TWI363798B - High lysine maize compositions and methods for detection thereof - Google Patents

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TWI363798B
TWI363798B TW093138614A TW93138614A TWI363798B TW I363798 B TWI363798 B TW I363798B TW 093138614 A TW093138614 A TW 093138614A TW 93138614 A TW93138614 A TW 93138614A TW I363798 B TWI363798 B TW I363798B
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Description

1363798 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於植物分子生物學之領域。更具體言之，本 發明係關於具增量離胺酸之轉殖基因玉米，及關於用以鑑 定可提供增量離胺酸之特異性外源DNA之檢定及方法。 【先前技術】
Zm maw通常為吾人所知之玉蜀黍及玉米，其是種廣泛 用於動物飼料之榖物。榖物（意即，榖粒）係豬 '牛及家禽之 蛋白質、澱粉及油之來源。在混合縠物飼料源中所認為的 十種必需胺基酸中，玉米之離胺酸、酥胺酸及甲硫胺酸尤 其有限。由於此等胺基酸之缺乏（尤其係離胺酸），致使飼料 玉米或玉米粉中須補充此等營養物，其通常係藉由添加大 旦粉而提供。增加玉米粒令之離胺酸含量，以使充當動物 飼料之種子及粗粉更具營養之手段對該項技術將有益。 為使用分子生物學方法增加離胺酸之含量，業已證明及 採用至少一種離胺酸途徑酵素（即，二氫吡啶二羧酸合成 酶，本文稱之為DHDPS)之反饋不敏感突變變型。分離自大 腸桿菌（五.⑶之細菌DHDPS基因於活體外已顯示為藉由 離胺酸含量之增加對抑制約2〇〇倍更不敏感，且當導入至轉 殖基因煙草中時，大腸桿菌DHDps*因之過度表達導致葉 組織中之綠胺酸含量增加（Giassman等人，美國專利案 5’288,300)汴&1(：〇等人揭示了種子中離胺酸含量增加的轉殖 基因植物及適用於產製該等轉殖基因植物的基因（美國專 利案5,773,691及6,459,019 ;美國專利申請公開案 97875-l000303.doc • 6 · 1363798 2003/0056242，其各自之全文以引用方式併入本文中）。此 ’ 等報導中，：Falco等人描述了分離及使用來自大腸桿菌之反 · 饋不敏感DHDPS及來自棒狀桿菌（CoryweZmcieriMm)(亦以 為吾人所知）之dhdpS以產生種子中離胺酸含量增 加之轉殖基因油菜軒、煙草、玉米及大豆植物。對於玉米，
Falco等人報導相對於未經轉型之榖粒，經j基因轉型 之縠粒中游離離胺酸增加大約13〇〇/0。 能夠檢測植物或種子、或該等植物或種子之後代中之特 定轉殖基因之存在與否係有利的，該檢測不僅關於轉殖基 鲁 因自身，而且關於其於宿主植物或種子之基因體中之位 置。關於位置之破認進一步提供轉殖基因轉化體之鍟定， 藉此’遺傳工程學家將該轉殖基因插入至該植物或種子之 袓代植物中。 【發明内容】 本發明提供適用於產生轉殖基因轉化體之構築體及適用 於鐘定特定轉殖基因轉化體之物質及方法，該轉殖基因轉 化體可產生比不含有該構築體之極相關植物積聚更高含量參 離胺酸之轉殖基因植物。詳言之，本發明包含無標記轉殖 基因玉采植品系，其包含特異性外源DNA，藉由標準玉米 轉型作用導入該DNA，本文中將該轉型作用稱之為"ly〇38 轉化體或”轉化體LY〇38s本發明進一步提供用以偵測獲 自玉米植物、種子或組織樣品DNA中之LY〇38轉化體存在與 否之方法。相對於袓代或其它實質性相關植物，包含轉化 體LY0 3 8之本發明玉米植物展現榖粒中增量之離胺酸。此 97875-1000303.doc 1363798 外，本發明提供外源DNA構築體，該構築體包含玉米球蛋 白1啟動子、水稻肌動蛋白1内含子、玉米二氫吡啶二羧酸 醋合成酶葉綠體轉運肽（chloroplast transit peptide-encoding)編碼DNA分子、棒狀桿菌二氫。比咬二叛酸 酯合成酶編碼DNA分子及玉米球蛋白1之Υ未轉譯區域，當 以人工方式操作連接並於轉殖基因植物細胞及植物中表現 時，其導致縠粒或其部分或自該穀粒或植物衍生之經處理 產物中之離胺酸含量增加。另一實施例中，該構築體進一 步包含lox位點，其存在係作為移除用於確認成功轉型體之 標記基因之機制之組份。 關於確認自特定轉殖基因轉化體衍生之植物或種子，本 發明提供組合物及方法以偵測源自包含轉化體LY03 8之新 穎玉米植物之基因體插入區域之存在，意即，該構築體存 在於其中基因體中之位點。所提供之DNA分子包含插入至 基因體之外源DNA之至少一部分及來自於側邊插入位點之 玉米基因體DNA(本文中將其稱之為”連接序列”）之一部分。 本發明之又另一實施例中，提供新穎DNA分子，其包含 SEQ ID NO: 1或2之至少約20個鹼基對，其中分別包括鹼基 對178 1-1782或200-201。藉由本發明進一步提供包含一擴增 子序列之DNA分子，具有SEQ ID N0:6之序列的該擴增子係 藉由DNA擴增方法獲得，該方法使用SEQ ID N0:3及4之引 子；且該DNA分子包含一與該擴增子互補之雜化探針，其 具有SEQIDN0:5之序列及其互補序列。具有SEQIDNO:5 或6之序列之DNA分子橫跨該外源DNA與側接玉米基因體 97875-1000303.doc ⑧ 1363798 DNA之間之連接處且當用於適當分析測試中時可鑒別轉化 體LY038 DNA。橫跨轉化體LY038之外源DNA/基因體插入 區域之連接處之本發明其它較佳DNA分子係具有SEQ ID N0:1、2及11之序列、及其互補序列之分子。包含此等分子 之穩定經轉型之玉米植物或種子係本發明之另一態樣。 當引子具有允許該引子在PCR反應中起作用且特異擴增 靶序列之長度時，其稱作具有”充足長度"；約11個核苷酸 或更多之長度係充足的，更佳約1 8個核苷酸或更多，仍更 佳約24個核苷酸或更多，甚至更佳約30個核苷酸係足以執 行且特異擴增靶序列。熟習該項技術者將知曉可於PCR反 應中適用地採用具有甚至比約30個核苷酸更大之長度的引 子且該引子因此具有充足長度。 適用於驗明轉化體LY03 8之PCR引子包含SEQ ID ΝΟ:1之 DNA序列之轉殖基因部分之充足長度及SEQ ID NO·· 1之5’ 側接玉米DNA序列之充足長度，或SEQ ID NO:2之DNA序列 之轉殖基因部分之充足長度及SEQ ID NO:2之3’側接玉米 DNA序列之充足長度。此等引子適用於PCR方法中以提供 鑒別轉化體LY03 8及其後代的DNA擴增子產物。與SEQ ID ΝΟ:1及2之任何合適長度同源或互補之PCR引子係本發明 之另一態樣，其可產製鑒別轉化體LY038之擴增子或探針。 例如，但不限於，鑒別轉化體LY038之較佳引子包括具有 SEQ ID N〇:3或4序列兩者之一之至少約18個鄰近核苷酸之 彼等。使用鑒別轉化體LY03 8及其後代之DNA引子）所產製 之該等擴增子係本發明之一態樣。鑒別轉化體LY038之較佳 97875-1000303.doc 1363798 擴增子具有SEQ ID N0:6序列。 本發明之另一態樣提供檢測樣品中對應於轉化體LY038 之DNA之存在或不存在之方法。該等方法包含自玉米植 物、種子或組織獲得DNA、將樣品DNA與PCR引子組接觸、 執行PCR及檢測擴增子之存在或不存在。鑒別轉化體LY038 之較佳PCR引子包括具有SEQ ID N0:3及4之序列之寡聚核 苷酸引子，其產製一LY038轉化體特異擴增子，該擴增子具 有例如SEQIDN0:6之序列，其可由具有例如SEQIDNO:5 之序列之LY038轉化體特異探針檢測。 可藉由至核酸操控技術可利用之任何適當手段（包括 TaqMan®檢定法、南方轉潰方法以及普通熟習分子生物學 技術者所知之其它方法）檢測指示轉化體LY03 8之存在的探 針雜化至包含轉化體LY03 8特異DNA之擴增子。熟習該項技 術者將知曉可藉由不涉及探針與擴增子之雜化之檢測手段 (例如丙烯醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠分析）執行擴增子之檢 測。熟習該項技術者亦將知曉引子及探針兩者之長度及序 列兩者可不同於SEQ ID NO:3、4及5中提出之例示序列，且 仍產製鑒別轉化體LY03 8之PCR擴增子、或擴增子及探針 組。 另一態樣中，本發明提供產製包含轉化體LY038 DNA之 後代植物之方法。該等後代植物可係近交或雜化植物。進 一步之應用中，本發明提供執行對轉化體LY038 DNA之標 記輔助育種之方法。根據本發明之另一態樣，提供包含轉 化體LY038 DNA及於穀粒或其部分中進一步包含經增加之 97875-1000303.doc -10- 離胺酸之穩定性經轉型之玉米植物。 本發明進一步係關於DNA檢測套組，該套組包含至少一 具有與SEQ ID ΝΟ:1或2同源或互補之鄰近核苷酸之充足長 度的DNA分子，其充當對轉化體LY038或其後代特異之 DNA引子或探針。 本發明進一步係關於包含轉化體LY038之高離胺酸玉米 (玉米屬（Zea所叮·?))植物及種子及其經處理產物及其具有 作為ATCC Accession No.(登記號）PTA-5623寄存之代表性 種子之衍生後代。另外藉由本發明提供藉由生長包含轉化 體LY03 8 DNA之植物產製之玉米植物或其部分，包括，例 如，花粉或種子。於其中本發明之DNA引子分子被適用地 採用來檢測其轉化體特異序列的包含轉化體LY038 DNA之 玉米植物及種子係本發明之進一步態樣。 LY03 8轉化體之經處理之產物包含玉米穀粒之一部分，例 如，胚乳。本發明之玉米粉可自包含LY038之轉殖基因DNA 分子之谷粒製得，其中該粉相對於其它不含該DNA分子之 玉米粉具有高的離胺酸。 本發明前述及其它態樣將自以下之詳細描述、實例及伴 隨之圖示而變得顯而易見。包括以下實例以論證本發明之 某些較佳實施例之實例。彼等熟習該項技術者應瞭解以下 實例中揭示之技術代表本發明者已發現在本發明之實施中 發揮良好的方法，且因此可視作其實施之較佳模式之實 例。然而，鑒於本揭示内容，彼等熟習該項技術者應瞭解 可於所揭示之特異實施例中進行許多變化且仍獲得不背離 97875-1000303.doc -11 · 1363798 本發明之精神及範圍之相同或相似結果。 【實施方式】 如本文所用，"外源DNA"係指並非天然起源自特定構築 體、細胞、或有機體（於其中發現彼DNA)之DNA。外源DNA 可包括基因體所原生但位於基因體中之新位置或以其原生 狀態連接至並非與外源DNA天然相關聯之其它序列成分的 DNA或RNA序列。用於轉型植物細胞之重組DNA構築體包 含外源DNA且通常包含如下討論之之其它成分。如本文所 用，"轉殖基因"意謂已併入宿主基因體或能於宿主細胞中 自主複製及能導致一或多種細胞產物表達之外源DNA。實 例性轉殖基因提供自其再生之宿主細胞或植物，其具有相 對於相應非經轉型祖代細胞或植物、或包含其它轉殖基因 但並非討論中之特定基因之相應經轉型祖代細胞或植物之 新穎顯型。轉殖基因可藉由遺傳轉型被直接導入至植物 中，或可自任何已用外源DNA轉型之前代之植物遺傳。 如本文所用，”基因"或”編碼序列”意謂RNA分子自其轉錄 的DNA序列。該RNA可係編碼蛋白質產物之mRNA，充當反 義分子之RNA，或構築體RNA分子（例如tRNA、rRNA、 snRNA、或其它RNA)。如本文所用，"表達"係指細胞内過 程之組合，包括轉錄及轉譯，藉由該等過程採用DNA分子 (例如基因）以產製多肽或RNA分子。實例性編碼序列係棒狀 桿菌二氫。比咬二敌酸酯合成酶基因（DHDPS ; Bonnassie等 A * Nucleic Acids Research, 18:6421, 1990 Richaud^ A ， J. Bacteriol., 1 66:297-300, 1986 ; SEQ ID NOs :7及 8之 bp 97875-1000303.doc -12- 1363798 2101至3003)，適用於具有經增加之離胺酸之玉米穀粒之產 製。經轉型以含有並表達導致穀粒組織中離胺酸增加之棒 狀桿菌DHDPS基因的玉米植物亦稱為高離胺酸玉米植物。 如本文所用，"啟動子"意謂起始DNA轉錄所必需之DNA 序列之區域，該轉錄導致與經轉錄之DNA互補之RNA之產 生；此區域亦可稱為"5'調整區域"。啟動子位於待轉錄之編 碼序列之上游且具有充當RN A聚合成酶之結合位點之區域 且具有與其它因子一起工作以促進RNA轉錄之區域。適用 植物啟動子包括彼等係構成性、可誘導性、組織特異性、 經臨時調整性、調整中具生理節奏性、乾旱可誘導性、應 力可誘導性、經發育調整性、冷可誘導性、光可誘導性及 其類似性質之啟動子。對本發明尤其重要者係胚芽特異啟 動子，例如，但不限於，該玉米球蛋白1啟動子（Kriz, 价oc/zew. 27:239-251，1989 ; Belanger 及 Kriz, 129: 863-872, 1991 ; SEQ ID NO:7之 bp 48至 1440)。 如該項技術中所熟知，重組DNA構築體通常亦包含除了 啟動子之外之其它調整成分，例如但不限於3'未經轉譯之區 域（例如聚腺苷醯化位點或轉錄終止訊號）、轉運或訊號肽、 内含子、及標記基因成分。適用於本發明之實施之3'未經轉 譯之區域（3’ UTR)係球蛋白 1 3' UTR(Kriz，扪oc/zem. Gewi·, 27:239-251, 1989 i Belanger A Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991;8£(^10>!0:7之匕？ 3 080至4079)。一特定適用之轉運 肽係玉米 DHDPS 轉運肽（Frisch 等人，Mo/. Gen. Genet., 228:287-293，1991 ; SEQ ID NO:7 之 bp 1930 至 2100)。適用 97875-1000303.doc -13- 1363798 於本發明之内含子係水稻肌動蛋白！内含子丨（McEir〇y等 人，P/仍i CW/, 2:i63-m，1990 ; SEQ ID N0:7 之 bp 1448 至1928)。 如本文所用，術語，，玉米"意謂玉米屬（Zeaw^5)，亦為吾 人所知之玉蜀黍，且包括可以玉米（包括野生玉米物種）育種 之所有植物種類。本發明實務中將外源DNA導入至植物基 因體中用以轉型植物之方法及組合物包括任何熟知及經論 證之方法。迄今為止，以微顆粒及土壤桿菌㈠ 媒介之基因輸送方法係兩種最常使用之植物轉型方法。以 微顆粒媒介之轉型作用係指塗布於微顆粒上之dna輸送， 該等微顆粒藉由若干方法被推進至標靶組織内。以土壤桿 菌媒/丨之轉型作用係使用屬於土壤桿菌屬之經遺傳工程設 汁之土壞細菌來完成。若干土壤桿菌物種可媒介傳送吾人 所知T-DNA之特異DNA，纟可經遺傳工程設計成攜帶任 何所舄DNA片#又至許多植物物種中。植物轉型作用之較佳 法係如美國專利案5,〇15 58() ; 5 55G 3i8 ; $，爪，綱； ’ ’208 ’ 6’399,861 ’及6,403,865中所闡明之微彈轟擊 (rmcr〇projectlle b〇mbardment);及如美國專利案 5,824,877 , 5,591,616 ； 5,981,840 ; ^6,384,301 中所闞明之土壤桿菌媒介之轉型作用，所有該等文獻以引 用之方式併入本文中。 如本文所用轉殖基因"有機體係指其基因體已併入外來 遺傳物質或原生遺傳物質之額外複本而被改變之有機體， 例如’藉由轉型作用或重組作用。轉殖基因有機體可為植 97875-1000303.doc 1363798 物、哺乳動物、真菌、細菌或病毒。如本文所用"轉殖基因 植物，，意謂穩定性經轉型植物或自其所衍生之任何後繼世 代之後代植物，其中該植物或其後代之DNA含有經導入之 外源DNA，該DNA最初不存在於相同品種之非轉殖基因植 物中。該轉殖基因植物可另外含經轉型植物原天生之序 列，但其中該外源DNA業經改變，以改變基因之表現程度 或模式。 如本文所用"穩定性”經轉型植物係其中該外源dna係可 經遺傳之植物。該外源DNA可以DNA片段保持於植物細胞 加以遺傳，不用插入至該宿主基因體中。較佳地，該穩定 性經轉型植物包含插入至核、線粒體或葉綠體中之染色體 DNA中之外源DNA，最佳者係在核染色體〇να中。 如本文所用"R。轉殖基因植物"係指用外源DNA直接轉型 之植物，或從經外源DNA轉型之細胞或細胞簇再生作用產 生之植物。如本文所用"後代"意謂任何後繼世代，包括來 自其之種子及植物，其係衍生自特定親本植物或親本植物 者’所得後代品系可係近親交配或雜化。本發明轉殖基因 植物之後代可為（例如）自交（self_cr〇ssed)、與轉疫基因植物 "雜父與非轉殖基因植物雜交’及/或回交（backcrossed)者。 本發明植物之種子可自可繁殖之轉殖基因植物收穫且被 用於生長本發明之植物之後代，包括包含轉化體LY〇3 8之外 源DNA之雜化植株’其於玉来穀粒中提供經增加之離胺酸 之益處。該玉米谷粒可處理成粗粉及油產物或該榖粒可無 需處理而喂給動物。該粗粉產物尤其含有經增強之農藝學 97875-1000303.doc 15 1363798 特性、經增加之離胺酸。本發明涵蓋具有相對於其它玉米 粉經增加之離胺酸之玉米粉，其中該玉米粉包含轉化體 LY038之外源DNA。 術語”轉化體LY038 DNA"係指一 DNA片段，其包含插入 至基因體中之特定位置之外源DNA及鄰近之側接基因體 DNA，該DNA片段預期將被傳遞至來自含該外源DNA之親 本植物之後代植物。更特異言之，轉化體LY038 DNA亦係 指包括R。轉型株之基因體中基因體DNA與經插入外源DNA 之介面之每一 DN A區域，例如，一介面周圍之區域，其中 該5’末端在基因體DAN中及該3'末端在外源DNA中。另外， 當存在於宿主基因體之其特定位置中時，包含轉化體DNA 之外源DNA序列可改變，例如，該序列之一部分可改變、 刪除、或擴增，且仍組成該轉化體DNA，其限制條件為該 外源DNA繼續存在於基因體之相同位置中。 藉由具有外源DNA構築體之植物細胞之轉型、由該外源 DNA插入至該植物之基因體中產生之植物之再生、及特徵 為轉化體DNA之特定植物之選擇產生轉殖基因"轉化體"。 通常，轉型許多植物細胞，產生植物之群體，自其選擇一 特定植物。術語”轉化體"係指包括插入至基因體中之特定 及唯一位置之外源DNA(意即，轉化體DNA)之原始R。轉型 株及轉型株之後代。術語"轉化體"亦係指藉由有性遠交 (sexual outcross)、自交、或經重複之回交產生之後代，其 中用於育種之至少一種植物係含有轉化體DNA之原始R。轉 型株之任何世代。 97875-1000303.doc -16· 1363798
或工具將轉化體DNA在不同植物、 备中之轉化體DNA X。可藉 之任何育種流程、方法、 、不同世代之間進行傳遞。 植物之轉型通常利用將培養物中之經轉型之細胞與未經
中，可選擇之標記基因保留於轉殖基因植物中；其它例子 中’需要移除該可選擇之標記基因或導入至外#dna之其 它序列。同源重組係-適用於刪除存在於轉殖基因植物内 之標記基因之方法（美國專利案6,58〇,〇19，其全文以引用之 方式併入本文中）。自植物移除序列之另一適用工具涉及使 用位點特異重組酶及其各自位點特異靶位點。 可根據本發明採用許多不同位點特異重組酶系統，包括 但不限於噬菌體P1之Cre/Iox系統、及酵母之FLp/FRT系 統。噬菌體PI Cre/lox及酵母FLP/FRT系統構成兩種用於轉 殖基因之位點特異整合或切除之尤其適用系統。此等系統 中，重組酶（Cre或FLP)將特異地分別與其位點特異重組序 列（分別為lox或FRT)相互作用以反置或切除插入序列。此 等兩種系統t各自序列係相對短的（對ι〇χ係34 bp且對FRT 係47 bp)且因此，便利於轉型載體之使用。FLp/FRT及 Cre/lox重組酶系統已被論證為於植物細胞中有效行使功 97875-1000303.doc 17 1363798 能。一較佳實施例中，採用Cre/lox重組酶系統以移除可選 擇之標記序列，尤其係lox P重組位點側接之NPT II標記基 因（見圖 l)(bp 4091 至 4124 SEQ ID NO:7; Russell等人，从〇/· 234:45-59，1992) 〇 展示經增強之所要特性（例如，”經增強之離胺酸"）之轉殖 基因植物、種子或其部分係包含外源DNA之植物，與無所 要外源DNA之大體上相同基因型之植物相比，該DNA給予 所要、可測量之特性變化。較佳藉由比較具有與經增強之 所要特性相聯繫之外源DNA之轉殖基因植物之特性與大體 上相同基因型但無彼外源DNA之植物之特性來量測經增強 之所要特性。如此之無彼外源DNA之植物可係天然野生型 植物或轉殖基因植物，較佳為與該轉殖基因植物相同物 種。較佳地，無該外源DNA之植物係無包含所要外源DNA 之植物之所要外源DNA之同胞。如此之同胞植物可包含其 它外源DNA。經增加之離胺酸可藉由谷粒中增加量之胺基 酸之積聚由植物展現且可藉由任何適當方法量測，該方法 例如經適當萃取組織之質譜分光光度術或高效液相層析法 之彼方法。 如本文所用，”探針"係一經分離之寡聚核苷酸，於其上 可附著一可檢測標簽或報導分子，例如，放射性同位素、 配位子、化學發光試劑、染料、或酶。如此一探針與靶核 酸之一股互補。本發明之情形中，如此一探針與來自轉化 體LY038之基因體DNA之一股互補，例如，來自轉化體 LY03 8之玉米植物或種子或其它植物部分之基因體DNA。根 97875-1000303.doc -18- ⑧ 1363798 據本發明之探針係特異結合至靶DNA序列且可被用於檢測 彼靶DNA序列之存在之物質（包括DNA、RNA及聚醯胺）。 "引子"係經分離之寡聚核苷酸，其可藉由核酸雜化黏接 至互補靶DNA股且隨後藉由聚合酶（例如，DNA聚合酶）沿 著該靶DNA股被擴展。如本文所用，本發明之引子被用於 靶核酸序列之DNA擴增，例如，藉由聚合酶鏈反應（PCR) 且亦可被稱為"PCR引子"。 探針及引子係充分核苷酸長度以於由熟習此項技術者決 定之雜化條件或反應條件下特異結合至靶DNA序列。此長 度可為具有適用於所選定檢測方法之充分長度之任何長 度。一般，使用約11個核苷酸或更多之長度，較佳約1 8個 核苷酸或更多，更佳約24個核苷酸或更多，且，最佳約30 個核苷酸或更多。該等探針及引子特異雜化至一靶。儘管 可藉由習知方法設計不同於靶DNA序列且保留雜化至靶 DNA序列之能力的探針，但較佳地，根據本發明之探針及 引子具有與與靶序列完全類似DNA序列之鄰近核苷酸。彼 等熟習此項技術者知曉製備及使用探針及引子之方法，使 用於，例如，Sambrook 等人，Mo/ecw/ar C7om_«g·. d Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，及其類似物中公開之協議。 轉殖基因轉化體之插入位點周圍之側接基因體DNA序列 之驗明允許檢測方法之設計，該等檢測方法係特異用於插 入基因體中之特定位點之給定轉殖基因轉化體。如此一檢 測方法（其可在位於基因體中之不同插入位點之相同或相 97875-1000303.doc 19 1363798 似轉殖基因之間各異）稱作轉化體特異DNA檢測方法（例 ' 如’轉化體特異檢定法。已描述用於（例如）耐草甘膦玉米轉 化體nk603之轉化體特異檢定法（美國專利申請公開案 2002/0013960’其以全文引用之方式併入本文中 一較佳實施例中，本發明之核酸探針特異雜化至LY〇38 轉化體特異擴增子’該擴增子具有SEQIDNO:3-6之核酸序 列’或其互補序列，最佳為；5]£(511)1^〇:5或其互補序列。本
發明另一態樣中’本發明之較佳核酸探針分子與SEq JD _ N〇S:3-6中之一或多個所闡明之核酸序列或其互補序列或 片段共有約80%，較佳約90%，更佳約95% ’甚至更佳約 98%，且最佳約99〇/。之間之序列同一性。對轉化體[¥〇38鑒 別之實例探針具有SEQ ID NO:6之序列。可由彼等熟習該項 技術者將該等探針分子用作植物育種方法之標記以驗明遺 傳雜交之後代。可藉由彼等熟習該項技術者所知之任何數 目之方法檢測探針與靶DNA分子之雜化。此等檢測方法可 φ 包括但不限於，螢光標簽、放射性標簽、抗體基標簽、及 化學發光標簽。 如本文所用，"同源"係指一核酸序列，其將特異雜化至 其將於高度嚴格條件下相比較的該核酸序列之互補序列。 促進DNA雜化的適當嚴格條件包括時間、溫度、及鹽條件 彼等條件，此係彼等熟習該項技術者所知。可變化溫声 及鹽兩者，或可將溫度或鹽濃度兩者之一保持值定而改變 變數。一較佳實施例中，本發明之聚核酸將於強至中 等殿格條件下特異雜化至SEQ ID N〇:142中闡明之一或多 -20· 97875-10003Q3.doc
1363798 個核酸分子，或其互補序列或兩種片段之一。一尤其較佳 實施例中，本發明之核酸將於高度嚴格條件下特異雜化至 SEQ ID N0:1或2中闡明之一或多個核酸分子，或其互補序 列或兩種片段之一。可藉由彼等熟習該項技術者所知之任 何數目之方法檢測探針至靶DNA分子之雜化，此等方法可 包括（但不限於）螢光標簽、放射性標簽、抗體基標簽、及化 學發光標簽》 如本文所用，"擴增子"係指靶核酸序列之核酸擴增之產 物’該核SiL序列係核酸模板之部分。例如，為測定得自有 性雜交之玉米植物是否含有來自包含外源LY〇38 DNA之玉 米植物之轉瘦基因轉化體基因體dna，自玉米植物組織樣 品萃取之DNA可經受核酸擴增方法，該方法使用一〇1^八引 子對（其包括自鄰近經插入之異質DNA之插入位點之植物 基因體中之側接序列衍生之第一引子，及自經插入之異質 DNA衍生之第二引子）以產生一擴增子，該擴增子係鑒別轉 化體DNA之存在《該擴增子係一定長度且具有亦鑒別該轉 化體之序列。該擴增子之長度範圍可介於自引子對之經組 合長度加一核苷酸鹼基對、較佳加約2〇個核苷酸鹼基對、 更佳加約50個核苷酸鹼基對、且甚至更佳加約15〇個核苷酸 鹼基對且更依賴於用於檢測該擴增子之方法。或者，引子 對可自該經插入之DNA之全部兩側上之側接序列衍生以便 產生-擴增子’其包括整個插入核苦酸序列。自該植物基 因體序列衍生之-引子對之—成員可被安置於自經插入之 DNA序列之一定距離處。此距離可介於自—核㈣驗基對 97875-1000303.doc •21 - 1363798 直至該擴增反應之極限、或約20,000個核苷酸鹼基對之範 圍内。術語"擴增子”之使用特異排除引子二聚體，其可自 DNA熱擴增反應中形成。 可藉由該項技術中已知之多種核酸擴增方法（包括聚合 成酶鏈反應（PCR))之任一種完成核酸擴增。可藉由擴增來 自 DNA(其自 ATCC登記號（Accession No.)ΡΤΑ·5623種子或 植物萃取）之該等序列使用自本文提供之序列衍生之DNA 引子繼而藉由PCR擴增子或經選殖之DNA之標準DNA測序 來校驗（且若需要則校正）來自轉化體LY038之異質DNA插 入之序列或側接DNA序列。 本文揭示之基於側接基因體DNA及插入序列之引子及探 針可藉由習知方法（例如，藉由再選殖及測序該等DNA分 子）被用於確認（且，若需要，則用於校正）經揭示之DNA序 列。 可藉由複數種技術檢測藉由擴增方法產生之擴增子，包 括但不限於凝膠基分析、遺傳位元分析（genetic bit analysis)(Nikiforov等人，TVwc/ez.c 22:4167-4175, 1994)、焦填酸測序（pyrosequencing)(Winge， Μ., Pyrosequencing-a new approach to DNA analysis, (2000), Innovations in Pharmaceutical Technology 5 第 00卷，4，第 18-24頁）、營光偏振（fluorescence polarization)(Chen等人， 9:492-498, 1999)、.及分子信標（molecular beacon)(Tyangi等人，14:303-308，1996)。 藉由 Taqman®檢定（購自 Applied Biosystems，Foster City, 97875-1000303.doc -22- 1363798
California)檢測對本發明具特殊意義。Taqman®檢定係一種 在該項技術中所熟知之檢測及量化DNA序列之存在之方 法，且於由製造商提供之說明中完全描述。此方法涉及PCR 擴增之使用及藉由雜化使用一特殊FRET寡聚核苷酸探針 對擴增產物之檢測。該FRET寡聚核苷酸探針被設計為具有 共價連接至該探針之5’及3’末端之5’螢光報導染料及3'黏接 體染料。該探針被設計為與基因體DNA及經插入之DNA之 連接交迭。該FRET探針及PCR引子（一引子於該外源轉殖基 因DNA序列中且一於側接基因體序列中）於一熱穩定聚合 成酶及dNTP存在下循環。FRET探針之雜化導致螢光部分自 該FRET探針上之黏接部分分離及釋放離開。螢光訊號指示 歸因於成功擴增及雜化導致之側接/轉殖基因插入序列之 存在。 較佳用於Taqman®檢定之PCR引子被設計為（a)具有18至 25個鹼基之尺寸範圍内之長度且匹配該側接基因體DNA及 該轉殖基因插入之序列，（b)具有於約57至約60°C範圍内之 經計算熔化溫度，例如，對應於約52至約55°C之最佳PCR 黏接溫度，及（c)產生一包括介於側接基因體DNA與該轉殖 基因插入之間之連接處且具有於約75至約250個鹼基對之 尺寸範圍内之長度之產物。該等PCR引子較佳被安置於使 得該連接序列係遠離每一 PCR引子之3'末端之至少一鹼基 處的位點上。該PCR引子必須不含廣泛之自我-或相互-互補 之區域。 FRET探針被設計為橫跨該連接序列之序列《—較佳實施 97875-1000303.doc •23- 1363798 例中，該FRET探針將於彼等3’末端併入化學部分，當該探 針被黏接至該模板DNA時，該化學部分結合至DNA之小凹 槽’因此增強該探針-模板複合物之穩定性^探針較佳具有 於約12至約17個鹼基範圍内之長度，且藉由3,小凹槽結合部 分’而具有比PCR引子之經計算炼化溫度高出約5至約7 之經計算熔化溫度。美國專利案5,538,848 ; 6,084，102 ;及 6,127,121中揭示探針設計。 採用本發明之序列之另一檢定係彼接合性檢定。接合性 檢定適用於測定是否包含轉化體之植物因轉化體Dn A而為 純合型（其包含染色體對之每一染色體上相同位置中之外 源DNA)或因轉化體DN A而為雜合型（其包含染色體對之僅 一個染色體上之外源DNA)。一實施例中，採用三引子分 析，其中引子1雜化且自經插入之外源DNA特異擴展，引子 2雜化且自經插入之外源DNA之5'侧之側接DNA特異擴 展’且引子3雜化且自經插入之外源DNA之3'側之側接DNA 特異擴展。該等三引子鑒別該轉化體。通常該外源DNa係 如此一尺寸，例如，約3至約7千鹼基對或更多，以致引子J 及引子3不再於PCR反應中產生一擴增子。當該等三引子於 PCR反應中與自因給定轉化體而為純合之植物萃取之〇να 一起混合時，藉由引子1及引子2產生一單擴增子，其尺寸 及序列將係指示且鑒別轉化體DNA。當該等三引子於PCR 反應中與自不包含該給定轉化體之植物萃取之Dna —起混 合時’藉由引子1及引子3產生一單擴增子，其尺寸及序列 將係指示且鑒別無外源DNA之玉米基因體DNA。當該等三 97875-1000303.doc -24· 引子於PCR反應中與自因給定轉化體而為雜合之植物萃取 之DNA—起混合時，產生2個擴增子：1)藉由引子1及引子3 產生一擴增子，其尺寸及序列將係指示且鑒別無外源DNA 之玉米基因體DNA，及2)藉由引子1及引子2產生一擴增 子，其尺寸及序列將指示且鑒別轉化體DNA ^彼等熟習該 項技術者知曉檢測藉由接合性檢定所產生之多種擴增子之 方法，且該等方法包括但不限於凝膠電泳、TaqMan®檢定、 南方轉潰、侵入技術、測序、分子信標、焦磷酸測序、及 其類似方法。 可使用本文揭示之組合物及DNA檢測技術中所熟知之方 法發展DNA檢測套組。該等套組適用於樣品中之玉米轉化 體LY03 8 DNA之驗明且可被應用於含轉化體LY038 DNA之 玉米植物之育種方法。該等套組包含DNA序列，該等序列 適用作引子及探針且與SEQ ID NO: 1或2之任何部分同源或 互補，或至與DNA同源或互補之DNA序列，該DNA含於 PMON5 5221之任何轉殖基因遺傳成分中（圖1)，其已被插入 至一玉米植物基因體以形成轉化體LY038(圖2)。此等DNA 序列可被用於DNA擴增方法（PCR)中或作為多聚核酸雜化 方法（意即南方轉潰分析、或北方轉潰分析）中之探針。含於 LY03 8轉化體基因體中之該DNA分子（SEQ ID NO:7)包含該 等異質轉殖基因遺傳成分，其包括玉米球蛋白1啟動子 (P-ZM globl)、水稻肌動蛋白1内含子（I-Os肌動蛋白）、玉米 二氫吡啶二羧酸酯合成酶葉綠體轉運肽編碼DNA分子（Zm DHDPS CTP)、棒狀桿菌二氫吡啶二羧酸酯合成酶-編碼 97875-1000303.doc -25- 1363798 DNA分子（DHDPS)、玉米球蛋白1 3’未轉譯區域（T-Zm globl)、及lox P位點且可被用作DNA擴增之模板、或用於 選擇同源或互補DNA分子，該等分子可於DNA檢測方法中 被用作DNA引子或探針。本發明涵蓋熟習DNA檢測技術者 可選擇一或多個與SEQ ID N0:7之轉殖基因DNA同源或互 補的DNA分子，其適用於用以檢測LY038之基因體及其後代 中之轉殖基因DNA之方法。 本發明包括以下實例以論證本發明之某些較佳實施例之 實例。彼等熟習該項技術者應瞭解以下實例中揭示之技術 代表本發明者已發現在本發明之實施中發揮良好的方法， 且因此可視作其實施之較佳模式之實例。然而，鑒於本揭 示内容，彼等熟習該項技術者應瞭解可於所揭示之特異實 施例中進行許多變化且仍獲得不背離本發明之精神及範圍 之相同或相似結果。 實例1 轉殖基因植物之製備 為轉型作用分離玉米品系H99之未成熟胚芽。將分離自載 體pMON5 5221(參見圖1)之序列匣DNA吸附至黃金顆粒 上’該載體包含玉米球蛋白1啟動子（Kriz (1989)，前述；
Belanger及Kriz (1991)，前述；美國專利案第6,329,574號，
其全文以引用之方式併入本文中；SEQ ID N0:7之鹼基對48 至1440)、水稻肌動蛋白1内含子（McElr〇y等人（199〇)，前 述；8£()10>10:7驗基對1448至1928)、玉米0肋？3葉綠體 轉運肽編碼DNA分子（Frisch等人（1991)，前述；SEQ ID 97875-1000303.doc -26 - 1363798 N0:7之鹼基對1930至2 100)、棒狀桿菌二氫吡啶二羧酸酯合 成酶編碼DNA分子（Bonnassie等人（1990)，前述；Richaud 等人（1986)，前述；SEQ ID NO:7之鹼基對2101至3003)、玉 米球蛋白1之3’未轉譯區域（Belanger及Kriz (1991), # 逑；SEQ ID NO:7之鹼基對3080至4079)、及lox P位點（美國 專利案5,65 8,772，其全文以引用之方式具體併入本文中； SEQ ID NO:7之鹼基對4091至4124)，及35S啟動子（Kay等 人，236: 1299-1302, 1987;美國專利案5,164,316)、 NPTII可選擇標記編碼DNA分子（Potrykus等人（1985)，前 述；）、nos 3' UTR(Fraley 等人，iVoc. iVa". *Scz·. (ί/.ϋ)， 8 0:4803-4807(1983)，前述；）、及lox P位點（美國專利案 5,658,772，其全文以引用之方式具體併入本文中）。使用微 彈轟擊法以彼等熟習該項技術者所知之方法將該外源DNA 導入至該未成熟玉米胚芽中。使用卡那徽素（kanamycin)選 擇流程篩選出經轉型之細胞。獲得卡那黴素抗性細胞群， 且使用標準方法將其再生成若干具繁殖力之R。轉殖基因植 物。 實例2 育種流程及離胺酸分析 表1總結用於玉米轉化體LY03 8發展之該育種流程及游離 離胺酸資料，轉化體LY038展示玉米榖粒組織中之高離胺 酸。初始使用PCR將藉由實例1中描述之轉型方法產生之植 物篩檢棒狀桿菌DHDPS序列之存在與否。使用Taqman®檢 定技術以測定轉殖基因插入之複本數目。使包含具有棒狀 97875-1000303.doc -27- 1363798 桿菌DHDPS序列（如實例1及圖1中所述之操作連接）之DNA 分子之植物達到成熟且使其產生F1A種子。為產生F1A種 子，將該等初級轉殖基因R。植物與一非轉殖基因原種（elite) 玉米近交株雜交。 使用一田地可記分卡那黴素阻抗測試作為證據，將F】a植 物篩檢NPTII序列之存在或不存在。如圖1中所顯示且如實 例1中所描述，對卡那黴素之不靈敏性指示植物包含且表達 該NPTII標記基因；此等植物於下文中稱為NPTII+。 將NPTII+植物與一表達一細菌Cre重組酶之轉殖基因玉 米株雜交以產生F1B種子。測定自每一穗中收集所得之F1B 種子之樣品中之游離離胺酸之含量。展現高於約1 〇〇〇 ppm 游離離胺酸之同胞F1B穀粒進階至一田地苗圃。藉由PCR及/ 或南方轉潰檢定F1B後代植物以測定該DHDPS基因序列、該 Cre重組酶編碼序列及該NPTII可選擇標記基因序列之存在 或不存在。將該NPTII可選擇標記基因由lox P位點（重組位 點）側接且因而，該Cre重組酶之活性導致該NPTII編碼序列 之切除。使包含該等DHDPS及Cre重組酶序列及無該等 NPTII序列之植物（下文稱之為標記-切除植物）自花授粉以 產生F2A種子。測定正及負F2A種子中之游離離胺酸。 已獲得包含所關注之該外源DHDPS基因且無該NPTII可 選擇標記基因之F2A種子，現在必需育除（breed away)該等 Cre重組酶序列。將來自標記切除植物之F2A種子種植於田 地中且再一次藉由PCR及/或南方轉潰檢定以測定該 DHDPS基因序列、該Cre重組酶編碼序列及該NPTII可選擇 97875-1000303.doc •28- ⑧ 1363798 標記基因序列之存在或不存在。選擇包含該DHDPS序列且 無Cre重組酶及NPTII兩者之植物作為"正"植物。選擇無該 DHDPS、Cre重組酶、及NPTII序列之同胞植物作為"負"植 物以用作負對照。使包含該DHDPS序列之植物自花授粉以 建置F3種子且其進階至田地中之下一代。同樣地，使無該 DHDPS、Cre重組酶、及NPTII序列之負植物自花授粉以建 置F3種子。測定正及負ρ3種子中之游離離胺酸。 於該田地中自F3種子生長正植物。選擇單一植物（藉由 Taqman®檢定為純合的）且被指定作ly〇38 ^對正及負選擇 兩者使Fa植物A)自花授粉以產生F4·38穗或B)與一近交株雜 交以產生F丨·38Α穗兩者之一。測定正及負j?4·38種子中之游離 離胺酸。 將轉化體LY038i Fusa種子於田地中生長且使其自花授 粉以產生Fa種子，對其測定游離離胺酸。 將轉化體LY038之F4·38種子於田地中生長以產生& 植 物且使其A)自花授粉以產生Fs·38種子或8)與一近交株雜交 以產生雜化Fi-WB種子兩者之一，該等種子被用於農藝學評 4貝。將轉化體LY03 8之Fs·3 8種子於田地中生長且使其a)自花 授粉以產生F6.38種子，或B)與一近交株玉米品種雜交以產 生另外之雜化Fk種子兩者之一，該等種子被用於另外之農 藝學評價》 藉由F5·38植物之自花授粉產生F6 38種子且藉由F6 38植物 之自花授粉以產生F7·38種子以產生以上揭示之轉化體 LY03 8之Monsanto Company玉米種子之寄存品。轉化體 97875-1000303.doc •29- 1363798 LY038之美國典型培養物保存中心（八動士抓Type Culture Collection)(Manassas，VA)之登記號（accession number)係 PTA-5623 〇 於轉化體LY038玉米株之發展期間監測游離離胺酸積 聚。該等離胺酸積聚值總結於表1中且以乾重計，以百萬分 之單位表示該成熟榖物中存在之游離離胺酸之數量。 不同方法係適用於評價包含轉化體LY〇38之成熟榖粒中 之該離胺酸含量。本發明之發明者預期適用於檢測且量化 離胺酸之該項技術中已知之其它方法可提供LY03 8種子之 離胺酸含量增加之類似發現。 將液相層析法-質譜分光光度術/質譜分光光度術 (LC-MS/MS)用於分析轉化體LY〇38之該等玉米穀粒中之游 離離胺酸。首先稱重轉化體LY〇38之單獨成熟玉米穀粒樣 。口，碾碎至精細、均相粉末且以一包含甲醇、水及曱酸之 萃取/谷液萃取。於谷粒係大量之情況中，使用大約30 mg 碾碎粉末。將液相層析法及多反應監測（MRM)質譜技術兩 者用於分離樣品萃取物中之離胺酸。分離後，使用其質譜 峰面積對其相應標準校準曲線（使用氘化之離胺酸内標 (IS)製備其）量化離胺酸。 另方法中，玉米榖粒之離胺酸含量係藉由高效液相層 析法（HPLC)基於該等游離胺基酸之評價。將轉化體[丫〇38 之單獨玉米谷粒或谷粒池磨碎至如所述之精細、均相粉 末，且於此例中，將大約3〇 „^粉末用於分析。以5%三氟 乙酸萃取胺基酸且藉由用〇_苯二醛（〇pA)之前管柱第一胺 97875-10003Q3.doc -30· 1363798 衍生達成胺基酸檢測。所得胺基酸加合物（異吲哚）疏水且具 有極好螢光特性，其隨後可於一螢光檢測器上被檢測。使 用逆相層析法，藉由位於每一胺基酸上之R-基之疏水性達 成分離。為幫助穩定該螢光體，加入硫醇，例如2-巯基乙 醇（SHCH2CH2OH)或 3·疏基丙酸（SHCH2CH2COOH)。 表1用於驗明高離胺酸玉米轉化體LY038之育種流程及 植物世代 分析及田地分析授粉 R〇植物 (近交A) 產生之 種子 LY038 負對照 離胺酸 離胺醭_ 功效* __^效 * ND ----- ND +++ ------- PCR ； TaqMan 複本數目測定 與近交株雜交 與Cre重組酶 F1A種子
F2A植物 (正及負） PCR ;南方轉 潰分析 自花授粉 F3種子 F3植物 (正及負） PCR F1-38A植物 (F3植物X近交） F4-38植物 (正及負） Fl-38B 植物(F438
轉化體特異 PCR 自花授粉；雜 交至近交株； 選擇株LY038 F‘38 及 Fl-38A 雜 化種子
自花授粉及雜 交至近交株 卩5-38及 Fl-38B 雜 化種子 F2C種子 自花授粉 _____ ____________ _ 代表包含轉化體LY038之成熟榖粒中之 ND=未經測定 -指示低於約400 ppm游離離胺酸 +指示約1000至約1200 ppm游離離胺酸 97875-1000303.doc 1363798 ++指示約1200至約1400 ppm游離離胺酸 +++指示高於約1400 ppm游離離胺酸 i =近交穀粒資料 基於此處所述之實驗，含該LY038構築體之玉米榖粒中之 游離離胺酸增加約200°/。（例如，F1B，及其它）及接近300%(例 如，F1A)之間。亦觀察到中間體游離離胺酸之增加（例如，
Fl-38A) 0 實例3 側接序列之測定 自被指定為LY038之玉米植物中分離基因體DNA且將其 用於實驗中以測定側接該轉殖基因DNA插入物之該玉米基 因體序列。使用三種不同測定側接序列及該基因體側接序 列與轉殖基因插入物之間之連接處之序列之方法：熱不對 稱交錯PCR(tail PCR)及來自ClonTech之基因體WalkerTM套 組（目錄數 K1807-1，ClonTech Laboratories，Palo Alto, California)、 及反向PCR。 熱不對稱交錯PCR係一種分離側接一已知經插入之序列 之基因體DNA序列之方法，其採用兼併引子（degenerative primer)及一生物素捕捉步驟。與外源DNA互補之引子連同 各種兼併引子一起用於初級PCR反應中。通常，對該外源 DNA特異之引子及該等兼併引子成對且並非於池中使用。 該等兼併引子一定程度雜化至側接該經插入DNA之該玉米 基因體序列以允許PCR擴增子之產生。將該等初級PCR擴增 子與該擴增子之該轉殖基因部分互補的經生物素標簽之引 97875-1000303.doc -32- 1363798 子混合且使其黏接。使用抗生蛋白鏈菌素捕捉經黏接至該 等生物素引子之該等擴增子且將未結合之擴增子洗滌去。 將該等經黏接之擴增子利用一嵌套引子經受第二PCR反 應，該嵌套引子與該擴增子之該外源DNA部分及多種兼併 引子互補。將第二PCR反應之該等PCR擴增子經受瓊脂糖凝 膠電泳且自凝膠切除帶且分離。測序該等經分離之PCR擴 增子。使用熱不對稱交錯PCR及測序驗明轉化體LY03 8之該 3'側接基因體DNA之該序列。 根據製造商之建議條件執行側接DNA分離之該基因體 Walker方法。將熱不對稱交錯PCR及該基因體Walker套組用 於驗明轉化體LY038之該5'側接DNA之該序列。對基因體 Walker，擴增該限制酶Seal之產物以產生適用於驗明轉化體 LY038之該5'側接基因體DNA序列之擴增子。 該熱不對稱交錯PCR及基因體Walker方法之使用產生側 接轉化體LY03 8中之該DNA構築體之該插入位點之DNA序 列的數百鹼基對或更多。將反向PCR及生物資訊 (bioinformatic)分析及對玉米基因體DNA序列資料庫之比 較用於獲得側接此等轉化體之另外基因體DNA。使用該等 經組合之方法，於SEQ ID NOs: 1、2、9、及10之序列中驗 明該等側接序列。當一玉米植物於其基因體内含一 DNA分 子（該分子可被用作一 DNA擴增反應中之一模板以提供一 擴增子，該擴增子包含本發明中所描述之連接DNA分子， 其中該連接DNA分子鑒別自一玉米組織樣品中萃取之一 DNA樣品中之玉米轉化體LY03 8 DNA)時，該玉米植物係本 97875-1000303.doc -33- 1363798 發明之一態樣。 實例4 轉化體特異引子及探針檢定資訊 對每一轉化體，設計適用於Taqman®檢定中之PCR引子及 探針，意即SEQ ID N0s:3及4。使用具有SEQ ID N0s:3及4 之序列之PCR引子，於一 Taqman®檢定中導致鑒別轉化體 LY038之一擴增子；該擴增子具有SEQIDNO:6之序列，且 適用於此擴增子檢測之探針具有SEQIDNO:5之序列。當將 該等引子及探針經受表2中概述之該等PCR條件時，一螢光 訊號指示產生由該探針檢測之擴增子。藉由包括適當對照 樣品（例如，多種負及正DNA對照），顯示該等PCR引子及探 針對該所欲之轉化體具特異性。 除該引子及探針組之外，對轉化體LY038 DNA具特異性 的任何自SEQ ID NO: 1或2衍生之引子及探針組（當被用於 一PCR擴增反應時產生鑒別轉化體LY038 DNA之一 DNA擴 增子）係本發明之一態樣且易於由彼等熟習該項技術者製 備。表2中包括產生鑒別轉化體LY038 DNA之一 Taqman®檢 定之PCR條件。 當執行本發明中所描述之該PCR或Taqman®檢定時，熟習 該項技術者將包括適當對照樣品。正對照DNA樣品、負對 照DNA樣品、及其它對照之包括係適當且幫助結果之解 釋。另外，普通熟習該項技術者將知曉如何使用已公開標 準方法（如由例如 Applied Biosystems，Foster City, California公 開）製備對該Taqman® PCR反應之内部對照引子及探針。熟 97875-1000303.doc -34- 1363798 習此項技術者亦將瞭解本文中指明之該等特定引子序列、 探針及反應條件可被修改且產生鑒別轉化體LY03 8 DNA之 一檢定法。另外，熟習該項技術者將知曉可藉由用於分析 之凝膠電泳分析該PCR反應之產物。 表2鑒別LY03 8轉化體DNA之PCR反應混合物及條件 步驟 試劑 體積 註解 1 18兆歐姆水 調節至最終 體積為1〇μ1 例如Sigma目錄 轉-4502 2 2X Universal Master Mix 5μ1 Applied Biosystems, Palo Alto, CA; Part # 4304437; IX緩衝溶液 之最終濃度 3 轉化體特異引子(SEQ ID NOs:3及4)之混合物* 0.5 μΐ 1 μΜ最終濃度 4 轉化體特異探針FAM標 簽(SEQIDNO^)** 0.2 μΐ 200 μΜ最終濃度 5 内部對照引子之混合物 氺Λ 5 0.5 μΐ 1 μΜ最終濃度 6 内部對照探針VIC標簽 0.2 μΐ 200 μΜ最終濃度 7 DNA模板*** 3.0 μΐ 較佳為每反應5-10 ng 8 擴增 循環號 設置 1 50°C 2分鐘 1 95°C 10 分鐘 10 95°c 15 分鐘 64°C 1分鐘 -1°C/循環 30 95°C 15 分鐘 54°C 1分鐘 1 10°C永遠 9 PCR反應之分析 Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700或螢光板 讀數器 重懸浮1 8兆歐姆中之經混合之引子至每一引子濃 97875-1000303.doc -35- 1363798 度為20 μΜ。實例：於100 μ]νΙ濃度之100 μΐ第一引 子’於100 μΜ濃度之第二引子，300 μ1 18兆歐姆之 水。 **於18死歐姆水117重懸浮探針至10 μΜ之濃度。 ***可包括但不限於： 負DNA對照（例如，非轉殖基因dna) 負水對照（無模板DNA) 正對照（轉化體LY03 8) 樣品DNA(來自葉、種子、其它植物部分樣品） Λ對廣泛種類之基因或基因體區域可進行内部對照引子 及探針組合’彼等熟習該項技術者知曉此設計。 已藉由美國典型培養物保存中心（American Type Culture
Collection)(ATCC)s 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110於Budapest Treaty下寄存以上揭示之代表轉化體 LY038之Monsanto Company玉米種子。對轉化體[γ〇38之該 ATCC登記號係PTA-5623。無論哪一個係更長，該寄存品將 於寄存處被保持30年之階段，或於最後請求後經5年或該 專利之有效壽命，且於彼階段中按需要被置換。 吾人已闡明且描述本發明之原理，對彼等熟習該項技術 者而言應顯而易見，本發明可在安排及細節上進行變更而 不脫離該等原則。吾人主張屬於附隨申請專利範圍之精神 及範圍内之所有變更。 【圖式簡單說明】 圖1係PMON55221之質體圖。 97875-1000303.doc -36· 1363798 圖2A係外源DNA插入轉化體LY038之示意圖。藉由斜體 字型指示外源DNA及有關鹼基對，藉由正規字型指示玉米 基因體DNA及有關鹼基對。 圖2B係於5·連接處之序列。 圖2C係於Y連接處之序列。 序列簡單描述 用於本發明之情形中具有所定義之序列之分子在與本申 請案伴隨申請之序列表中闡明。序列表之概要如下： SEQ ID ΝΟ:1係5，DNA之1961鹼基對（bp)多聚核苷酸序 列，其包含LY038轉化體DNA之插入位點之5’側所側接之玉 米基因體部分（bp 1-1781)及轉殖基因插入部分 (bpl782-1961) ° SEQ ID NO:2係3' DNA之867鹼基對（bp)多聚核苷酸序 列，其包含LY038轉化體DNA之插入位點之3’側所側接之3' 玉米基因體部分（bp 201-867)及轉殖基因插入序列（bp 1-200) ° SEQ ID NO:3及4係適用於產製可鑒別轉化體LY038 DNA 之擴增子之PCR引子的多聚核苷酸序列。 SEQ ID NO:5係適用於雜化至檢測轉化體LY038 DNA之 擴增子之寡聚核苷酸探針的多聚核苷酸序列。 SEQ ID NO:6係鑒別轉化體LY038 DNA之擴增子之多聚 核苷酸序列。 呂£(^1〇^[〇:7係玉米球蛋白1啟動子0卩48至144〇;1<：1^, Gewei., 27:239-251, 1989 ; Belanger 及 Kriz, 97875-1000303.doc -37- 1363798 129:863-872，1991 ;為國專利案 6,329,574，其全 文以引用之方式併入本文中）、水稻肌動蛋白1内含子（bp 1448至 1928 ; McElroy等人，Ce//，2:163-171，1990)、 玉米DHDPS葉綠體轉運肽（bp 1930至2100; Frisch等人，Mo/.
22 8:287-293, 1991)、棒狀桿菌 DHDPS基因（bp 2101 至 3003 ; Bonnassie 等人，iYwc/eic yic/心 jResearc/z， 18:6421, 1990) ； Richaud^ A > J. Bacteriol., 166:297-300, 1986)、玉米球蛋白1 3'未轉譯區域（bp 3080至4079 ; Belanger 及 Kriz,前述）、及 lox P位點（bp 4091 至 4124; Russell 等人，Mo/. Gen. Genei·, 234:45-59，1992)之多聚核苷酸序 列。 SEQ ID NO:8係棒狀桿菌DHDPS基因（Bonnassie等人， 18:6421，1990 ; Richaud等人，J. 1 66:297-3 00，1986)之多聚核苦酸序列。 SEQ ID NO:9係LY038轉化體之插入位點之5'側所側接之 另外玉米基因體DNA之1736鹼基對多聚核苷酸序列（見圖 2A)。 SEQ ID NO:10係LY038轉化體之插入位點之3’側所側接 之另外玉米基因體DNA之3 59鹼基對多聚核苷酸序列（見圖 2A)。 SEQIDNO:ll係20鹼基對多聚核苷酸序列，其由圖2C中 圖解之結合序列之轉殖基因插入DNA之10個鄰近核苷酸及 玉米基因體DNA之10個鄰近核苷酸組成。 97875-1000303.doc -38- 1363798 第093138614號專利申請案 _ 中文序列表替換頁(100年3月） * β年5月3日修(更3$換頁 --- <110>美商孟山都科技有限責任公司 <120〉高離胺酸玉蜀黍組合物及其檢測方法 <130> 06009.0030.00PC00 <140> 093138614 <141> 2004-12-13 <150> US 60/529,182 <151〉 2003-12-11 <160〉 11 <170〉專利版本3.3 <210> 1 <211> 1961 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>玉蜀黍屬側接部分及轉基因部分 <400> 1 60 120 180 240 300 360 420 480 ataaaccagc tcccttcgag gggcttcaag ctcatgaaca aggcagacgg gaagcacagg aacttcggta tatctcgaat ctctggcgag gcagttgcta ctcgacggaa ctagtcagct gaaggtcttt ttgctattgg aattcaatag gaggcgggag ctaactgaca ccatgccgcc ctagttttgt tgaactgata gtggtgctag ccttgtgcat agtaggggcc aggggagtaa taatatttcc cttgtctaag gaagtgatta aggatgtagg agcacagcgc aaatgattag caaaacgatc acgttcgcag tgcggcaggc attgcgcagc tggttcgttt gttcaatcag tgctctcgct cacagtgacc tgacagcgtg atcactaaac ctagtagctg ggcgcgcctt tctagatcag aacggaacat tggcactgga ttagattcca gtgcggcatg cttcgaaagc gaggacacgg gtgctcccta agtacatgtt ttgaatggat gtggagtggc ccgtccattc 97875-1000303.doc 540 1363798
cgcattccaa tgggcctgtt tggttcagct tttttctgac cagcttttct gagaatctgg 600 ctgtggggag aatctggctg tgtagagaat ctgagtatca ttaggattac gtgcggagga 660 agataaaggt gtccatagga ctcaggatgt agaaagtgac ggattcctac tattgcaacg 720 actcaaccga ttatgtgttt atgttgattt tgaatggttt ttacccaaac gaattttata 780 gaagttgact gaaaagctga gcgtttggca gtccgcaaca gcttttggtg gccagaagct 840 ccaaaaagct gaaacaaaca ggggcaatag ttgacgcttt ggacgtctca agcctggccg 900 tcaggcgctg taccccagct ggctgttcag agctacaaca ctactcggga gttttttttt 960 gtctcaccta taaaaaagaa cataaaataa agaactactg ctacgactca caggccagaa 1020 gtcagaacga cgacacagtg gcaactctcg tccatcgtca ttttctgcgt ggcggtacgc 1080 atgcataggg tcgccgttga ttcctactcg tatactttac ctgaacaccg ctgcatgcac 1140 gcctggacaa agataacgag gaaacgtcca gtcgctagct ctgacagtgt tggacgtttt 1200 accgctgcaa tcactattac gggatgcatt tgatatctgg agagtacgtt gcgcgaagac 1260 gcagtttgcg aagcctggtc gtgctcgtgc acctgcattg cagttcattt cagtcgctcg 1320 agcactcctc atcccccacc atcgtcacca cttttcgggt ttggtttggt attttcccgc 1380 acgcacgggg gccccgaggt gtgtgacact gtgactggac acccaaagcc tagccaagca 1440 agcggaagaa cgcaacgcaa agcaggtcag ctcctccgtc cgaattcagc ctgttactcg 1500 ttcgctcact ttcctctccc tttctctccc cgccatcttc cttaaatctt ttcttccagt 1560 aacctttcgc cgcaaaatcc gtgcttccga gtcgagtatt ggactcgctg cctggtttcg 1620 ttttttttat gatgagagaa agagagagag gaaaggtaat ccgtcctgtt ttgatgatgt 1680 gcctgctgag atttaaggct gcattgtggg ttcagtctgc gaatgtttgg gggtgggggc 1740 caatccctgc gcagaatctc aggatccgag cggagtttat gggtcgacgg tatcgataag 1800 cttgatatcg aattcctgca gcccgggccg agtgccatcc ttggacactc gataaagtat 1860 attttatttt ttttattttg ccaaccaaac tttttgtggt atgttcctac actatgtaga 1920 tctacatgta ccattttggc acaattacat atttacaaaa a 1961 97875.doc 1363798 <210〉 2 <211> 867 <212> DNA <213〉人工序列 <220> " <223〉玉蜀黍屬側接部分及轉殖基因部分 <400〉 2 cgttcgttct cagcatcgca actcaatttg ttatggcgga gaagcccttg tatcccaggt agtaatgcac agatatgcat tattattatt cataaaagaa ttcgaggggg atccataact tcgtatagca tacattatac gaagttattc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcgg atccactagt aacggccgcc ataattattg cccagtcttt cagggtatta cagtgtacaa tgtttcagta ttttagactg cactactata atatcacaag aactacaaat ggagcattca atactactag tacaatgagt gtgcattgcg acggcacaca aattattcaa taaaatatta gtggacaata attacatgaa aacgaaccaa ttaagatgtc cgcttgaagt gccttttggg tcaattacat agctcccctg caaatggagc attcaatact ttcctgtccg cttgaaatgc cttttgggtc aattacatag ctcccctgca aattaagatg tcaaatatac tatcacataa ccatcccaaa ggataaacca ggatcaccaa acacacaata ccaattgatc tcagacaggc acatccaaca ttgcttgaat ctcaagtaaa acaattccag atctatcttg tataagtaaa agagctttct gatccaagac atgcttttct gaatctcaag taaaacaata ccagacaggc acattacttg ctttctgatc caagacatgc tttgactcag aatccactca agtataacac catatattta tatatctttt agttgagtaa aacatgcaat catcaatgaa gataaacccc ctgcttataa tgaatcaggc ttataac <210〉 3 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 97875.doc 60 120 180
300 360 420 480 540 600 660 720 9 780 840 867 1363798 <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 3 aatccctgcg cagaatctca 20 <210〉 4 <211〉 25 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 4 tgcaggaatt cgatatcaag cttat 25 <210〉 5 <211〉 16 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉探針 <400〉 5 cggagtttat gggtcg 16 > > > > 0 12 3 11 11 11 1 2 2 2 2 < < < < 6 79
DNA 人工序列 <220> <223〉PCR產物擴增子 <400> 6 aatccctgcg cagaatctca ggatccgagc ggagtttatg ggtcgacggt atcgataagc 60 ttgatatcga attcctgca 79 <210〉 7 <211〉 4176 97875.doc 1363798 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉外源 <400〉 7 ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcctgcag cccgggccga gtgccatcct tggacactcg ataaagtata ttttattttt tttattttgc caaccaaact ttttgtggta tgttcctaca ctatgtagat ctacatgtac cattttggca caattacata tttacaaaaa tgttttctat aaatattaga tttagttcgt ttatttgaat ttcttcggaa aattcacatt taaactgcaa gtcactcgaa acatggaaaa ccgtgcatgc aaaataaatg atatgcatgt tatctagcac aagttacgac cgatttcaga agcagaccag aattttcaag caccatgctc actaaacatg accgtgaact tgttatctag ttgtttaaaa attgtataaa acacaaataa agtcagaaat taatgaaact tgtccacatg tcatgatatc atatatagag gttgtgataa aaatttgata atgtttcggt aaagttgtga cgtactatgt gtagaaacct aagtgaccta cacataaaat catagagttt caatgtagtt cactcgacaa agactttgtc aagtgtccga taaaaagtac tcgacaaaga agccgttgtc gatgtactgt tcgtcgagat ctctttgtcg agtgtcacac taggcaaagt ctttacggag tgtttttcag gctttgacac tcggcaaagc gctcgattcc agtagtgaca gtaatttgca tcaaaaatag ctgagagatt taggccccgt ttcaatctca cgggataaag tttagcttcc tgctaaactt tagctatatg aattgaagtg ctaaagttta gtttcaatta ccaccattag ctctcctgtt tagattacaa atggctaaaa gtagctaaaa aatagctgct aaagtttatc tcgcgagatt gaaacagggc cttaaaatga gtcaactaat agaccaacta attattagct attagtcgtt agcttcttta atctaagcta aaaccaacta atagcttatt tgttgaatta caattagctc aacggaattc tctgtttttt taaaaaaaaa ctgcccctct cttacagcaa attgtccgct gcccgtcgtc cagatacaat gaacgtacct agtaggaact cttttacacg ctcggtcgct cgccgcggat cggagtcccc 97875.doc 60 120 180 240
360 420 480 540 600 660 720 780審 840 900 . 960 1020 1080 * 1140 ， 1200 1363798 ggaacacgac tgcaccgagc gtgtgtctgc gcccggcgct ggatcccctc tttccgtctc gcgcgcccag ggatccggcc tgttggggga gggaaaaggg gtgctagatc cggtagtttt gtagccacca aatggcggcg ctcccttcag agtacaggtt gttactccat tatttggttg acgacaaccg cgggcgaagc gaagctgctg ccgagccaag atttgtctct cgcctgagtg accactgtgg cggagcccgg tgccacgcag ggtataaatg gaaattcggt ggtctcgatc atcggtgcgc cggatctcgc gatgatgggg cactatggtt tttctttctt tcttttcatg tggtttcgcc cagcgacggc gcctccaatc taacagctaa tcacggaatc ataagggctt ccgctgaaaa tcatcgccgg cttctgctgg agggattgct atgacattcc aattacctac aacacgacaa ataagcacgg ccttcctcca cgcgccacct aaccaccccg tttggccttg gggaggggcg ggggaatggg ggtttaaaat tatattttta ctttttgtgg atttgtgaca gacgaatctc gagcccctct tgtgactggt gaccggagta cggagacatc ggattctttg actagaactg tgtcggaacc cgcagacggc ggcgcacttc tggtcggtca gattttggcg agtctgctca taaggagagt cgtagccgcg ccgctttagt cccctctcct gtagtttggg ggatctcgcg gctctcggat ttccgccatg tatatttctg gtagaatttg aatgcagcct ctcccggcgc tctccctcgg agagggaagg gagcacttcg gatatcgctg gttctcgcgg ctcaaggccg aacaacacgc cttttagttg ggtgcaattg ggtattccaa gtcaaggacg gaggcggcca acggcgggac cggccgcgcc tctgcataca ctttctttct tgggcgagag gctggggctc gtagatctgc ctaaacaaga ctgcttcgtc aatccctcag cgtgcggagc ggaagatcac tggccgcacg tttccttggc gcaccgttgg ctggccgcga gcaccactgg ttcgtgagga ggacatctgt taactcctta ctgcagcaac ttgagtctga ccaagggtga caccctggcg gtggcgaccc acgtaccagg gccaacccaa ccgttttttt gcggcttcgt tcgccggcgt gatccgccgt tcaggaagag aggcttagat ctttgttcat ttttttgtag ccctgtctca gccacggcga agccatcact agtagcaatg agtcgcggct tgaatcccca agttggggat ggaacttgcg ttactccaag agaggttcca taccatgaga cctcgttgca 1260 -1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 · 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160
2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 97875.doc 1363798 gccacgtcat cttgtttggc acagcattac atcaacgcca gcaaaagctg gctccaaatg taatgatcta cgccaccgcg gacgtgcgta tgcgtgttaa acgtgcgggt cgtgttctat tgccgttacg atgacccttc aactattagc ctattggccc aatatgtagc gggtattttt aatcggctat tataaatctt tatgcaacaa cattggcgca cgcttacttt tgatcaaaga ttgctttggg gtgagttgta aactatcacc ctctgcgtct agcaggaact gagcaagccg gtggagctcg cgtagcatga ctatgtacgt acgatgctgt aatctcttcg ctgagaacag atcgctaggc ccctacatgt tgcccatccc ttttaaaatt tactgcctcc aaacgaaaca atatcctgcc actctccaaa cgaactttca cttccccgtt aacgggactt cggatcaggt cacaagcttc gctggtagct gcagggcatc tgaggctctc aattcctgca ccaaaacgag gcctgagtgg aagcggcagg aagctactga cttcttcatt acacagcaga tcaaacagca ttcagacgat aagcaatgat agaagataat gtttttcttt gagagaaaag tagagctgtt tttaagtatc cctgctatag cgttctcagc gcctggtatt ttcatttccg gaggaaggcg gcccaaggtc aacgtaggag cgagaagaca gcccggggga caggaagcaa agacgttgga cagtgcaata ggcaagtcca tgtccccttg cgaaccaaaa ccccgtacga acataaatat ctcgaagtat tttgagacaa atttctcgtc ttactctaaa aaaaagatag ccaactaccc ccgacgtaca atcgcaactc caggcgatga taattggaca acctcgtccg gcttgggtgg atcctcgact tgaaaaaagc tccactagtt cgagagggtg cgtgtatgta agtgtggctc taaataaata cggagtttgg gtgagttctt acacagcaaa agcccatcct ttttaatata aaatctccaa acctagttta agcaactcca acaactttag aacgcatatc tgttcgtttt aatttgttat cccactaaac tgcagccccc tgcgcgggaa agtcagcttg tccaattatg tggagttcta ctagagcggc gcgcgcgacc tatacctctc tgtagtatgt atgacacgtg catccattga gtatgaaact ttagtcatct tagcaattag tagtattttt gtattttttt attttgtgct acagattaga tggattagtg gttccctttt ttttgggcgg ggcggagaag 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020
97875.doc 1363798 cccttgtatc ccaggtagta atgcacagat atgcattatt attattcata aaagaattcg 4080 agggggatcc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattctaga gcggccgcca 4140 ccgcggtgga gctcggatcc actagtaacg gccgcc 4176
<210> 8 <211〉 903 <212> DNA <213〉棒狀桿菌麩胺酸 <400〉 8 agtacaggtt taacagctaa gaccggagta gagcacttcg gcaccgttgg agtagcaatg 60 gttactccat tcacggaatc cggagacatc gatatcgctg ctggccgcga agtcgcggct 120 tatttggttg ataagggctt ggattctttg gttctcgcgg gcaccactgg tgaatcccca 180 acgacaaccg ccgctgaaaa actagaactg ctcaaggccg ttcgtgagga agttggggat 240 cgggcgaagc tcatcgccgg tgtcggaacc aacaacacgc ggacatctgt ggaacttgcg 300 gaagctgctg cttctgctgg cgcagacggc cttttagttg taactcctta ttactccaag 360 ccgagccaag agggattgct ggcgcacttc ggtgcaattg ctgcagcaac agaggttcca 420 atttgtctct atgacattcc tggtcggtca ggtattccaa ttgagtctga taccatgaga 480 cgcctgagtg aattacctac gattttggcg gtcaaggacg ccaagggtga cctcgttgca 540 gccacgtcat tgatcaaaga aacgggactt gcctggtatt caggcgatga cccactaaac 600 cttgtttggc ttgctttggg cggatcaggt ttcatttccg taattggaca tgcagccccc 660 acagcattac gtgagttgta cacaagcttc gaggaaggcg acctcgtccg tgcgcgggaa 720 atcaacgcca aactatcacc gctggtagct gcccaaggtc gcttgggtgg agtcagcttg 780 gcaaaagctg ctctgcgtct gcagggcatc aacgtaggag atcctcgact tccaattatg 840 gctccaaatg agcaggaact tgaggctctc cgagaagaca tgaaaaaagc tggagttcta 900 taa 903 <210〉 9 97875.doc 1363798 <211〉 1736 <212> DNA <213> Zea mays <400> 9 gaatccctca gctttgttca tcggtagttt ttcttttcat gatttgtgac aaatgcagcc tcgtgcggag cttttttgta ggtagccacc atggagtgca caccggtctc tactctagtc gcaacatttg caccctcacg acgctgcgac tgcgggggga tttcaacccg tcggctccta tcttcggctt ctactctagt ctcatcgtgt gtggtgcccc gttgcaactg cggggggatg ttagactgtg tgtgggctgg caccactgtt gggctgccga cccattaggg ttagggttaa gtctctctat gtatgtaccc cttctctatg caatagatta agcattaggg tttcctacac acaccaggat tttaagtgaa caaatgtgcc cctttacaaa ctaacaatga ccatgaaatg cctaagatta ccaatgatcc aagaccagga atttttatta ttttgtggtg ttgcttttgt aagctaatta ggttgtttat ttttggtgct ttatagttgt ccaaccttat tgccttttcc accaattggg tacactcatt cttcaacaca ttcattaact atttcatgtt tttttaactt gaactgcgct tatctctgtt cttttatttt atgacttgga tgaaataagt cagttagtcg tattaaccat ttggctgcca ttttacatgt gatagattat ttatttcttg attcctgata gtttttttta ttcgtggctt ctactgttct aatatgaact atggactaaa tattttattt tgatttcctg ctacttgcag attgaaatgt cggagatacg tgctttagtc agccgagcta ctgctaggag tcttgttctg attgatgaaa tatgtagagg cacagaaact gcaaaaggaa catgtatagc tggtagcatc attgaaagac ttgataatgt tggctgccta ggcatcatat caactcacct gcatgggatt ttcgacctgc ctctctcact tagcaacact gatttcaaag ctatgggaac tgaagtggtc gatggatgca ttcatccaac atggaaactg attgatggca tatgtagaga aagccttgct tttcaaacag caaggaggga aggcatgcct gacttgataa tcaccagggc tgaggagcta tatttgagta tgagtacaaa taacaagcag ggagcatcag tggcgcacaa tgagcctcct aatggcagcc ccagtgtaaa tggcttggtt gaggagcctg 97875.doc 60 120 180 240 300 36 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 * 1200 1260
1363798 aatctctgaa gaacagactg gaaatgctgc ctggtacctt tgagccgctg cggaaggaag 1320 ttgagagtgc tgttactacg atgtgtaaga aaatactgtc ggacctttac aacaaaagta 1380 gcatcccaga actggtcgag gtggtctgcg ttgctgtagg tgctagagag caaccaccgc 1440 cttccactgt tggcagatct agcatctacg tgattatcag aagcgacaac aggctctatg 1500 ttggacaggt aaattcatga tcgcattttt ttttctgcgt tgttcattat ctcaggtgat 1560 acagccccat aaaatgccga cactgacgac agatctcctt tttttctgcc tgcagacgga 1620 cgatcttctg gggcgcttga acgccccaca gatcgaagga aggcatgcgg gacgctacgg 1680 tattatacgt cttggtccct ggcaagagcg ttgcctgcca gctggaaacc cttctc 1736 <210〉 10 <211〉 359 <212> DNA <213> Zea mays <400> 10 aatgaagata aaccccctgc ttataatgaa tcaggcttat aacaacaaat tataatatga 60 aggatttaat taactttagt tttcttcaaa cttgtagctg accatatatt tatatatctt 120 ttagttgagt aaaacatgca atcatttctt taggcttctc ctttctagta cttataattt 180 caccttctct ataatagtat tcagaagtaa atgtatcctt taaaatagta ctcagattta 240 tttttaattt ttttcatttt tgttagccag tttcttttct ttgtgttatt ctacgattca 300 ggttcaacat taattaaatc tgaaacgcac aaacacattt aaaggaaagt gggaagctt 359 <210> 11 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉合成 <400〉 11 aacggccgcc ataattattg 20 97875.doc •10·

Claims (1)

  1. 第093138614號專利申請案
    職舰 |替換本(100年12月） 中 1. 一種DNA構築體，其包含SEQ ID NO:7 2. 一種用於檢測玉米轉化體LY038之DNA引子分子對，其包 含：第一DNA分子及第二DNA分子，其中該等分子各自 包含SEQ ID ΝΟ:1之至少12個連續核苷酸，且其中該第一 DNA分子與SEQ ID ΝΟ:1之玉米基因體部分同源或互 補，且該第二DNA分子與SEQIDNO:l之轉殖基因插入部 分同源或互補。 3. 如請求項2之DNA引子分子對，其中該等引子係SEQ ID NO:3及 SEQ ID NO:4。 4. 一種用於檢測玉米轉化體LY038之DNA引子分子對，其包 含：第一DNA分子及第二DNA分子，其中該等分子各自 包含SEQ ID NO:2之至少12個連續核苷酸，且其中該第一 DNA分子與SEQ ID NO:2之玉米基因體部分同源或互 補，且該第二DNA分子與SEQIDNO:2之轉殖基因插入部 分同源或互補。 5. —種測定玉米組織樣品中存在外源LY038 DNA之方法， 其包含步驟： (a) 從該玉米組織樣品獲取DNA ; (b) 將該DNA與PCR引子對接觸，其中該PCR引子對之第一 引子雜化至SEQ ID ΝΟ:1之1至1781鹼基對内之序列或 其完全互補序列，而其中該PCR引子對之第二引子雜 化至SEQ ID ΝΟ:1之1782至1961鹼基對内之序列或其 互補序列， 97875-1001223.doc 1363798 (c) 以該PCR引子擴增DNA，據此產生DNA擴增子分子， 「其包含至少SEQ ID Ν0··1之1781至1782鹼基對或其完 全互補序列， (d) 檢測該DNA擴增子分子。 6. —種測定玉米組織樣品存在外源LY038 DNA之方法，其 包含步驟： (a) 從該玉米組織樣品獲取DNA ; (b) 將該DNA與引子對接觸，其中該引子對之第一引子雜 # 化至SEQ ID Ν0.·2之1至200鹼基對内之序列或其完全 互補序列，且其中該引子對之第二引子雜化至SEQ ID NO:2之201至867鹼基對内之序列或其完全互補序列， (c) 以該引子對進行DNA擴增方法，據此產生DNA擴增子 分子，其包含至少SEQ ID NO:2之200至201鹼基對或其 互補序列， (d) 檢測該DNA擴增子分子。 • Ί. 一種用於檢測玉米轉化體LY038之DNA檢測套組，其包 含：至少一種DNA分子，其中該分子包含SEQ ID ΝΟ:1或 SEQ ID NO:2之至少12或更多連續核苷酸，其在專一性設 計用以檢測樣品DNA中玉米轉化體LY03 8及其後代之 DNA的方法中，具有充當DNA引子或探針之功能。 8. 一種包含SEQ IDNO:l、2、5、6或11之經分離DNA分子， 其中該分子與玉米之高量離胺酸特性具有關聯性。 97875-1001223.doc
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