FR2828694A1

FR2828694A1 - Utilisation d'associations entre au moins un polymorphisme de sequence nucleique du gene sh2 et au moins une caracteristique de qualite de la graine, dans des procedes de selection de plantes

Info

Publication number: FR2828694A1
Application number: FR0110906A
Authority: FR
Inventors: Domenica Manicacci; Dominique Vienne; Mathilde Causse; Jean Louis Prioul; Pascal Touzet; Matthieu Falque
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2003-02-21
Anticipated expiration: 2021-08-17
Also published as: WO2003016564A3; CA2457787A1; FR2828694B1; WO2003016564A2; EP1421219A2; US20050250205A1

Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines pour la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID Ndegre1, ladite base polymorphe ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans un gène Sh2. Application à l'obtention de plantes transformées susceptibles de produire des graines de qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées.

Description

partie au moins de la région codante de la PDE4.

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine de la sélection de variétés de plantes possédant des caractéristiques agronomiques améliorses, en particulier des caractéristiques phénotypiques de qualité des s graines améliorées. Elle est relative-à la détection des caractéristiques phénotypiques de qualité des graines améliorées par analyse du polymorphisme d'un gène Sh2 pour sélectionner des plantes à qualité de graine améliorse ainsi qu'à des moyens pour la mise en _uvre de cette détection.

ART ANTERIEUR

Composition du grain Le grain accumule des réserves énergétiques suffisantes pour permettre la germination de l'embryon. Ces réserves sont sous forme de s réserves glucidiques, protéiques ou oléiques. Chez les cérénles, les réserves accumulées sont principalement de formes glucidique et protélque. Les réserves glucidiques sont en grande partie constituéss par des polyosides - tels que l'amidon. L'amidon est composé de deux fractions polysaccharidiques distinctes, I'amylose et l'amylopectine. L'amylose o constitue la fraction minoritaire de l'amidon, c'est une chane de monomères

de glucose liés en a 1-4 présentant moins de 1% de ramifications.

L'amylopectine représente la fraction majoritaire de l'amidon. Elle est constituée de monomères de glucose liés en oc 1-4 et est ramifiée à environ % avec des monomères de glucose liés à la chane principale par des liaisons 1-6. L'amidon représente près de 85% du poids de l'albumen des grains, la fraction de réserves énergétiques restante étant essentiellement

constituse de protéines.

Importance agronomique et nutritive des céréales et de l'amidon so L' am idon est le polyoside majoritai re de stockage énergétiq ue chez les végétaux. il revêt une importance particulière dans les céréales. Ainsi, I'amidon de riz, de blé ou de ma7s constitue le principal apport en sucre dans l'alimentation humaine et animale. L'étude des processus de remplissage du grain, la sélection et la créstion de variétés de céréales avec des teneurs en am idon mod ifiées constituent u n des axes privi logi és des rech erches

concernant les céréales.

Enyme ADP-Glucose Pyrophosphorylase L'ADP Glucose Pyrophosphorylase (AGPase) est une enzyme clef de ia voie de biosynthèse des polysaccharides, aussi bien chez les bactéries que chez les végétaux. Chez ies plantes, elle permet de déphosphoryler le

glucose-1-phosphate en ADP-glucose, monomère constitutif de l'amidon.

L'AGPase végétale possède une structure complexe sous forme o d'hétérotétramère composé de deux types de sous-unités similaires mais d i sti ncts. Les deux types de sous-unités, d' un poids mol écu la ire proche de kDa dans l'albumen, sont codées, I'une par le gène Sh2 pour Shrunken 2, (Bheve et a/., 1990) et l'autre par le gène Bt2 pour Brittle- 2, (Bae et al., 1 99o) Polymorphisme génétique

Au sein d'une même espèce, le génome présente du polymorphisme.

Les principales causes de ces variabilités génétiques sont des mutations intervenant lors de la réplication de l'ADN qui précède la multiplication o cellulaire. Ce peut être l'insertion ou la délétion de un ou plusieurs nucléotides (regroupés sous le terme d'indel), ou bien une substitution de type transition (substitution d'une base purique par une autre base purique ou d'une base pyrimidique par une autre base pyrimidique) ou transversion

(substitution d'une base purique par une base pyrimidique ou vice versa).

:5 Les sites polymorphes sont ainsi classés en deux catégories selon qu'il s'agit de la substitution d'une base (SNP pour single nucleotide polymorphism) ou

bien d'un indel (Insertion-Délétion).

Si les sites polymorphes sont retrouvés plus fréquemment dans les régions non codantes du génome, une partie des SNPs ou des indels est retrouvoe dans les régions codantes du génome ou dans des régions impliquées dans la régulation de la transcription eVou de la traduction, telles que les régions promotrices, les régions 5'-leader, voire même certains introns. Ce type de polymorphisme peut alors avoir un impact sur I'expression d'un gène, la structure ou l'activité d'une protéine, et par suite

sur l'expression d'un phénotype donné par la plante.

L'analyse de la variabilité des séquences d'ADN permet de caractériser un individu ou un groupe d' individ us par son génom e. En effet, La connaissance de la variabilité génétique des individus permet de générer des marqueurs pour détecter la ou les forme(s) allélique(s) présente(s) chez d'autres individus. Ce peut être des amorces PCR, des sondes alPèles spécifiques, ou toute autre séquence nucléotidique permettant de détecter un o site polymorphe particulier du gène. Lorsqu'un marqueur spécifique à un locus est lié à un caractère agronomique particulier de la plante, la connaissance de la forme allélique du marqueur permet de prédire le phénotype d'un individu. Il est aussi possible d'utiliser les marqueurs définis grâce au polymorphisme de séquence pour introgresser ou intégrer, par

s transgénèse, un allèle favorable dans une plante.

Cas du mas, enzyme AGPase ef gène Sh2 Chez le maTs, plusieurs études ont révélé des QTLs (pour .. " Quantitative Trait Loci "), aussi désignés " loci contrôlant un caractère à o variation quantitative>>, de caractères de remplissage du grain, dans la région du chromosome 3 qui porte le gène Sh2. Il s'agit, en particulier, de QTLs associés à la teneur en amidon et en protéines (Goldman, 1993), ainsi qu'à la teneur en amylose et au rapport amyloseJamylopectine (Séne et al., 2000). De plus, des modifications de la région amont 3' du gène, sous l'effet s de transposons de type Ac/Ds, peuvent induire une augmentation de la quantité d'amidon dans le grain (Giroux et al. 1996). Il apparat donc que la variabilité du gène Sh2 puisse rendre compte de la variation de caractères de remplissage du grain. Shaw et Hannah (1992) ont séquencé le gène Sh2 de la variété de mafs Black Mexican Sweet, qui comprend environ 7200

o paires de bases.

Toutefois, si les études publiées dans l'état de la technique sur le gène Sh2, suggèrent une certaine relation entre l'activité de ce gène et les qualités de la graine, elles ne décrivent aucun moyen technique précis prédictif des caractéristiques phénotypiques de la qualités des graines, util i sable à gran de échel le. et permettant de discri m iner, entre eux, les divers types ou niveaux de phénotypes caractérisant la qualité de la graine, tels que le nombre de grains par épi, la masse du grain mûr, la teneur en amidon du grain, la teneur en amylose du grain ou la teneur en protéines du grain ou s encore une combinaison des caractéristiques phénotypiques pécitées

SOMMAIRE DE L'INVENTION

L' invention fournit pour la première fois un ensemble de moyens permettant de sélectionner des variétés de plantes pour leurs o caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, par l'analyse de polymorphismes nouvellement identifiés dans le gène Sh2, polymorphismes qui sont statistiquement associés à une caractéristique phénotypique précise de la qualité de la graine, ou à une combinaison de

caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine.

il a en effet été montré selon l'invention qu'un allèle donné de chacun des nouveaux sites polymorphes du gène Sh2 était statistiquement associé à l'expression d'un ou plusieurs caractères phénotypiques définissant la qualité de la graine.: L'invention a pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce o nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique permet la détection d'une base poiymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1, ladite base polymorphe ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans le gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques comprenant un site nucléotidique polymorphe associé à une caractéristique ou à une combinaison de caractéristiques phénotypiques liées à la qualité de la so graine, notamment le nombre de graines par épi, la masse de la graine mûre, la teneur en protéines de la graine, la teneur en amidon de la graine, la teneur en amylose de la graine ou le rapport pondéral protéines/amidon de la graine. Elle est également relative à un procédé pour déterminer l'identité de I'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléotIdique polymorphe présente à au moins une s position nucléotidique dudit acide nuclélque correspondant à au moins un des nucléotides inclus dans un site nucléotidique polymorphe nouveliement

identifié du gène Sh2.

Sel on ce procédé, la détermination de l' identité de l' al l èle d' un site polymorphe ou d'une combinaison de sites polymorphes permet de prédire le o phénotype de qualité de la graine de la plante analysée, sans nscessiter

d'analyse directe des caractères phénotypiques eux-mêmes.

L'invention concerne aussi des sondes et des amorces nucléotidiques permettant de déterminer la forme allélique d'un site polymorphe du gène Sh2, utiles notamment comme moyens de détermination de 1'identité de la i5 base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe au site polymorphe associé à une caractéristique ou à une combinaison de

caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine.

Elle a aussi pour objet un acide nuclélque dérivé du gène Sh2 et comprenant au moins un site polymorphe tel que défini dans la présente

o description, ainsi que des vecteurs recombinants comprenant un tel acide

nuclélque. Elle a également trait à une cellule hôte transformée par un acide nucléique ou un vecteur recombinant décrit ci-dessus, de préférence une

cellule hôte bactérienne ou vépétale.

s Elle concerne encore une plante transformoe par un acide nucléique

ou par un vecteur recombinant décrit ci-dessus.

Elle est aussi relative à des anticorps dirigés spécifiquement contre un polypeptide SH2 codé par un acide nucléique dérivé du gène Sh2

comprenant un site polymorphe tel que défini dans la présente description

ainsi qu'à un nécessaire ou kit comprenant 1'un de ces anticorps ou encore

une comb i nai son de pl usi eurs de ces anticorps.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 représente la séquence nucléotidique du gène Sh2 décrite par Shaw et Hannah (1992), qui est identique à la séquence SEQ ID

N 1 du listage de séquence.

La première colonne de gauche représente la numérotation en s nucléotides de la séquence SEQ ID N 1 du listage de séquences de la

présente description. Le premier nucléotide est numéroté 1.

La seconde colonne de gauche représente ia numérotation en nucléotides prescrite par Shaw et Hannah (1992), qui est basée sur la

position du nucléotide du site d'initiation de la transcription, numéroté +1.

o Le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID N 1 est le nucléotide en position-1020 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1 992).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La demanderesse a identifié, dans la séquence du gène Sh2, une coilection de polymorphismes dont elle a montré qu'ils étaient, chacun, associés à au moins une caractéristique phénotypique définissant la qualité de la graine d' une pl ante. L'identification de ces polymorphismes a rendu o possible la mise au point de procédés de détection de ces polymorphismes à partir de l'ADN d'un individu végétal, cellule végétale, plante au stade plantule, plante à un stade précoce de développement ou plante au stade végétatif, permettant de prédire quelles sont ou seront les caractéristiques

phénotypiques liées à la qualité de la graine ou de la future graine.

s L'association entre la présence d'un allèle défini d'un site polymorphe du gène Sh2 et au moins un caractère de remplissage du grain permet de mettre en relation un allèle donné ou une combinaison d'allèles donnés (haplotype) et un caractère phénotypique ou une combinaison de caractères phénotypiques définissant la qualité de la graine. Les inventeurs ont montré o que le polymorphisme du gène Sh2 est statistiquement associé à des caractères de qualité de la graine, tels que: - le nombre de graines par épi - la masse de la graine mature - la teneur en protéines de la graine s - la teneur en amidon de la graine - la teneur en amylose de la graine

- le rapport teneur en protéines/teneur en amidon dans la graine.

L' identification d'allèles particuliers de sites polymorphes associés aux caractéristiques de qualité de la graine, dans la séquence du gène Sh2, a permis de définir des séquences oligonucléotidiques spécifiques d'un allèle donné d'un ou de plusieurs sites polymorphes du gène Sh2 et d'utiliser ces séquences en tant que sondes ou amorces pour faciliter la sélection de plantes assistée par marqueurs, pour générer des séquences alléliques o favorables par mutagénèse dirigée, ou pour cloner des séquences apportant un caractère agronomique favorable, lié à la qualité de la graine, à la plante

transformée avec ces séquences.

Il a aussi été montré selon l'invention que certains polymorphismes du

gène Sh2 entranaient des modifications dans la séquence d'acides aminés.

s Les allèles favorables repérés au niveau de ces polymorphismes peuvent

être utilisés pour modifier la structure ou l'activité de l'enzyme AGPase.

Le gène Sh2 utilisé comme séquence nucléotidique de référence à partir de laquelle sont définis les divers sites polymorphes nouvellement identifiés selon l'invention est la séquence nucléotidique référencée dans la o base de données GenBank sous le numéro d'accès M81603 et qui est

reproduite comme la séquence SEQ ID N 1 du listage de séquences.

Le gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1 possède 7320 nucléotides de longueur. Il possède 16 exons, respectivement: - Exon n 1: du nucléotide en position 1021 jusqu'au nucléotIde en position 1082 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 62 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992), telle qu'illustrée sur la Figure 1.; - Exon n 2: du nucléotide en position 1521 jusqu'au nucléotide en position o 1745 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 501 jusqu'au nucléotide en position 725 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 3: du nucléotide en position 2222 jusqu'au nucléotide en position 2344 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 1202 jusqu'au nucléotide en position 1324 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 4: du nucléotide en position 2629 jusqu'au nucléctide en position 2799 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 1609 jusqu'au nucléotide en position 1779 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 5: du nucléotide en position 3036 jusqu'au nucléotide en position 3125 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 2016 jusqu'au nucléotide en position 2105 du to gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1 992).; - Exon n 6: du nucléotide en position 3217 jusqu'au nucléotide en position 3303 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 2197 jusqu'au nuciéotide en position 2283 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 7: du nucléotide en position 3388 jusqu'au nucléctide en position 3443 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 2368 jusqu'au nucléotide en position 2423 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 8: du nacléotide en position 3546 jusqu'au nucléotide en position o 3639 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nuciéotide en position 2526 jusqu'au nucléotide en position 2619 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 9: du nucléotide en position 3805 jusqu'au nocléotide en position 3917 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 2785 jusqu'au nucléotide en position 2897 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).; - Exon n 10: du nucléotide en position 3986 jusqu'au nucléotide en position 4058 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 2966 jusqu'au nucléotide en so position 3038 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1992).;

- Exon n 11: du nucléotide en position 4217 jusqu'au nucléotide en position 4297de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 3197 jusqu'au nucléotide en position 3277 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1992).;

- Exon n 12: du nucléotide en position 4463 jusqu'au nucléotide en position 4549 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 3443 jusqu'au nucléotide en position 3529 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1992).;

- Exon n 13: du nucléotide en position 4620 jusqu'au nucléotide en position 4724 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la o séquence allant du nocléotide en position 3600 jusqu'au nucléotide en position 3704 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1992).;

- Exon n 14: du nucléotide en position 6546 jusqu'au nucléotide en position 6652 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la s séquence allant du nucléotide en position 5526 jusqu'au nucléotide en position 5632 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1992).;

- Exon n 1 5: du nucléctide en position 6735 jusqu'au nucléotide en position 6795 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la o séquence allant du nucléotide en position 5715 jusqu'au nucléotide en position 5775 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

( 1 992).;

- Exon n 16: du nucléctide en position 6912 jusqu'au nucléotide en position 7287 de la séquence SEQ ID N 1, ce qui correspond à la séquence allant du nucléotide en position 5892 jusqu'au nucléotide en position 6267 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah

(1992).;

Dans la présente description, la numérotation utilisse pour définir la

position du nucléotide polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe d'un site polymorphe du gène Sh2 est exclusivement celle décrite par Shaw et Hannah (1992) et qui est rappelée dans la première

colonne de gauche de la séquence du gène Sh2 représentée à la Figure 1.

Sites nolymorphes du nène Sh2 selon l'invention Le polymorphisme du gène Sh2 a été déterminé à partir de l'ADN provenant de 33 lignées consanguines de mas, dont les caractéristiques

s phénotypiques liées à la qualité du grain ont été simultanément analysées.

L'analyse de polymorphisme a permis de caractériser 72 sites

polymorphes dans la séquence du gène Sh2.

Parmi ces 72 sites polymorphes, 19 d'entre eux ont présenté une différence nucléotidique pour une seule des lignses étudiées. Ces 19 sites o polymorphes ne présentaient pas une distribution statistique informative pouvant être mise en _uvre dans une étude d'association entre la présence d' u n al lèl e don né de ces sites polymorphes et la con statati on d' un caractère

phénotypique donné de la qualité de la graine.

Parmi les 53 sites polymorphes informatifs, certains d'entre eux ont été considérés comme redondants en ce que les mêmes allèles de deux ou plus de ces sites étaient systématiquement retrouvés conjointement dans l'ADN de plusieurs lignées. Deux sites poymorphes redondants apportent la mê m e information statistique concernant l' association de l' un de leurs all èl es

avec une caractéristique phénotypique déterminée de la qualité de la graine.

ilS permettent une discrimination identique entre deux lignées ou deux

groupes de lignées.

Selon l'invention, 43 sites polymorphes du gène Sh2 ont été retenus comme constituant des polymorphismes ou des groupes de polymorphismes d'intérêt, dont un allèle déterminé et caractérisé est statistiquement associé à une caractéristique phénotypique de la qualité de la graine et parfois à

plusieurs caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine.

Par " site polymorphe " du gène Sh2, on entend une région de la séquence du gène Sh2 laquelie, dans le génome de certaines lignées végétales, plus spécifiquement dans certaines lignées de mas, diffère par un so ou plusieurs nucléctides consécutifs par rapport à la région correspondante du gène Sh2 défini par la séquence SEQ iD N 1. Un site polymorphe peut consister en une variation d'un seul nucléotide qui peut prendre deux significations, par exemple une base A ou une base T. un tel site polymorphe étant alors désigné polymorphisme SNP (pour c Single Nucleotide Polymorphism "). Un site polymorphe peut aussi consister en l'addition ou la délétion d'un ou plusieurs nocléctides consécutifs, par rapport à la séquence de référence SEQ ID N 1. Ce second type de sites polymorphes est désigné

<< indel " (pour " Insertion-Délétion ").

Les sites polymorphes du gène Sh2 caractérisés dans la présente s invention sont définis ci-dessous. Ils sont caractérisés par leur différence nocléotidique par rapport à la séquence du gène Sh2 SEQ ID N 1 de référence et dont les positions de nocléotides sont définis selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). Tels qu'ils sont définis cidessous, les sites polymorphes du gène Sh2 sont caractérisés par leur allèle dont la o présence, dans le génome d'une plante, est associée à l'expression d'un

caractère phénotypique modifié de qualité de la graine.

(a) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléctide en position -921 du gène Sh2 est un G; s (b) un acide nuclélque dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -830 à -824, de séquence 5'-TGAGAAA-3', du gène Sh2 sont absents; (c) un acide nuclélque dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions-580 à -573, de séquence 5'-TCACCTAT-3', du o gène Sh2 sont absents; (d) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -438 du gène Sh2 est un G; (e) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -362 du gène Sh2 est un A; s (f) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position --347 du gène Sh2 est un T; (g) un acide nucléique dans lequel le nucléctide correspondant au nucléotide en position -296 du gène Sh2 est un T; (h) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au so nucléotide en position -277 du gène Sh2 est un T; (i) un acide nacléique dans lequel le nucléotide correspondant au nocléotide en position -266 du gène Sh2 est un C; 0) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -168 du gène Sh2 est un A; (k) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -15 du gène Sh2 est un A; (i) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +35 du gène Sh2 est un T; s (m) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucléotide en position +304 du gène Sh2; (n) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +515 du gène Sh2 est un C; (o) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au o nucléotide en position +587 du gène Sh2 est un C; (p) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +678 du gène Sh2 est un A; (q) un acide nuclélque dans lequel ie nucléotide correspondant au nucléotide en position +960 du gène Sh2 est un A; s (r) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1059 du gène Sh2 est un G; (s) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1068 du gène Sh2 est un G; (t) un acide nucleique dans lequel le nucléotide A correspondant au o nucléotide en position +1081 du gène Sh2 est absent; (u) un acide nucléique dans lequei le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1473 du gène Sh2 est un C; (v) un acide nuclélque dans lequel un T additionnel est présent après le nucléotide en position +1505 du gène Sh2; s (w) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nocléotide en position +1542 du gène Sh2; (x) un acide noclélque dans lequel le nucléotide correspondant au - nucléotide en position +1867 du gène Sh2 est un C; (y) un acide nucléique dans lequel le nucléotide T correspondant au so nucléotide en position +2514 du gène Sh2 est absent; (z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucléotide en position 2771 du gène Sh2; (ab) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +2939 du gène Sh2 est un G; (ac) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +2983 du gène Sh2 est un C; et (ad) un acide nuclélque comprenant l'insertion de la séquence '-GTlTllATllA-3' après le nucléotide correspondant au nucléotide en

s position +3123 du gène Sh2.

Pour le site polymorphe +587, la présence d'une base C constitue une substitution de base conservative n'entranant aucun changement dans la séquence d'acides aminés du polypeptide SH2 correspondant, par rapport au polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N 52 codé par la séquence SEQ

o ID N 1.

Pour le site polymorphe +678, la présence d'une base A entraine le remplacement, dans la séquence du polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N 52, de l'acide aminé Alanine, codé par la séquence SEQ ID N 1 à cette

position, par l'acide aminé Thréonine.

Pour le site polymorphe +2983, la présence d'une base C entrane le remplacement, dans la séquence du polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N 52, de l'acide aminé Leucine, codé par la séquence SEQ ID N 1 à cette

position, par l'acide aminé Sérine.

Comme exposé précédemment, la caractérisation selon l'invention de o sites polymorphes informatifs au sein de la séquence du gène Sh2 a rendu possible la construction de divers moyens de détection d'un allèle donné de chacun des sites polymorphes, utiles notamment dans des procédés de sélection de lignées de plantes, spécifiquement de mafs, possédant des

caractéristiques phénotypiques de qualité de la graine recherchées.

De tels procédés de sélection de lignées de plantes peuvent être réalisés à des stades précoces du développement de la plante, avant la formation des graines, à un moment du développement de la plante pour lequel iln'est pas possible de déterminer les caractéristiques phénotypiques de la graine. Les procédés mettant en _uvre une analyse des sites so polymorphes du gène Sh2 de l'invention ont donc une valeur prédictive d'un

grand intérêt technique et économique.

Utilisations et urocédés mettant en _uvre les caractéristinues des sites

nolymorPhes selon 17invention.

L'invention a pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des s caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1, ladite base polymorphe ou ladite séquence o nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide noclélque inclus dans un gène Sh2, choisi parmi les acides nuclélques suivants: (a) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -921 du gène Sh2 est un G; (b) un acide nuclélque dans lequel les nucléotides correspondant aux s nucléotides en positions -830 à -824, de séquence 5'-TGAGAAA-3', du gène Sh2 sont absents; (c) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions-580 à -573, de séquence 5'-TCACCTAT-3', du gène Sh2 sont absents; (d) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position 438 du gène Sh2 est un G; (e) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -362 du gène Sh2 est un A; (f) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position-347 du gène Sh2 est un T; (g) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -296 du gène Sh2 est un T; (h) un acide nucléique dans lequsi le nucléotide correspondant au nucléotide en position -277 du gène Sh2 est un T; so (i) un acide nucléique dans lequel le nucléctide correspondant au nucléotide en position -266 du gène Sh2 est un C; (j) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléctide en position -168 du gène Sh2 est un A; (k) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -15 du gène Sh2 est un A; (I) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +35 du gène Sh2 est un T; (m) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucléotide en position + 304 du gène Sh2; s (n) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +515 du gène Sh2 est un C; (o) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +587 du gène Sh2 est un C; (p) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au o nucléotide en position +678 du gène Sh2 est un A; (q) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +960 du gène Sh2 est un A; (r) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1059 du gène Sh2 est un G; s (s) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1068 du gène Sh2 est un G; (t) un acide nucléique dans lequel le nucléotide A correspondant au nucléctide en position +1081 du gène Sh2 est absent; (u) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au o nucléotide en position +1473 du gène Sh2 est un C; (v) un acide nuclélque dans lequel un T additionnel est présent après le nucléotide en position +1505 du gène Sh2; (w) un acide nuclélque dans lequel un T additionnel est présent après ie nucléotide en position +1542 du gène Sh2; (X) un acide nucléique dans lequel le nucléctide correspondant au nucléotide en position +1867 du gène Sh2 est un C; (y) un acide nucléique dans lequel le nucléotide T correspondant au nucléotide en position +2514 du gène Sh2 est absent; (z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le so nucléotide en position 2771 du gène Sh2; (ab) un acide nuclélque dans lequel le nucléctide correspondant au nucléotide en position +2939 du gène Sh2 est un G; (ac) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +2983 du gène Sh2 est un C; et (ad) un acide nucléique comprenant l'insertion de la séquence '-GTI I I IAl I IA-3, après le nucléotide correspondant au nucléotide en

position +3123 du gène Sh2.

L'expression aqualité du grain" englobe les caractères influant sur la qualité et la quantité de la graine tels que par exemple: le nombre de graines par épi, la masse des graines matures, la teneur en protéines, en amidon, en amylose et le rapport pondéral teneur en protéinesiteneur en amidon dans la graine, ainsi que tous les caractères complexes incluant un ou plusieurs de

o ces caractères.

Une des méthodes pouvant être utilisée pour déterminer le phénotype d'un individu à ce ou ces sites peut consister à: i) obtenir un échantillon d'ADN d'un individu, ii) identifier l'allèle à une ou plusieurs des positions citées ci-dessus (en référence aux positions décrites selon la séquence Genbank n M81603) dans le gène Sh2, iii) prédire la qualité du grain de l'individu en référence à l'association du polymorphisme du gène Sh2 tel que décrit ci-dessus et du

caractère de qualité de grain.

o L'échantillon d'ADN est obtenu selon les méthodes classiques d'extractions d'ADN utilisées chez les plantes, en particulier à partir de

jeunes feuilles de mais (Dellaporta et a/. 1983).

L'échantillon d'ADN devra contenir au moins la séquence du gène Sh2, c'est-à-dire une région de cette séquence pouvant être amplifise par s une quelconque technique connue de l'art antérieur, telle que par exemple, la PCR. La qualité du grain de l'individu étudié peut être déterminée en référence à la présence d'un allèle à au moins une, plusieurs ou toutes les position s décrites en combi naison avec d'autres polymorph i sm es dans le so gène Sh2 qui sont connus ou qui seront caractérisés ultérieurement li existe un grand nombre de procédures d'analyse connues dans l'état de la technique qui peuvent être utilisées par l'homme du métier pour détecter la forme allélique d'un ou plusieurs sites polymorphes du gène Sh2 de l'invention. En général, la détection des allèles requiert une technique de ss discrimination des polymorphismes. En général, les méthodes courantes impliquent l'amplification de la séquence cible puis l'identification des allèles par des hybridations de courtes sondes, par restriction par des endonucléases, par discrimination par polymérases ou ligases, en observant le nucléotide incorporé par la polymérase en fonction de la séquence

s matrice, ou par détection de mésappariement sur de l'ADN double brin.

Parmi ces techniques de détection d'allèles, il peut être cité les techniques suivantes: séquençage d'ADN, séquençage par hybridation, SSCP (Single strand conformation polymorphism analysis), DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (Temperature gradient gel o electrophoresis), analyse d'hétéroduplex, CMC (Chemical mismatch cleavage) , Dot blots, Reverse dot blots, oligonucleotide array (puce à ADN), Taqman_ (US 5210015 et US 5487972, Hoffmann-La Roche), ARMS_ (Amplification refractory mutation system), ALEX_ (Amplification refractory mutation system linear extension, EP 332435B1, Zeneca Itd)), COPS (Gibbs et a/. 1989), mini-séquençage, APEX (Arrayed primer extension) , RFLP (Restriction fragment length polymorphism), sites de restriction sur produit de PCR (CAPS), OLA (Oligonucleotide ligation assay), pyroséquençage (Nyrèn

etal. 1997).

Ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec des o systèmes de générations de signaux comme, par exemple, les techniques suivantes: FRET (Fluorescence resonance energy transfer), fluorescence quenching, fluorescence polarisation (UK 2228998, Zeneca Itd), chimioluminescence, électrochimioluminescence, radioactivité, colorimétrie, hybridization protection assay, spectrométrie de masse. D'autres techniques s d'amplification telles que la SSR (Self sustained replication), LCR (Ligase chain resction), SDA (Strand displacement amplification) ou lebDNA (branched DNA). La plupart de ces techniques de détection des variations ai!éliques sont récapitulées dans des ouvrages standard comme " Laboratory Protocols for mutation detection ", Ed. by U.Landegren, Oxford so University press, 1996 et " PCR ", 2nd Edition by Newton et Greham, BIOS Scientific Publishers Ltd. 1997). D'autres protocoles de séquerçage, de cl onage et autres aspects de biologie mol écu laire sont répertoriés dans

"Genes Vll" (Lewin, 1999).

Ces techniques peuvent utiliser des oligonucléotides synthétisés à partir des séquences suivantes (la forme allélique du SNP ou indel détecté dans l'invention est indiquée entre parenthèses, et la différence entre la forme allélique de la variété de référence BMS et l'allèle décrit est indiquse en gras): Dans l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nacléotidique, telle s qu'elle est définie ci-dessus, ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique peut être caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre la présence d'un premier acide nuclélque (1) et d'un second acide nucléique (2), lesdits acides nuclélques (1) et (2) étant choisis parmi les suivants: o Sites polvmorphes (a) Site - 921: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 2 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 2 dans lequel le nucléotide en position 41 est une i5 base A; (b) Site - 438: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 3 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 3 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A; o (c) Site - 362: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 4 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQID N 4 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (d) Site - 347: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQID N 5 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 5 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (e) Site - 296: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 6 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de so séquence SEQID N 6 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (f) Site 277: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 7 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 7 dans lequel le nucléctide en position 41 est une base C; (9) Site- 266: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 8 dans lequel le nocléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 8 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (h) Site- 168: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 9 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 9 dans lequel le nocléotide en position 41 est une base G; (i) Site -15: I'acide nacléique (1) de séquence SEQ ID N 10 dans lequel o le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide noclélque (2) de séquence SEQID N 10 dans lequel le nuciéotide en position 41 est une base G; (j) Site + 35: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 11 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de s séquence SEQID N 11 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (k) Site + 515: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 12 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 12 dans lequel le nucléotide en position 41 est o une base T; (I) Site + 587: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 13 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQID N 13 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (m) Site + 678: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 14 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 14 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (n) Site + 960: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 15 dans so lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 15 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (o) Site + 1059: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 16 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 16 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (p) Site + 1068: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQID N 17 dans lequel le nucléotide en position 41 est une 1aase G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 17 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (q) Site + 1473: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 18 dans lequei le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 18 dans lequel le nucléotide en position 41 est o une base T; (r) Site + 1867: I'acide nuciéique (1) de séquence SEQ ID N 19 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 19 dans lequel le nacléotide en position 41 est une base T; s (s) Site + 2939: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 20 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 20 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (t) Site + 2983: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 21 dans o lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 21 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (u) Site - 830 à -824: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 23 et l'acide nacléique (2) de séquence SEQIDN 22; (V) Site - 580à-573: I'acide nuciélque (1) de séquence SEQID N 25 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQIDN 24; (w) Site + 304: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQID N 27 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQIDN 26; (x) Site + 1081: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 29 et l'acide so nucléique (2) de séquence SEQIDN 28; (y) Site + 1505: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 31 et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQIDN 30; (z) Site + 1542: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQID N 33 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQIDN 32; (aa) Site + 2514: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 35 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 34; (ab) Site + 2771: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 37 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 36; et s (ac) Site + 3123: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 39 et

l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ll) N 38.

Sel on un autre mode de réalisati on préféré, led it aci de n ucléi que est un acide nuclélque s'hybridant spécifiquement avec un acide nuclélque de séquence complémentaire à l'un quelconque des acides nucléiques (1) ou

o (2) définis en (a) à (ac) ci-dessus.

L'utilisation ci-dessus peut être aussi caractérisée en ce que: a) la sonde nucléotidique sthybride spécifiquement avec un acide nucléique d'une première forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un premier allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 et ne s'hybride pas avec un acide nuclélque d'une seconde forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un second allèle d'un site polymorphe du gène ShZ; ou b) I'amorce nucléotidique hybride spécifiquement avec une séquence o nucléotidique contenue dans un gène Sh2, ladite séquence nucléotidique étant localisée en amont d'une forme allélique d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe dont la présence ou l'absence

définit un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2.

Le polymorphisme du gène Sh2 une fois identifié par l'une des méthodes décrites ci-dessus peut être utilisé, selon l'invention, pour réaliser une sélection prédictive de plantes avec une meilleure qualité de grain, y compris la sélection de plantes au stade plantule eVou au stade précoce

eVou au stade végétatif.

La séquence nucléotidique du gène Sh2 de mafs SEQ ID N 1 so présente une forte identité en nucléotides avec les séquences nucléotidiques de nombreuses céréales, en particulier de nombreuses variétés de graminées, identité qui est presque totale dans le cadre ouvert de lecture

(ORF).

En parti cu lier, la séquence du gène Sh2 de ma fs po ssade un e très grande identité en nucléotides avec le gène Sh2 de sorgho, I'identité la plus grande entre les deux séquences étant retrouvée dans le cadre ouvert de lecture (ORF). Ainsi, le polypeptide SH2 codé par le gène Sh2 de sorgho possède une différence d'un seul acide aminé avec le polypeptide SH2 codé

par le gène Sh2 de maTs SEQ ID N 1.

Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les sites polymorphes retrouvés dans le gène Sh2 de mas sont également retrouvés dans le gène Sh2 du génome d'autres céréales, en particulier graminées, et encore plus spécifiquement dans le gène Sh2 du sorgho. Les sites polymorphes localisés dans le cadre ouvert de lecture du o gène Sh2 de mas SEQ ID N 1 sont ceux qui ont statistiquement le plus de probabi l ité de se retrouver aussi dans les gènes Sh2 d' autres céréal es, en

particulier d'autres graminées, comme le sorgho.

La sélection prédictive s'applique donc en particulier aux céréales telles que par exemple le mas et le sorgho. L'utilisation du polymorphisme allélique décrit dans l'invention s'applique particulièrement à la sélection de variétés de maTs. Lorsqu'une population est ségrégeante sur plusieurs loci affectant plusieurs caractères de qualité de grain, la sélection assistée par marqueur (SAM) est plus efficace qu'une simple évaluation phénotypique puisqu'elle permet notamment des cycles de sélection beaucoup plus o rapides que les techniques classiques de caractérisation directe du phénotype. Un autre avantage de la SAM par rapport à l'évaluation phénotypique est que les analyses sont complètement indépendantes des

aléss climatiques.

L' util isati on ci-dessus est en outre caractérisoe en ce que l es caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de ia graine sont choisies parmi le nombre de graines par épi, la masse des graines, la teneur en protéines des graines, la teneur en amidon des graines, la teneur en amylose des graines et le rapport pondéral protéines/amidon des graines,

ou une combinaison de ces caractéristiques phénotypiques.

so L'invention a aussi pour objet un procédé pour déterminer l'identité de l'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de l'identité de la base polymorphe s ou de la séquence nucléotidique poiymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide nuclélque correspondant à au moins un des nucléotides en position -921, -830 à-824, -580 à-573,-438,- 362, -347,

-296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059,

+1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 et

s +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

Selon un premier aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que la caractérisation du site polymorphe est réalisée par séquençage dudit

acide nuclélque.

Selon un second aspect du procédé ci-dessus, la caractérisation de o l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde nuciéotidique s'hybridant spécifiquement avec la séquence d'un allèle déterminé du gène Sh2. Selon cet aspect, la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une base polymorphe ou une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe

déterminé du gène Sh2.

Selon un troisième aspect du procédé ci-dessus, la caractérisation du site polymorphe est réalisée par élongation d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une séquence nucléctidique localisée en o amont d'une forme allélique d'une base poiymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe

déterminé d'un gène Sh2.

Selon une caractéristique particulière de ce troisième aspect, la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation s d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec la séquence située en amont, du côté 5' de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle donné d'un site polymorphe du gène Sh2, puis élongation de l'amorce. La caractérisation de l'ailèle polymorphe peut être réalisée par séquençage du produit de l'élongation de I'amorce. Dans un mode de réalisation particulier7 le nucléotide situé à l'extrémité 3' de l'amorce hybride avec le nucléotide situé immédiatement en amont du côté 5' de la base polymorphe ou de la séquence nucisotidique polymorphe. Dans ce mode de réalisation particulier, l'identité de l'allèle du site polymorphe considéré peut être déterminé directement en réalisant ss l'étape d'élongation de l'amorce en présence de didéoxynucléotides fluorescents bloquant la résction d'élongation. L'identité du didéoxynucléotide aouté à la séquence de l'amorce, et donc l'identité de l'allèle du site polymorphe, est déterminée directement par analyse de fluorescence. Il s'agit de la technique de micro-séquençage, bien connue s dans l'état de la technique. L'amorce hybride avec le brin d'ADN comprenant la séquence codant le polypeptide SH2 (le brin+) ou avec le brin d'ADN complémentaire, qui porte une base complémentaire de la base

correspondante portée par le brin " + " au site polymorphe.

Selon un quatrième aspect, le procèdé est caractérisé en ce que pour o sélectionner une plante possédant un nombre modifié de graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position-168, +1473, +1542 et +2983 du gène

Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

s Selon un cinquième aspect, le procédé est caractérisé en ce que pour sél ectionner u ne plante avec une masse mod ifiée de g rain e, on déterm i ne l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un .. des nucléctides en position-168, +1473, +1542 et +2983 du gène Sh2 de

o séquence SEQ ID N 1.

Selon un sixième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante ayant une teneur modifiée en protéines dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473,

+1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, + 1505

et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

Selon un septième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amidon dans la so graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de

séquence SEQ ID N 1.

Selon un huitième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amylose dans les graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique s correspondant à au moins un des nucléotides en position - 38, -266, + 678,

+960, -921, -580 à-573, -277, +35, +304, +1059, +1081, +1867, +2514,

+2771 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

Selon un neuvième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant un rapport protéineslamidon modifié dans to la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, + 1473,

+1542, +2983, -830 à-824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505

et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

Selon un dixième aspect, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il est réalisé sur l'ADN prélevé à partir de plantes au stode plantule eVou au stade

précoce eVou au stade végétatif.

De préférence, la plante est une céréale, de préférence une céréale à paille.

o Préférentiellement, la plante est choisie parmi le maTs et le sorgho.

Sondes ef amorces nacléct;diques L'invention concerne également les amorces et les sondes obtenues à partir des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et spécifiques d'un allèle du gène Sh2. Une des applications de l'invention consiste à utiliser ces sondes eVou amorces pour détecter ie polymorphisme du gène Sh2 à au moins l'un des sites polymorphes tels qu'ils ont été définis ci-dessus. Les sondes et les amorces obtenues selon un des aspects de l'invention peuvent étre employées comme marqueurs spécifiques d'un allèle so du gène Sh2. Les amorces nucléotidiques spécifiques d'allèles, ou permettant de discriminer selon les allèles connus, sont constituses préférentiellement de 8 à 40 nucléotides, plus précisément de 17 à 25 nucléotides. La réalisation de telles amorces est connue de l' hom me du métier. En général, de telles amorces comprennent une séquence entièrement complémentaire à la séquence définissant l'allèle de référence ou l'allèle a variant " associé à un caractère phénotypique de qualité

améliorée de la graine, tel que défini précédemment dans la description. Les

amorces objets de l' invention ai nsi réal isées portent un ou pl us ieurs marquages pour faciliter leur détection. Par exemple, le marquage peut être fluorimétrique (digoxygénine, fluoresceine, etc...), radioactif (par exemple 32p), enzymatique (peroxydese, phosphatase alkaline, etc...), ou réalisé par

des microbilles d'or, de verre coloré ou de plastique.

Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 à SEQ ID N 39, ainsi que les acides nucléiques o de séquences complémentaires aux séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 39, sont uti l es pour la fabrication de son des ou d'amorces permettant, lorsqu'elles sont mises en _uvre dans des résctions d'hybridation, d'élongation ou d'amplification, de discriminer entre eux les deux allèles d'un

site polymorphe donné du gène Sh2 caractérisé selon 1'invention.

Font égal ement partie de l' invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant avec un acide nuclélque choisi parmi les séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 39, ou avec un acide nucléique de séquence complémentaire à l'une des séquences SEQ ID n 2 à SEQ ID N 39.

L'invention a aussi pour objet une sonde ou une amorce nucléotidique o caractérisoe en ce qu'elle permet de discriminer entre eux les différents allèles d'un site polymorphe à au moins l'une des positions-921, -830 à

-824, -580 à -573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, + 304,

+515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081, +1473, +1505, +1542,

+1867, +2514, +2771, +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence

s SEQ ID N 1.

Elle est également relative à l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce telle que définie ci-dessus comme marqueur d'au moins un site polymorphe

du gène Sh2.

L'invention concerne également les kits de diagnostic comportant des so séquences nucléctidiques telles que définies ci-dessus, spécifiques de l'allèle favorable du gène Sh2 pour un ou plusieurs des caractères agronomiques choisis parmi le nombre de grains par épi, la masse du grain

mûr, les teneurs en amidon, en amylose ou en protéines du grain.

Elle a aussi pour objet une trousse ou kit prédictif des caractéristiques phénotypi ques de qualité d' une graine de pl ante, caractéri sé en ce qu' i i comprend: a) une sonde ou une piuralité de sondes ou d'amorces telles que définies s ci-dessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une résction

d'hybridation ou d'amplification.

Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est

caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

to Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un

marqueur détectable.

Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n EP o 0. 707.592. Chacun des acides nuclélques selon i'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques,

biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32p 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5bromodéoxyuridine,

fluarescoine, acétylaminofluorène) ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de mo lécu l es marquées au sein des polynucl éoti des par extension d' amorces,

so ou bien par rejout sur les extrémités 5'ou 3'.

Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR-78.10975 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez Pescador et

al. (1988).

De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al; (1991) ou encore dans

le brevet européen n EP-0.225.807 (Chiron).

s Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN du gène Sh2 ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de ce gène lorsque

l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.

Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisses pour la o détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements. Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et englobent les surfaces des puits de plaques s de micro-titration, les billes de polystyrène, les billes magnétiques, les bandes de nitrocellulose ou encore les microparticules telles que les

particules de latex.

Moyens d'expression des acides nacléiques comprenant un s/fe

o polymorphe du gène Sh2.

L'invention concerne également l'utilisation des méthodes décrites ci dessus pour isoler et /ou cloner les formes alléliques particulières et/ou favorables du gène Sh2, notamment en combinaison avec des techniques de biologie moléculaire comme par exemple la PCR, ia RT-PCR, le séquençage d'allèles (par exemple pyroséquençage,). L'homme de l'art pourra trouver

la description des principales techniques de clonage dans des ouvrages

généraux tels que " Guide to Molecular Cloning Techniques " (Berger et Kimmel, ref), " Molecular Cloning A-laboratory manual >> (Sambrook et al.,

2001), Current protocols in molecular biology " (Ausubel et al., 1997).

o Un acide nucléique comprenant la séquence complète d'un allèle déterminé du gène Sh2 et comprenant au moins une base polymorphe d'un

* site polymorphe tel que défini dans la présente description, ou un acide

nocléique comprenant l'ensemble des exons de cet allèle déterminé du gène Sh2, peut être obtenu selon des techniques bien connues de l'homme du ss métier, comme par exemple par la technique d'amplification PCR à l'aide d'amorces s'hybridant spécifiquement avec les extrémités nucléotidiques cibles choisies du gène Sh2, comme cela est décrit notamment dans les

exemples.

Notamment, l'homme du métier peut se baser sur la séquence SEQ ID N 1 pour synthétiser des sondes et des amorces nocléotidiques permettant d'isoler et de cloner n'importe quel acide nucléique allélique du

gène Sh2.

Par exemple, I'homme du métier peut obtenir un acide nucléique dérivé du gène Sh2 et comprenant au moins un allèle associé à une o caractéristique phénotypique de quantité ou de qualité de la graine améliorée d'au moins un site polymorphe selon l'invention en amplifiant respectivement la partie 5' et la partie 3' du gène Sh2 en se basant sur la séquence

nucléotidique SEQ ID N 1.

L'invention a aussi pour objet un vecteur recombinant dans lequel a été inséré un acide nuclélque comprenant la séquence complète d'un allèle déterminé du gène Sh2 et comprenant au moins une base polymorphe d'un

site polymorphe tel que défini dans la présente description, ou un acide

nuclélque comprenant l'ensemble des exons de cet allèle déterminé du gène Sh2. o De préférence, un tel acide nucléique est un acide nucléique dérivé du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1 et comprenant au moins une base polymorphe ou au moins une séquence nucléotIdique polymorphe à au moins l'une des positions -921,-830 à -824,-580 à -573, - 438, - 362, - 347,

-296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059,

+1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 et

+3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

Un premier acide nucléique objet de l'invention est un acide nocléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale, en particulier à un mas, un nombre modifié de graines, par rapport au mas de o référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléIque comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel

que défini dans la présente description à au moins un site polymorphe choisi

parmi les sites polymorphes - 168, + 1473, + 1542 et + 2983 du gène Sh2

ss de séquence SEQ ID N 1.

: - 30 2828694

Un second acide nuclélque objet de l'invention est un acide nuclélque susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale, en particulier à un maTs, une masse modifiée de la graine par rapport au mas de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah . . - 5 (1992), ledit acide nuclélque comprenant la forme- allélique associée I'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel

que dénl dans la présente description5 à au moins un site polymorphe choisi

parmi les sites polymorphes -168,+1473, 1542 et + 2983 du gène Sh2 de

À. -:.- sequencé.SEQ IDN 1..:.::. -. .

o; Un troisième acide nuclélque objet de l'invention èst un acide nuclélque susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale en particulier à un mas, une teneur modifiée en protéines dans les graines, par rapport au mas de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nuclélque comprenant la forme i5 allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de

qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins

un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, 1473, +

1542, 2983, - 830 à - 824, - 362, -.347, - 296, - 15, 5-15, +.1068, + 1505

i et +.2939 du géne Sh? dé séquence SEQ ID N .1.:... - -;: - Un quatrième acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptIble de conférer à une plante, de préférence une céréale en particulier à un maTs7 une teneur modifiée en amidon dans les graines, par rapport au mafs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ladit acide nucléique comprenant la forme 2s allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de

un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 830 à - 824, 362, :.! - 3A7, - 296, - 16, 515, 587, + 1068, + 1505.et + 2939-du gène Sh? de

- séquence SEQ ID N 1.- -

so Un cinquième acide nucléique objet de l'invention est un acide nuclélque susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale, . en particulier â:un mas, une teneurniodifée en amylose--dans les. graires, À par rapport au mafs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nuclélque comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de

un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 438, - 266, + 678,

+ 960, - 921, - 580 à - 573, - 277, 3S, + 304, + 1059, + 1081, + 1867, +

2514, + 2771 et + 3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

U n sixiè me aci de n ucléi que objet de l' invention est u n aci de nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale en particulier à un ma s un rapport protéines/amidon mod ifié dans la g rai ne, par rapport au mas de référence de la variété Biack Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique o associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la

graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site

polymorphe choisi parmi les sites polymorphes-168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 à - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et

+ 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

i5 La variété de mas Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992) , qui est la variété de référence, peut aussi être désignée variété de

maTs " sauvage ", aux fins de la présente description.

Les techniques de mesure du nombre de graines, de la masse de la graine, de la teneur en protéines de la graine, de la teneur en amidon dans la o graine, de la teneur en amylose dans la graine et le calcul du rapport teneur en protéines/teneur en am i don font partie des con nai ssances général es

techniques de l'homme du métier.

L'invention concerne aussi un vecteur recombinant, par exemple un vecteur recombinant de clonage ou un vecteur recombinant d'expression,

dans lequel a été inséré un acide nucléique tel que défini ci-dessus.

Selon une des applications de l'invention, les séquences nucléotidiques constituant des formes alléliques particulières du gène Sh2 peuvent être clonées, transféréss dans des cellules, en particulier pour produire des plantes transgéniques. Les séquences nucléotidiques des loci so sélectionnés sont introduites dans les cellules végétales, soit en culture soit dans des organes de plantes comme par exemple les feuilles, les tiges, les graines, les racines, etc... L'expression naturelle ou synthétique de ces séquences peut être réalisée en liant de manière opérationnelle ces séquences d'intérêts à un promoteur, en incluant le construit dans un vecteur s5 et en introduisant le vecteur dans une cellule hôte. Un promoteur endogène

lié à la séquence nucléotidique à introduire peut favorablement être employé.

Les vecteurs habituellement utilisés comprennent des séquences initiatrices et terminatrices à la fois de transcription et de traduction, et des promoteurs permettant la réqulation de l'expression de cette séquence nuciéctidique particulière. Les vecteurs peuvent également comprendre des cassettes d'expression avec au moins une séquence terminatrice indépendante, des séquences permettant la réplication de la cassette chez les eucaryotes ou les procaryotes ou les deux (vecteurs navettes) et un marqueur de sélection pour au moins l'un des deux systèmes procaryotiques ou eucaryotiques o (Giliman et Smith, 1979; Roberts et al., 1987; Schneider et a/., 1995;

Sambrook ef al., 2001; Ausubel et a/., 1997).

Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaque du chou-fleur (Franck et al. 1980) ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti

d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.

Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment les promoteurs dits constitutifs, les promoteurs dits inductifs ainsi que les promoteurs tissus spécifiques. Un promoteur constitutif permet zo une expression forte du transcrit dans i'ensemble des tissus de la plante régénérse et sera actif dans la plupart des conditions environnementales, et

dans l'ensemble des étapes de transformation et de différentiation cellulaires.

Par exemple, le promoteur 35S ou le promoteur double pd35S du CaMV décrit dans l'article de Kay et al., (1987), ou le promoteur de l'actine du riz s suivi de l'intron actine de riz contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al. 1991; ou encore le promoteur ubiquitine 1 de mas (Christensen et al., 1996). Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser une séquence promotrice de transcription inductible capable d'être contrôlée par les conditions environnementales ou le stade de développement, comme

so par exemple les promoteurs phénylalanine ammoniac Iyase (PAL), d'HMG-

CoA réductese (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de protéinase (Pl), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US-5.670.349), tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par ie Tableau 3 du brevet US 5.670.349. Une autre catégorie de promoteurs pouvant être utilisée regroupe les promoteurs tissus spécifiques, comme par exemple les promoteurs tissus spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment ies promoteurs de la napine (EP-0.255.378), de la glutenine, de l'héliantinine (WO-92/17580), de l'albumine (W0-98145460), de l'oléosine (WO-98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (WO-99/20775). Les méthodes ies plus répandues pour introduire des acides nucléiques dans des cellules bactériennes peuvent être utilisées dans le cadre de cette invention. Ce peut être la fusion de cellules réceptrices avec des protoplastes bactériens contenant l'ADN, I'électroporation, le o bombarde ment par projecti les, I' infection par des vecteu rs vi raux, etc. Les ceilules bactériennes sont souvent utilisées pour amplifier le nombre de plasmides contenant le construit comprenant la séquence nucléotidique, objet de l ' i nvention. Les bactéri es sont mises en cu lture et l es pl asm ides sont ensuite isolés selon des méthodes bien connus de l'homme du métier (se reporter aux manuels de protocoles déjà cités), incluant les kits de purification de plasmides vendus dans le commerce comme par exemple EasyPrepl de Pharmacia Biotech ou QlAexpress Expression System de Qiagen. Les plasmides ainsi isolés et purifiés sont ensuite manipulés pour produire d'autres plasmides qui seront utilisés pour transfecter les cellules o végétales. La transformation de cellules végétales peut être réalisse par diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes végétaux après incubation de ces derniers dans une solution de polysthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+), s l'électroporation (Fromm et al. 1985), 1'utilisation d'un canon à particules, ou

la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (Neuhaus et al, 1987).

Une des méthodes de transformation de cellules végétales pouvant être utilisse dans le cadre de l'invention est l'infection des cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence o d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium tumeLaciens (An ef al.

1 986), ou A. rRizogenes (Guerche et al. 1987).

De manière préférentiel le. la transformation des cell ules végétales est réalisse par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A. tumeLaciens, en utilisant s un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant

inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes.

L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide s modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessai res à la transformation de la cell ul e vépétale. Ce plasm ide est

maintenu dans AgrobaGterfum.

Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida et al. (1996) peut être appliquée pour la transformation des monocotylédones, en o particulier le mas. Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992) utilisant le canon à particules

de tungstène ou d'or.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique dérivé du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1 tel que défini ci-dessus pour

s transformer une cellule hôte.

De préférence, la cellule hôte est une cellule hôte bactérienne, par exemple une cellule de Agrobacterium tumeLaciens, ou une cellule végétale, de préférence une cellule de céréale, et de manière tout à fait préférée une

cellule de mas, de riz, de blé, de seigle ou d'orge.

L'invention concerne également les cellules transformées, avec les séquences nocléotidiques constituant des formes alléliques particulières du gène Sh2, y compris ies micro-organismes (virus et bactéries) et les cellules

vépétales, en particulier des cellules de mais.

El le a trait en particulier à une cellule hôte transformée par un acide nucléique dérivé du gène Sh2 ou par un vecteur recombinant, tels que

définis ci-dessus.

L'invention concerne également les plantes régénérées à partir des cellules vépétales transformées décrites ci-dessus, ainsi que les plantes dont au moins un des parents a été régénéré à partir d'une cellule vépétale so transformée comprenant au moins une des séquences nucléotidiques

constituant une forme allélique particulière du gène Sh2.

L'invention concerne également l'utilisation d'un acide nuclélque, ou d'un vecteur recombinant ou d'une cellule hôte transformée, définis selon l'invention, pour fabriquer une plante transformée capable de produire des

graines à qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées.

Rentre également dans l e cad re de l' invention une pl ante transformée

comprenant une pluralité de cellules hôtes transformées selon l'invention.

L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à qualités s industrielles ou agroalimentaires améliorées, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide nuclélque ou par un vecteur recombinant selon l'invention; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant o intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nuclélque selon l'invention; c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules

transformées obtenues à l'étape b).

L'invention s'étend à une plante transformée ou toute partie d'une

plante transformée telle que définie dans la présente description, telle que la

racine, mais aussi les parties aériennes comme la tige, la feuille, la fleur et surtout la graine. L'invention a encore pour objet une semence ou une graine

de plante produite par une plante transformée telle que définie ci-dessus.

Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé o comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nuclélque définie selon l'invention, le cas échéant

de manière contrôlée et inductible.

Fait également partie de l'invention tout produit de transformation

d'une semence telie que définie dans la présente description.

Anficorps dirigés spécifiquement contre les protéines SH2 produites par un acide nacléique comprenant un site dont /e polymorphisme est décrit selon l'invention L'invention concerne également les anticorps monoclonaux ou so polyclonaux reconnaissant spécifiquement des polypeptides correspondant à des allèles du gène Sh2, ces allèles comprenant au moins l'une des formes décrites aux positions n -921, -830à- 824, -580à-573, -438, -362, -347, -296,

-277, -266, -168, -15, 35, 304, 515, 587, 678, 960, 1059, 1068, 1081, 1473,

1505,1542,1867, 2514, 2771, 2939, 2983, 3123.

Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps suivants: les anticorps reconnaissant spécifiquement la région d'acides aminés d'un polypoptide SH2 codée par les nucléotides localisés à proximité du site polymorphe +678, ces anticorps étant capables de discriminer entre la présence d'un résidu Alanine et la présence d'un résidu Thréonine codé par s le codon comprenant la base polymorphe de ce site polymorphe; et - les anticorps reconnaissant spécifiquement la région d'acides aminés d'un polypeptide SH2 codée par les nucléotides localisés à proximité du site polymorphe +2983, ces anticorps étant capables de discriminer entre la présence d'un résidu Leucine et la présence d'un résidu Sérine codé par le o codon comprenant la base polymorphe de ce site polymorphe L' invention concerne également le kit de diagnostic comportant un

mélange de ces anticorps.

Les anticorps définis ci-dessus sont utiles notamment pour prédire les caractéristiques phénotypiques de quantité ou de qualité de la graine, sans nécessiter d'analyse directe, par exemple biochimique, longue et coûteuse

de ces caractéristiques phénotypiques.

Des anticorps contre les polypeptides SH2 définis ci-dessus peuvent être préparés selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier. o Par " anticorps" au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemp le l es fragments F(ab)'2, F (ab)) ou encore tout polypepti de comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou

le fragment de polypeptide cible selon l' invention.

Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975) La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la

so technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).

L' invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chane Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N 4,946,778 ou encore

par Martineau et al. (1998).

Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments 3 5 d' anti corps obtenus à l'aide de banq ues de ph ages tel les que d écrites par Ridder et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par Reinmann et al. (1997) et Leger et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence eVou de la quantité d'un polypeptide SH2 tel que défini ci-dessus ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent

dans un échantillon.

Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la blotine, selon des

o techniques bien connues de l'homme du métier.

Ainsi, I'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de: a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que i5 décrit ci-dessus;

b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.

L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: o a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection

du complexe antigène/anticorps formé.

De surcrot, I'invention a également pour objet une base de données comportant au moins l'une quelconque des séquences nucléotidiques s décrites, obtenues, isolées ou identifiées dans au moins l'une des

applications de l'invention.

La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants:

EXEMPLES

Exemple 1: Identification de sites PoivmorPhes dans le qène Sh2.

1.1 Matérel vépétal Au total, 33 lignées consanguines de mas ont été analysses pour, d'une part, le séquençage du gène Sh2, et d'autre part les mesures de phAnpes du gem. Ces lances sow dangle eupbenne, amAAcaine ou tmcale, ieur apparentement sur la base de donndes RFLP, est Bible (DubreuN e1 al.1996, et donndes non pubU6est Les caractdsques du grain

des ligndes A Z et a e sont prAsentes dans le tableau 1.

Tableau 1: Caractéristiques des lignées Lignées Grain Corné Denté B Denté C Corné-denté D Corné E Denté F Corné G Denté Corné I Denté J Denté K Corné Denté L Denté M Denté Denté O Denté P Denté Q Denté R Denté S Denté T Denté Denté V Farineux W Denté X Denté Y Denté Z Corné Tableau 1:Caractéristiques des lignées (suite) Lignées Grain a Corné Denté b Denté Corné d Corné e Corné Corné 1.2 Détection du polymorphisme du gène Sh2 L'ADN a été isolé à partir de jeunes feuilles par une méthode décrite par Causse et al. (1995). Deux fragments chevauchants ont été amplifiés par PCR à l'aide de primers dessinés à partir de la séquence de référence du o gène Sh2 chez la lignée Black Mexican Swest SEQ ID N 1 (Shaw and Hannah, 1992). Le premier fragment (Sh2-l) de longueur voisine de 2653 bp couvre environ 1000bp en amont de la boite TATA supposée, les trois premiers introns, les trois premiers exons ainsi qu'une partie de l'exon 4. Le second fragment (SH2-ll) a une longueur voisine de 2455 bp, et recouvre les s introns 3 à 12, les exons 3 à 12 ainsi qu'environ 30 bases de l'exon 13. Les amorces utilisées sont les suivants (position sur la séquence de référence): pour Sh2-l: - 5'-CTGGGCAGGGAGAGCTAT (position- 1008) (SEQ ID N 40) - 3'-GGATATCMTMGCCTGTMCAT (position 1623) (SEQ ID N 41) o pour Sh2-ll: - 5'-TGCAGCATTCTCMMCACAG (position 1197) (SEQ ID N 42) 3'-CGATGTTGCATTCTCTCAGTM (position 3630) (SEQ ID N 43) Pour les deux fragments et toutes les lignées, les amplifications par PCR ont été réalisées dans 100,ul (environ 0.1 à 1.5g d'ADN, 1.75u de taq s polymérase Roche Expand High Fidelity, 0.5,uM de chaque amorce, 0.3,uM de dNTP, 1.875 mM de Mg2+) dans les conditions suivantes: - dénaturation à 94 C: 2 min - 9 cycles: dénaturation à 94 C: 30 S hybridation de 60 à 52 C (diminution de 1 C par cycle): S élongation à 72 C:2 min - 25 cycles: dénaturation à 94 C: 30 S hybridation à 51 C: 30 S élongation à 72 C: 2 à 10 min (augmentation de 20 S o par cycle) - élongation à 72 C: 7 min Après purification sur gel grâce au kit QIAEX de Qulagen, les produits

de PCR ont été séquencés par les sociétés Génome Express ou Genaxis.

Tout d'abord, les amorces de PCR ont été utilisées pour la séquence, puis la partie centrale des fragments a été séquencée grâce aux nouvelles amorces suivantes: - Pour Sh2-1: '-ATGTCCTGCACCTAGGGAGC (position -424), (SEQ ID N 44) 53-CCACCAGTATGCCCTCCTCA (position -58), (SEQ ID N 45) 3'GACCCTAI GMCAMTCTT (position 852), (SEQ ID N 46) 3'-GCAGCMCTCTMGGTCTATTT (position 961), (SEQ ID N 47) '-TTTGGGAGACTTCCAGTCM (position 1503), (SEQ ID N 48) - Pour Sh2-11: S 3'-CATCGTCCTCGACATGTTT (position 2365), (SEQ ID N 49) 3'-GGAAAGCAGATTAGACCATAT (position 2486), (SEQ ID N 50) 3'-TGGAAACTGGAMCAAAMCMC (position 3098) (SEQ ID N 51) Une première correction des séquences, les contigs et l'alignement o des séquences ont été réalisés grâce aux logiciels Sequencing Analysis et Sequence Navigator de ABI. Les séquences ont été alignées soit visuellement, soit en utilisant la procébure d'alignement multiple Clustal du logiciel Sequence Navigator. Les fragments n'ont été séquencés que sur un seul brin. Néanmoins, des vérifications ont été réalisées. Tout d'abord la ss partie chevauchante des fragments de séquences n'a jamais montré d'incohérence lors de la réalisation des contigs. De plus, I'amplification par PCR et le séquençage ont été répétés sur un total d'environ 10000bp afin de vérifier l'ensemble des polymorphismes singletons (cas o une seule lignée diffère de toutes les autres). Des résultats identiques ont toujours été

s obtenus pour les deux répétitions.

Les sites pour lesquels des différences ont été observées parmi les séquences de Sh2 sont identifiés par leur position par rapport à la séquence de référence de la lignées Black Mexican Sweet SEQ ID N 1 (Shaw et Hannah, 1992). Sur l'ensemble de la région séquencée, 72 sites to polymorphes ont été observés. Parmi ces polymorphismes, 19 présentent une différence pour une seule lignéss, toutes les autres étant identiques. Ces singletons ne seront pas utilisables dans la recherche d'associations avec la variabilité phénotypique des grains. Parmi les 53 sites informatifs restants, certains sont parfaitement redondants entre eux, c'est à dire qu'ils apportent i5 une information identique quant aux similarités entre lignées et permettent - donc une discrimination identique en deux groupes de lignéss. Parmi les 20 sites ou groupes de sites informatifs et non redondants, ceux trouvés statistiquement associés à des mesures phénotypiques sont indiqués dans la présentation détaillée de l'invention. Le tableau 2 présente la forme allélique

o de chaque lignée, ou groupe de lignées, pour ces polymorphismes.

Tableau 2: formes alléliques aux 29 polymorphismes décrits, dont 20 SNP et 9 indels, nommés par leur position sur la séquence de référence SEQ ID N 1 de la lignée Black Mexican Sweet (BMS). Les notes ' à 4 indiquent les :5 sites redondants: le site -168 est redondant avec les sites 1473, 1542 et 2983; I'indel -830à-824 est redondant avec les sites -362, -347, -296, -15, 515, 587, 1068, 1505 et 2939; le site -438 est redondant avec les sites -266, 678 et 960; le site -921 est redondant avec les sites -580à573, -277, 35, 304, 105g, 1081, 1867, 2514, 2771 et 3123. Les haplotypes H1 à H6 so correspondent aux lignées suivantes: H1: BMS, E, c, M, Q. F. G H2: A,D,L,P,R,b,H, O. S,T,a,U,X,N

H3: B. K, Y

H4: J. V,I

H5:W,C,Z

sites -921' -830à-8242 -580à-573' -4383 -3622 3472 -2962 -277' -2663 1684 1 52 35' 304' 5152 5872 SNP indel indel SNP SNP SNP SNP SNP SNP SNP SNP SNP indel SNP SNP

H 1 A TGAGAAA TCACCTAT A G C C T T G G C T T T

H3 G. _ G... T C.. T T.

_

H4 G _ _. A T T T.. A T T C C.

H5 G. _.... T. A _ T T. _

suite

25141 2771' 29392 39834 3123

indel indel SNP SNP indel _ T = GTTmAmA _ T.. GTI I I IAmA _ T G = GmTTATTTA _ T. C Gl l l l IAmA Exemple 2: Identiflcation des associations statistiquement sinnificatives entre un allèle donné des sites polvmorPhes du nène Sh2 et une ou plusieurs caractéristiques Phénotypiques de la qualite de la qraine. 2,1 Mesures phénotypiques du grarn to Trois essais au champ ont été réalisés. La première année (année 1) lignées ont été étudiées, c'est à dire les lignées présentées dans le tableau 1 à l'exception des lignées R)(01, RX02 et R)(03. Pour les essais mis en place l es années 2 et 3, les 33 l ig nées ont été random i sées et répétées dans trois blocs. Chaque lignée a été représentée, dans chaque bloc, par s une à quatre plante semées côte à côte. Pour chacune des trois expérimentations, les plantes ont été autofécondées et les grains récoltés à maturité. Les analyses d'associations avec les polymorphismes moléculaires de Sh2 ont porté sur des valeurs moyennes de chaque caractère par expérimentation. o Les teneurs en protéines, amidon et amylose de chaque lignée ont été dosées manuellement pour l'essai de l'année 1 (voir détail des méthodes dans Sene et al. 2000) et prédites par spectrométrie en réflectance dans le proche infrarouge (NIRS) au ClRAD-Montpellier par C. Mestres et F. Davrieux pour les essais des années 2 et 3. L'acquisition des spectres a été effectuée sur grains entiers par un appareil Nirsystem 6500. Les données spectrales, pour une gamme de longueurs d'onde de 400 à 2500 nm, ont été collectées et analysées grâce au logiciel NIRS 2 version 4.0 (Infrasoft Internationnal). La gamme de valeurs prédites n'étant pas parfaitement superposable à la gamme de valeurs ayant permis le calibrage des équations, une trentaine d'échantillons issue de nos deux essais a été

o utilisée pour affiner le calibrage.

2.2 Associafions entre polymorphismes du gène Sh2 ef caractères

phénotypiques d'intérét.

Les polymorphismes décrits ci-dessus sont statistiquement associés à s des caractères du grains tels que le nombre de grains par épi, la masse du grain mûr, la teneur en protéines, amidon et amylose du grain, et le rapport de la teneur en protéines sur la teneur en amidon du grain. Ces associations ont été mises en évidence par des tests de régressions multiples grâce au Iogiciel SAS (1990). Lorsqu'un caractère est significativement associé à o plusieurs sites, il est possible de définir la part de variabilité du caractère expliquée par l'ensemble des sites impliqués (R2T, dernière colonne du Tableau 3). Par exemple, on peut noter que, dans l'expérimentation de la première annse, la combinaison de l'lndel -830 à -824 et du SNP -168 permet d'expliquer 64% de la variance du rapport protéine/amidon parmi I'ensemble des lignses. La redondance des sites (voir tableau 2) rend l'interprétation de causalité fine entre un site et un caractère difficile. De plus, il est possible que des polymorphismes non décrits dans l'invention et présents à proximité de la région séquencée, soit dans la région promotrice soit dans la partie 3' non séquencée du gène, soient aussi redondants avec o les sites décrits et donc associés aux mêmes caractères. Chez la pomme de terre, une zone importante pour la réqulation de l'expression du gène se

trouve à plus de 2kb en amont de la TATA box (Muller-Rober et al., 1994).

Néanmoins, que la relation de causalité entre polymorphisme moléculaire et phénotypique soit connue ou non, les associations statistiques décrites dans s l'invention permettent l'utilisation des SNP et indels décrits à des fins de prédiction phénotypique ou d'amélioration de la valeur génétique des grains

de mas.

Tableau 3: résultats des tests d'associations par régressions multiples entre chaque caractère du grain et les sites polymorphes dans la séquence de Sh2 pour 25 à 33 lignées. Les sites indiqués sont en redondance totaie avec d'autres sites le long de la séquence de Sh2 (voir Tableau 2). Les colonnes n1, moy1, n2, et moy2 contiennent les effectifs et les valeurs moyennes du caractère pour les deux groupes de iignées discriminées par les sites o polymorphes correspondants. F: vaieur du test de Fisher, P: degré de signification, R2: part de variation phénotypique expliquée par un site, R2T: part de variation phénotypique expliquée par un groupe de sites combinés

par régression multiple.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléctidique dans un procédé de s sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléctidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1, ladite base polymorphe to ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans un gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques suivants: (a) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -921 du gène Sh2 est un G; s (b) un acide nuclélque dans lequel les nocléotides correspondant aux nucléotides en positions-830 à-824, de séquence 5'-TGAGAAA-3', du gène Sh2 sont absents; (c) un acide nucléique dans leque! les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions-580 à -573, de séquence 5'- TCACCTAT-3', du o gène Sh2 sont absents; (d) u n acide nucléiq ue dans lequel le n ucléotid e correspond ant au nucléotide en position -438 du gène Sh2 est un G; (e) un acide nucléique dans lequel le nucléctide correspondant au nucléotide en position -362 du gène Sh2 est un A; (f) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position --347 du gène Sh2 est un T; (g) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -296 du gène Sh2 est un T; (h) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au so nucléotide en position -277 du gène Sh2 est un T; (i) un acide nucléique dans iequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -266 du gène Sh2 est un C; (J) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -168 du gène Sh2 est un A; so (k) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position -15 du gène Sh2 est un A; (I) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +35 du gène Sh2 est un T; s (m) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucléotide en position +304 du gène Sh2; (n) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +515 du gène Sh2 est un C; (o) un acide nucléique dans lequei le nucléotide correspondant au o nucléotide en position +587 du gène Sh2 est un C; (p) un acide nuclélque dans iequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +678 du gène Sh2 est un A; (q) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +960 du gène Sh2 est un A; t5 (r) un acide nucléique dans lequel le nacléotide correspondant au nucléotide en position +1059 du gène Sh2 est un G; (s) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1068 du gène Sh2 est un G; (t) un acide nucléique dans lequel le nucléotide A correspondant au o nucléotide en position +1081 du gène Sh2 est absent; (u) un acide nucléique dans lequel le nocléctide correspondant au nucléotide en position +1473 du gène Sh2 est un C; (v) un acide nuclélque dans lequel un T additionnel se trouve après le nucléotide en position +1505 du gène Sh2; (w) un acide nocléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucléotide en position + 1542 du gène Sh2; (x) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +1867 du gène Sh2 est un C; (y) un acide nucléique dans lequel le nucléotide T correspondant au o nucléotide en position +2514 du gène Sh2 est absent; (z) un acide nuclélque dans lequel un T additionnel se trouve après le nucléctide en position 2771 du gène Sh2; (ab) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +2939 du gène Sh2 est un G; (ac) un acide nuclélque dans lequel le nucléotide correspondant au nucléotide en position +2983 du gène Sh2 est un C; et (ad) un acide nuclélque comprenant l'insertion de la séquence '-G I TTATTTA-3' après le nucléotide correspondant au nucléotide en position +3123 du gène Sh2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisce en ce que la sonde ou l'amorce nucléotidique permet de discriminer entre la présence d'un premier acide nucléique (1) et d'un second acide nuclélque (2), iesdits acides o nuclélques (1) et (2) étant choisis parmi les suivants: (a) Site - 921: I'acide nocléique (1) de séquence SEQ ID N 2 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nacléique (2) de séquence SEQ ID N 2 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A; (b) Site - 438: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 3 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 3 dans lequel le nucléctide en position 41 est une base A; (c) Site - 362: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 4 dans lequel o le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nacléique (2) de séquence SEQ ID N 4 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (d) Site - 347: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 5 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 5 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (e) Site - 296: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 6 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 6 dans lequel le nucléotide en position 41 est une so base C; (f) Site - 277: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 7 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 7 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (g) Site - 266: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 8 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQ ID N 8 dans lequel le nocléotide en position 41 est une base T; s (h) Site 168:l 'acide nuclélque (1) de séquence SEQID N 9 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 9 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (i) Site -15: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 10 dans lequel o le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 10 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (fl Site + 35: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 11 dans lequel le nucléctide en position 41 est une base T et l'acide nuclélque (2) de s séquence SEQ ID N 11 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (k) Site + 515: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 12 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 12 dans lequel le nucléotide en position 41 est o une base T; (I) Site + 587: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 13 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 13 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; s (m) Site + 678: I'acide nacléique (1) de séquence SEQ ID N 14 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 14 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (n) Site + 960: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 15 dans o lequel le nucléctide en position 41 est une base A et l'acide nacléique (2) de séquence SEQID N 15 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G; (o) Site + 1059: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 16 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nocléique (2) de séquence SEQID N 16 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C; (p) Site + 1068: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 17 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQID N 17 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (q) Site + 1473: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 18 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQID N 18 dans lequel le nucléctide en position 41 est o une base T; (r) Site + 1867: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 19 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 19 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; t5 (s) Site + 2939: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 20 dans lequel le nocléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 20 dans lequel le nocléotide en position 41 est une base T; (t) Site + 2983: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 21 dans o lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 21 dans lequel le nucléotide en position 41 est une base T; (u) Site - 830 à - 824: I'acide nocléique (1) de séquence SEQ ID N 23 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 22; s (v) Site - 580 à - 573: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 25 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 24; (w) Site + 304: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQID N 27 et l'acide - noclélque (2) de séquence SEQ ID N 26; (x) Site + 1081: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 29 et l'acide o nucléique (2) de séquence SEQID N 28; (y) Site + 1505: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 31 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 30; (z) Site + 1542: I'acide nucléique (1) de séquence SEQID N 33 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQID N 32; s4 (aa) Site + 2514: I'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N 35 et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQ ID N 34; (ab) Site + 2771: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 37 et l'acide nuclélque (2) de séquence SEQ ID N 36; et s (ac) Site + 3123: I'acide nuclélque (1) de séquence SEQ ID N 39 et

l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N 38.

3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que:

a) la sonde nucléotidique s'hybride spécifiquement avec un acide o nucléique d'une première forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un premier allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 et ne s'hybride pas avec un acide nucléique d'une seconde forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un second allèle d'un i5 site polymorphe du gène Sh2; ou b) I'amorce nucléotidique hybride spécifiquement avec une séquence nucléotidique contenue dans un gène Sh2, ladite séquence nucléotidique : étant localisse en amont d'une forme allélique d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe dont la présence ou l'absence

o définit un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2.

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les

caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine sont choisies parmi le nombre de graines par épi, la masse des graines, la teneur en protéines des graines, la teneur en amidon des graines, la teneur en amylose des graines et le rapport pondéral protéines/amidon des graines,

ou une combinaison de ces caractéristiques phénotypiques.

5. Procédé pour déterminer l'identité de l'allèle d'un site polymorphe au sein o d'un acide nuclélque dérivé d'un gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléctidique polymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -921, -830 à -824, ss

-580 à-573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, + 515,

+587, +678, +96O, +1059, +1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867,

+2514, +2771, +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1. s 6. P rocédé selon la revendi cation 5, caractérisé en ce que la caractérisati on de l'identité du site polymorphe est réalisée par séquençage dudit acide nucléique. o 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde nocléotidique s'hybridant spécifiquement avec une base polymorphe ou une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site

polymorphe déterminé du gène Sh2.

8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la caractérisation du site polymorphe est réalisée par élongation d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifquement avec une séquence nucléotidique localisée en amont d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe

o définissant un allèle d'un site polymorphe déterminé d'un gène Sh2.

9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour

sélectionner une plante possédant un nombre modifié de graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au s moins une position nucléotidique dudit acide nuclélque correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983 du gène

Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour

so sélectionner une plante avec une masse modifiée de graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983 du gène Sh2 de

séquence SEQ I[) N 1.

56 2828694

11. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour

sélectionner une plante ayant une teneur modifiée en protéines dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nuclélque .... correspondant à au moins un des nucléctides en position -168, *1473, ..

+1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068,-+ 1505

et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

-.12, Procèdé.selon itune dés revéndications.5 à 8,- car.actérisé en ce qué p-our o sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amidon dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nuclélque correspondant à au moins un des nucléotides en position 830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de

s séquence SEQ ID N 1.

13. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour

À.sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amylose.dans les ::..graines, on déterrnine:.l'idéntité de la-basé o d'une sëquence:débases :o présentes à au moins une position nucléctidiquedudit acide nucTeique correspondant à au moins un des nucléotides en position 38, -266, +678,

+960, -921, -580 à -573, -277, +35, +304, +1059, +1081, +1867, +2514,

+2771 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

s 14. Procèdé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour

sélectionner une plante possédant un rapport protéines/amidon modifié dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases -. -.. présentes à au moins une position nucleotidique dudit acide nucleique - correspondant:à au moins un des- nucléotides en position -168, +1473,

+1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, + 1505

et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

À...... .

15. Procèdé seion l'une des revendications 5 à 14, caractérisé en ce qu'il ëst

réalisé sur l'ADN prélevé à partir de plantes au stade plantuie eVou au stade

s précoce eVou au stade végétatif.

16. Procédé selon l'une des revendications 5 à 15, caractérisé en ce que la

plante est une céréale.

s 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en que la plante est

choisie parmi le mas et le sorgho.

18. Sonde ou une amorce nucléotidique caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre les différents allèles d'un site polymorphe à au moins l'une o des positions-921, -830 à -824, -580 à -573, 438, -362, - 347, -296, -277,

266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081,

+1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 et +3123 du

gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

s 19. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce selon la revendication 18

comme marqueur d'au moins un site polymorphe du gène Sh2.

20. Trousse ou kit de diagnostic prédictif des caractéristiques phénotypiques de qualité d'une graine de plante, caractérisé en ce qu'il comprend: a) une sonde ou une pluralité de sondes ou d'amorces selon la

revendication 18.

b) le cas échéant, les résctifs nscessaires à la réalisation d'une résction

d'hybridation ou d'amplification.

21. Acide nuclélque susceptibie de conférer à une plante un nombre modifié de graines par rapport au mafs a sauvage " de référence, caractérisé en ce que ladit acide nuclélque comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans

la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites

so polymorphes - 168, +1473, +1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ

ID N 1.

22. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante une masse modifiée de la graine par rapport au mafs a sauvage " de référence, caractérisé en ce que iedit acide nucléique comprend la forme allélique associ se à l' expression du caractère phénotypi que modifié de qualité de l a

graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site

polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, + 1473, + 1542 et

+ 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

s 23. Acide nuclélque susceptible de conférer à une plante une teneur modifiée en protéines dans les graines, par rapport au maTs << sauvage " de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la

o graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site

polymorphe choisi parmi les sites polymorphes -168,+ 1473, + 1542, + 2983, -830 à - 824, -362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 1068, + 1505 et + 2939 du

gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

s 24. Acide nocléique susceptible de conférer à une plante une teneur modifiée en amidon dans ies graines, par rapport au mas " sauvage " de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à liexpression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la revendication 1, à au moins un site polymorphe o choisi parmi les sites polymorphes - 830 à -824,-362, -347,-296, -15, + 515,

+ 587, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

25. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante une teneur modifiée en amylose dans les graines, par rapport au mas " sauvage " de référence, caractérisé en ce que ledit acide nuclélque comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la revendication 1, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 438, - 266, + 678, + 960, - 921, - 580 à - 573, - 277, + 35, + 304, + 1059, + 1081, + 1867, + 2514, + 2771 et + 3123

du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

26. Acide nuclélque susceptible de conférer à une plante un rapport protéineslamidon modifié dans la graine, par rapport au mas K sauvage " de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de ss qualité de la graine, tel que défini dans la revendication 1, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes -168,+ 1473, + 1542, 2983, - 830 à - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et +

2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N 1.

s 27. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des

revendications 21 à 26.

28. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26 ou

o d'un vecteur recombinant selon la revendication 27 pour transformer une

cellule hôte.

29. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée en ce que la cellule

hôte est un cellule hôte bactérienne ou une cellule hôte végétale.

30. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des

revendications 21 à 26 ou par un vecteur recombinant selon la revendication

27. 31. Cellule hôte transformée selon la revendication 30, caractérisoe en ce

qu'il s'agit d'une cellule bactérienne ou d'une cellule végétale.

32. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26,

d'un vecteur recombinant selon la revendication 27 ou d'une cellule hôte

transformoe selon l'une des revendications 30 ou 31 pour fabriquer une

plante transformée capable de produire des graines à qualités industrielles

ou agroalimentaires amélioréss.

33. Plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes selon la

revendication 30 ou 31.

34. Procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: i 60 2828694 a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide

nuclélque selon l'une des revendications 21 à 26; ou par un

vecteur recombinant selon la revendication 27; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant s - intégré dans leur génome au moins une-copie d'un acide nucléique

selon l'une des revendications 21 à 26;

c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules

transformées obtenues à l'étape b).

.,.....:.:.....:.:

to 35. Plante transFormée ou partie dé plante transformée, notamment graine ou semence, susceptible d'étre obtenue par le procédé selon la

revendication 34.

36. Produit de transformation d'une graine ou semence selon la

revendication 35.

37. Anticorps spécifique d'un polypoptide SH2 codé par un acide nuclélque

selon l'une des revendications 21 à 26. -; - -

:,:,. " -::;, À ':: '-:':,:::.,, -:...,-:

o 38. Nécessaire ou kit de diagnostic des caractéristiques phénotypiquet de qualité d'une graine de plante, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un anticorps ou une combinaison d'anticorps selon la revendication 37; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection d'un complexe

formé entre ledit ou lesdits anticorps et un polypeptide SH2.

:......

.... -,