttcatttt tgttagccag tttcttttct ttgtgttatt ctacgattca 300 ggttcaacat taattaaatc tgaaacgcac aaacacattt aaaggaaagt gggaagctt 359 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 aacggccgcc ataattattg 20

Claims (4)

  1. 하기의 단계들 (a)~(d)를 포함하는, 옥수수 조직 시료내에 서열번호 1이 존재하는지를 측정하여 옥수수 계통 LY038을 확인하는 방법에 의해 분석한 결과, 서열번호 5를 포함하는 DNA 증폭산물을 생성하는, 안정되게 형질전환된 옥수수 식물:
    (a) 옥수수 조직 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 상기 DNA를 PCR 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계(여기에서, 상기 PCR 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기쌍 1~1781 내의 서열 또는 이의 상보체에 혼성화하고, 상기 PCR 프라이머쌍의 제2 프라이머는 서열번호 1의 염기쌍 1782~1961 내의 서열 또는 이의 상보체에 혼성화함);
    (c) DNA를 상기 PCR 프라이머 쌍으로 증폭시켜서, 서열번호 1의 염기쌍 1781~1782 또는 이의 상보체를 적어도 포함하는 DNA 증폭산물 분자를 생성하는 단계; 및
    (d) 상기 DNA 증폭산물 분자를 검출하는 단계.
  2. 하기의 단계들 (a)~(d)를 포함하는, 옥수수 조직 시료내에 서열번호 2가 존재하는지를 측정하여 옥수수 계통 LY038을 확인하는 방법에 의해 분석한 결과, 서열번호 11을 포함하는 DNA 증폭산물을 생성하는, 안정되게 형질전환된 옥수수 식물:
    (a) 옥수수 조직 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 상기 DNA를 PCR 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계(여기에서, 상기 PCR 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 서열번호 2의 염기쌍 1~200 내의 서열 또는 이의 상보체에 혼성화하고, 상기 PCR 프라이머쌍의 제2 프라이머는 서열번호 2의 염기쌍 201~867 내의 서열 또는 이의 상보체에 혼성화함);
    (c) 상기 프라이머 쌍에 의한 상기 DNA의 DNA 증폭방법을 수행시킴으로써, 서열번호 2의 염기쌍 200~201 또는 이의 상보체를 적어도 포함하는 DNA 증폭산물 분자를 생성하는 단계; 및
    (d) 상기 DNA 증폭산물 분자를 검출하는 단계.
  3. 서열번호 5 및 서열번호 11을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 가루.
  4. 다른 옥수수 내배유들에 비하여 리신이 증가된 옥수수 내배유로서, 서열번호 5 및 서열번호 11을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 내배유.
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