JP2001502923A

JP2001502923A - 植物の種子のリシン含有量を増やすためのキメラ遺伝子及び方法

Info

Publication number: JP2001502923A
Application number: JP10543284A
Authority: JP
Inventors: フアルコ，サベリオ・カール; ザサードマクデビツト，レイモンド・アービン，; エペルバウム，サビーネ・ウルスラ
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2001-03-06
Also published as: TR199902349T2; WO1998042831A2; AU6780198A; CA2280196A1; WO1998042831A3; BR9811256A; KR20010005645A; EP0973880A2; HUP0002305A3; CN1253584A; PL336042A1; ID22486A; CA2280196C; HUP0002305A2; AU747997B2

Abstract

(57)【要約】キメラ遺伝子が開示される。１つのキメラ遺伝子は植物リシンケトグルタル酸還元酵素をコードし、もう１つのキメラ遺伝子は植物葉緑体移行配列に機能的に連結されているリシン非感受性のジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）をコードし、全て植物種子特異的調節配列に機能的に連結されている。形質転換された植物の種子においてリシンの増加したレベルをもたらすためのそれらの使用方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】植物の種子のリシン含有量を増やすためのキメラ遺伝子及び方法関連出願に対する引照これは１９９３年３月１８日に出願された現在放棄されているＰＣＴ／ＵＳ９３／０２４８０の国内出願であり、そして現在放棄されている１９９２年３月19日に出願された第０７／８５５，４１４号の一部継続出願である１９９４年１月６日に出願された第０８／１７８，２１２号の一部継続出願である、係属中の１９９５年６月７日に出願された第０８／４７４，６３３号の一部継続出願である、係属中の１９９７年３月２７日に出願された第０８／８２４，６２７号の一部継続出願である。発明の分野本発明は植物の種子のリシン含有量を増やすためのキメラ遺伝子及び方法、特に２個のキメラ遺伝子、全て植物種子特異的調節配列に機能的に連結されている、植物リシンケトグルタル酸還元酵素（ＬＫＲ）をコードする第一のもの及び植物葉緑体移行配列（ｔｒａｎｓｉｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）に機能的に連結されているリシン非感受性ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）をコードする第二のものに関する。発明の背景ヒトを初めとする多くの脊椎動物は多数のアミノ酸を生産する能力を欠き、それ故、これらのアミノ酸が食品中に補足されることを必要とする。これらは必須アミノ酸と呼ばれる。多数の穀物から得られるヒト食品及び動物飼料はそれら１０個の必須アミノ酸のうちのいくつかを欠いている。トウモロコシ（ジー・メイズ・エル（ＺｅａｍａｙｓＬ．）では、リシンは多くの動物の食餌要件を最も限定するアミノ酸である。ダイズ（グリシン・マックス・エル（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）荒粉は主にリシン補足としてトウモロコシに基づく動物飼料に添加剤として用いられる。従って、トウモロコシまたはダイズのいずれかのリシン含有量の増加は、微生物の発酵により生産されたリシンで混合穀物飼料を補足する必要性を減らすかまたは除く。植物育種家は穀物植物におけるタンパク質の質及び量を改善するために天然に存在する変種を用いることに長い間関心を抱いている。通常レベルより高いリシン（７０％）を含有するトウモロコシ系統が同定されている［Ｍｅｒｔｚ等（１９６４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１４５：２７９、Ｍｅｒｔｚ等（１９６５）Ｓｃｉｅｎｃｅ１５０：１４６９−７０］。しかしながら、突然変異体遺伝子ｏｐａｑｕｅ−２を含むこれらの系統は好ましくない作物学的特性を示し（病気及び害虫に対する増加した罹患性、収量の８−１４％の減少、低い穀粒重量、より遅い乾燥、周辺ひき割り（ｆｌａｋｉｎｇｇｒｉｔｓ）のより低い乾燥製粉収量、及び増加した貯蔵問題）、従って、商業的に有用ではない［Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９７８）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．ＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ１０５：２８１−３００］。ｏｐａｑｕｅ−２及びｓｕｇａｒｙ−２遺伝子並びに関連する変更遺伝子を用いるＣＩＭＭＹＴで品種改良されたＱｕａｌｉｔｙＰｒｏｔｅｉｎＭａｉｚｅ（ＱＰＭ）は、穀粒中に硬い内乳並びに強化されたレベルのリシン及びトリプトファンを有する［Ｖａｓａｌ、Ｓ．Ｋ．等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ３ｒｄｓｅｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ、８月３１日−９月２日、１９８３］。しかしながら、ＱＰＭ系統に示される遺伝子プールは熱帯性及び亜熱帯性である。ＱｕａｌｉｔｙＰｒｏｔｅｉｎＭａｉｚｅは遺伝学的に複合形質であり、現在の系統は米国で使われている歯状胚原質に容易に適応されず、トウモロコシ育種家によるＱＰＭの採用を妨げている。種子のアミノ酸含有量は主として（９０−９９％）種子中のタンパク質のアミノ酸組成により、そしてより少ない程度で（１−１０％）遊離アミノ酸プールにより決定される。種子中の全タンパク質の量は穀類の乾量の約１０％からマメの乾量の２０−４０％までと様々である。タンパク質に結合されたアミノ酸の多くは種子貯蔵タンパク質中に含まれ、それらは種子発生中に合成され、そして発芽後の主要な栄養分貯蔵として働く。多くの種子において貯蔵タンパク質は全タンパク質の５０％またはそれ以上を占める。種子のアミノ酸組成を改善するために、遺伝子工学技術を用いて貯蔵タンパク質の遺伝子を単離し、トランスジェニック植物においてそれを発現させている。例えば、２６％の硫黄含有アミノ酸からなる種子２Ｓアルブミンのブラジルナッツからの遺伝子が単離され［Ａｌｔｅｎｂａｃｈ等（１９８７）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２３９−２５０］、マメファゼオリン貯蔵タンパク質遺伝子からの調節配列の制御下で形質転換されたタバコの種子において発現されている。タバコ種子における硫黄に富んだタンパク質の蓄積は、種子においてメチオニンのレベルの３０％までの増加をもたらした［Ａｌｔｅｎｂａｃｈ等（１９８９）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５１３−５２２］。しかしながら、植物タンパク質の平均リシン含有量に対して同様にリシンに富んだいかなる植物種子貯蔵タンパク質も現在まで同定されておらず、リシンを増やすためにこの方法を用いることを妨げている。別の方法は遺伝子工学技術によりリシンのような特定の遊離アミノ酸の生産及び蓄積を増加することである。しかしながら、植物の種子におけるリシンの生合成及び代謝の制御に関してほとんどの手引きが利用できない。リシンは、トレオニン、メチオニン及びイソロイシンと共に、アスパルテートから得られるアミノ酸であり、このファミリーの各メンバーの生合成の調節は相互に連結している。経路の代謝の流れの調節は主として最終生成物によるようである。経路の第一段階は酵素アスパルトキナーゼ（ＡＫ）によるアスパルテートのリン酸化であり、この酵素は多くの生物において調節のための重要な標的であることが見いだされている。しかしながら、アスパルテート経路による４炭素分子の流れに関する詳細な生理学的研究がモデル植物系レムナ・ポーシコスタタ（Ｌｅｍｎａｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ）において実施されている［Ｇｉｏｖａｎｅｌｌｉ等（１９８９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９０：１５８４−１５９９］。この参考文献において、「これらのデータは、今回、アスパルトキナーゼにより触媒される段階が一般に［植物において］アスパルテートファミリーのアミノ酸に４炭素単位が入ることの調節のための重要な位置ではないという明確な証拠を与える」と記述された。また、アスパルテートファミリー経路は分枝点反応でも調節されると考えられる。リシンでは、これはジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤＨＤＰＳ）により触媒されるピルベートとアスパルチルβ−セミアルデヒドの縮合であり、一方、トレオニン及びメチオニンでは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）によるアスパルチルβ−セミアルデヒドの還元及びそれに続くホモセリンキナーゼ（ＨＫ）によるホモセリンのリン酸化が重要な制御地点である。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄａｐＡ遺伝子はＤＨＤＰＳ酵素をコードし、それは典型的な植物ＤＨＤＰＳ酵素、例えばコムギ麦芽ＤＨＤＰＳよりリシンによる阻害に対して約２０倍感受性が低い。エシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子はカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター及び植物葉緑体移行配列に連結されている。キメラ遺伝子は形質転換によりタバコ細胞中に導入され、葉において遊離リシンレベルの実質的な増加をもたらすことが示された［Ｇｌａｓｓｍａｎ等（１９８９）ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１３０９、Ｓｈａｕｌ等（１９９２）ＰｌａｎｔＪｏｕｒ．２：２０３−２０９、Ｇａｌｉｌｉ等（１９９２）ＥＰＯ特許出願９１１１９３２８．２］。しかしながら、種子のリシン含有量はこれらの研究で記述された形質転換植物のいずれにおいても増加されなかった。また、同じキメラ遺伝子はジャガイモ細胞中にも導入され、再生植物の葉、根及び塊茎において遊離リシンのわずかな増加をもたらした［Ｇａｌｉｌｉ等（１９９２）ＥＰＯ特許出願９１１１９３２８．２、Ｐｅｒｌ等（１９９２）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：８１５−８２３］。また、これらの研究者等はリシン非感受性ＡＫ酵素をコードするエシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子の形質転換によるタバコ細胞中への導入に関しても報告している［Ｇａｌｉｌｉ等（１９９２）欧州特許出願９１１１９３２８．２；Ｓｈａｕｌ等（１９９２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１００：１１５７−１１６３］。エシェリキア・コリ酵素の発現は形質転換された植物の葉及び種子において遊離トレオニンのレベルの増加をもたらす。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳ及びＡＫを発現する植物の交配は、親のＤＨＤＰＳ植物より多い遊離リシンを葉に蓄積するが、親のＡＫ植物より少ない遊離トレオニンを葉に蓄積する子孫をもたらした。種子における遊離リシンの増加したレベルのいかなる証拠も示されなかった。植物における生合成経路の調節の詳細についての限られた理解のために、特に種子に対する遺伝子工学技術の適用は確定されていない。種子におけるアスパルテート由来のアミノ酸の起源に関して利用できる情報はほとんどない。例えば、大部分の植物から、それらが種子において合成されるか、または葉から種子へ輸送されるか、またはその両方であるかどうかは知られていない。さらに、遊離アミノ酸は種子の全アミノ酸含有量のわずかな割合のみを構成する。それ故、種子の全アミノ酸組成に著しく変化をもたらすために遊離アミノ酸の過剰蓄積は何倍もでなければならない。さらに、種子における遊離アミノ酸の異化作用についてほとんど知られていない。遊離リシンの異化作用はトウモロコシ及びオオムギの発生する内乳において見られている。リシンの異化作用の第一段階はリシン−ケトグルタル酸還元酵素（ＬＫＲ）により触媒されると考えられる［Ｂｒｏｃｈｅｔｔｏ−Ｂｒａｇａ等（１９９２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９８：１１３９−１１４７］。このタンパク質は実際には二機能を持つ酵素であり、リシンの異化作用における２番目の反応と推定されるサッカロピンデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）の触媒作用も招く［Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ−Ｂｕｔｒｕｉｌｌｅ等（１９９６）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１０：７６５−７７１］。植物からのＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の様々な部分をコードするゲノムまたはｃＤＮＡクローンの単離の報告はほんのわずかしかない。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託ＡＴＵ９５７９はアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）からの二機能酵素の全長ｃＤＮＡクローンの配列を示す。このクローンによりコードされるタンパク質は真菌生物からのＬＫＲ及びＳＤＨタンパク質の両方の相同物である。アラビドプシスからのゲノムクローンのＤＮＡ配列もジーンバンク受託Ｕ９５７５８として利用できる（Ｔａｎｇ等（１９９７）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９：１３０５−１３１６及びＥｐｅｌｂａｕｍ等（１９９７）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：７３５−７４８）。ジーンバンク受託ＡＦ００３５５１はＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質のＳＤＨドメイン内からのポリペプチドの合成を導くトウモロコシからのｃＤＮＡを開示する。ジーンバンク受託ＡＦ０４２１８４はアラビドプシスからの全長クローンの比較的短い部分に相同なブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）からのｃＤＮＡの配列を開示する。しかしながら、そのような異化経路が植物において一般的であるかどうか、そしてそれらが遊離アミノ酸の蓄積のレベルに変化をもたらすかどうかは知られていない。最後に、種子発生及び生存能力に対するリシンまたはトレオニンのような遊離アミノ酸の過剰蓄積の影響は知られていない。これまで、遺伝子工学により種子におけるリシンのレベルを増やすためのいかなる方法も知られていなかった。従って、種子におけるリシンの過剰蓄積により栄養分特性の改善をもたらすための遺伝子、キメラ遺伝子及びそれらを種子において発現させる方法に対する要求がある。発明の要約本発明はリシンケトグルタル酸還元酵素の全部または一部をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメントに関する。別の態様として、本発明は適当な種子特異的調節配列に機能的に連結された、リシンケトグルタル酸還元酵素の全部もしくは一部をコードする前記の核酸フラグメントまたはそのサブフラグメントを含んでなるキメラ遺伝子に関し、その場合、該キメラ遺伝子は形質転換された植物の種子及び前記のキメラ遺伝子で形質転換された植物細胞または植物種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を下げる。第三の態様として、本発明はリシンケトグルタル酸還元酵素をコードする遺伝子の突然変異のためにリシンケトグルタル酸還元酵素活性が減少している植物細胞に関する。第四の態様として、本発明はリシンケトグルタル酸還元酵素をコードする遺伝子の突然変異のためにリシンケトグルタル酸還元酵素活性が減少している植物種子に関する。第五の態様として、本発明は：（ａ）適当な種子特異的調節配列に機能的に連結された、リシンケトグルタル酸還元酵素の全部もしくは一部をコードする前記の核酸フラグメントまたはそのサブフラグメントを含んでなるキメラ遺伝子で植物細胞を形質転換し、その場合、該キメラ遺伝子は形質転換された植物の種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を下げ；（ｂ）種子を得るために適当な条件下で工程（ａ）から得られた形質転換された植物細胞から稔性成熟植物を再生させ；（ｃ）工程（ｂ）の子孫種子を減少したリシンケトグルタル酸還元酵素活性に関してスクリーニングし；そして（ｄ）種子が減少したリシンケトグルタル酸還元酵素活性を含有する系統を選択することを含んでなる植物種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を下げるための方法に関する。第六の態様として、本発明は（ａ）適当な種子特異的調節配列に機能的に連結された、リシンケトグルタル酸還元酵素の全部もしくは一部をコードする前記の核酸フラグメントまたはそのサブフラグメントを含んでなる第一のキメラ遺伝子、その場合、該キメラ遺伝子は形質転換された植物の種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を下げる、及び（ｂ）リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸フラグメントが植物葉緑体移行配列及び植物種子特異的調節配列に機能的に連結されている第二のキメラ遺伝子、を含んでなる核酸フラグメントに関する。本発明の第七の態様は前記の核酸フラグメントまたは第一及び第二の前記のキメラ遺伝子をゲノム中に含んでなる植物及び種子に関する。図面の簡単な説明及び配列本出願の一部を形成する以下の詳細な説明及び付随する図面及び配列から本発明をより完全に理解することができる。図１は側面及び上面から見たαヘリックスを示す。図２はαヘリックスコイルドコイル構造の末端（図２ａ）及び側面（図２ｂ）図を示す。図３はロイシン及びメチオニンの類似した形状を強調するそれらの化学構造を示す。図４ａは葉遺伝子発現カセットの概念図を示し；図４ｂは種子特異的遺伝子発現カセットの概念図を示す。図５はバイナリープラスミドベクターｐＺＳ９７Ｋの地図を示す。図６はバイナリープラスミドベクターｐＺＳ９７の地図を示す。図７ＡはバイナリープラスミドベクターｐＺＳ１９９の地図を示し；図７ＢはバイナリープラスミドベクターｐＦＳ９２６の地図を示し；図７ＣはバイナリープラスミドベクターｐＢＴ５９３の地図を示し；図７ＤはバイナリープラスミドベクターｐＢＴ９７の地図を示す。図８ＡはプラスミドベクターｐＢＴ６０３の地図を示し；図８ＢはプラスミドベクターｐＢＴ６１４の地図を示す。図９は２つの植物ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドと真菌のＳＤＨ（グルタメート形成）の間のアミノ酸配列類似性を示す。図１０はＳＳＰ遺伝子配列の構築及び発現に用いるためのベクター（ｐＳＫ５）を作製する方法を示す。図１１は基礎遺伝子配列の唯一のＥａｒＩ部位中にオリゴヌクレオチド配列を挿入する方法を示す。図１２はプラスミドｐＳＫ６を作製するためのｐＳＫ５のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位への基礎遺伝子オリゴヌクレオチドの挿入を示す。唯一のＥａｒＩ部位で様々なＳＳＰコーディング領域を挿入するためにこの基礎遺伝子配列を図８におけるように用いて、挙げたクローン化セグメントを作製した。図１３は図１２の重複スキームで使用するための非反復遺伝子配列を作製するために用いた６３ｂｐ「セグメント」オリゴヌクレオチドの挿入を示す。図１４（Ａ及びＢ）はイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合を利用して非反復遺伝子「セグメント」を増やす方法を示す。図１５は種子特異的プロモーター及び３’配列カセットを含有するベクターを示す。ＮｃｏＩ及びＡｓｐ７１８部位を用いてこれらのベクター中にＳＳＰ配列を挿入した。図１６はプラスミドベクターｐＭＬ６３の地図を示す。図１７はプラスミドベクターｐＢＴ６８０の地図を示す。図１８はプラスミドベクターｐＢＴ６８１の地図を示す。図１９はプラスミドベクターｐＬＨ１０４の地図を示す。図２０はプラスミドベクターｐＬＨ１０５の地図を示す。図２１はプラスミドベクターｐＢＴ７３９の地図を示す。図２２はプラスミドベクターｐＢＴ７５６の地図を示す。配列番号：１は実施例１において記述されたＡＫIIIをコードする野生型エシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。配列番号：２及び３をエシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子の翻訳開始コドンにＮｃｏＩ部位を作製するために実施例２において用いた。配列番号：４及び５をコリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｄａｐＡ遺伝子の単離のためのＰＣＲプライマーとして実施例３において用いた。配列番号：６は実施例３において記述するリシン非感受性ＤＨＤＰＳをコードする野生型コリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。配列番号：７をエシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子の翻訳開始コドンにＮｃｏＩ部位を作製するために実施例４において用いた。葉緑体移行配列を作製し、そしてその配列をエシェリキア・コリｌｙｓＣ、エシェリキア・コリｌｙｓＣ−Ｍ４、エシェリキア・コリｄａｐＡ及びコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子に連結するために配列番号：８、９、１０及び１１を実施例６において用いた。配列番号：１２及び１３をエシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子の翻訳終止コドンのすぐ後にＫｐｎＩ部位を作製するために実施例６において用いた。葉緑体移行配列を作製し、そしてその配列をコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子に連結するためのＰＣＲプライマーとして配列番号：１４及び１５を実施例６において用いた。配列番号：１６−９２は植物の種子における発現のために適当なリシンに富んだ合成の種子貯蔵タンパク質のキメラ遺伝子を作製するために用いる核酸フラグメント及びそれらがコードするポリペプチドを示す。配列番号：９３をトウモロコシのための構成的発現カセットとして実施例６において用いた。トウモロコシ葉緑体移行配列を作製し、そしてその配列をエシェリキア・コリｌｙｓＣ −Ｍ４遺伝子に連結するために配列番号：９４−９９を実施例６において用いた。トウモロコシ葉緑体移行配列を作製し、そしてその配列をエシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子に連結するためのＰＣＲプライマーとして配列番号：１００及び１０１を実施例６において用いた。配列番号：１０２及び１０３はアラビドプシス・サリアナからの植物リシンケトグルタル酸還元酵素／サッカロピンデヒドロゲナーゼのｃＤＮＡである。配列番号：１０４及び１０５はそれぞれ配列番号：１０２及び１０３によりコードされる真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）に相同なポリペプチドである。配列番号：１０６及び１０７をトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子の５’及び３’ 末端にＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ部位を付加するためのＰＣＲプライマーとして実施例２５において用いた。配列番号：１０８及び１０９をアラビドプシスゲノムＤＮＡからの２２４ｋｂＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のために用いた。配列番号：１１０はアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨゲノムＤＮＡフラグメントの配列を示す。配列番号：１１１はアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡの配列を示す。配列番号：１１２はアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定されるアミノ酸配列を示す。配列番号：１１３及び１１４をダイズ及びトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のために用いた。配列番号：１１５はダイズＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡフラグメントの配列を示す。配列番号：１１６はトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡフラグメントの配列を示す。配列番号：１１７はダイズＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１１８はトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１１９はダイズからの２５８２ヌクレオチドｃＤＮＡの配列を示す。配列番号：１２０はトウモロコシからの３２６５ヌクレオチドｃＤＮＡの配列を示す。配列番号：１２１は配列番号：１１９のヌクレオチド３〜２３５７によりコードされるダイズＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１２２は配列番号：１２０のヌクレオチド３〜３０７１によりコードされるダイズＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１２３は配列番号：１２０のヌクレオチド１〜１９０８に対応するヌクレオチド配列である。配列番号：１２４は配列番号：１２３から推定されるアミノ酸配列である。配列番号：１２５はイネからの７２０ヌクレオチドＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡの配列を示す。配列番号：１２６は配列番号：１２５のヌクレオチド２〜７２０によりコードされるイネＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１２７はイネからの３０８ヌクレオチドＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡの配列を示す。配列番号：１２８は配列番号：１２７のヌクレオチド１〜１２９によりコードされるイネＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１２９はコムギからの４２９ヌクレオチドｃＤＮＡの配列を示す。配列番号：１３０は配列番号：１２９のヌクレオチド１〜２５２によりコードされるコムギＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を示す。配列番号：１３１はアラビドプシスｃＤＮＡクローンのＳＤＨコーディング領域を示す。配列番号：１３２はアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質のＳＤＨドメインのアミノ酸配列を示す。引用することにより本明細書に組み込まれるＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１３：３０２１−３０３０（１９８５）及びＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）中に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ基準に従って特定されるように、配列はヌクレオチド配列文字には１文字コードを、そしてアミノ酸には３文字コードを含む。発明の詳細な説明非形質転換植物におけるリシンのレベルに比較した場合に、形質転換された植物の種子においてリシンの蓄積を増やすために有用な核酸フラグメント及び方法を記述する。遺伝子工学により植物の種子における遊離リシンの蓄積を増やすために、この経路のどの酵素が植物の種子において経路を制御するかを決定した。これを成し遂げるために、経路の酵素をコードする遺伝子をバクテリアから単離した。ある場合には、コードされる酵素を最終生成物阻害に対して非感受性にするために遺伝子の突然変異を得た。細胞内局在化配列及び植物の種子における発現のために適当な調節配列を連結してキメラ遺伝子を作製した。次に、形質転換によりキメラ遺伝子を植物中に導入し、種子におけるリシンの蓄積を引き出すそれらの能力に関して評価した。１つはＬＫＲをコードし、そしてもう１つはリシンによるフィードバック阻害に対して実質的に非感受性であるＤＨＤＰＳをコードする２つの核酸サブフラグメント（配列）を含んでなる独特な第一の核酸フラグメントが提供される。本出願の目的のために、実質的に非感受性という用語は、リシンによるフィードバック阻害に対して同じ反応を触媒する典型的な植物酵素より少なくとも２０倍感受性が低いことを意味する。サブフラグメントの組み合わせが非形質転換宿主植物に比較した場合に形質転換された植物の種子において蓄積されるリシンを増加できることが見いだされた。また、種子における過剰の遊離リシンの蓄積の最大潜在能力がリシン異化作用により下げられることも見いだされた。さらに、リシン異化作用がサッカロピン及びα−アミノアジピン酸のようなリシン分解生成物の蓄積をもたらすことが見いだされた。異化作用による過剰のリシンの損失を減らすため及びリシン分解生成物の蓄積を減らすための２つの別の方法が本明細書において提供される。第一の方法では、リシン分解の第一段階を触媒する酵素リシンケトグルタル酸還元酵素（ＬＫＲ）の活性の減少によりリシン異化作用を防ぐ。ＬＫＲをコードする植物遺伝子において酵素機能を下げるかまたは除く突然変異を導入することによりこれを成し遂げることができる。リシン分解生成物のサッカロピン及びα−アミノアジピン酸を蓄積することができないことに関して突然変異体をスクリーニングすることによりリシン過剰生産体系統においてそのような突然変異を同定することができる。あるいはまた、植物ＬＫＲ遺伝子を単離するためのいくつかの方法が提供され；植物ＬＫＲｃＤＮＡを含有する核酸フラグメントも提供される。次に、植物の種子におけるアンチセンスＬＫＲＲＮＡの発現のためまたはＬＫＲの共抑制のためのキメラ遺伝子を作製することができる。リシン非感受性ＤＨＤＰＳをコードするキメラ遺伝子にキメラＬＫＲ遺伝子を連結し、両方を同時に形質転換により植物中に導入するか、またはキメラ遺伝子の各々で独立して形質転換された植物を交配させることによりキメラ遺伝子を一緒にする。第二の方法では、例えば、過剰の遊離リシンをジ−、トリ−もしくはオリゴペプチドまたは好ましくはリシンに富んだ貯蔵タンパク質中に取り入れることにより、それを分解に対して非感受性である形態に取り入れる。選択されるリシンに富んだ貯蔵タンパク質は平均的タンパク質より高いレベルのリシンを含有すべきである。理想的には、これらの貯蔵タンパク質は重量で少なくとも１５％のリシンを含有すべきである。リシンに富んだ種子貯蔵タンパク質として用いるためにインビボで発現させることができるポリペプチドの好ましい種類の設計が提供される。リシンに富んだ合成貯蔵タンパク質（ＳＳＰ）をコードする遺伝子を合成し、植物の種子における発現のために適当な調節配列にＳＳＰ遺伝子が連結されているキメラ遺伝子を作製する。次に、ＳＳＰキメラ遺伝子をキメラＤＨＤＰＳ遺伝子に連結し、両方を同時に形質転換により植物中に導入するか、またはキメラ遺伝子の各々で独立して形質転換された植物を交配させることによりそれらの遺伝子を一緒にする。植物を形質転換するための方法は本明細書に教示され、その場合、得られる植物の種子は非形質転換植物の種子より少なくとも１０％、好ましくは１０％ないし４倍多いリシンを有する。本明細書において例として与えられるものは非形質転換植物より１００％増加した種子リシンレベルを有する形質転換されたアブラナ植物及び非形質転換植物のリシンレベルより４倍増加した種子リシンレベルを有するダイズ植物及び１３０％増加した種子リシンレベルを有するトウモロコシ植物である。本開示の文脈上、多数の用語を利用する。本明細書において用いられる場合、「核酸」という用語は糖、リン酸塩及びプリンまたはピリミジンのいずれかを含有するモノマー（ヌクレオチド）からなる一本鎖または二本鎖であってもよい巨大分子をさす。「核酸フラグメント」は与えられた核酸分子の断片である。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝子物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡ中の情報のタンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は生物の各細胞中に含まれる遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列」という用語は、場合によりＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中に組み入れることができる合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であってもよいＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーをさす。本明細書に用いられる場合、「に相同な」という用語は、２個の核酸分子のヌクレオチド配列間または２個のタンパク質分子のアミノ酸配列間の相補性をさす。相同性の定量的評価は［Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ（編集）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．中に記述されたような］当業者により十分に理解されるようなストリンジェンシーの条件下でＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれかによるか、または２個の核酸もしくはタンパク質間の配列類似性の比較により与えられる。本明細書に用いられる場合、「本質的に類似した」は、コードされるアミノ酸に変異をもたらさない塩基変異を含む可能性があるか、または１個もしくはそれ以上のアミノ酸を改変する可能性があるがＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基変異を含むＤＮＡ配列をさす。それ故、本発明は特定の例示配列より多くを包含すると理解される。また、得られるタンパク質分子の機能特性に実質的に影響を及ぼさないサイレント変異を生じる配列中の欠失、挿入または置換のような配列に対する改変も考えられる。例えば、遺伝暗号の縮重を反映するか、または与えられた位置で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変も考えられ；例えば、疎水性アミノ酸、アミノ酸アラニンのコドンをグリシンのような別の疎水性がより低い残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのような疎水性がより高い残基をコードするコドンで置換することができる。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のようなある負に荷電した残基の代わりに別のもの、またはアルギニンの代わりにリシンのようなある正に荷電した酸基の代わりに別のものでの置換をもたらす変異も生物学的に同等な生成物を生じると考えることができる。また、タンパク質分子のＮ末端及びＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変異もタンパク質の活性に影響を及ぼすと考えられない。ある場合には、タンパク質の生成物学的活性に対する改変の影響を調べるために配列の突然変異体を作製することが実際に望ましいことがある。コードされる生成物の生物学的活性の保持の測定がそうであるように、提示した改変の各々は当該技術分野の通常技術の十分に範囲内である。さらに、本発明により包含される「本質的に類似した」配列が本明細書に例示される配列と厳しい条件下（０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）でハイブリダイズするそれらの能力によっても特定されることを当業者は認識する。「遺伝子」はコーディング領域の前（５’非コーディング）及び後（３’非コーディング）の調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをさす。「天然の」遺伝子はそれ自体の調節配列と共に自然界において見いだされるような遺伝子をさす。「キメラ」遺伝子は異種の調節及びコーディング配列を含んでなる遺伝子をさす。「内因性」遺伝子はゲノム中のその自然な位置に通常見いだされる天然の遺伝子をさす。「外来」遺伝子は宿主生物中に通常見いだされないが遺伝子導入により導入される遺伝子をさす。「コーディング配列」は、特定のタンパク質をコードし、そして非コーディング配列を除くＤＮＡ配列をさす。「開始コドン」及び「終止コドン」はタンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞれ開始及び鎖終結を特定するコーディング配列中の３個の隣接するヌクレオチドの単位をさす。「オープンリーディングフレーム」はコーディング配列の翻訳開始及び終止コドンの間でコードされるアミノ酸配列をさす。「ＲＮＡ転写産物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼにより触媒される転写の結果生じる産物をさす。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写産物と呼ばれ、またはそれは一次転写産物の転写後プロセシングから得られるＲＮＡ配列であってもよい。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は細胞によりタンパク質に翻訳することができるＲＮＡをさす。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的であり、それから得られる二本鎖のＤＮＡをさす。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写産物をさす。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相捕的であり、そしてその一次転写産物またはｍＲＮＡのプロセシング、輸送及び／または翻訳を妨げることにより標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物をさす。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写産物のいずれの部分、すなわち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列とであってもよい。さらに、本明細書に用いられる場合、アンチセンスＲＮＡは遺伝子発現を阻止するアンチセンスＲＮＡの効能を増すリボザイム配列の領域を含んでもよい。「リボザイム」は触媒ＲＮＡをさし、配列特異的エンドリボヌクレアーゼを含む。本明細書に用いられる場合、適当な「調節配列」は、おそらく細胞のタンパク質生合成装置と連結して、コーディング配列の転写及び／または発現を制御する、コーディング配列の上流（５’）、内部及び／または下流（３’）に位置するヌクレオチド配列をさす。これらの調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、転写終結配列及びポリアデニル化配列を含む。「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写のために必要とされる他の因子が認識することによりコーディング配列の発現を制御する、通常、コーディング配列の上流（５’）の、遺伝子中のＤＮＡ配列をさす。また、プロモーターは生理的または発生条件に反応して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含んでもよい。また、それはエンハンサー成分を含んでもよい。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列である。それはプロモーターのレベル及び／または組織特異性を高めるために挿入されるプロモーターの生来の成分または異種起源の成分であってもよい。「構成的プロモーター」は全ての組織及び全ての時期で遺伝子発現を導くものをさす。本明細書に示されるような「器官特異的」または「発生特異的」プロモーターは、それぞれ、ほとんど葉もしくは種子のような特定の器官においてまたは初期もしくは後期胚発生のような器官の特定の発生段階でのみ遺伝子発現を導くものである。「機能的に連結された」という用語は、一方の機能がもう一方により影響を受けるように結合されている単一核酸分子上の核酸配列をさす。例えば、プロモーターが構造遺伝子（すなわち、本明細書に示されるようなリシン非感受性であるアスパルトキナーゼをコードする遺伝子）の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、構造遺伝子がプロモーターの転写制御下にある）場合、それはその構造遺伝子と機能的に連結されている。「発現」という用語は、本明細書において用いられる場合、遺伝子によりコードされるタンパク質産物の生産を意味すると考えられる。より具体的には、「発現」は本発明の核酸フラグメントから得られるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積をさし、それは細胞のタンパク質装置と連結してタンパク質産物の改変されたレベルをもたらす。「アンチセンス阻害」は標的タンパク質の発現を妨げることができるアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産をさす。「過剰発現」は通常または非形質転換生物における生産のレベルを超えるトランスジェニック生物における遺伝子産物の生産をさす。「共抑制」は外来及び内因性遺伝子の両方の発現の抑制をもたらす内因性遺伝子に実質的な相同性を有する外来遺伝子の発現をさす。「改変されたレベル」は通常または非形質転換生物のものと異なる量または割合のトランスジェニック生物における遺伝子産物の生産をさす。「３’非コーディング配列」はポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるあらゆる他の調節シグナルを含む遺伝子のＤＮＡ配列部分をさす。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を与えることを特徴とする。「翻訳リーダー配列」はプロモーターとＲＮＡに転写されるコーディング配列の間の遺伝子のＤＮＡ配列部分をさし、完全にプロセシングされたＲＮＡ中で翻訳開始コドンの上流（５’）に存在する。翻訳リーダー配列はｍＲＮＡへの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼす可能性がある。「成熟」タンパク質はそのターゲッティングシグナルのない翻訳後にプロセシングされたポリペプチドをさす。「前駆体」タンパク質はｍＲＮＡの翻訳の一次産物をさす。「葉緑体ターゲッティングシグナル」はタンパク質と結合して翻訳され、それを葉緑体に導くアミノ酸配列である。「葉緑体移行配列」は葉緑体ターゲッティングシグナルをコードするヌクレオチド配列をさす。「形質転換」は本明細書において宿主生物のゲノム中への外来遺伝子の導入及びその遺伝的に安定な継承をさす。植物形質転換の方法の例はアグロバクテリウムにより媒介される形質転換及び粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術を含む。「アミノ酸」は本明細書において天然に存在するＬアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）をさす。「必須アミノ酸」は動物により合成することができないアミノ酸である。「ポリペプチド」または「タンパク質」は本明細書に用いられる場合（ペプチド結合としても知られている）アミド結合により線状に連結されたモノマー（アミノ酸）からなる分子をさす。本明細書において「合成タンパク質」は天然に存在することが知られていないアミノ酸配列からなるタンパク質をさす。アミノ酸配列は天然に存在するタンパク質の一致に由来してもよく、または完全に新規であってもよい。「一次配列」は分子の立体配座を考慮しないポリペプチド鎖中のアミノ酸の連結順序をさす。一次配列は慣例によりポリペプチド鎖のアミノ末端からカルボキシ末端へ記述される。本明細書において「二次構造」は側鎖特性の変動または立体配座を考慮しないポリペプチド鎖の物理化学的に好ましい規則的主鎖配置をさす。本明細書に用いられる場合「αヘリックス」はヘリックス１回転当たり約３．６残基を有する右巻きヘリックスをさす。「両親媒性ヘリックス」は本明細書においてヘリックスの片側が主に疎水性であり、そしてもう片側が主に親水性であるらせん状構造のポリペプチドをさす。本明細書において「コイルドコイル」は左巻き超らせんを形成するように相互に巻きついている２本の平行右巻きαヘリックスの集合体をさす。本明細書に説明されるような「塩橋」は、ポリペプチド鎖の２つの部分の間または一方の鎖ともう一方の鎖の間で吸引性静電相互作用が維持されるように空間に配置された荷電したアミノ酸側鎖の酸−塩基対をさす。「宿主細胞」は導入される遺伝物質で形質転換される細胞を意味する。ＡＫ遺伝子の単離エシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子は以前にクローン化され、制限エンドヌクレアーゼ地図が作製され、シークエンスされている［Ｃａｓｓａｎ等（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０５２−１０５７］。本発明のために、Ｋｏｈａｒａ、Ａｋｉｙａｍａ及びＩｓｏｎｏ［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］により構築されたクローン化エシェリキア・コリＤＮＡの３４００の重複するセグメントの規則正しい（ｏｒｄｅｒｅｄ）ライブラリーからバクテリオファージラムダクローン上でｌｙｓＣ遺伝子を得た。エシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子は酵素ＡＫIIIをコードし、それはリシン阻害に対して感受性である。ＡＫIII遺伝子をリシンに耐性であるようにする突然変異をｌｙｓＣ遺伝子において得た。リシン耐性の分子的基礎を決定するために、野生型ｌｙｓＣ遺伝子及び３つの突然変異体遺伝子の配列を決定した。配列番号：１において示されるクローン化された野生型ｌｙｓＣ遺伝子の配列は、コーディング領域中５個の位置で公開されたｌｙｓＣ配列と異なった。リシン非感受性アスパルトキナーゼをコードする３つの突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子の配列は、各々、野生型配列と単一ヌクレオチドで異なり、タンパク質において単一アミノ酸置換をもたらした。１つの突然変異体 (M2)は配列番号：１のヌクレオチド９５４でＧの代わりに置換されたＡを有し、ＡＫIIIのアミノ酸配列においてメチオニンの代わりのイソロイシン置換をもたらし、そして２つの突然変異体（Ｍ３及びＭ４）は配列番号：１のヌクレオチド１０５５でＣの代わりの同一のＴ置換を有し、トレオニンの代わりのイソロイシン置換をもたらす。これらの位置で野生型ＡＫIIIにおいて存在するメチオニンまたはトレオニン残基の代わりにアミノ酸置換をもたらす他の突然変異を実施例１において記述されるようにインビボでまたは当業者に知られている方法で部位特異的突然変異生成によりインビトロでのいずれかで作製することができるはずである。そのような突然変異はリシン非感受性酵素をもたらすと考えられる。さらに、リシン非感受性ＡＫIIIをコードする必要なだけ多くのさらなる突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子を容易に単離し、特性化するために実施例１において記述される方法を用いることができるはずである。多数の他のＡＫ遺伝子が単離され、シークエンスされている。これらはエシェリキア・コリのｔｈｒＡ遺伝子［Ｋａｔｉｎｋａ等（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：５７３０−５７３３］、エシェリキア・コリのｍｅｔＬ遺伝子［Ｚａｋｉｎ等（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：３０２８−３０３１］、サッカロミセス・セレビシエのＨＯＭ３遺伝子［Ｒａｆａｌｓｋｉ等（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：２１４６ −２１５１］を含む。エシェリキア・コリのｔｈｒＡ遺伝子は二機能タンパク質、ＡＫＩ−ＨＤＨＩをコードする。この酵素のＡＫ活性はリシンに非感受性であるが、トレオニンに感受性である。また、エシェリキア・コリのｍｅｔＬ遺伝子も二機能タンパク質、ＡＫII−ＨＤＨIIをコードし、この酵素のＡＫ活性もリシンに非感受性である。酵母のＨＯＭ３遺伝子は、リシンに非感受性であるが、トレオニンに感受性であるＡＫをコードする。これらの遺伝子に加えて、リシン非感受性のＡＫをコードするいくつかの植物遺伝子が知られている。オオムギでは、２つの異なるリシン非感受性ＡＫイソ酵素をもたらす２つの関連性のない遺伝子に突然変異を保有するリシンとトレオニンに耐性の突然変異体が記述されている［Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ２９９：２７８−２７９、Ｒｏｇｎｅｓ等（１９８３）Ｐｌａｎｔａ１５７：３２−３８、Ａｒｒｕｄａ等（１９８４）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．７６：４４２−４４６］。トウモロコシでは、リシンとトレオニンに耐性の細胞系統が、リシン阻害に対してその親系統より感受性が低いＡＫ活性を有した［Ｈｉｂｂｅｒｄ等（１９８０）Ｐｌａｎｔａ１４８：１８３−１８７］。続いて単離されたリシンとトレオニンに耐性のトウモロコシ突然変異体は異なる遺伝子座で改変されており、それもリシン非感受性のＡＫを生産する［Ｄｉｅｄｒｉｃｋ等（１９９０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：２０９−２１５、Ｄｏｔｓｏｎ等（１９９０）Ｐｌａｎｔａ１８２：５４６−５５２］。タバコでは、葉にリシン感受性のものとトレオニン感受性のものの２つのＡＫ酵素がある。完全にリシンに非感受性のＡＫを発現したリシンとトレオニンに耐性のタバコ突然変異体が記述されている［Ｆｒａｎｋａｒｄ等（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８２：２７３−２８２］。これらの植物突然変異体はリシン非感受性のＡＫをコードする遺伝子の供給源として使用することができるはずであり、形質転換された植物の種子においてリシン及びトレオニンの蓄積を増やすために本明細書における教示に基づいて用いることができる。ニンジンからのＡＫの部分アミノ酸配列が報告されている［Ｗｉｌｓｏｎ等（１９９１）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９７：１３２３−１３２８］。この情報を用いて一組の縮重ＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、合成し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いてニンジンＡＫ遺伝子を単離できるはずである。最近、ニンジンＡＫ遺伝子が単離され、そのヌクレオチド配列が決定されている［Ｍａｔｔｈｅｗｓ等（１９９１）Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／７４６，７０５］。上記のリシン非感受性のＡＫをコードする遺伝子を単離するためにこの遺伝子を異種起源のハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。エシェリキア・コリにおける野生型及び突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子の高レベル発現エシェリキア・コリにおいてｌｙｓＣ遺伝子の高レベル発現を得るために、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等（１９８７）Ｇｅｎｅ５６：１２５−１３５］を用いるバクテリア発現ベクターを使用した。発現ベクター及びｌｙｓＣ遺伝子を実施例２において記述するように改変してｌｙｓＣ発現ベクターを構築した。突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子（Ｍ２、Ｍ３及びＭ４）の発現のために、実施例２において記述するように野生型ｌｙｓＣ遺伝子を突然変異体遺伝子で置き換えた。高レベル発現のために、発現ベクターの各々をエシェリキア・コリ株Ｂ１２１（ＤＥ３）中に形質転換した［Ｓｔｕｄｉｅｒ等、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０］。実施例２において記述するように培養物を増やし、発現を誘導し、細胞を集め、抽出物を調製した。実施例２において記述するように非誘導及び誘導培養物からの抽出物の上清及びペレット画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＡＫ酵素アッセイにより分析した。誘導培養物の上清及びペレット画分中のクーマシーブルー染色により見える主要なタンパク質はＡＫIIIであった。約８０％のＡＫIIIタンパク質は上清中にあり、そしてＡＫIIIは抽出物中の全エシェリキア・コリタンパク質の１０−２０％に相当した。ＡＫIII酵素活性の約８０％が上清画分中にあった。野生型及び突然変異体粗抽出物の比活性は５−７μｍｏｌｅｓ生成物／分／ｍｇ全タンパク質であった。野生型ＡＫIIIはアッセイにおけるＬ−リシンの存在に感受性であった。約０．４ｍＭの濃度で５０％阻害が、そして約０．１ｍＭで９０％阻害が見られた。それに反して、突然変異体ＡＫIII−Ｍ２、Ｍ３及びＭ４は１５ｍＭのＬ−リシンで全く阻害されなかった。実施例２において記述するように誘導培養物の上清から野生型ＡＫIIIタンパク質を精製した。精製したＡＫIIIタンパク質に対してウサギ抗体を作製した。多数の他の微生物発現ベクターが文献中に記述されている。当業者はｌｙｓＣ発現ベクターを構築するためにこれらのいずれを利用してもよい。次に、これらのｌｙｓＣ発現ベクターを形質転換により適切な微生物中に導入してＡＫIIIの高レベル発現のための系を与えることができるはずである。ＤＨＤＰＳ遺伝子の単離エシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子（ｅｃｏｄａｐＡ）は以前にクローン化され、制限エンドヌクレアーゼ地図が作製され、シークェンスされている［Ｒｉｃｈａｕｄ等（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２９７−３００］。本発明のために、Ｋｏｈａｒａ，．Ａｋｉｙａｍａ及びＩｓｏｎｏ［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］により構築されたクローン化エシェリキア・コリＤＮＡの３４００の重複するセグメントの規則ライブラリーからバクテリオファージラムダクローン上でｄａｐＡ遺伝子を得た。ｅｃｏｄａｐＡ遺伝子はリシン阻害に感受性であるＤＨＤＰＳ酵素をコードする。しかしながら、それは典型的な植物ＤＨＤＰＳ、例えばコムギ麦芽ＤＨＤＰＳよりリシンによる阻害に対する感受性が約２０倍低い。コリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子（ｃｏｒｄａｐＡ）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＡＴＣＣ株１３０３２からのゲノムＤＮＡから単離した。コリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列は公開されている［Ｂｏｎｎａｓｓｉｅ等（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：６４２１］。遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを増幅させ、同時に遺伝子を含むさらなる構築を容易にするために遺伝子の開始コドンにそして終止コドンのすぐ後に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を付加することができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のオリゴヌクレオチドプライマーをその配列から設計することが可能であった。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の単離の詳細は実施例３において示される。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子はリシン阻害に非感受性であるＤＨＤＰＳ酵素をコードする。翻訳開始コドンで制限エンドヌクレアーゼ部位を導入することに加えて、ＰＣＲプライマーはｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の２番目のコドンもセリンをコードするＡＧＣからアラニンをコードするＧＣＴに変えた。活性のあるリシン非感受性ＤＨＤＰＳを発現するいくつかのクローン化ＤＮＡフラグメントが単離され、２番目のコドンのアミノ酸置換が酵素活性に影響を及ぼさないことが示された。ＰＣＲにより作製されたコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子をＰｒｏｍｅｇａからのファージミドベクターｐＧＥＭ−９ｚｆ（−）中にサブクローン化し、一本鎖ＤＮＡを生成し、シークエンスした（配列番号：６）。すでに記述した２番目のコドンの違いは別にして、その配列は２つの位置、ヌクレオチド７９８及び７９９を除いて公開された配列と一致した。公開された配列ではこれらはＴＣであり、一方、配列番号：６に示される遺伝子ではそれらはＣＴである。この変異はセリンの代わりにロイシンのアミノ酸置換をもたらす。この違いの理由は分からない。その違いによりＤＨＤＰＳ酵素活性に対する明らかな影響はない。ＤＨＤＰＳをコードする他の遺伝子の単離が文献中に記述されている。コムギからのＤＨＤＰＳをコードするｃＤＮＡ［Ｋａｎｅｋｏ等（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７４５１−１７４５５］及びトウモロコシからのＤＨＤＰＳをコードするｃＤＮＡ［Ｆｒｉｓｃｈ等（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：２８７−２９３］が２つの例である。これらの遺伝子は野生型リシン感受性ＤＨＤＰＳ酵素をコードする。しかしながら、Ｎｅｇｒｕｔｕｉ等［（１９８４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１１−２０］は、ＤＨＤＰＳ活性がリシン阻害に対して野生型酵素より感受性が低い２つのＡＥＣ耐性タバコ突然変異体を得た。コムギもしくはトウモロコシ遺伝子を単離するためにすでに記述された方法を用いるか、あるいはまた異種起源ハイブリダイゼーションプローブとしてコムギもしくはトウモロコシ遺伝子を用いることによりこれらの遺伝子を単離することができるはずである。ｅｃｏｄａｐＡ遺伝子、ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子のいずれか、または植物ＤＨＤＰＳ遺伝子のいずれかをＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより当業者はＤＨＤＰＳをコードするさらに他の遺伝子を単離することができるはずである。あるいはまた、ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子［Ｙｅｈ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１２：１０５−１１１］及びトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子を単離するために実施されたように、エシェリキア・コリｄａｐＡ突然変異体の機能相補性によりＤＨＤＰＳをコードする他の遺伝子を単離することができるはずである。エシェリキア・コリにおけるｅｃｏｄａｐＡ及びｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現エシェリキア・コリにおいてｅｃｏｄａｐＡ及びｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現を得るために、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等（１９８７）Ｇｅｎｅ５６：１２５−１３５］を用いるバクテリア発現ベクターを使用した。ベクター及びｄａｐＡ遺伝子を以下に記述するように改変してｅｃｏｄａｐＡ及びｃｏｒｄａｐＡ発現ベクターを構築した。高レベル発現のために、発現ベクターの各々をエシェリキア・コリ株Ｂ１２１（ＤＥ３）中に形質転換した［Ｓｔｕｄｉｅｒ等、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０］。実施例４において記述するように培養物を増やし、発現を誘導し、細胞を集め、抽出物を調製した。実施例４において記述するように非誘導及び誘導培養物からの抽出物の上清及びペレット画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＤＨＤＰＳ酵素アッセイにより分析した。両方の誘導培養物の上清及びペレット画分中のクーマシーブルー染色により見える主要なタンパク質は、ＤＨＤＰＳに対して予想される大きさの３２−３４ｋｄの分子量を有した。非誘導培養物中でさえこのタンパク質は生産される最も顕著なタンパク質であった。ｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を含む誘導培養物では、ＤＨＤＰＳタンパク質の約８０％が上清中にあり、ＤＨＤＰＳは抽出物中の全タンパク質の１０−２０％に相当した。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子を含む誘導培養物では、ＤＨＤＰＳタンパク質の５０％より多くがペレット画分中にあった。両方の場合でペレット画分は９０−９５％純粋なＤＨＤＰＳであり、他の単一タンパク質は顕著な量で存在しなかった。従って、これらの画分はウサギ抗体の作製に用いるために十分に純粋であった。誘導抽出物の上清画分中のエシェリキア・コリＤＨＤＰＳの比活性は約５０ＯＤ₅₄₀ユニット／ｍｇタンパク質であった。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳはアッセイにおけるＬ−リシンの存在に対して感受性であった。約０．５ｍＭの濃度で５０％阻害が見られた。コリネバクテリアＤＨＤＰＳでは、誘導抽出物よりむしろ非誘導抽出物の上清画分中に酵素活性が測定された。酵素活性は約４ＯＤ₅ ₃₀ ユニット／分／ｍｇタンパク質であった。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳと対照的に、コリネバクテリアＤＨＤＰＳは７０ｍＭの濃度でさえＬ−リシンにより全く阻害されなかった。多数の他の微生物発現ベクターが文献中に記述されている。ｅｃｏｄａｐＡ及びｃｏｒｄａｐＡ発現ベクターを構築するために当業者はこれらのいずれを利用してもよい。次に、形質転換によりこれらの発現ベクターを適切な微生物中に導入してＤＨＤＰＳの高レベル発現のための系を与えることができるはずである。高レベルのＤＨＤＰＳ及び／またはＡＫIIIを発現するエシェリキア・コリによるアミノ酸の分泌エシェリキア・コリ発現カセットを発現ベクター中に挿入し、次に、エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｓｔｕｄｉｅｒ等（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０］中に形質転換してエシェリキア・コリにアミノ酸を生産させ、分泌させた。用いた方法の詳細及び結果は実施例５において示される。ｌｙｓＣ及びｄａｐＡ遺伝子の発現カセットを作製し、組み合わせるために当業者に知られている他の微生物発現ベクターを用いることができるはずである。次に、これらの発現ベクターを形質転換により適切な微生物中に導入してリシン、トレオニン及びメチオニンの生産及び分泌のための別の系を与えることができるはずである。植物における発現のためのキメラ遺伝子の構築本発明のキメラ遺伝子の発現のための異種起源宿主の好ましい種類は真核生物宿主、特に高等植物の細胞である。高等植物及びそれらから得られる種子の中で好ましいものはダイズ、アブラナ（ブラシカ・ナパス、ブラシカ・カムペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ヒマワリ（ヘリアンタス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｓ））、ワタ(ゴシピウム・ヒルスタム(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ ))、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メジカゴ・サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ））、コムギ（トリチカム種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｓｐ））、オオムギ（ホルデウム・ブルカル（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ））、オートムギ（アベナ・サチバ、エル（Ａｖｅｎａｓａｔｉｖａ、Ｌ））、モロコシ（ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ））、イネ（オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ））及び飼草である。植物における発現はそのような植物において機能できる調節配列を用いる。植物における外来遺伝子の発現は確立している［ＤｅＢｌａｅｒｅ等（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７−２９１］。多数の異なるプロモーターの使用により、植物細胞における本発明の異なるキメラ遺伝子の発現の適切なレベルを得ることができる。そのようなキメラ遺伝子を単一の発現ベクターにおいて一緒にかまたは１つより多いベクターを用いて順次にかのいずれかで宿主植物中に導入することができる。コーディング配列の発現を導くために選択されるプロモーターの起源は、それが適切な宿主組織において翻訳可能なｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを発現することにより本発明を成し遂げるために十分な転写活性を有する限り決定的に重要ではない。全ての植物器官における発現のため、特に葉における発現のために好ましいプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルスの１９Ｓ及び３５Ｓ転写産物［Ｏｄｅｌｌ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８６：４８２−４９３］、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット［Ｍｏｒｅｌｌｉ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１５：２００；Ｂｒｏｇｌｉｅ等（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８；Ｈｅｒｅｒｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ等（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１０：１１５；Ｃｏｒｕｚｚｉ等（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１６７１；Ｆａｃｉｏｔｔｉ等（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２４１］、トウモロコシゼインタンパク質［Ｍａｔｚｋｅ等（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１５２５］及びクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質［Ｌａｍｐａ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３１６：７５０−７５２］を導くものを含む。用途によっては、植物の１つまたはそれ以上の器官における発現に特異的なプロモーターを選択することが望ましいことがある。例としては、発現が光合成器官において所望される場合のリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの光誘導性プロモーター、または種子に特に活性があるプロモーターを含む。好ましいプロモーターは特に種子における発現を可能にするものである。種子は植物アミノ酸の主要な供給源であり、そしてまた種子特異的発現は非種子器官におけるあらゆる可能性がある有害な作用を回避するので、これは特に有用である可能性がある。種子特異的プロモーターの例は種子貯蔵タンパク質のプロモーターを含むがそれらに限定されない。種子貯蔵タンパク質は厳密に調節され、ほとんど種子においてのみ非常に器官特異的且つ時期特異的に発現される［Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：１９１−２２１；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等（１９８９）Ｃｅｌｌ５６：１４９−１６０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ１０：１０８−１１３］。さらに、異なる種子貯蔵タンパク質を種子発生の異なる時期で発現させることができる。現在、トランスジェニック双子葉植物における種子貯蔵タンパク質遺伝子の種子特異的発現の多数の例がある。これらはマメβ−ファゼオリン［Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐｌａｌａｎ等（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３３２０−３３２４；Ｈｏｆｆｍａｎ等（１９８８）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：７１７−７２９］、マメレクチン［Ｖｏｅｌｋｅｒ等（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３５７１−３５７７］、ダイズレクチン［Ｏｋａｍｕｒｏ等（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２４０−８２４４］、ダイズクニッツ型トリプシンインヒビター［Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：０９５−１１０９］、ダイズβ−コングリシニン［Ｂｅａｃｈｙ等（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：３０４７−３０５３；Ｂａｒｋｅｒ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４５８−４６２；Ｃｈｅｎ等（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：２９７−３０２；Ｃｈｅｎ等（１９８９）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２−１２２；Ｎａｉｔｏ等（１９８８）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１０９−１２３］、エンドウマメビシリン［Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９８８）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６８３−６９５］、エンドウマメコンビシリン［Ｎｅｗｂｉｇｉｎ等（１９９０）Ｐｌａｎｔａ１８０：４６１］、エンドウマメレグミン［Ｓｈｉｒｓａｔ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１５：３２６］、アブラナナピン［Ｒａｄｋｅ等（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６８５−６９４］の双子葉植物からの遺伝子並びにトウモロコシ１５ｋＤゼイン［Ｈｏｆｆｍａｎ等（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３２１３− ３２２１；Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ等（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：１２４９−１２５３；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ等（１９８８）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８８：１００２−１００７］、オオムギβ−ホルデイン［Ｍａｒｒｉｓ等（１９８８）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３５９−３６６］及びコムギグルテニン［Ｃｏｌｏｔ等（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３５５９−３５６４］のような単子葉植物からの遺伝子を含む。さらに、キメラ遺伝子構築物において異種起源のコーディング配列に機能的に連結された種子特異的遺伝子のプロモーターは、トランスジェニック植物においてそれらの時間的及び空間的発現様式も維持する。そのような例はアラビドプシス及びブラシカ・ナパス種子においてエンケファリンペプチドを発現させるためのアラビドプシス・サリアナ２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーター［Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ等（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：９２９−９３２］、ルシフェラーゼを発現させるためのマメレクチン及びマメβ−ファゼオリンプロモーター［Ｒｉｇｇｓ等（１９８９）ＰｌａｎｔＳｃｉ．６３：４７−５７］及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現させるためのコムギグルテニンプロモーター［Ｃｏｌｏｔ等（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３５５９−３５６４］を含む。本発明の核酸フラグメントの発現に特に有用なものはクニッツ型トリプシンインヒビター［Ｊｏｆｕｋｕ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：１０７９ −１０９３；Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：１０９５−１１０９］、グリシニン［Ｎｉｅｌｓｏｎ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：３１３−３２８］、 β−コングリシニン［Ｈａｒａｄａ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：４１５−４２５］のもののようないくつかの詳細に特性化されたダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種起源プロモーターである。ダイズβ−コングリシニン貯蔵タンパク質のα’−及びβ−サブユニットの遺伝子のプロモーターは：ａ）トランスジェニック種子においてそれらの発現に対して非常にわずかな位置効果しかなく、そしてｂ）それら２つのプロモーターは異なる時間的調節を示し：α’−サブユニット遺伝子のプロモーターはβ−サブユニット遺伝子のものの数日前に発現されるので、トランスジェニック植物においてダイズ種子発生の中期ないし後期で子葉においてｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを発現させることに特に有用である［Ｂｅａｃｈｙ等（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：３０４７−３０５３；Ｂａｒｋｅｒ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４５８ −４６２；Ｃｈｅｎ等（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：２９７−３０２；Ｃｈｅｎ等（１９８９）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２−１２２；Ｎａｉｔｏ等（１９８８）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１０９−１２３］。また、本発明の核酸フラグメントの発現に特に有用なものは１０ＫＤゼイン［Ｋｉｒｉｈａｒａ等（１９８８）Ｇｅｎｅ７１：３５９−３７０］、２７ｋＤゼイン［Ｐｒａｔ等（１９８７）Ｇｅｎｅ５２：５１−４９；Ｇａｌｌａｒｄｏ等（１９８８）ＰｌａｎｔＳｃｉ．５４：２１１−２８１］及び１９ｋＤゼイン［Ｍａｒｋｓ等（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６４５１ −１６４５９］からの内乳特異的プロモーターのようないくつかの詳細に特性化されたトウモロコシ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種起源プロモーターである。トウモロコシにおけるこれらのプロモーターの相対的転写活性が報告されており［Ｋｏｄｒｚｙｃｋ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：１０５−１１４］、トウモロコシのためのキメラ遺伝子構築物における使用のためにプロモーターを選択する基準を与える。トウモロコシ胚における発現のためには、ＧＬＢ１遺伝子［Ｋｒｉｚ（１９８９）ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ２７：２３９−２５１、Ｗａｌｌａｃｅ等（１９９１）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９５：９７３−９７５］からの強い胚特異的プロモーターを用いることができる。他のプロモーター構築物中へのエンハンサーまたはエンハンサー様成分の導入も本発明を成し遂げるために一次転写産物の増加したレベルを与えると予見される。これらは３５Ｓプロモーター中に見いだされるもの［Ｏｄｅｌｌ等（１９８８）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２６３−２７２］のようなウイルスのエンハンサー、オピン遺伝子からのエンハンサー［Ｆｒｏｍｍ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：９７７−９８４］または本発明の核酸フラグメントに機能的に連結されたプロモーター中に置かれた場合に増加した転写をもたらすあらゆる他の起源からのエンハンサーを含む。特に重要なものは構成的プロモーターに４０倍種子特異的増大を与えることができるβ−コングリシニンのα’−サブユニットの遺伝子から単離されたＤＮＡ配列成分である［Ｃｈｅｎ等（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：２９７−３０２；Ｃｈｅｎ等（１９８９）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２−１２２］。トランスジェニック植物においてプロモーターで種子特異的増大発現を得るために、当業者はこの成分を容易に単離し、それをあらゆる遺伝子のプロモーター領域内に挿入することができる。β−コングリシニン遺伝子と異なる時期に発現されるあらゆる種子特異的遺伝子におけるそのような成分の挿入は、種子発生中のより長い期間トランスジェニック植物において発現をもたらす。ポリアデニル化シグナル及び適切な発現のために必要とされる可能性がある他の調節配列を与えることができるあらゆる３’非コーディング領域を本発明を成し遂げるために用いることができる。これはマメファゼオリン遺伝子の３’末端、ダイズβ−コングリシニン遺伝子の３’末端のようなあらゆる貯蔵タンパク質からの３’末端、３５Ｓもしくは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写産物の３’末端のようなウイルス遺伝子からの３’末端、オピン合成遺伝子からの３ ’末端、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼもしくはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の３’末端、または用いられる配列が機能的に連結されているプロモーター／コーディング領域の組み合わせの適切な発現をもたらすために必要な調節情報をその核酸配列内に与えるようなあらゆる起源からの３’末端配列を含む。異なる３’非コーディング領域の有用性を教示する多数の例が当該技術分野においてある［例えば、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：６７１−６８０を参照］。本発明を成し遂げるためにタンパク質の適切な発現に必要とされる場合、細胞内局在化配列をコードするＤＮＡ配列をｌｙｓＣ及びｄａｐＡコーディング配列に付加してもよい。植物アミノ酸生合成酵素は葉緑体に局在化されることが知られており、それ故、葉緑体ターゲッティングシグナルを有して合成される。ＤＨＤＰＳ及びＡＫIIIのようなバクテリアのタンパク質はそのようなシグナルがない。それ故、葉緑体移行シグナルをｄａｐＡ及びｌｙｓＣコーディング配列に融合することができるはずである。好ましい葉緑体移行配列は、双子葉植物における使用のためには例えばダイズから［Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅｒ等（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４８３−４９８］、そして単子葉植物における使用のためにはトウモロコシから［Ｌｅｂｒｕｎ等（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：４３６０］のリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのものである。植物中へのキメラ遺伝子の導入高等植物の真核細胞中にＤＮＡ配列を導入する（すなわち、形質転換する）様々な方法が当業者に利用できる（ＥＰＯ公開０２９５９５９Ａ２及び０１３８３４１Ａ１を参照）。そのような方法はアグロバクテリウム種のＴｉ及びＲｉプラスミドに基づく形質転換ベクターに基づくものを含む。これらのベクターのバイナリー型を用いることが特に好ましい。Ｔｉ由来のベクターはダイズ、ワタ及びアブラナのような単子葉及び双子葉植物を初めとする多種多様な高等植物を形質転換する［Ｐａｃｃｉｏｔｔｉ等（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２４１；Ｂｙｒｎｅ等（１９８７）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ８：３；Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ等（１９８７）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２０９−２１６；Ｌｏｒｚ等（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１７８；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３］。植物への導入のために、実施例７−１２及び１４−１６において記述するように本発明のキメラ遺伝子をバイナリーベクター中に挿入することができる。それらのベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のバイナリーＴｉプラスミドベクター系［Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２０］の一部である。外来ＤＮＡ構築物の直接取り込み［ＥＰＯ公開０２９５９５９Ａ２を参照］、エレクトロポレーションの技術［Ｆｒｏｍｍ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９：７９１を参照］または核酸構築物で被覆された金属粒子での高速弾道衝撃［Ｋｌｉｎｅ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０を参照、そして米国特許第４，９４５，０５０号を参照］のような他の形質転換法が当業者に利用できる。いったん形質転換されると、それらの細胞を当業者は再生させることができる。特に関係のあるものは、アブラナ［ＤｅＢｌｏｃｋ等（１９８９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４−７０１を参照］、ヒマワリ［Ｅｖｅｒｅｔｔ等（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１２０１］、ダイズ［ＭｃＣａｂｅ等（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３；Ｈｉｎｃｈｅｅ等（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９１５；Ｃｈｅｅ等（１９８９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：１２１２−１２１８：Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８６：７５００−７５０４；ＥＰＯ公開０３０１７４９Ａ２］及びトウモロコシ［Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ等（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：６０３ −６１８；Ｆｒｏｍｍ等（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３ −８３９］のような、商業的に重要な作物中に外来遺伝子を形質転換するための最近記述された方法である。高速弾道衝撃による植物への導入のために、実施例６において記述するように本発明のキメラ遺伝子を適当なベクター中に挿入することができる。実施例17-1 9において記述するように形質転換された植物を得ることができる。タバコ植物におけるｌｙｓＣ及びｄａｐＡキメラ遺伝子の発現形質転換された植物の葉または種子におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、当業者に知られている方法により酵素的及び／または免疫学的にＡＫ IIIまたはＤＨＤＰＳタンパク質を検出し、定量することができる。このようにして高レベルの発現タンパク質を生産する系統を容易に同定することができる。葉の遊離アミノ酸組成を測定するために、実施例７において記述するようなものを初めとする様々な方法により遊離アミノ酸を抽出することができる。種子の遊離または全アミノ酸組成を測定するために、実施例８において記述するようなものを初めとする様々な方法により抽出物を調製することができる。葉の遊離リシンまたはトレオニン（またはあらゆる他のアミノ酸）レベルに対してはＡＫIIIまたはＡＫIII−Ｍ４（葉緑体ターゲッティングシグナルを有する）の発現のいかなる顕著な影響もなかった（実施例７における表２を参照）。ＡＫ III−Ｍ４は経路の最終生成物のいずれによるフィードバック阻害に対しても非感受性であるので、これは葉における生合成経路の他の段階で制御がなされなけらばならないことを示す。それに反して、種子におけるＡＫIIIまたはＡＫIII−Ｍ４（葉緑体ターゲッティングシグナルを有する）の発現は、非形質転換植物に比較して種子における遊離トレオニンのレベルのそれぞれ２ないし４倍または４ないし２３倍の増加を、そしてある場合には遊離リシンのレベルの２ないし３倍の増加をもたらした（表３、実施例８）。より高レベルのＡＫIIIまたはＡＫIII−Ｍ４タンパク質を発現する形質転換体とより高レベルの遊離トレオニンを有するものの間には十分な相関関係があったが、これはリシンでは言えない。ＡＫIIIタンパク質で得られた遊離トレオニンまたはリシンの比較的わずかな増加は、種子の全トレオニンまたはリシンのレベルにおいて、非形質転換植物に比較して検出できる増加をもたらすために十分ではなかった。ＡＫIII−Ｍ４タンパク質の発現により得られた遊離トレオニンのより大きい増加は、種子の全トレオニンのレベルにおいて、非形質転換植物からの種子に比較して検出できる増加をもたらすために十分であった。種子の全トレオニン含有量の１６ないし２５％の増加が得られた。増加した全トレオニンを示す系統は、最も高いレベルの遊離トレオニンの増加及びＡＫIII −Ｍ４タンパク質の高発現を示すものと同じであった。上記の教示はアミノ酸生合成が種子において起こり、そしてアミノ酸生合成酵素をコードする外来遺伝子の発現によりそれを調節できることを示す。さらに、それらはアミノ酸生合成経路の制御がある植物器官と別のもので、例えば種子と葉で著しく異なる可能性があることを示す。この結果の重要性は、以下に記述される葉及び種子における外来ＤＨＤＰＳの発現の異なる結果を考慮する際に強調される。種子におけるトレオニン生合成は主にＡＫの最終生成物阻害により制御されると結論を下すことができる。それ故、リシン阻害に非感受性であり且つ葉緑体に局在化されるＡＫをコードする、形質転換により導入された遺伝子の発現により植物の種子におけるトレオニン蓄積を増やすことができる。また、上記の教示は種子においてより高レベルの導入酵素を発現する形質転換植物が種子においてより高レベルの遊離トレオニンを蓄積することも示す。さらに、それらの教示は種子においてリシン非感受性のＡＫを発現する形質転換植物が同じレベルのリシン感受性のＡＫを発現する形質転換植物より高レベルの遊離トレオニンを種子に蓄積することを示す。遊離トレオニンの商業的に有益な増加を得るためには、リシン非感受性のＡＫが好ましい。これらの教示は種子における遊離リシンのレベルがＡＫの最終生成物阻害により別のアスパルテート由来のアミノ酸のトレオニンの蓄積を制御することを示す。高レベルの遊離リシン自体を蓄積するためには、リシン非感受性のＡＫの発現によりＡＫのリシン阻害を回避することが必要である。形質転換されたタバコ植物の若葉及び成熟葉の両方で、活性のあるエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素の発現を得た（表４、実施例９）。通常のタバコ植物より５０ないし１００倍高い、高レベルの遊離リシンが葉緑体ターゲッティングシグナルを有する酵素を発現する植物の若葉に蓄積したが、そのようなターゲッティングシグナルなしではそうではなかった。しかしながら、より大きい葉では遊離リシンのはるかに少ない蓄積（２ないし８倍）が見られた。師部のリシンを測定する実験から、リシンが大きい葉から運び出されることが示唆される。この運び出されたリシンは、栄養分を運び出すよりむしろ吸収することが知られている小さい成長する葉におけるリシンの蓄積に寄与する可能性がある。たとえエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素が葉と同様に種子において発現されてもこれらの植物の種子における遊離リシンレベルに対するいかなる影響も見られなかった。葉緑体ターゲッティングシグナルを含むかまたは含まないかのいずれかのエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素の高レベル種子特異的発現は、あらゆる形質転換系統において種子の全または遊離リシンまたはトレオニン（またはあらゆる他のアミノ酸）組成に対していかなる影響も及ぼさなかった（表５、実施例１０）。これらの結果は、リシン阻害に実質的に非感受性であるＤＨＤＰＳ酵素の種子における発現が遊離リシンの増加した生産または蓄積を導くために十分ではないことを示す。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素を発現する形質転換体からのこれらの教示は、葉におけるリシン生合成は主にＤＨＤＰＳの最終生成物阻害により制御され、一方、種子ではその経路の少なくとも１つのさらなる制御地点があるはずであることを示す。エシェリキア・コリＡＫIII及びＡＫIII−Ｍ４酵素を発現する形質転換体からの教示は、種子における遊離リシンのレベルがＡＫの最終生成物阻害により全てのアスパルテート由来のアミノ酸の蓄積を制御することを示す。それ故、ＡＫはさらなる制御地点である。葉及び種子におけるエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ及びＡＫIII−Ｍ４の両方の同時高レベル発現を得るために、それらの遺伝子の各々を発現する植物を交配させ、両方を発現する雑種を選択することができるはずである。別の方法は両方の遺伝子を同じＤＮＡフラグメント上に含有するベクターを構築し、連結された遺伝子を形質転換により植物中に導入することである。それらの遺伝子は後の植物育種作業の間中連結されたままであるのでこれが好ましい。同じＤＮＡフラグメント上に両方の遺伝子を保有する代表的なベクターを実施例１１、１２、１５、１６、１８、１９及び２５において記述する。３５Ｓプロモーターに連結されたエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ及びＡＫIII −Ｍ４遺伝子の両方を保有するベクターで形質転換されたタバコ植物を実施例１１において記述する。ほとんどまたは全くＡＫIII−Ｍ４を発現しない形質転換体では、エシェリキア・コリＤＨＤＰＳの発現のレベルが葉におけるリシン蓄積のレベルを決定する(実施例１１、表６)。しかしながら、ＡＫIII−Ｍ４及びエシェリキア・コリＤＨＤＰＳの両方を発現する形質転換体では、各タンパク質の発現のレベルがリシン蓄積のレベルを制御することに役割を果たす。同じレベルでＤＨＤＰＳを発現する形質転換された系統は、ＡＫIII−Ｍ４も発現する場合により多くのリシンを蓄積する（表６、系統５６４−１８Ａ、５６４−５６Ａ、５６４−３６Ｅ、５６４−５５Ｂ及び５６４−４７Ａを比較せよ）。従って、リシン非感受性のＡＫの発現は、内因性植物酵素よりリシンに対する感受性が２０倍低いＤＨＤＰＳ酵素と同時に発現される場合に葉におけるリシン蓄積を増加する。これらの葉の結果は、種子においてエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４及びエシェリキア・コリＤＨＤＰＳを別個に発現させることから得られた種子の結果と合わせると、種子におけるエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４及びエシェリキア・コリＤＨＤＰＳの両方の同時発現が遊離リシンの増加した蓄積をもたらし、そして遊離トレオニンの増加した蓄積ももたらすことを示唆する。ファゼオリンプロモーターに連結されたエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ及びＡＫIII−Ｍ４遺伝子の両方を保有するベクターで形質転換されたタバコ植物を実施例１２において記述する。これらの植物では遊離リシン及び遊離トレオニンの増加した蓄積がある。遊離トレオニンの増加したレベルはＡＫIII−Ｍ４のみを発現する種子においてみられた２０倍の増加よりむしろ、通常の種子に対して４倍であった。遊離トレオニンの蓄積の減少は、経路中間体が生合成経路のリシン分岐の下にそらされていることを示唆する。遊離リシンの増加したレベルは通常の種子（またはエシェリキア・コリＤＨＤＰＳのみを発現する種子）に対して２倍であった。しかしながら、種子におけるリシン増加は葉において見られた１００倍増加と同等ではない。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素はリシン阻害に対して植物ＤＨＤＰＳより感受性が低いが、なおリシンにより阻害される。ＡＫタンパク質に関する上記の教示は、完全にリシン非感受性の酵素の発現が、植物酵素より感受性が低いがなおリシンにより阻害される酵素の発現よりアスパルテート経路最終生成物トレオニンのかなり多くの蓄積をもたらすことができることを示唆する。それ故、種子特異的プロモーターに連結されたコリネバクテリアＤＨＤＰＳ及びＡＫIII−Ｍ４遺伝子の両方を保有するベクターを実施例１５及び１９において記述するように構築した。種子特異的プロモーターに連結されたコリネバクテリアＤＨＤＰＳ及びＡＫIII−Ｍ４遺伝子の両方を保有するベクターで形質転換されたタバコ植物を実施例１５において記述する。表９に示されるように、これらの植物はリシン非感受性のＡＫと同時にエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素を発現する先に記述した植物より多い種子の遊離リシンの蓄積を示さなかった。洞察すると、種子におけるリシン蓄積はエシェリキア・コリＤＨＤＰＳを阻害するために十分な高いレベルに決して達さず、それ故、リシン非感受性のコリネバクテリアＤＨＤＰＳでのこの酵素の置換はいかなる効果もなかったということによりこの結果を説明することができる。高レベルのエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４及びエシェリキア・コリＤＨＤＰＳまたはコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する形質転換された系統では、種子においてかなりの量のα−アミノアジピン酸を検出することが可能であった。この化合物は穀物種子におけるリシンの異化作用の中間体であると考えられるが、その低レベルの蓄積のために放射性トレーサー実験によってのみ通常検出される。遊離アミノ酸のレベルに匹敵する高レベルのこの中間体の発見は、多量のリシンがこれらの形質転換された系統の種子において生産され、異化経路に入っていることを示唆する。α−アミノアジピン酸の蓄積は種子においてエシェリキア・コリＤＨＤＰＳのみまたはＡＫIII−Ｍ４のみを発現する形質転換体では見られなかった。これらの結果から、種子において高レベルの遊離リシンを生産するためには両方の酵素を同時に発現させることが必要であることが示される。高レベルの遊離リシンを蓄積するためには、リシン異化作用を防ぐことも必要である可能性がある。あるいはまた、生産される高レベルのリシンを例えばジ−、トリ −もしくはオリゴペプチドまたはリシンに富んだ貯蔵タンパク質中に組み入れることにより、分解に非感受性である形態にそれを転化することが望ましい可能性がある。アブラナ及びダイズ植物におけるｌｙｓＣ及びｄａｐＡキメラ遺伝子の発現形質転換されたアブラナ及びダイズの種子においてキメラのｌｙｓＣ及びｄａｐＡ遺伝子の発現を分析するため及び種子におけるアミノ酸含有量に対する発現の結果を決定するために、実施例１６もしくは１９において記述するようにかまたはあらゆる他の適当な方法により種子荒粉を調製することができる。必要な場合、例えばヘキサン抽出により、種子荒粉を部分的または完全に脱脂することができる。荒粉からタンパク質抽出物を調製し、ＡＫ及び／またはＤＨＤＰＳ酵素活性を分析することができる。あるいはまた、ＡＫ及び／またはＤＨＤＰＳタンパク質の存在を当業者によく知られている方法により免疫学的に試験することができる。種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を荒粉から抽出し、当業者に知られている方法により分析することができる（適当な方法は実施例８、１６及び１９を参照）。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子を保有するベクターから得られたアブラナ形質転換体の全てがコリネバクテリアＤＨＤＰＳタンパク質を発現し、そしてｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子を保有するベクターから得られた８つのうち６つの形質転換体がＡＫIII −Ｍ４タンパク質を発現した（実施例１６、表１２）。従って、アブラナ種子においてこれらのタンパク質を発現させることは容易である。ＤＨＤＰＳタンパク質を発現する形質転換体はそれらの種子において遊離リシンレベルの１００倍より大きい増加を示した。より高レベルのＤＨＤＰＳタンパク質を発現する形質転換体とより高レベルの遊離リシンを有するものの間に十分な相関関係があった。コリネバクテリアＤＨＤＰＳの非存在下でＡＫIII−Ｍ４を発現するある形質転換体は種子における遊離トレオニンのレベルの５倍の増加を示した。両方の酵素の同時発現は高レベルの遊離リシンの蓄積をもたらしたが、トレオニンはそうではなかった。リシン異化作用を表す高レベルのα−アミノアジピン酸が形質転換された系統の多く、特に最も高いレベルのＤＨＤＰＳ及びＡＫIIIタンパク質を発現する系統で見られた。従って、リシンケトグルタル酸還元酵素の不活化によりリシン異化作用を妨げることは種子における遊離リシンの蓄積をさらに増やすはずである。あるいはまた、ペプチドまたはリシンに富んだタンパク質中へのリシンの取り込みは異化作用を防ぎ、種子におけるリシンの蓄積の増加をもたらす。成熟したアブラナ種子の全アミノ酸組成を測定するために、実施例１６において記述するように脱脂荒粉を分析した。種子における相対的アミノ酸レベルを全アミノ酸に対するリシンのパーセンテージとして比較した。非形質転換コントロールに比較して、リシンレベルの５−１００％の増加を有する種子が見られた。最も高いリシン含有量を有する形質転換体は高レベルのエシェリキア・コリＡＫ III−Ｍ４及びコリネバクテリアＤＨＤＰＳの両方を発現した。この形質転換体において、リシンはあらゆる以前に知られているアブラナ種子よりかなり高い、全種子アミノ酸の約１３％を構成する。７つのうち６つのダイズ形質転換体がＤＨＤＰＳタンパク質を発現した。ＤＨＤＰＳを発現する６つの形質転換体では、個々の種子においてＧＵＳとＤＨＤＰＳの発現の間に優れた相関関係があった。従って、ＧＵＳ及びＤＨＤＰＳ遺伝子はダイズゲノムの同じ位置に組込まれている。７つのうち４つの形質転換体がＡＫIIIタンパク質を発現し、再び個々の種子においてＡＫIII、ＧＵＳ及びＤＨＤＰＳの発現の間に優れた相関関係があった。従って、これら４つの形質転換体では、ＧＵＳ、ＡＫIII及びＤＨＤＰＳ遺伝子がダイズゲノムの同じ位置に組込まれている。コリネバクテリアＤＨＤＰＳを単独でそしてエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４と同時に発現するダイズ形質転換体はそれらの種子において高レベルの遊離リシンを蓄積した。また、リシン異化作用の第一の代謝産物の高レベルのサッカロピンも高レベルのリシンを含有する種子において見られた。また、より少ない量のα−アミノアジピン酸も見られた。従って、リシンケトグルタル酸還元酵素の不活化によりリシン異化作用を防ぐことは、ダイズ種子における遊離リシンの蓄積をさらに増やすはずである。あるいはまた、ペプチドまたはリシンに富んだタンパク質中へのリシンの取り込みは異化作用を防ぎ、ダイズ種子におけるリシンの蓄積の増加をもたらす。導入遺伝子が単一遺伝子座として分離する形質転換体からの個々の種子における遊離リシンレベルの分析から、遊離リシンレベルの増加が種子の約１／４で著しく高いことが示された。種子の１／４は導入遺伝子がホモであると考えられるので、より高いリシン種子はホモ接合体であると思われる。さらに、これは遊離リシンの増加のレベルが導入遺伝子のコピー数により決まることを示唆する。それ故、２つの異なる形質転換体の雑種を作製し、両方の導入遺伝子の遺伝子座でホモである子孫を得ることによりリシンレベルをさらに増加することができるはずである。コリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現するダイズ種子は全種子リシンの蓄積の実質的な増加を示した。非形質転換コントロールに比較して、全リシン含有量の５ −３５％の増加を有する種子が見られた。これらの種子においてリシンは全種子アミノ酸の７．５−７．７％を構成する。エシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４と同時にコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現するダイズ種子はコリネバクテリアＤＨＤＰＳのみを発現するものよりかなり多い全種子リシンの蓄積を示した。全リシン含有量の４倍より多い増加を有する種子が見られた。これらの種子においてリシンはあらゆる以前に知られているダイズ種子よりかない高い全種子アミノ酸の２０−２５％を構成する。トウモロコシ植物におけるｌｙｓＣ及びｄａｐＡキメラ遺伝子の発現形質転換されたカルスから再生させたトウモロコシ植物をサザンブロットまたはＰＣＲにより完全なｌｙｓＣ及びｄａｐＡ導入遺伝子の存在に関して分析することができる。それらの遺伝子を保有する植物を自殖または優等系統に他配させてＦ１種子を生成する。６ないし８個の種子をプールし、ウェスタンブロット分析によりコリネバクテリアＤＨＤＰＳタンパク質及びエシェリキア・コリＡＫII I−Ｍ４タンパク質の発現に関してアッセイする。種子の遊離アミノ酸組成及び全アミノ酸組成を上記のように測定する。好ましくはグロブリン１遺伝子から得られる、胚において活性がある調節配列を用いて種子の胚で、または好ましくはグルテリン２遺伝子もしくは１０ｋＤゼイン遺伝子から得られる、内乳において活性がある調節配列を用いて内乳でコリネバクテリアＤＨＤＰＳタンパク質及び／またはエシェリキア・コリＡＫIII− Ｍ４タンパク質の発現を得ることができる（詳細は実施例２６を参照）。種子における遊離リシンレベルはコントロール種子における約１．４％の遊離アミノ酸からグロブリン１プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳのみを発現する形質転換体の種子における１５−２７％まで増加される。増加した遊離リシンはグロブリン１プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する種子では胚に局在化された。遊離リシンの大きい増加は全種子リシン含有量の著しい増加をもたらす。グロブリン１プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する種子では全リシンレベルを少なくとも１３０％増加することができる。コリネバクテリアＤＨＤＰＳと同時にグロブリン１プロモーターからエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４タンパク質を発現させることにより遊離リシンレベルのより大きい増加を得ることができる。リシン異化作用はトウモロコシの胚より内乳において大きいと考えられる。従って、内乳において著しいリシン増加を得るためには、内乳においてコリネバクテリアＤＨＤＰＳ及びエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４の両方を発現させること及び以下に記述するようにリシンケトグルタル酸還元酵素のレベルを下げることによりリシン異化作用を減らすことが好ましい。植物リシンケトグルタル酸還元酵素遺伝子の単離より高レベルの遊離リシンを蓄積するため並びにサッカロピン及びα−アミノアジピン酸のようなリシン分解生成物の蓄積を防ぐためにリシン異化作用を防ぐことが望ましい可能性がある。リシンがサッカロピン経路により植物において異化されることが証拠から示される。この経路の存在に関する最初の酵素的証拠は、発生中のトウモロコシ種子の未成熟内乳におけるリシンケトグルタル酸還元酵素（ＬＫＲ）活性の検出であった［Ａｒｒｕｄａ等（１９８２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．６９：９８８−９８９］。ＬＫＲはリシン異化作用の第一段階、ＮＡＤＰＨを補因子として用いるα−ケトグルタレートとＬ−リシンのサッカロピンへの縮合を触媒する。ＬＫＲ活性はトウモロコシにおいて内乳発生の開始から急に増加し、授粉後約２０日で最高レベルに達し、次に減少する［Ａｒｒｕｄａ等（１９８３）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：２６８７−２６８９］。リシンの異化作用を防ぐためには、ＬＫＲ発現または活性を減らすかまたは除くことが望ましい。ＬＫＲ遺伝子をクローニングし、ＬＫＲの共抑制のためのキメラ遺伝子を調製するかまたはＬＫＲのアンチセンスＲＮＡを発現するようにキメラ遺伝子を調製し、キメラ遺伝子を形質転換により植物中に導入することによりこれを成し遂げることができるはずである。あるいはまた、ＬＫＲ酵素活性がない植物突然変異体を得ることができるはずである。植物ＬＫＲ遺伝子をクローン化するためのいくつかの方法が当業者に利用できる。Ｂｒｏｃｈｅｔｔｏ−Ｂｒａｇａ等［（１９９２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９８：１１３９−１１４７］中に記述されたようにトウモロコシ内乳からタンパク質を精製し、抗体を作製するために用いることができる。次に、それらの抗体を用いてＬＫＲクローンに関してｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいはまた、精製されたタンパク質を用いてタンパク質のアミノ末端でまたはプロテアーゼにより得られる内部ペプチドフラグメントからアミノ酸配列を決定することができる。そのアミノ酸配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドプローブを調製し、ハイブリダイゼーションにより植物ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。別の方法は２０μｇ／ｍＬのＬ−リシンを含有する合成培地中で生育することができないエシェリキア・コリ株を利用する。この株におけるＬＫＲ全長ｃＤＮＡの発現はリシン濃度を減らすことにより生育阻害を取り消す。リシン耐性の生育をもたらすクローンを植物ｃＤＮＡライブラリーから選択するために適当なエシェリキア・コリ株の構築及びその使用を実施例２０において記述する。さらに別の方法は植物ＬＫＲとサッカロピンデヒドロゲナーゼの間の相同性による。真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ（リシン形成）は真菌のリシン生合成経路の最後の２段階を触媒する。植物ＬＫＲ及び真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（リシン形成）は正及び逆の両方の反応を触媒し、同一基質を用い、そして類似した補因子を用いる。同様に、リシン異化経路の第二段階を触媒する植物サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）は真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）のように正及び逆の両方の反応に働き、同一基質を用い、類似した補因子を用いる。真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼのいくつかの遺伝子が単離され、シークエンスされており、当業者に容易に利用できる［Ｘｕａｎ等（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４７９５−４８０６、Ｆｅｌｌｅｒ等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：６４１１−６４１８］。植物ＬＫＲ及び植物サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）核酸フラグメントを同定するため、あるいはまた植物ｃＤＮＡにおける相同なタンパク質コーディング領域を同定するためにこれらの遺伝子を異種起源のハイブリダイゼーションプローブとして用いることができるはずである。ヒト及びウシの研究から得られた生化学的及び遺伝学的証拠から、哺乳類のＬＫＲ及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）酵素活性が約１１７，０００のモノマー分子量を有する単一タンパク質上に存在することが示されている。これは約４４，０００の分子量を有するサッカロピンデヒドロゲナーゼ（リシン形成）及び約５１，０００の分子量を有するサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）の別個のタンパク質上に保有される真菌酵素と対照的である。植物ＬＫＲは約１４０，０００の分子量を有することが報告されており、それがＬＫＲ及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）の両方の酵素活性が単一タンパク質上に存在する動物の異化作用タンパク質のようであることを示唆している。アラビドプシス・サリアナから得られたｃＤＮＡを含有する２つの植物サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）核酸フラグメント（配列番号：１０２及び１０３）が与えられる。これらは真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）に相同なタンパク質をコードするｃＤＮＡとして同定された。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１０８及び配列番号：１０９）を設計し、合成するためにこれらの核酸フラグメントを用いた。それらのプライマーを合成し、アラビドプシスゲノムＤＮＡからの２．２４ｋｂＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のために用いた。ゲノムＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションにより、このＤＮＡフラグメントを用いてより大きいゲノムＤＮＡフラグメントを単離し、それは全コーディング領域並びに５’及び３’隣接領域を含んだ。このゲノムＤＮＡフラグメントの配列が与えられ（配列番号：１１０）；この配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、ＲＴ−ＰＣＲにより全長ｃＤＮＡを単離するために用いた。全長ｃＤＮＡの配列（配列番号：１１１）が与えられる。これらの核酸フラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用いて所望するあらゆる植物からＬＫＲ及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）の両方の酵素活性をコードするゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントを同定し、単離することができる。アラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定されるアミノ酸配列を配列番号：１１２に示す。アミノ酸配列から、植物ではＬＫＲ及びＳＤＨ酵素活性が単一の二機能タンパク質上に保有されること及びそのタンパク質がＮ末端のターゲッティング配列を欠くことが示され、リシン分解経路が植物細胞サイトゾルに位置することが示唆される。アラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質のアミノ酸配列を他のＬＫＲ及びＳＤＨタンパク質のものと比較し、そのようにして保存されたアミノ酸配列の領域を明らかにした。この情報に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを設計し、他の生物、好ましくは植物からＰＣＲによりゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントを増幅するために用いることができる。この例として、配列番号：１１３及び配列番号：１１４を設計し、ダイズ及びトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡフラグメントを増幅するために用いた。部分的ダイズＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡの配列を配列番号：１１５に示し、そして部分的トウモロコシｃＤＮＡの配列を配列番号：１１６に示す。アラビドプシスに実施したように、トウモロコシまたはダイズゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションにより、これらのＤＮＡフラグメントを用いて全コーディング領域並びに５’及び３’隣接領域を含むより大きいゲノムＤＮＡフラグメントを単離することができる。５’ＲＡＣＥ及びｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションのようなプロトコルにおける出発材料として配列番号：１１５及び１１６中の配列を用いてダイズ及びトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨのコーディング領域からのより完全な配列情報を得た。ダイズＬＫＲ／ＳＤＨのほぼ全長ｃＤＮＡを配列番号：１１９に示し、トウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨのほぼ全長ｃＤＮＡを配列番号：１２０に示す。トウモロコシからのＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡの欠失型を配列番号：１２３に記述する。ダイズＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を配列番号：１１７及び１２１に示し、そしてトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を配列番号：１１８、１２２及び１２４に示す。これらのアミノ酸配列を他のＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質配列、例えばアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質配列と比較することができ、そのようにして保存されたアミノ酸配列の領域を明らかにする。この情報を用いて、あらゆる植物源からのＬＫＲ／ＳＤＨゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントの単離を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成することができる。アラビドプシス、ダイズ及びトウモロコシからの植物ＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の配列情報が利用できることにより、イネ及びコムギからのＥＳＴを初めとする他の植物から得られたＥＳＴ配列にそれらの配列を比較することができた。配列番号：１２５及び１２７はイネからのＬＫＲ／ＳＤＨをコードする部分ｃＤＮＡクローンの配列を記述し、そして配列番号：１２９はコムギからのＬＫＲ／ＳＤＨのフラグメントをコードする部分ｃＤＮＡの配列を記述する。配列番号：１２５、１２７及び１２９に示される配列によりコードされる推定タンパク質フラグメントをそれぞれ配列番号：１２６、１２８及び１３０に記述する。植物ＬＫＲ／ＳＤＨ遺伝子を利用できることにより、形質転換された植物においてＬＫＲ／ＳＤＨ遺伝子の発現を妨げることが可能になる。これを成し遂げるために、上記の植物プロモーター配列のいずれかにＬＫＲ遺伝子または遺伝子フラグメントを連結することによりＬＫＲの共抑制のために設計されたキメラ遺伝子を構築することができる。（共抑制により植物遺伝子発現を妨げるための方法論は米国特許第５，２３１，０２０号を参照。）あるいはまた、上記の植物プロモーター配列のいずれかにＬＫＲ遺伝子または遺伝子フラグメントを逆向きに連結することによりＬＫＲ遺伝子の全部または一部のアンチセンスＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子を構築することができる。（アンチセンスＲＮＡにより植物遺伝子発現を妨げるための方法論は米国特許第５，１０７，０６５号を参照。）共抑制またはアンチセンスキメラ遺伝子のいずれかを形質転換により植物中に導入することができる。次に、内因性ＬＫＲ遺伝子の発現が減少されるかまたは除かれている形質転換体を選択する。キメラ遺伝子の好ましいプロモーターは種子特異的プロモーターである。ダイズ、アブラナ及び他の双子葉植物には、マメファゼオリン遺伝子、ダイズβ−コングリシニン遺伝子、グリシニン遺伝子、クニッツ型トリプシンインヒビター遺伝子またはアブラナナピン遺伝子からの強い種子特異的プロモーターが好ましい。トウモロコシ及び他の単子葉植物には、強い内乳特異的プロモーター、例えば１０ｋＤもしくは２７ｋＤゼインプロモーターまたは強い胚特異的プロモーター、例えばＦＬＢ１プロモーターが好ましい。キメラＬＫＲ遺伝子のいずれかを含有する形質転換された植物を上記の方法により得ることができる。ＬＫＲの共抑制またはアンチセンスＬＫＲのキメラ遺伝子及び実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳをコードするキメラ遺伝子を発現する形質転換された植物を得るために、実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳをコードするキメラ遺伝子に共抑制またはアンチセンスＬＫＲ遺伝子を連結することができ、そして２個の遺伝子を形質転換により植物中に導入することができる。あるいはまた、実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳを発現する先に形質転換された植物中にＬＫＲの共抑制またはアンチセンスＬＫＲのキメラ遺伝子を導入することができ、あるいは共抑制またはアンチセンスＬＫＲ遺伝子を通常の植物中に導入することができ、得られた形質転換体を実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳを発現する植物と交配させることができる。植物ＬＫＲ／ＳＤＨ遺伝子を利用できることにより、異種起源の系においてそれらのタンパク質を発現させることが可能になる。これを示すために、アラビドプシスＳＤＨコーディング領域（配列番号：１１９）を含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲプライマーを用いて作製し、原核生物発現ベクター中に連結した。アラビドプシスＳＤＨの高レベル発現がエシェリキア・コリにおいて得られ、ＳＤＨタンパク質をバクテリア抽出物から精製し、タンパク質に対してウサギ抗体を作製するために用いた。ＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質を生産しないか、または親植物に比較して減少した量のタンパク質を生産する変異体を見いだすために、これらの抗体を用いて植物突然変異体をスクリーニングすることができる。減少したＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質を発現するかまたは全くタンパク質を発現しない植物突然変異体を実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳを発現する植物と交配させることができる。リシンに富んだポリペプチドの設計例えば、生産された高レベルのリシンをジ−、トリ−もしくはオリゴペプチドまたはリシンに富んだ貯蔵タンパク質中に取り込むことにより、それを分解に非感受性である形態に転化することが望ましい可能性がある。いかなる天然のリシンに富んだタンパク質も知られていない。本発明の一つの態様は、リシンに富んだ種子貯蔵タンパク質として働くようにインビボで発現させることができるポリペプチドの設計である。ポリペプチドは１つのアミノ酸のα−カルボキシル基が鎖の次のアミノ酸のα−アミノ基に共有結合しているアミノ酸の直線状ポリマーである。鎖の残基間及び周囲の溶媒との非共有結合相互作用は分子の最終的な構造を決定する。当業者は安定な折りたたまれたポリペプチド鎖の設計において静電力、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用及び個々のアミノ酸残基の構造優先を考慮しなければならない［例えば：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ１３３−１９７またはＳｃｈｕｌｚ等、（１９７９）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ２７−４５を参照］。相互作用の数及びそれらの複雑さは、可能な場合、天然のタンパク質モデルの使用により設計工程を補助してもよいことを示唆する。本発明に例示される合成貯蔵タンパク質（ＳＳＰ）は、植物種子におけるタンパク質の平均レベルに比較してリシンに富んでいる可能性を有するポリペプチドであるように選択される。リシンは生理的ｐＨで荷電したアミノ酸であり、それ故、タンパク質分子の表面上に最もよく見いだされる［Ｃｈｏｔｈｉａ、（１９７６）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１０５：１−１４］。リシン含有量を最大にするために、出願人等は本発明に例示される合成貯蔵タンパク質のために高い表面対体積比を有する分子形状を選択した。選択肢は大部分のタンパク質の共通球状形態を伸ばして桿状伸長構造を形成するかまたは球状形態を盤状構造に平らにすることのいずれかである。繊維状タンパク質の種類に長い桿状タンパク質のいくつかの天然モデルがあるので［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐ１９１］出願人等は前者の形状を選択した。コイルドコイルは繊維状タンパク質の種類のよく研究された一組を構成する［Ｃｏｈｅｎ等、（１９８６）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２４５−１４８を参照］。天然の例はα−ケラチン、パラミオシン、ライトメロミオシン及びトロポミオシンにおいて見いだされる。これらのタンパク質分子は左巻き超らせんにおいて相互に巻きついた２本の平行αヘリックスからなる。この超らせんの反復距離は（個々のヘリックスの１回転の５．４Åの反復距離に比較して）１４０Åである。超らせんは２本の個々のαヘリックスの軸の間にわずかなゆがみ（１０°）をもたらす。コイルドコイルでは、個々のヘリックスの１回転当たり３．５残基あり、超らせん軸に対してちょうど７残基の周期性をもたらす（図１参照）。それ故、ポリペプチド鎖の７番目のアミノ酸毎にヘリックス軸に対して同等な位置を占める。出願人等は本発明のこのヘプタド（ｈｅｐｔａｄ）単位の７つの位置を図１及び２ａに示されるように（ｄｅｆｇａｂｃ）と呼ぶ。これはコイルドコイル文献において用いられる慣例に従う。ヘプタドのａ及びｄのアミノ酸は一次配列の４，３反復パターンに従い、個々のαヘリックスの片側にくる（図１参照）。αヘリックスの片側のアミノ酸が全て非極性である場合、ヘリックスのその面は疎水性であり、例えばもう一つの類似したヘリックスの非極性面のような他の疎水性面と会合する。２本のヘリックスがそれらの疎水性面を相互に一列に並べるように二量化する場合、コイルドコイル構造が生じる（図２ａ参照）。球状タンパク質の露出及び埋蔵残基型の予想パターンにより、天然のコイルドコイルにおいて成分αヘリックスの外側面上のアミノ酸（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ）は通常極性である［Ｓｃｈｕｌｚ等、（１９７９）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐ１２；Ｔａｌｂｏｔ等、（１９８２）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１５：２２４−２３０；Ｈｏｄｇｅｓ等、（１９８１）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５６：１２１４−１２２４］。向かい合わせの鎖上の位置ｅとｇ’または位置ｇとｅ’の間で荷電したアミノ酸が塩橋を形成するのがしばしば見られる（図２ａ参照）。従って、図１に示されるもののような２本の両親媒性ヘリックスはａ、ａ’、ｄ及びｄ’残基間の疎水性相互作用の組み合わせにより、そしてｅとｇ’及び／またはｇとｅ’残基間の塩橋によりまとめられる。超らせんにおける疎水性残基のパッキングは鎖を「正確に重ね合わせて」保つ。数回転のみの成分αヘリックス鎖を含んでなる短いポリペプチドでは、ヘリックス軸間の１０°のゆがみを無視でき、（図２ａに示されるように）２本の鎖を平行として扱うことができる。多数の合成コイルドコイルが文献中に報告されている［Ｌａｕ等、（１９８４）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５９：１３２５３−１３２６１；Ｈｏｄｇｅｓ等、（１９８８）ＰｅＰｔｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ１：１９−３０；ＤｅＧｒａｄｏ等、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：６２２−６２８；Ｏ’Ｎｅｉｌ等、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：６４５−６５１］。これらのポリペプチドは大きさが異なるが、Ｌａｕ等は２９アミノ酸がコイルドコイル構造を形成するための二量化のために十分であることを見いだした［Ｌａｕ等、（１９８４）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５９：１３２５３−１３２６１］。出願人等は本発明におけるポリペプチドを構造的安定性の理由から２８残基及びそれより大きい鎖として構築した。本発明のポリペプチドを水性環境においてコイルドコイルモチーフを有して二量化するように設計する。出願人等はコイルドコイル構造を安定させるために疎水性相互作用及び静電相互作用の組み合わせを用いている。大部分の非極性残基をａ及びｄの位置に限定し、それはヘリックスの軸に平行な疎水性細片を生じる。これが二量化面である。出願人等は二量化に伴う立体干渉を最小限にするため及び安定なコイルドコイル構造の形成を促進するためにこの面に沿った大きいかさばるアミノ酸を避けた。位置ａ及びｄのメチオニンがロイシンジッパー亜群のコイルドコイルを不安定にすることを示唆する文献における最近の報告［Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ等、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１６８１−１６８８及びＨｕ等、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：１４００−１４０３］にもかかわらず、出願人等はＳＳＰポリペプチドの疎水性面上のロイシンの代わりにメチオニン残基を用いることを選択した。メチオニン及びロイシンは分子の形状が類似している（図３）。出願人等は疎水性コア中のメチオニンにより引き起こされる可能性があるコイルドコイルのあらゆる不安定化が、塩橋（ｅ−ｇ’及びｇ−ｅ’）の形成がヘリックス中の全ての可能な位置で（すなわちヘプタド組当たり２回）起こる場合に配列中で相殺されるようであることを示した。出願人等は、リシンに富んだポリペプチドを作製するという目標と両立できる程度にポリペプチド中の片寄った電荷を最小限にした。これはポリペプチドがインビボで発現される場合に合成貯蔵タンパク質と他の植物タンパク質の間の望ましくない相互作用を防ぐために役立つ可能性がある。一次配列に対する最低限の制限で、特定の構造的に安定な構造のαヘリックスコイルドコイルに自然に折りたたむように本発明のポリペプチドを設計する。これにより合成貯蔵タンパク質を特定の最終使用者の要求に合わせることができる。ヘプタド反復単位のｂ、ｃ及びｆの位置を用いて７残基ごとに１個までの頻度であらゆるアミノ酸を組み入れることができる。出願人等は本発明の合成貯蔵タンパク質中に４３％までの群イソロイシン、ロシシン、リシン、メチオニン、トレオニン及びバリンからの必須アミノ酸を組み入れることができること及び１４％までの群フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからの必須アミノ酸を組み入れることができることを認める。ＳＳＰにおいてＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒのみが疎水性コア中に位置する。さらに、ＳＳＰ中のｅ、ｇ、ｅ’及びｇ’の位置は、吸引性静電相互作用がいつもＳＳＰダイマーの２本のポリペプチド鎖の間のこれらの位置で起こるように限定される。これはＳＳＰポリペプチドをダイマーとしてより安定にする。従って、本発明において記述される新規な合成貯蔵タンパク質は可能なコイルドコイルポリペプチドの特定のサブセットを表す。水溶液中で両親媒性αヘリックス構造を取る全てのポリペプチドが本明細書に記述される用途のために適当であるわけではない。出願人等の研究から得られた以下の規則は出願人等がその発明に用いるＳＳＰポリペプチドを特定する：合成ポリペプチドはｎ個のヘプタド単位（ｄｅｆｇａｂｃ）を含んでなり、各ヘプタドは同じまたは異なるのいずれかであり、その場合：ｎは少なくとも４であり；ａ及びｄは独立してＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ及びＴｈｒよりなる群から選択され；ｅ及びｇは独立して酸／塩基対Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｒｇ／Ｇｌｕ、Ａｒｇ／Ａｓｐ、Ｌｙｓ／Ａｓｐ、Ｇｌｕ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｒｇ及びＡｓｐ／Ｌｙｓよりなる群から選択され；そしてｂ、ｃ及びｆは独立してＧｌｙまたはＰｒｏ以外のあらゆるアミノ酸であり、そして各ヘプタドのｂ、ｃ及びｆの少なくとも２つのアミノ酸はＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＡｌａよりなる群から選択される。リシンに富んだポリペプチドをコードするキメラ遺伝子上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を遺伝暗号に基づいて設計することができる。特定のアミノ酸に対して複数のコドンが存在する場合、植物における翻訳のために好ましいものからコドンを選択すべきである。当業者に知られている方法により、これらのＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチドをＡＢＩＤＮＡ合成機を用いて合成し、相補鎖に対応するオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、プラスミドベクター中に挿入することができる。さらなるアニーリングさせたオリゴヌクレオチドを合成遺伝子中に作製された制限エンドヌクレアーゼ部位で挿入することによりコードされるポリペプチド配列を長くすることができる。本発明のリシンに富んだポリペプチドをコードする遺伝子を構築するためのいくつかの代表的な方法並びに好ましい態様のＤＮＡ及びアミノ酸配列は実施例２１において与えられる。リシンに富んだポリペプチドをコードする合成貯蔵タンパク質遺伝子のＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子を、上記の植物プロモーター配列のいずれかに遺伝子を連結することにより構築することができる。好ましいプロモーターは種子特異的プロモーターである。ダイズ、アブラナ及び他の双子葉植物には、マメファゼオリン遺伝子、ダイズβ−コングリシニン遺伝子、グリシニン遺伝子、クニッツ型トリプシンインヒビター遺伝子またはアブラナナピン遺伝子からの強い種子特異的プロモーターが好ましい。トウモロコシまたは他の単子葉植物には、強い内乳特異的プロモーター、例えば１０ｋＤもしくは２７ｋＤゼインプロモーターまたは強い胚特異的プロモーター、例えばトウモロコシグロブリン１プロモーターが好ましい。リシンに富んだポリペプチドをコードする合成貯蔵タンパク質遺伝子のキメラ遺伝子を発現する植物を得るために、上記の方法のいずれかにより植物を形質転換することができる。キメラＳＳＰ遺伝子並びに実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳ及びＡＫをコードするキメラ遺伝子の両方を発現する植物を得るために、実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳ及びＡＫをコードするキメラ遺伝子にＳＳＰ遺伝子を連結することができ、３個の遺伝子を形質転換により植物中に導入することができる。あるいはまた、実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳ及びＡＫを発現する先に形質転換された植物中にキメラＳＳＰ遺伝子を導入することができ、またはＳＳＰ遺伝子を通常の植物中に導入することができ、得られた形質転換体を実質的にリシン非感受性のＤＨＤＰＳ及びＡＫを発現する植物と交配させることができる。リシンに富んだタンパク質遺伝子を含有する形質転換植物とリシン生合成遺伝子を含有する形質転換植物の遺伝的交配（ｇｅｎｅｔｉｃｃｒｏｓｓｅｓ）からの結果（実施例２３参照）は、これらの遺伝子の同等発現により種子における全リシンレベルを増加できることを示す。導入遺伝子の全ての遺伝子コピー数は雑種において減少しているので、この結果は特に意外であった。生合成遺伝子及びリシン富んだタンパク質遺伝子が全てホモである場合、リシンレベルがさらに増加されると考えられる。植物形質転換のための選択マーカーとしてのｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子の使用多数の植物の細胞培養物及び実生の成長は高濃度のリシン及びトレオニンにより阻害される。メチオニン（またはインビボでメチオニンに転化されるホモセリン）の添加により成長は回復される。リシン及びトレオニン阻害は内因性ＡＫのフィードバック阻害の結果生じると考えられ、それは経路を通した流れを減らし、メチオニンの飢餓状態をもたらす。タバコでは、葉においてリシン感受性のものとトレオニン感受性のものの２つのＡＫ酵素がある。［Ｎｅｇｒｕｔｕｉ等（１９８４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１１−２０］。高濃度のリシン及びトレオニンはタバコ葉盤からのシュートの成長を阻害し、低濃度のメチオニンの添加により阻害は取り消される。従って、成長阻害はおそらく２つのＡＫアイソザイムの阻害による。活性のあるリシン及びトレオニン非感受性ＡＫIII−Ｍ４の発現もリシン及びトレオニン成長阻害を取り消す（表２、実施例７）。発現されるＡＫIII−Ｍ４タンパク質のレベルとリシン及びトレオニンに対する耐性の間に十分な相関関係がある。リシン感受性の野生型ＡＫIIIの発現は同様な効果をもたない。ＡＫIII −Ｍ４タンパク質の発現は通常阻害的な条件下での成長を可能にするので、実施例１３及び１７において例示されるように植物においてＡＫIII−Ｍ４の発現をもたらすキメラ遺伝子を形質転換の選択遺伝子マーカーとして用いることができる。実施例本発明は以下の実施例においてさらに特定され、その場合、他に記載しないかぎり全ての割合及びパーセンテージは重量により、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、例示のためにのみ示されることを理解すべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲からそれずに、様々な使用及び条件に本発明を適合させるためにその様々な変更及び改変を実施することができる。実施例１エシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子の単離及びリシン非感受性のＡＫIII をもたらすｌｙｓＣの突然変異エシェリキア・コリｌｙｓＣ遺伝子は以前にクローン化され、制限エンドヌクレアーゼ地図が作製され、シークエンスされている［Ｃａｓｓａｎ等（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０５２−１０５７］。本発明のために、Ｋｏｈａｒａ、Ａｋｉｙａｍａ及びＩｓｏｎｏ［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］により構築されたクローン化エシェリキア・コリＤＮＡの３４００の重複するセグメントの規則ライブラリーからバクテリオファージラムダクローン上でｌｙｓＣ遺伝子を得た。このライブラリーは全エシェリキア・コリ染色体の物理的地図を与え、物理的地図を遺伝子地図に結びつける。エシェリキア・コリ遺伝子地図上の９０分のｌｙｓＣの地図位置［Ｔｈｅｚｅ等（１９７４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７：１３３−１４３］、クローン化された遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地図［Ｃａｓｓａｎ等（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０５２−１０５７］及びエシェリキア・コリライブラリーのクローン化ＤＮＡフラグメントの制限エンドヌクレアーゼ地図［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］が分かると、ｌｙｓＣ遺伝子を保有すると思われる候補としてラムダファージ４Ｅ５及び７Ａ４［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］を選択することが可能であった。宿主としてＬＥ３９２を用いて記述されたように［ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＮｅｗＹｏｒｋを参照］単一プラークから液体培養でそれらのファージを増殖させた［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照］。記述されたように［［ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＮｅｗＹｏｒｋを参照］フェノール抽出によりファージＤＮＡを調製した。遺伝子の配列から、１８６０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメント、２１４０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩフラグメント及び１６００ｂｐＥｃｏＲＩ− ＢａｍＨＩフラグメントを初めとするｌｙｓＣ遺伝子に特徴的ないくつかの制限エンドヌクレアーゼフラグメントが予測された。これらのフラグメントの各々はファージＤＮＡの両方で検出され、これらがｌｙｓＣ遺伝子を保有することを裏付けた。ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメントを単離し、同じ酵素で消化したプラスミドｐＢＲ３２２中にサブクローン化し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性のエシェリキア・コリ形質転換体を得た。そのプラスミドをｐＢＴ４３６と称した。クローン化されたｌｙｓＣ遺伝子が機能的であることを確立するために、３つのエシェリキア・コリＡＫ遺伝子の各々に突然変異を有する［Ｔｈｅｚｅ等（１９７４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７：１３３−１４３］エシェリキア・コリ株Ｇｉｆ１０６Ｍ１（Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ株ＣＧＳＣ−５０７４）中にｐＢＴ４３６を形質転換した。この株は全てのＡＫ活性を欠き、それ故、ジアミノピメレート（細胞壁生合成のためにも必須であるリシンへの前駆体）、トレオニン及びメチオニンを必要とする。形質転換された株では、全てのこれらの栄養要求が除かれ、クローンされたｌｙｓＣ遺伝子が機能的ＡＫIIIをコードすることを示した。増殖培地への約０．２ｍＭの濃度のリシン（またはインビボでリシンに容易に転化されるジアミノピメレート）の添加は、ｐＢＴ４３６で形質転換されたＧｉｆ１０６Ｍ１の増殖を阻害する。Ｇｉｆ１０６Ｍ１の増殖のために必要な、アルギニン及びイソロイシンを補足したＭ９培地［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照］並びにｐＢＴ４３６プラスミドの選択を維持するためにアンピシリンを用いた。この阻害は増殖培地へのトレオニン及びメチオニンの添加により取り消される。これらの結果から、外部から添加したリシンによりＡＫIIIを阻害することができ、アスパルテートに由来する他のアミノ酸の飢餓状態をもたらすことが示された。リシン非感受性のＡＫIIIをコードするｌｙｓＣの突然変異を選択するためにｐＢＴ４３６で形質転換されたＧｉｆ１０６Ｍ１のこの特性を用いた。ｐＢＴ４３６で形質転換されたＧｉｆ１０６Ｍ１の単一コロニーを選択し、１００μｌの１％リシン及び１００μｌのＭ９培地の混合物２００μｌ中に再懸濁した。１０⁷−１０⁸細胞を含有する全細胞懸濁液をアルギニン、イソロイシン及びアンピシリンを補足したＭ９培地を含有するペトリ皿上に広げた。このようにして１６枚のペトリ皿を調製した。１６枚のうち１１枚のペトリ皿で１個から２０個までのコロニーが生じた。１個または２個（使用できる場合）のコロニーを選択し、リシン耐性に関して再試験し、これから９個のリシン耐性クローンを得た。これらのうちの８個からプラスミドＤＮＡを調製し、リシン耐性遺伝子がプラスミドで運ばれるかどうかを決定するためにＧｉｆ１０６Ｍ１中に再形質転換した。８つのうち６つのプラスミドＤＮＡがリシン耐性コロニーを生じた。これら６つのうち３つが１５ｍＭのリシンにより阻害されないＡＫIIIをコードするｌｙｓＣ遺伝子を保有し、一方、野生型ＡＫIIIは０．３−０．４ｍＭリシンで５０％阻害され、１ｍＭリシンで＞９０％阻害される（詳細は実施例２を参照）。リシン耐性の分子的基礎を決定するために、野生型ｌｙｓＣ遺伝子及び３つの突然変異体遺伝子の配列を決定した。”Ｕｓｉｎｇｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｔｅｍｐｌａｔｅｓｗｉｔｈＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TM”［Ｋｒａｆｔ等（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：５４４−５４５］の方法を用いた。シークエンシングを容易にするために、公開されたｌｙｓＣ配列に基づき且つ約２００ｂｐ毎の間隔で配置されたオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ｐＢＴ４３６中にクローン化された野生型ｌｙｓＣ遺伝子の配列（配列番号：１）はコーディング領域において５個の位置で公開されたｌｙｓＣ配列と異なった。これらのヌクレオチドの違いのうち４つはコドンの３番目の位置であり、ＡＫIIIタンパク質のアミノ酸配列に変異をもたらさない。違いの１つはＡＫIIIのアミノ酸５８でシステイン→グリシン置換をもたらす。これらの違いはおそらくｌｙｓＣ遺伝子をクローン化した異なる株のためである。リシン非感受性ＡＫをコードする３つの突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子の配列は各々野生型配列と単一ヌクレオチドで異なり、タンパク質において単一アミノ酸置換をもたらす。突然変異体Ｍ２は配列番号：１のヌクレオチド９５４でＧの代わりに置換されたＡを有し、アミノ酸３１８でメチオニンの代わりにイソロイシンの置換をもたらし、突然変異体Ｍ３及びＭ４は配列番号：１のヌクレオチド１０５５でＣの変わりに同一のＴ置換を有し、アミノ酸３５２でトレオニンの代わりにイソロイシンの置換をもたらす。従って、これらの単一アミノ酸置換のいずれもＡＫIII酵素をリシン阻害に非感受性にするために十分である。実施例２エシェリキア・コリにおける野生型及び突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子の高レベル発現以下のオリゴヌクレオチド：を用いてｌｙｓＣ遺伝子の翻訳開始コドンでＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）部位を挿入した。アニーリングするとこれらのオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ及びＡｓｐ７１８「付着」末端を有する。ｌｙｓＣコーディング配列の上流で切断するＢａｍＨＩ及び開始コドンの３１ヌクレオチド下流で切断するＡｓｐ７１８でプラスミドｐＢＴ４３６を消化した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドをプラスミドベクターに連結し、エシェリキア・コリ形質転換体を得た。プラスミドＤＮＡを調製し、ＮｃｏＩ部位の存在に基づいてオリゴヌクレオチドの挿入に関してスクリーニングした。挿入が正しいことを確かめるためにその部位を含有するプラスミドをシークエンスし、ｐＢＴ４５７と称した。ｌｙｓＣの開始コドンにＮｃｏＩ部位を生じることに加えて、このオリゴヌクレオチド挿入は２番目のコドンをセリンをコードするＴＣＴからアラニンをコードするＧＣＴに変えた。このアミノ酸置換はＡＫIII酵素活性に対して明らかな影響をもたない。エシェリキア・コリにおいてｌｙｓＣ遺伝子の高レベル発現を得るために、バクテリア発現ベクターｐＢＴ４３０を用いた。このベクターはバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を用いるｐＥＴ−３ａ［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等（１９８７）Ｇｅｎｅ５６：１２５−１３５］の誘導体である。まず、ｐＥＴ−３ａ中のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII部位をそれらの元の位置で壊すことによりプラスミドｐＢＴ４３０を構築した。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ III部位を含有するオリゴヌクレオチドアダプターをｐＥＴ−３ａのＢａｍＨＩ部位で挿入した。これにより発現ベクターへの遺伝子の挿入のためのさらなる唯一のクローニング部位を有するｐＥＴ−３ａＭが作製された。次に、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて翻訳開始の位置のＮｄｅＩ部位をＮｃｏＩ部位に転化した。この領域のｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配列、５’−ＣＡＴＡＴＧＧをｐＢＴ４３０において５’−ＣＣＣＡＴＧＧに転化した。ｌｙｓＣ遺伝子をプラスミドｐＢＴ４５７から１５６０ｂｐＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出し、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＢＴ４３０中に挿入し、プラスミドｐＢＴ４６１を生ぜしめた。突然変異体ｌｙｓＣ遺伝子（Ｍ２、Ｍ３及びＭ４）の発現のために、ｐＢＴ４６１をＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、それは翻訳開始コドンから約３０ヌクレオチド下流から野生型ｌｙｓＣ遺伝子を取り除き、そして突然変異体遺伝子から相同なＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入し、それぞれｐＢＴ４９０、ｐＢＴ４９１及びｐＢＴ４９２を生ぜしめた。高レベル発現のために、それらのプラスミドの各々をエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｓｔｕｄｉｅｒ等（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０］中に形質転換した。培養物をアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地中２５℃で増殖させた。６００ｎｍで約１の光学密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）を０．４ｍＭの最終濃度に添加し、インキュベーションを２５℃で３時間続けた。細胞を遠心分離により集め、５０ｍＭＮａＣｌ；５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭＥＤＴＡ中に元の培養容量の１／２０（または１／１００）で再懸濁し、 −２０℃で冷凍した。１ｍＬの冷凍したアリコートを３７℃で融解し、氷水浴中で超音波処理し、細胞を溶解した。ライセートを４℃で１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除き、ペレットを１ｍｌの上記のバッファー中に再懸濁した。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ４６１の非誘導及びＩＰＴＧ誘導培養物の上清及びペレット画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。誘導培養物の上清中のクーマシーブルー染色により見ることができる主要なタンパク質は、ＡＫIIIに対して予想される大きさの約４８ｋｄの分子量を有した。ＡＫI IIタンパク質の約８０％が上清中にあり、ＡＫIIIは抽出物中の全エシェリキア・コリタンパク質の１０−２０％に相当した。ＡＫ活性を以下に示すようにアッセイした：アッセイミックス（１２アッセイチューブ用）４．５ｍＬＨ₂Ｏ１．０ｍＬ８ＭＫＯＨ１．０ｍＬ８ＭＮＨ₂ＯＨ−ＨＣｌ１．０ｍＬ１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．００．５ｍＬ０．２ＭＡＴＰ（０．２ＭＮａＯＨ中１２１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬ１ＭＭｇＳＯ₄ 各１．５ｍＬエッペンドルフアッセイチューブは：０．６４ｍＬアッセイミックス０．０４ｍＬ０．２ＭＬ−アスパラギン酸または０．０４ｍＬＨ₂Ｏ０．０００５−０．１２ｍＬ抽出物Ｈ₂Ｏ全容量０．８ｍＬまでを含有した。アッセイチューブを３０℃で適切な時間（１０−６０分）の間インキュベートした。次に、０．４ｍＬのＦｅＣｌ₃試薬（１０％ｗ／ｖＦｅＣｌ₃、３．３％トリクロロ酢酸、０．７ＭＨＣｌ、を添加し、材料をエッペンドルフ遠心機で２分間遠心分離した。上清をデカントした。ＯＤを５４０ｎｍで読み取り、アスパルチルーヒドロキサメート基準と比較した。ＡＫIII活性の約８０％が上清画分中にあった。野生型及び突然変異体粗抽出物の比活性は５−７μＭ生成物／分／ｍｇ全タンパク質であった。野生型ＡＫII IはアッセイにおいてＬ−リシンの存在に感受性であった。約０．４ｍＭの濃度で５０％阻害が、そして約１．０ｍＭで９０％阻害が見られた。それに反して、突然変異体ＡＫIII−Ｍ２、Ｍ３及びＭ４（実施例１参照）は１５ｍＭのＬ−リシンにより全く阻害されなかった。野生型ＡＫIIIタンパク質をＩＰＴＧ誘導培養物の上清から以下のように精製した。１ｍＬの抽出物に、０．２５ｍＬの１０％ストレプトマイシン硫酸塩を添加し、４℃で一晩保った。混合物を４℃で１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を集め、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｍカラム（ＣｏｌｕｍｎＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩した。次に、それをモノ（Ｍｏｎｏ）−ＱＨＰＬＣカラムに流し、０−１ＭＮａＣｌ勾配で溶出した。ＡＫIII活性の大部分を含有する２つの１ｍＬ画分をプールし、濃縮し、脱塩し、ＨＰＬＣサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラム（ＴＳＫＧ３０００ＳＷ）に流した。２０ｍＭＫＰＯ₄バッファー、ｐＨ７．２、２ｍＭＭｇＳＯ₄、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１５ＭＫＣｌ、０．５ｍＭＬ−リシン中に画分を溶出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により＞９５％純粋であることが見いだされた。タンパク質に対してウサギ抗体を作製するために、精製されたＡＫIIIタンパク質をＨａｚｅｌｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＦａｃｉｌｉｔｙ（３１０ＳｗａｍｐｒｉｄｇｅＲｏａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ１７５１７）に送った。実施例３エシェリキア・コリ及びコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｄａｐＡ遺伝子の単離エシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子（ｅｃｏｄａｐＡ）は以前にクローン化され、制限エンドヌクレアーゼ地図が作製され、シークエンスされている［Ｒｉｃｈａｕｄ等（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２９７−３００］。本発明のために、Ｋｏｈａｒａ、Ａｋｉｙａｍａ及びＩｓｏｎｏにより構築されたクローン化エシェリキア・コリＤＮＡの３４００の重複するセグメントの規則ライブラリーからバクテリオファージラムダクローン上でｄａｐＡ遺伝子を得た［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８、実施例１参照］。エシェリキア・コリ遺伝子地図上の５３分のｄａｐＡの地図位置［Ｂａｃｈｍａｎ等（１９８３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７：１８０−２３０］、クローン化された遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地図［Ｒｉｃｈａｕｄ等（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２９７−３００］及びエシェリキア・コリライブラリーのクローン化ＤＮＡフラグメントの制限エンドヌクレアーゼ地図［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］が分かると、ｄａｐＡ遺伝子を保有すると思われる候補としてラムダファージ４Ｃ１１及び５Ａ８［Ｋｏｈａｒａ等（１９８７）Ｃｅｌｌ５０：５９５−５０８］を選択することが可能であった。宿主としてＬＥ３９２を用いて記述されたように［ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＮｅｗＹｏｒｋを参照］単一プラークから液体培養でそれらのファージを増殖させた［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照］。記述されたように［ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＮｅｗＹｏｒｋを参照］フェノール抽出によりファージＤＮＡを調製した。両方のファージはｄａｐＡ遺伝子に対して予想される約２．８ｋｂＰｓｔＩＤＮＡフラグメントを含有した［Ｒｉｃｈａｕｄ等（１９８６）Ｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２９７−３００］。そのフラグメントをファージ５Ａ８の消化産物から単離し、ＰｓｔＩ消化したベクターｐＢＲ３２２中に挿入してプラスミドｐＢＴ４２７を生ぜしめた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＡＴＣＣ株１３０３２からのゲノムＤＮＡからコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子（ｃｏｒｄａｐＡ）を単離した。コリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列は公開されている［Ｂｏｎｎａｓｓｉｅ等（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：６４２１］。遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを増幅させ、同時に遺伝子の開始コドン（ＮｃｏＩ）及び終止コドンのすぐ後ろ（ＥｃｏＲＩ）で唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を付加するＰＣＲのオリゴヌクレオチドプライマーをその配列から設計することが可能であった。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは：であった。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓキットを販売業者の説明書に従って用いて同じ会社により製造されたサーモサイクラーでＰＣＲを実施した。反応産物をアガロースゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色すると、それはコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子に対して予想される大きさの約９００ｂｐの強いＤＮＡバンドを示した。ＰＣＲにより作製されたフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＢＴ４３０（実施例２参照）中に挿入した。翻訳開始コドンでＮｃｏｌ部位を導入することに加えて、ＰＣＲプライマーはセリンをコードするＡＧＣからアラニンをコードするＧＣＴに２番目のコドンの変異ももたらした。活性のあるリシン非感受性ＤＨＤＰＳを発現するいくつかのクローンが単離され（実施例４参照）；２番目のコドンアミノ酸置換が活性に影響を及ぼさないことが示され；１個のクローンをＦＳ７６６と称した。ＰＣＲにより作製されたコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子を保有するＮｃｏＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメントをＰｒｏｍｅｇａからのファージミドベクターｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）中にサブクローン化し、一本鎖ＤＮＡを調製し、シークエンスした。この配列を配列番号：６に示す。すでに記述した２番目のコドンの違いは別にして、その配列は２つの位置、ヌクレオチド７９８及び７９９を除いて公開された配列と一致した。公開された配列ではこれらはＴＣであり、一方、配列番号：６に示される遺伝子ではそれらはＣＴである。この変異はセリンの代わりにロイシンのアミノ酸置換をもたらす。この違いの理由は分からない。それは公開された配列の誤り、遺伝子を単離するために用いた株の違いまたはＰＣＲにより生成された誤りによる可能性がある。同じ変異が少なくとも３つの独立して単離されたＰＣＲにより作製されたｄａｐＡ遺伝子において見られたので最後のものは疑わしいと思われる。その違いはＤＨＤＰＳ酵素活性に対して明らかな影響をもたない（実施例４参照）。実施例４エシェリキア・コリにおけるエシェリキア・コリ及びコリネバクテリウム・グルタミカムｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いてエシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子の翻訳開始コドンにＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）部位を挿入した。プラスミドｐＢＴ４２７中のｄａｐＡ遺伝子を保有する２．８ｋｂＰｓｔＩＤＮＡフラグメント（実施例３参照）をファージミドベクターｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＰｓｔＩ部位に挿入してｐＢＴ４３１を生ぜしめた。ｄａｐＡ遺伝子の方向は、コーディング鎖が一本鎖ファージミドＤＮＡ上に存在するようにであった。以下に示す突然変異誘発プライマー：でＢｉｏ−ＲａｄからのＭｕｔａ−Ｇｅｎｅキットを製造業者のプロトコルに従って用いてオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を実施した。突然変異体と考えられるものをＮｃｏＩ部位の存在に関してスクリーニングし、ＤＮＡシークエンシングによりｐＢＴ４３７と称するプラスミドが突然変異の近くに適切な配列を有することが示された。また、翻訳開始コドンでのＮｃｏＩ部位の付加は、フェニルアラニンをコードするＴＴＣからバリンをコードするＧＴＣへの２番目のコドンの変異ももたらした。エシェリキア・コリにおいてｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現を得るためにバクテリア発現ベクターｐＢＴ４３０（実施例２参照）を用いた。エシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子をプラスミドｐＢＴ４３７から１１５０ｂｐＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして切り出し、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＢＴ４３０中に挿入し、プラスミドｐＢＴ４４２を生ぜしめた。コリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子の発現のためには、ｐＢＴ４３０中に挿入された配列番号：６の９１０ｂｐＮｃｏＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメント（ｐＦＳ７６６、実施例３参照）を用いた。高レベル発現のために、各々のプラスミドをエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｓｔｕｄｉｅｒ等（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０］中に形質転換した。培養物を２５℃でアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地中で増殖させた。６００ｎｍで約１の光学密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）を０．４ｍＭの最終濃度に添加し、インキュベーションを２５℃で３時間続けた。細胞を遠心分離により集め、５０ｍＭＮａＣｌ；５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭＥＤＴＡ中に最初の培養容量の１／２０（または１／１００）で再懸濁し、−２０℃で凍結した。１ｍＬの凍結したアリコートを３７℃で融解し、氷水浴中で超音波処理し、細胞を溶解した。ライセートを４℃で１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除き、ペレットを１ｍｌの上記のバッファー中に再懸濁した。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ４４２またはＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＦＳ７６６の非誘導及びＩＰＴＧ誘導培養物の上清及びペレット画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。両方の誘導培養物の上清及びペレット画分中のクーマシーブルー染色により見える主要なタンパク質は、ＤＨＤＰＳに対して予想される大きさの３２−３４ｋｄの分子量を有した。非誘導培養物中でさえこのタンパク質は生産される最も顕著なタンパク質であった。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ４４２ＩＰＴＧ誘導培養物では、ＤＨＤＰＳタンパク質の約８０％が上清中にあり、ＤＨＤＰＳは抽出物中の全タンパク質の１０−２０％に相当した。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＦＳ７６６ＩＰＴＧ誘導培養物では、５０％より多くのＤＨＤＰＳタンパク質がペレット画分中にあった。両方の場合でペレット画分は９０−９５％純粋なＤＨＤＰＳであり、他の単一タンパク質は顕著な量で存在しなかった。従って、これらの画分は抗体の作製に用いるために十分に純粋であった。２−４ｍｇのエシェリキア・コリＤＨＤＰＳまたはコリネバクテリアＤＨＤＰＳのいずれかを含有するペレット画分を５０ｍＭＮａＣｌ；５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭＥＤＴＡ、０．２ｍＭジチオトレイトール、０．２％ＳＤＳ中に可溶化し、それらのタンパク質に対してウサギ抗体を作製するためにＨａｚｅｌｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＦａｃｉｌｉｔｙ（３１０ＳｗａｍｐｒｉｄｇｅＲｏａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ１７５１７）に送った。ＤＨＤＰＳ酵素活性を以下のようにアッセイした：アッセイミックス（１０ｘ１．０ｍＬアッセイチューブ用またはマイクロタイター皿用４０ｘ０．２５ｍＬ）；使用直前に新しく作製する：２．５ｍＬＨ₂Ｏ０．５ｍＬ１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．００．５ｍＬ０．２Ｍピルビン酸Ｎａ０．５ｍＬｏ−アミノベンズアルデヒド（エタノール中１０ｍｇ／ｍＬ）２５μＬ１．０ＮＨＣｌ中１．０ＭＤＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ）−β−セミアルデヒド（ＡＳＡ）アッセイマイクロアッセイ（１．０ｍＬ）：（０．２５ｍＬ）：ＤＨＤＰＳアッセイミックス０．４０ｍＬ０．１０ｍＬ酵素抽出物＋Ｈ₂Ｏ；０．１０ｍＬ．０２５ｍＬ１０ｍＭＬ−リシン５μＬまたは２０μＬ１μＬまたは５μＬ３０℃で適切な時間インキュベートする。１．０ＮＨＣｌ０．５０ｍＬ０．１２５ｍＬの添加により停止する。３０−６０分間発色させる。エッペンドルフ遠心機で沈殿物を落とす。０分に対するＯＤ₅₄₀をブランクとして読み取る。マイクロアッセイには、０．２ｍＬをマイクロタイターウェルに等分し、ＯＤ₅₃₀で読み取る。誘導抽出物の上清画分中のエシエリキア・コリＤＨＤＰＳの比活性は１．０ｍＬアッセイにおいて約５０ＯＤ₅₄₀ユニット／分／ｍｇタンパク質であった。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳはアッセイにおけるＬ−リシンの存在に感受性であった。約０．５ｍＭの濃度で５０％阻害が見られた。コリネバクテリアＤＨＤＰＳでは、誘導抽出物よりむしろ非誘導抽出物の上清画分中で活性が測定された。酵素活性は０．２５ｍＬアッセイにおいて約４ＯＤ₅₃₀ユニット／分／ｍｇタンパク質であった。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳと対照的に、コリネバクテリアＤＨＤＰＳは７０ｍＭの濃度でさえＬ−リシンで全く阻害されなかった。実施例５高レベルのＤＨＤＰＳ及び／またはＡＫIIIを発現するエシェリキア・コリによるアミノ酸の分泌ｐＢＴ４４２（実施例４参照）をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約１２５０ｂｐフラグメントをゲルから溶出することによりＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに連結されたエシェリキア・コリｄａｐＡ遺伝子を有するエシェリキア・コリ発現カセットを単離した。このフラグメントを（Ｔ７プロモーター／ｌｙｓＣ遺伝子を含有する）プラスミドｐＢＴ４６１及び（Ｔ７プロモーター／ｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子を含有する）ｐＢＴ４９２のＢａｍＨＩ部位に挿入した。両方の遺伝子の転写が同じ向きであるインサートを制限エンドヌクレアーゼ分析により同定し、プラスミドｐＢＴ５１７（Ｔ７／ｄａｐＡ＋Ｔ７／ｌｙｓＣ−Ｍ４）及びｐＢＴ５１９（Ｔ７／ｄａｐＡ＋Ｔ７／ｌｙｓＣ）を生ぜしめた。エシェリキア・コリにアミノ酸を生産させ、分泌させるために、これらのプラスミド並びにプラスミドｐＢＴ４４２、ｐＢＴ４６１及びｐＢＴ４９２（及びコントロールとしてｐＢＲ３２２）をエシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｓｔｕｄｉｅｒ等（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３ −１３０］中に形質転換した。これらのプラスミドの全てであるが、特にｐＢＴ５１７及びｐＢＴ５１９はこの宿主株においていくぶん不安定であり、増殖中にアンピシリン耐性の選択を注意深く続ける必要がある。プラスミドの選択を続けるためにアンピシリンを補足した最少塩類Ｍ９培地［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照］で全ての株を３７℃で一晩増殖させた。培養物が１のＯＤ₆₀₀に達するとそれらを集めた。細胞を遠心分離により除き、上清（３ｍＬ）を０．２ミクロンフィルターに通して残っている細胞及び巨大分子を除いた。上清画分の５μｌアリコートをカラム後のニヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析器でアミノ酸組成に関して分析した。結果を表１に示す。表１培養上清中のアミノ酸濃度［ｍＭ］ｐＢＲ３２２コントロールを除いた全てのプラスミドが培養培地中へのリシンの分泌をもたらした。ｌｙｓＣまたはｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子の発現はリシン及びトレオニンの両方の分泌をもたらした。ｌｙｓＣ−Ｍ４＋ｄａｐＡの発現はリシン、メチオニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸の分泌をもたらすが、トレオニンの分泌はもたらさなかった。さらに、アラニン及びバリンは培養上清中に検出されなかった。グルタミン酸が分泌されなかったことを除いて、同様な結果がｌｙｓＣ＋ｄａｐＡで得られた。実施例６植物における発現のためのキメラｄａｐＡ、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＣ− Ｍ４遺伝子の構築植物におけるｅｃｏｄａｐＡ、ｃｏｒｄａｐＡ、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＣ−Ｍ４の発現のためのキメラ遺伝子の構築のためにいくつかの遺伝子発現カセットを用いた。葉発現カセット（図４ａ）はカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター［Ｏｄｅｌｌ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８６：４８２−４９３］、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）遺伝子からの翻訳リーダー［Ｄｕｎｓｍｕｉｒ（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：２５０３−２５１８］及びノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）遺伝子からの３’転写終結領域［Ｄｅｐｉｃｋｅｒ等（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１− ５７０］からなる。５’及び３’領域の間には制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ及びＫｐｎＩがある。カセット全体にはＳａｌＩ部位が隣接し；カセットの上流にはＢａｍＨＩ部位もある。種子特異的発現カセット（図４ｂ）はマメのファゼオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）からの種子貯蔵タンパク質ファゼオリンの β−サブユニットをコードする遺伝子からのプロモーター及び転写ターミネーター［Ｄｏｙｌｅ等（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８］からなる。ファゼオリンカセットはファゼオリンの翻訳開始コドンから上流（５’）の約５００ヌクレオチド及び翻訳終止コドンから下流（３’）の約１６５０ヌクレオチドを含む。５’及び３’領域の間には制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）ＮｃｏＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩがある。カセット全体にはＨｉｎｄIII部位が隣接している。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子にはもう一つの種子発現カセットを用いた。これはダイズクニッツ型チロシンインヒビター３（ＫＴＩ３）遺伝子からのプロモーター及び転写ターミネーター［Ｊｏｆｕｋｕ等（１９８９）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１：４２７−４３５］から構成された。ＫＴＩ３カセットはファゼオリンの翻訳開始コドンから上流（５’）の約２０００ヌクレオチド及び翻訳終止コドンから下流（３’）の約２４０ヌクレオチドを含む。５’及び３’領域の間には唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩがある。カセット全体にはＢａｍＨＩ部位が隣接している。ｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子及びｅｃｏｄａｐＡ遺伝子の発現のためにはトウモロコシの構成的発現カセットを用いた。それは、２つのトウモロコシプロモーターの一部に由来し且つ高レベルの構成的プロモーターを生成するようにインビトロ部位特異的突然変異誘発により改変されたキメラプロモーター及び未知の機能のトウモロコシ遺伝子からの３’領域からなった。５’及び３’領域の間には唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）ＮｃｏＩ、ＳｍａＩ及びＢｇｌIIがある。構成的トウモロコシ発現カセットのヌクレオチド配列を配列番号：９３に示す。植物アミノ酸生合成酵素は葉緑体に局在化されることが知られており、それ故、葉緑体ターゲッティングシグナルを有して合成される。ＤＨＤＰＳ及びＡＫII Iのようなバクテリアタンパク質はそのようなシグナルをもたない。それ故、いくつかのキメラ遺伝子のｅｃｏｄａｐＡ、ｃｏｒｄａｐＡ、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＣ −Ｍ４コーディング配列に葉緑体移行配列（ｃｔｓ）を融合した。用いたｃｔｓはダイズからのリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのｃｔｓに基づいた［Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ等（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４８３−４９８］。オリゴヌクレオチド配列番号：８ −１１を合成し、以下に記述するように用いた。トウモロコシでは、用いたｃｔｓはトウモロコシからのリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのｃｔｓに基づき［Ｌｅｂｒｕｎ等（１９８７）ＮｕｃｌｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：４３６０］、ダイズｃｔｓとそれを区別するためにｍｃｔｓと称する。オリゴヌクレオチド配列番号：１７−２２を合成し、以下に記述するように用いた。１４のキメラ遺伝子を作製した：番号１）３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’番号２）３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’ 番号３）３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’ 番号４）ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／ファゼオリン３’領域番号５）ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域番号６）３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’ 番号７）３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’ 番号８）ファゼオリン５’領域／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域番号９）ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域番号１０）３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’ 番号１１）ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’ 領域番号１２）ＫＩＴ３５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＫＩＴ３３’領域番号１３）ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＨＨ２−１３’ 領域番号１４）ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ＨＨ２ −１３’領域全ｌｙｓＣコーディング領域及び約９０ｂｐの３’非コーディング配列を含有する１４４０ｂｐＮｃｏＩ−ＨｐａＩフラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化した葉発現カセット中に挿入し（キメラ遺伝子番号１）、プラスミドｐＢＴ４８３を生ぜしめた。葉緑体ターゲッティングシグナルのカルボキシ末端部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：８及び配列番号：９をアニーリングさせ、ＮｃｏＩ適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＮｃｏＩ消化したｐＢＴ４６１中に挿入した。正しい方向の正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ４９６を生ぜしめた。葉緑体ターゲッティングシグナルのアミノ末端部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：１０及び配列番号：１１をアニーリングさせ、ＮｃｏＩ適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＮｃｏＩ消化したｐＢＴ４９６中に挿入した。正しい方向の正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ５２１を生ぜしめた。このようにしてｃｔｓをｌｙｓＣ遺伝子に融合した。ｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子にｃｔｓを融合するために、ｐＢＴ５２１をＳａｌＩで消化し、ｃｔｓ及びｌｙｓＣのアミノ末端のコーディング領域を含む約９００ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントをＳａｌＩ消化したｐＢＴ４９２中に挿入し、ｌｙｃＣ−Ｍ４のアミノ末端のコーディング領域を融合したｃｔｓ及びｌｙｓＣのアミノ末端のコーディング領域で効果的に置き換えた。リシン非感受性をもたらす突然変異は置換されたフラグメント中にないので、新しいプラスミド、ｐＢＴ５２３はｌｙｓＣ−Ｍ４に融合したｃｔｓを保有した。ｌｙｓＣに融合したｃｔｓ及び約９０ｂｐの３’非コーディング配列を含有する１６００ｂｐＮｃｏＩ−ＨｐａＩフラグメントを単離し、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化した葉発現カセットに挿入して（キメラ遺伝子番号２）プラスミドｐＢＴ５４１を生ぜしめ、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化した種子特異的発現カセットに挿入して（キメラ遺伝子番号４）プラスミドｐＢＴ５４３を生ぜしめた。同様に、ｌｙｓＣ−Ｍ４に融合したｃｔｓ及び約９０ｂｐの３’非コーディング配列を含有する１６００ｂｐＮｃｏＩ−ＨｐａＩフラグメントを単離し、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化した葉発現カセットに挿入して（キメラ遺伝子番号３）プラスミドｐＢＴ５４０を生ぜしめ、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化した種子特異的発現カセットに挿入して（キメラ遺伝子番号５）プラスミドｐＢＴ５４４を生ぜしめた。発現カセットへの挿入前に、翻訳終止コドンのすぐ後に制限エンドヌクレアーゼ部位、ＫｐｎＩを挿入するようにｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を改変した。この目的のために、オリゴヌクレオチド配列番号：１２−１３を合成した：オリゴヌクレオチド配列番号：１２及び配列番号：１３をアニーリングさせ、一方の末端にＳｐｈＩ適合末端をそしてもう一方にＨｉｎｄIII適合末端を生成し、ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄIII消化したｐＢＴ４３７に挿入した。正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ４４３を生ぜしめた。全ｅｃｏｄａｐＡコーディング領域を含有するｐＢＴ４４３からの８８０ｂｐＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化した葉発現カセットに挿入して（キメラ遺伝子番号６）プラスミドｐＢＴ４５０を生ぜしめ、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化した種子特異的発現カセットに挿入して（キメラ遺伝子番号８）プラスミドｐＢＴ４９４を生ぜしめた。葉緑体ターゲッティングシグナルのカルボキシ末端部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：８及び配列番号：９をアニーリングさせ、ＮｃｏＩ適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＮｃｏＩ消化したｐＢＴ４５０に挿入した。正しい方向の正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ４５１を生ぜしめた。全ｅｃｏｄａｐＡコーディング領域に融合した葉緑体ターゲッティングシグナルのカルボキシ末端部分をコードするｐＢＴ４５１からの９５０ｂｐＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化した種子特異的発現カセットに挿入し、プラスミドｐＢＴ４９５を生ぜしめた。葉緑体ターゲッティングシグナルのアミノ末端部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：１０及び配列番号：１１をアニーリングさせ、ＮｃｏＩ適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＮｃｏＩ消化したｐＢＴ４５１及びｐＢＴ４９５に挿入した。正しい方向の正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、それぞれｐＢＴ４５５及びｐＢＴ５２０を生ぜしめた。このようにして葉発現カセット（キメラ遺伝子番号７）及び種子特異的発現カセット（キメラ遺伝子番号９）においてｃｔｓをｅｃｏｄａｐＡ遺伝子に融合した。全ｃｏｒｄａｐＡコーディング領域を含有するｐＦＳ７６６からの８７０ｂｐＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した葉発現カセットに挿入し、プラスミドｐＦＳ７８９を生ぜしめた。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子にｃｔｓを結合するために、全ｃｔｓを含有するＤＮＡフラグメントをＰＣＲを用いて調製した。鋳型ＤＮＡはｐＢＴ５４０であり、用いたオリゴヌクレオチドプライマーは：であった。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓキットを販売業者の説明書に従って用いて同じ会社により製造されたサーモサイクラーでＰＣＲを実施した。ＰＣＲにより作製した１６０ｂｐフラグメントを４種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸の存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端フラグメントを得た。ＮｃｏＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントで処理して５’突出を埋めたｐＦＳ７８９にｃｔｓフラグメントを挿入した。挿入されたフラグメント及びベクター／インサート連結が正しいことをＤＮＡシークエンシングにより確かめ、キメラ遺伝子番号１０を含有するｐＦＳ８４６を生ぜしめた。ｃｏｒｄａｐＡコーディング領域に結合したｃｔｓを含有するｐＦＳ８４６からの１０３０ｂｐＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化したファゼオリン種子発現カセットに挿入し、キメラ遺伝子番号１１を含有するプラスミドｐＦＳ８８９を生ぜしめた。同様に、ｐＦＳ８４６からの１０３０ｂｐＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントをＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化したＫＴＩ３種子発現カセットに挿入し、キメラ遺伝子番号１２を含有するプラスミドｐＦＳ８６２を生ぜしめた。トウモロコシ葉緑体ターゲッティングシグナルのカルボキシ末端部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：９４及び配列番号：９５をアニーリングさせ、ＸｂａＩ及びＮｃｏＩ適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＸｂａＩ及びＮｃｏＩ消化したｐＢＴ４９２に挿入した（実施例２参照）。正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ５５６を生ぜしめた。葉緑体ターゲッティングシグナルの中央部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：９６及び配列番号：９７をアニーリングさせ、ＢｇｌII及びＸｂａＩ適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＢｇｌII及びＸｂａＩ消化したｐＢＴ５５６に挿入した。正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ５５７を生ぜしめた。葉緑体ターゲッティングシグナルのアミノ末端部分をコードするオリゴヌクレオチド配列番号：９８及び配列番号：９９をアニーリングさせ、ＮｃｏＩ及びＡｆｌII適合末端をもたらし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ＮｃｏＩ及びＡｆｌII消化したｐＢＴ５５７に挿入した。正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ５５８を生ぜしめた。このようにしてｍｃｔｓをｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子に融合した。ｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子に結合したｍｃｔｓを含有するｐＢＴ５５８からの１．６ｋｂＮｃｏＩ−ＨｐａＩフラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離し、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化した構成的トウモロコシ発現カセットに挿入し、キメラ遺伝子番号１３を含有するプラスミドｐＢＴ５７３を生ぜしめた。ｅｃｏｄａｐＡ遺伝子にｍｃｔｓを結合するために、全ｍｃｔｓを含有するＤＮＡフラグメントを上記のようにＰＣＲを用いて調製した。鋳型ＤＮＡはｐＢＴ５５８であり、用いたオリゴヌクレオチドプライマーは：であった。ＮｃｏＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して５ ’突出を埋めたｐＢＴ４５０（上記）にｍｃｔｓフラグメントを挿入した。挿入されたフラグメント及びベクター／インサート連結が正しいことをＤＮＡシークエンシングにより確かめ、ｐＢＴ５７６を生ぜしめた。プラスミドｐＢＴ５７６をＡｓｐ７１８で消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して平滑末端フラグメントを生ぜしめ、次に、ＮｃｏＩで消化した。得られたｍｃｔｓに結合したｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を含有する１０３０ｂｐＮｃｏＩ−平滑末端フラグメントを電気泳動後にアガロースゲルから単離した。ＢｇｌIIで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して平滑末端フラグメントを生ぜしめ、次に、ＮｃｏＩで消化した構成的トウモロコシ発現カセットにこのフラグメントを挿入し、キメラ遺伝子番号１４を含有するプラスミドｐＢＴ５８３を生ぜしめた。実施例７３５Ｓプロモーター／ｌｙｓＣキメラ遺伝子でのタバコの形質転換３５Ｓプロモーター／ｌｙｓＣキメラ遺伝子でのタバコの形質転換を以下のように実施した：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’及び３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子を３．５−３．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化したベクターｐＺＳ９７Ｋ（図５）に挿入し、それぞれ、プラスミドｐＢＴ４９７、ｐＢＴ５４５及びｐＢＴ５４２を生ぜしめた。ベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンスのバイナリーＴiプラスミドベクター系［Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２０］の一部である。ベクターは：（１）形質転換された植物細胞の選択マーカーとしてのキメラ遺伝子ノパリンシンターゼプロモーター／ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコーディング領域（ｎｏｓ：ＮＰＴ II）［Ｂｅｖａｎ等（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０４：１８４−１８６］；（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左及び右境界［Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２０］；（３）ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩの唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するエシェリキア・コリｌａｃＺα−相補性セグメント［Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２）Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６７］：（４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドｐＶＳ１からのバクテリア複製起点［Ｉｔｏｈ等（１９８４）Ｐｌａｓｍｉｄ１１：２０６−２２０］；及び（５）形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの選択マーカーとしてのＴｎ５からのバクテリアネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［Ｂｅｒｇ等（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３６２８−３６３２］を含む。また、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３ ’及び３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子をバイナリーベクターｐＢＴ４５６にも挿入し、それぞれ、ｐＢＴ５４７及びｐＢＴ５４６を生ぜしめた。このベクターは、先にキメラ遺伝子３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとして挿入したｐＺＳ９７Ｋである（実施例９参照）。クローニング工程中にｄａｐＡキメラ遺伝子の大きい欠失が起こった。結果としてこれらのプラスミドは、（選択マーカー遺伝子、ＮＰＴ II以外に）植物において発現される唯一の導入遺伝子が３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’または３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’であった点で、ｐＢＴ５４５及びｐＢＴ５４２と同等である。キメラｌｙｓＣ遺伝子を含有するバイナリーベクターを３親接合（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌｍａｔｉｎｇ）［Ｒｕｖｋｉｎ等（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２８９：８５−８８］によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４［Ｈｏｃｋｅｍａ等（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９−１８０］に導入した。タバコ葉盤に接種するためにアグロバクテリウム形質転換体を用いた［Ｈｏｒｓｃｈ等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９−１２３１］。カナマイシンを含有する選択培地でトランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の葉におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、タンパク質を以下のように抽出した。中脈を取り除いた約２．５ｇの若い植物の葉を０．２ｇのポリビニルポリピロリドン及び１１ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ− ＨＣｌｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＮＥ）を含むダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー中に入れ、完全にすりつぶした。設定７で操作したＢｒｉｎｋｍａｎＰｏｌｙｔｒｏｎＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒでの２０秒の処理により懸濁液をさらに均質化した。微粒子を除くために、得られた懸濁液をＳＳ３４ローターを用いてＤｕｐｏｎｔ−Ｓｏｒｖａｌｌ超高速遠心機で４℃で１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清をデカントし、必要な場合、ＴＮＥの添加により容量を１０ｍｌであるように調整し、そして８ｍｌの冷えた飽和硫酸アンモニウムを添加した。混合物を氷上に３０分間置き、上記のように遠心分離した。上清をデカントし、ＡＫIIIタンパク質を含有するペレットを１ｍｌのＴＮＥ中に再懸濁し、セファデックスＧ−２５Ｍカラム（ＣｏｌｕｍｎＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通すことにより脱塩した。免疫学的特性決定のために、３容量の抽出物を１容量の４ｘＳＤＳ−ゲルサンプルバッファー（０．１７ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６.８、６．７％ＳＤＳ、１６．７％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、３３％（ｖ／ｖ）グリセロール）と混合し、サイズ基準として用いるバクテリアで生産されたＡＫIII及び陰性コントロールとして用いる非形質転換タバコ葉から抽出されたタンパク質と一緒に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでレーン当たり各抽出物から３μＬを泳動した。次に、それらのタンパク質を電気泳動的にニトロセルロース膜上にブロットした（ウェスタンブロット）。ＢｉｏＲａｄにより提供される標準プロトコルを用いてそのＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔキットで１：５０００希釈のウサギ血清で実施例２において記述したように調製したＡＫIII抗体に膜をさらした。結合していない一次抗体を除くためにすすいだ後、１：３０００希釈の二次抗体、西洋わさびペルオキシダーゼに結合したロバ抗−ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に膜をさらした。結合していない二次抗体を除くためにすすいだ後、膜をＡｍｅｒｓｈａｍ化学発光試薬及びＸ線フィルムに露出した。キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’を含有する１３のうち７の形質転換体が、そしキメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’を含有する１７のうち１３の形質転換体がＡＫIIIタンパク質を生産した（表２）。全ての場合で、ＡＫIII抗体と反応するタンパク質はいくつかの大きさのものであった。全てのサンプルにおいてエシェリキア・コリで生産されたＡＫIIIとそれより約６ｋｄ大きいタンパク質に大きさが等しいほぼ等量のタンパク質が明らかであり、葉緑体ターゲッティングシグナルが合成されたタンパク質の約半分から取り除かれたことを示唆する。これはさらに、タンパク質の約半分が葉緑体に入ったことを示唆する。さらに、かなりの量の高分子量のタンパク質が見られた。このタンパク質の起源ははっきりせず；存在する全量は成熟及び推定されるＡＫIII前駆体タンパク質を合わせた量に等しいかまたはわずかに多い。実施例２において記述したように葉抽出物をＡＫ活性に関してアッセイした。内因性ＡＫ活性が存在する場合、リシン及びトレオニンに対する増加した耐性によりＡＫIIIをそれから区別することができるはずである。しかしながら、残念なことに、このアッセイはこれらの抽出物においてＡＫIII活性を確かに検出するために十分に高感度ではなかった。キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’を含有する４つの形質転換体のうちいずれもＡＫIII活性を示さなかった。３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’遺伝子を含有する形質転換体からの１つの抽出物のみが確実なレベルの酵素活性を生じた。これは形質転換体５４６−４９Ａから得られ、ウェスタンブロットにより最も高いレベルのＡＫIII−Ｍ４タンパク質を示した抽出物でもあった。活性のあるＡＫIII酵素の発現を検出するための別の方法は、高濃度のリシン及びトレオニンに対する葉組織の感受性または耐性を評価することである。多くの植物の細胞培養物及び実生の成長は高濃度のリシン及びトレオニンにより阻害され；これはメチオニン（またはインビボでメチオニンに転化されるホモセリン）の添加により取り消される。リシン及びトレオニン阻害は内因性ＡＫのフィードバック阻害に起因すると考えられ、それは経路を通した流れを減らし、メチオニンの飢餓状態をもたらす。タバコには、リシン感受性のもの及びトレオニン感受性のものの２つのＡＫ酵素が葉にある［Ｎｅｇｒｕｔｕｉ等（１９８４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１１−２０］。高濃度のリシン及びトレオニンはタバコ葉盤からのシュートの成長を阻害し、低濃度のメチオニンの添加により阻害は取り消される。従って、成長阻害はおそらく２つのＡＫアイソザイムの阻害による。活性のあるリシン及びトレオニン非感受性ＡＫIII−Ｍ４の発現は成長阻害を取り消すと予測される。表２において分かるように、これが見られた。実際に、発現されたＡＫIII−Ｍ４タンパク質のレベルとリシン及びトレオニン阻害に対する耐性の間に十分な相関関係がある。リシン感受性の野生型ＡＫIIIの発現は同様な効果がない。最も多く発現する形質転換体だけがリシン及びトレオニン阻害に対していくらかの耐性を示し、これはＡＫIII−Ｍ４で見られたものよりかなり効果が低かった。葉の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を以下のように抽出した。約３０−４０ｍｇの若葉組織をかみそりで切断し、ドライアイス上で１２ｖ／５ｖ／３ｖの比率で混合した０．６ｍＬのメタノール／クロロホルム／水（ＭＣＷ）中に落とした。１０−３０分後に懸濁液を室温にし、Ｏｍｎｉ１０００ＨａｎｄｈｅｌｄＲｅｃｈａｒｇｅａｂｌｅホモジナイザーで均質化し、次に、エッペンドルフ微量遠心機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で３分間遠心分離した。約０．６ｍＬの上清をデカントし、ペレットにさらに０．２ｍＬのＭＣＷを添加し、それを次にボルテックスし、上記のように遠心分離した。約０．２ｍＬの２回目の上清を１回目のものに添加した。これに、０．２ｍＬのクロロホルム、続いて０．３ｍＬの水を添加した。混合物をボルテックスし、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離し、約１．０ｍＬの上部水相を取り出し、ＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機で乾燥させた。サンプルの１／１０をカラム後ニンヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。葉の相対的遊離アミノ酸レベルをロイシンに対するリシンまたはトレオニンの割合として、このようにロイシンを内部基準として用いて比較した。葉のリシンまたはトレオニン（またはあらゆる他のアミノ酸）レベルに対するＡＫIIIまたはＡＫIII−Ｍ４の発現の一致した影響はなかった（表２）。表２ＢＴ５４２形質転換体：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’ ＢＴ５４５形質転換体：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／ＮＯｓ３’ ＢＴ５４６形質転換体：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’ ＢＴ５４７形質転換体：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／Ｎｏｓ３’ 実施例８ファゼオリンプロモーター／ｌｙｓＣキメラ遺伝子でのタバコの形質転換ファゼオリンプロモーター／ｌｙｓＣキメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５ ’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域（実施例６）を約３．３ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離した。これらのフラグメントをバイナリーベクターｐＺＳ９７（図６）の唯一のＨｉｎｄIII部位に挿入し、それぞれ、ｐＢＴ５４８及びｐＢＴ５４９を生ぜしめた。このベクターは２つのさらなる唯一のクローニング部位、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII並びにバクテリアのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の代わりの形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの選択マーカーとしての（アンピシリン耐性をもたらす）バクテリアβ−ラクタマーゼ遺伝子の存在を除いて実施例７において記述したｐＺＳ９７Ｋと同じである。実施例７において記述した方法により、キメラｌｙｓＣ遺伝子を含有するバイナリーベクターを３親接合でアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、トランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の種子におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、植物を開花させ、自家受粉させ、種子にした。成熟した種子から以下のように全タンパク質を抽出した。約３０−４０ｍｇの種子を１．５ｍＬの使い捨てプラスチック微量遠心チューブに入れ、０．２５ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、２ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中ですりつぶした。微量遠心チューブ中に合うように設計された使い捨てプラスチック回転軸を有する電動式粉砕機を用いて粉砕を実施した。微粒子を除くために、得られた懸濁液を微量遠心機で室温で５分間遠心分離した。３容量の抽出物を１容量の４ｘＳＤＳ− ゲルサンプルバッファー（０．１７ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、６．７％ＳＤＳ、１６．７％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、３３％（ｖ／ｖ）グリセロール）と混合し、サイズ基準として用いるバクテリアで生産されたＡＫ III及び陰性コントロールとして用いる非形質転換タバコ種子から抽出されたタンパク質と一緒に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでレーン当たり各抽出物から５μＬを泳動した。次に、それらのタンパク質を電気泳動的にニトロセルロース膜上にブロットした。ＢｉｏＲａｄにより提供される標準プロトコルを用いてそのＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔキットで１：５０００希釈のウサギ血清で（実施例２において記述したように調製した）ＡＫIII抗体に膜をさらした。結合していない一次抗体を除くためにすすいだ後、１：３０００希釈の二次抗体、西洋わさびペルオキシダーゼに結合したロバ抗−ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に膜をさらした。結合していない二次抗体を除くためにすすいだ後、膜をＡｍｅｒｓｈａｍ化学発光試薬及びＸ線フィルムに露出した。キメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／ファゼオリン３’ 領域を含有する１１のうち１０の形質転換体が、そしてキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を含有する１１のうち１０の形質転換体がＡＫIIIタンパク質を生産した（表３）。全ての場合で、ＡＫIII抗体と反応するタンパク質はいくつかの大きさのものであった。全てのサンプルにおいてエシェリキア・コリで生産されたＡＫIIIとそれより約６ｋｄ大きいものに大きさが等しいほぼ等量のタンパク質が明らかであり、葉緑体ターゲッティングシグナルが合成されたタンパク質の約半分から取り除かれたことを示唆する。これはさらにタンパク質の約半分が葉緑体に入ったことを示唆する。さらに、より低分子量のいくつかのタンパク質が見られ、おそらくＡＫIIIポリペプチドの分解生成物に相当する。種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、成熟した種子から遊離アミノ酸を以下のように抽出した。約３０−４０ｍｇの種子及びほぼ等量の滅菌した砂を室温で１２ｖ／５ｖ／３ｖの比率で混合した０．２ｍＬのメタノール／クロロホルム／水（ＭＣＷ）と共に１．５ｍＬの使い捨てプラスチック微量遠心チューブに入れた。微量遠心チューブ中に合うように設計された使い捨てプラスチック回転軸を有する電動式粉砕機を用いて種子を粉砕した。粉砕後、さらに０．５ｍＬのＭＣＷを添加し、混合物をボルテックスし、次に、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離した。約０．６ｍＬの上清をデカントし、ペレットにさらに０．２ｍＬのＭＣＷを添加し、それを次にボルテックスし、上記のように遠心分離した。約０．２ｍＬの２回目の上清を１回目のものに添加した。これに、０．２ｍＬのクロロホルム、続いて０．３ｍＬの水を添加した。混合物をボルテックスし、次に、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離し、約１．０ｍＬの上部水相を取り出し、ＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機で乾燥させた。サンプルを１１０−１２０℃で２４時間窒素下で６Ｎ塩酸、０．４％（ｖ／ｖ）β −メルカプトエタノール中で加水分解し；サンプルの１／４をカラム後ニンヒドリン検出を用いるＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。種子の相対的遊離アミノ酸レベルをロイシンに対するリシン、メチオニン、トレオニンまたはイソロイシンの割合として、このようにロイシンを内部基準として用いて比較した。種子の全アミノ酸組成を測定するために、６個の種子を１１０−１２０℃で２４時間窒素下で６Ｎ塩酸、０．４％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中で加水分解し；サンプルの１／１０をカラム後ニンヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。種子の相対的アミノ酸レベルをロイシンに対するリシン、メチオニン、トレオニンまたはイソロイシンの割合として、このようにロイシンを内部基準として用いて比較した。一次形質転換体のこれらの自家受粉した子孫において導入遺伝子は分離しており、６個の種子のみを分析したので、いくらかのサンプリング誤差が予想された。それ故、系統のあるものでは測定を複数回繰り返した（表３）。種子におけるｃｔｓ／ｌｙｓＣの発現は、ある場合で種子の遊離トレオニンのレベルの２ないし４倍の増加及び遊離リシンのレベルの２ないし３倍の増加をもたらした。高レベルのＡＫIIIタンパク質を発現する形質転換体とより高いレベルの遊離トレオニンを有するものの間に十分な相関関係があったが、リシンではこれは当てはまらなかった。遊離トレオニンまたはリシンのこれらの比較的小さい増加は、種子における全トレオニンまたはリシンのレベルの検出できる増加をもたらすために十分ではなかった。種子におけるｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子の発現はある場合で種子の遊離トレオニンのレベルの４ないし２３倍の増加及び遊離リシンのレベルの２ないし３倍の増加をもたらした。高レベルのＡＫ IIIタンパク質を発現する形質転換体とより高いレベルの遊離トレオニンを有するものの間に十分な相関関係があったが、再びリシンではこれは当てはまらなかった。遊離トレオニンのより大きい増加は種子における全トレオニンのレベルの検出できる増加をもたらすために十分であった。複数回サンプルを取った３系統において種子の全トレオニン含有量の１６ないし２５％の増加が見られた。（比較のためにロイシンに対するイソロイシンの割合を示す。）増加した全トレオニンを示す系統は、遊離トレオニンの最も高レベルの増加及びＡＫIII−Ｍ４タンパク質の高発現を示すものと同じであった。これらの結果から、遊離トレオニンは通常のタバコ種子に存在する全トレオニンの約１％に相当するが、高レベルのＡＫIII−Ｍ４を発現する種子に存在する全トレオニンの約１８％に相当すると見積もることができる。表３ＢＴ５４８形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ／ファゼオリン３’ ＢＴ５４９形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’遊離アミノ酸には６サンプル、そして全アミノ酸には２３サンプルの平均として通常を計算した。＊少なくとも５サンプルの平均を示す。ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域で形質転換された２植物、植物５４９−５Ａ及び５４９−４０Ａの自家受粉から得られた種子は、導入遺伝子の単一部位挿入を表す、１カナマイシン感受性に対して３カナマイシン耐性の実生を示した。子孫植物を成長させ、自家受粉させ、種子をカナマイシンマーカー遺伝子の分離に関して分析した。導入遺伝子挿入がホモである、従って２コピーの遺伝子カセットを含有する子孫植物は、１コピーの遺伝子カセットを有するそれらの同胞のヘテロ子孫より約２倍、そして遺伝子をもたない種子より約８倍多いトレオニンをそれらの種子に蓄積した。これはエシェリキア・コリ酵素の発現のレベルが遊離トレオニンの蓄積を制御することを示す。実施例９３５Ｓプロモーター／ｅｃｏｄａｐＡキメラ遺伝子でのタバコの形質転換３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’及び３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子をそれぞれ３．１及び３．３ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ消化したバイナリーベクターｐＺＳ９７Ｋ（図５）に挿入し、それぞれプラスミドｐＢＴ４６２及びｐＢＴ４６３を生ぜしめた。バイナリーベクターは実施例７に記述されている。実施例７において記述した方法により、キメラｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を含有するバイナリーベクターを３親接合でアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、得られたトランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の葉におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、以下の改変を含んで実施例７において記述したようにタンパク質を抽出した。１回目の硫酸アンモニウム沈殿からの上清、約１８ｍＬをさらに１２ｍＬの冷えた飽和硫酸アンモニウムと混合した。実施例７において記述したように混合物を氷上に３０分間置き、遠心分離した。上清をデカントし、ＤＨＤＰＳタンパク質を含有するペレットを１ｍＬのＴＮＥに再懸濁し、セファデックスＧ−２５Ｍカラム（ＣｏｌｕｍｎＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通すことにより脱塩した。実施例４において記述したように葉抽出物をＤＨＤＰＳ活性に関してアッセイした。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳをリシン対するその増加した耐性によりタバコＤＨＤＰＳ活性から区別することができ；エシェリキア・コリＤＨＤＰＳは０．１ｍＭリシンでその活性の８０−９０％を保持し、一方、タバコＤＨＤＰＳはその濃度のリシンで完全に阻害された。キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’を含有する１０のうち１つの形質転換体がエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ発現を示し、一方、キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’を含有する１０のうち５の形質転換体がエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ発現を示した。実施例７において記述したように葉から遊離アミノ酸を抽出した。キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’の発現は葉の遊離リシンのレベルの実質的な増加をもたらしたが、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’はそうではなかった。非形質転換タバコより２から９０倍まで高い遊離リシンレベルが見られた。形質転換された植物を開花させ、自家受粉させ、種子にした。３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’遺伝子で形質転換されたいくつかの系統からの種子を表面滅菌し、カナマイシンの存在下で寒天プレート上で発芽させた。導入遺伝子の単一部位挿入を表す、１カナマイシン感受性に対して３カナマイシン耐性の実生を示す系統を同定した。標準的な遺伝分析を用いてこれらの系統から導入遺伝子挿入がホモである子孫を得た。次に、若葉及び成熟した葉におけるエシェリキア・コリＤＨＤＰＳの発現並びに若葉及び成熟した葉及び成熟した種子に蓄積された遊離アミノ酸のレベルに関してホモの子孫を特性決定した。活性のあるエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素の発現が、形質転換体のホモの子孫の若葉及び成熟した葉の両方において明らかに明白であった（表４）。通常のタバコ植物より５０ないし１００倍高い高レベルの遊離リシンがそれらの植物の若葉に蓄積したが、より大きい葉では遊離リシンのかなり少ない蓄積（２ないし８倍）が見られた。師部のリシンを測定する実験から、大きい葉からリシンが運び出されることが示唆される。この運び出されたリシンは、栄養分を運び出すよりむしろ吸収することが知られている小さい成長する葉におけるリシンの蓄積に寄与する可能性がある。より大きい葉は植物のバイオマスの大部分を構成するので、植物におけるリシンの全体的な増加した蓄積は、より大きい葉におけるリシンのレベルによりさらに影響される。これらの植物の種子における遊離リシンレベルに対していかなる影響も見られなかった（表４）。表４３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’がホモのＢＴ４６３形質転換体の子孫実施例１０ファゼオリンプロモーター／ｅｃｏｄａｐＡキメラ遺伝子でのタバコの形質転換キメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５’領域／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域（実施例6)をそれぞれ約２．６及び２．８ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離した。これらのフラグメントをバイナリーベクターｐＺＳ９７（図６）の唯一のＨｉｎｄIII部位に挿入し、それぞれｐＢＴ５０６及びｐＢＴ５３４を生ぜしめた。このベクターは実施例８に記述されている。実施例７において記述した方法により、キメラｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を含有するバイナリーベクターを３親接合によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、得られたトランスジェニック植物を再生させた。キメラ遺伝子の発現をアッセイするために、形質転換された植物を開花させ、自家受粉させ、種子にした。全種子タンパク質を実施例８において記述したように抽出し、以下の改変を含んで実施例７において記述したように免疫学的に分析した。ＢｉｏＲａｄにより提供される標準プロトコルを用いてそのＩｍｍｕｎ− Ｂｌｏｔキットで１：５０００希釈のウサギ血清で実施例４において調製したＤＨＤＰＳ抗体にウェスタンブロット膜をさらした。キメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を含有する１４のうち１３の形質転換体が、そしキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を含有する１３のうち９の形質転換体がウェスタンブロッティングにより検出できるＤＨＤＰＳタンパク質を生産した（表３）。ＤＨＤＰＳ抗体と反応するタンパク質はいくつかの大きさのものであった。キメラ遺伝子が葉緑体移行配列を含むにしろ含まないにしろ、タンパク質の大部分はエシェリキア・コリで生産されるＤＨＤＰＳに大きさが等しかった。これは合成された前駆体タンパク質から葉緑体ターゲッティングシグナルが効率よく取り除かれたことを示した。これはさらにタンパク質の大部分が葉緑体に入ったことを示唆する。さらに、より低分子量のいくつかのタンパク質が見られ、おそらくＤＨＤＰＳポリペプチドの分解生成物に相当する。種子の遊離アミノ酸組成及び全アミノ酸組成を測定するために、実施例８において記述したように成熟した種子から遊離アミノ酸及び全アミノ酸を抽出し、分析した。ｅｃｏｄａｐＡ遺伝子またはｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡのいずれの発現も、形質転換された系統のいずれの種子の全リシンまたはトレオニン組成に対しても影響を及ぼさなかった（表５）。ファゼオリン５’ 領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’キメラ遺伝子で形質転換された系統のいくつかも遊離アミノ酸組成に対するなんらかの影響に関して試験した。再び、高レベルのエシェリキア・コリＤＨＤＰＳタンパク質を発現する系統において種子のリシンまたはトレオニン組成に対するわずかな影響さえ見られなかった（表５）。葉の遊離リシンレベルに対してこのタンバク質の発現が有する（実施例９に記述した）劇的な影響を考えると、これは意外な結果であった。これに対する１つの可能な説明は、ウェスタンブロットにより見られたＤＨＤＰＳタンパク質が機能的でないことであった。この仮説を試験するために、全タンパク質抽出物を成熟した種子から調製し、ＤＨＤＰＳ活性に関してアッセイした。約３０−４０ｍｇの種子を１．５ｍＬ使い捨てプラスチック微量遠心チューブに入れ、０．２５ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＮＥ）中で粉砕した。微量遠心チューブ中に合うように設計された使い捨てプラスチック回転軸を有する電動式粉砕機を用いて粉砕を実施した。微粒子を除くために、得られた懸濁液を微量遠心機で室温で５分間遠心分離した。ペレット物質と上部油相の間の約０．１ｍＬの水性上清を取り出した。種子抽出物を実施例４において記述したようにＤＨＤＰＳ活性に関してアッセイした。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳをリシンに対するその増加した耐性によりタバコＤＨＤＰＳ活性から区別することができ；エシェリキア・コリＤＨＤＰＳは０．４ｍＭリシンでその活性の約５０％を保持し、一方、タバコＤＨＤＰＳはその濃度のリシンで完全に阻害された。高レベルのエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ活性が試験した４つ全ての種子抽出物において見られ、この説明を退けた。キメラｅｃｏｄａｐＡ遺伝子中のｃｔｓ配列の存在は葉における高レベルのリシンの蓄積を引き出すために必須であった。従って、別の可能な説明は、バイナリーベクターへのキメラファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’遺伝子の挿入中にｃｔｓ配列がどうにかして失われたことであった。しかしながら、形質転換された系統のいくつかのＰＣＲ分析からｃｔｓ配列の存在が示され、この可能性を除いた。第三の説明は、アミノ酸が種子において通常合成されず、それ故、経路の他の酵素が種子に存在しないことであった。ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ −Ｍ４／ファゼオリン３’遺伝子の発現が種子における高レベルの遊離トレオニンの蓄積をもたらした実施例８に示された実験の結果はこれが当てはまらないことを示す。これらの結果及び実施例９において示された結果を合わせると、種子または葉のいずれかにおけるリシン非感受性ＤＨＤＰＳの発現は種子において増加した遊離リシンの蓄積を得るために十分ではないことを示す。表５ＢＴ５０６形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’ ＢＴ５３４形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’ 実施例１１３５Ｓプロモーター／ｃｔｓ／ｄａｐＡ及び３５Ｓプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子でのタバコの形質転換３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３ ’及び３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子をバイナリーベクターｐＺＳ９７Ｋ（図５）中に合わせた。バイナリーベクターは実施例７に記述されている。３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子（図４ａ参照）の５’末端のＢａｍＨＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に転化するためにオリゴヌクレオチドアダプターを合成した。次に、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子をプラスミドｐＢＴ５４０（実施例６）から３．６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＢＴ４６３（実施例９）に挿入し、プラスミドｐＢＴ５６４を生ぜしめた。このベクターは同じ向きに挿入された３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’及び３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子の両方を有する。実施例７において記述した方法により、キメラｅｃｏｄａｐＡ及びｌｙｓＣ− Ｍ４遺伝子を含有するバイナリーベクターを３親接合でアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、得られたトランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の葉におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、ＡＫIIIには実施例７において記述したように、そしてＤＨＤＰＳには実施例９において記述したようにタンパク質を抽出した。実施例４及び９において記述したように葉抽出物をＤＨＤＰＳ活性に関してアッセイした。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳはリシンに対するその増加した耐性によりタバコＤＨＤＰＳ活性から区別することができ；エシェリキア・コリＤＨＤＰＳは０．１ｍＭリシンでその活性の８０−９０％を保持し、一方、タバコＤＨＤＰＳはその濃度のリシンで完全に阻害された。実施例７及び１０において記述したようにウェスタンブロットによりＡＫIII及びＤＨＤＰＳタンパク質の発現に関して抽出物を免疫学的に特性化した。１２のうちの１０の形質転換体がエシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素活性を発現した（表６）。酵素活性のレベルと免疫学的に検出されたＤＨＤＰＳタンパク質の量の間に十分な相関関係があった。実施例７において記述したように、ＡＫアッセイはこれらの抽出物の酵素活性を検出ために十分に高感度ではなかった。しかしながら、１２のうちの８の抽出物でＡＫIII−Ｍ４タンパク質が免疫学的に検出された。いくつかの形質転換体５６４−２１Ａ及び４７ＡではＤＨＤＰＳとAKIII−Ｍ４の発現のレベルの間で大きい差異があったが、１２のうちの１０系統で十分な相関関係があった。実施例７において記述したように葉から遊離アミノ酸を抽出し、アミノ酸組成に関して分析した。顕著なＡＫIII−Ｍ４の非存在下では、キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’の発現のレベルがリシン蓄積のレベルを決定した（表６）。いずれも顕著なＡＫIII −Ｍ４を発現しない系統５６４−２１Ａ、４７Ａ及び３９Ｃを比較せよ。系統５６４−２１Ａはより低いレベルのエシェリキア・コリＤＨＤＰＳを発現する系統５６４−４７Ａより約１０倍高いレベルのリシンを、そしてエシェリキア・コリＤＨＤＰＳを発現しない５６４−３９Ｃより４０倍高いレベルのリシンを蓄積する。しかしながら、全て類似した量のエシェリキア・コリＤＨＤＰＳを発現する形質転換体（５６４−１８Ａ、５６Ａ、３６Ｅ、５５Ｂ、４７Ａ）では、キメラ遺伝子、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’の発現のレベルがリシン蓄積のレベルを制御した。従って、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’の発現は単独で発現された場合には葉の遊離アミノ酸レベルに対していかなる影響も及ぼさないが（実施例７参照）、３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子と同時に発現されるとリシン蓄積を増加できることが明らかである。これらの遺伝子を一緒に発現することは葉のいかなる他の遊離アミノ酸のレベルにも影響を及ぼさなかった。表６ＢＴ５６４形質転換体：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’ ３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’ 実施例８において記述したように自家受粉させた植物から得られた成熟した種子から遊離アミノ酸を抽出し、定量した。葉における最も高い遊離リシン蓄積を示す植物、すなわち、植物５６４−１８Ａ、５６４−２１Ａ、５６４−３６Ｅ、５６４−５６Ａからのものに比較して、非形質転換植物からの種子の遊離アミノ酸含有量の著しい違いはなかった。実施例１２ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ及びファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子でのタバコの形質転換キメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’（実施例６）をバイナリーベクターｐＺＳ９７（図６）中で合わせた。バイナリーベクターは実施例８に記述されている。これを成し遂げるために、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’キメラ遺伝子を２．７ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離し、ベクターｐＵＣ１３１８［Ｋａｙ等（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．６：２７７８］のＨｉｎｄIII部位に挿入し、ｐＢＴ５６８を生ぜしめた。次に、ｐＢＴ５６８をＢａｍＨＩで消化し、キメラ遺伝子を２．７ｋｂＢａｍＨＩフラグメント上で単離することが可能であった。このフラグメントをＢａｍＨＩ消化したｐＢＴ５４９（実施例８）に挿入し、ｐＢＴ５７０を生ぜしめた。このバイナリーベクターは同じ向きに挿入されたキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３ ’遺伝子及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３ ’の両方を有する。実施例７において記述した方法により、バイナリーベクターｐＢＴ５７０を３親接合でアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、得られたトランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の種子におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、植物を開花させ、自家受粉させ、種子にした。実施例８において記述したように成熟した種子から全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより分析した。２５のうち２１の形質転換体がＤＨＤＰＳタンパク質を発現し、これらのうちの１９がＡＫIIIタンパク質も発現した（表７）。発現されたタンパク質の量は形質転換体に存在する遺伝子コピーの数に関係し；最も高い発現系統、５７０− ４Ｂ、５７０−１２Ｃ、５７０−５９Ｂ及び５７０−２３Ｂは全て、カナマイシンマーカー遺伝子の分離に基づいて２またはそれ以上の遺伝子カセット挿入部位を有した。タンパク質が検出された全ての試験した系統の成熟した種子において酵素的に活性のあるエシェリキア・コリＤＨＤＰＳが見られた。種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、実施例８において記述したように成熟した種子から遊離アミノ酸を抽出し、分析した。より高レベルのＤＨＤＰＳ及びＡＫIIIタンパク質の両方を発現する形質転換体とより高レベルの遊離リシン及びトレオニンを有するものの間に十分な相関関係があった。（表７において星印をつけた）最も多く発現する系統は種子の遊離リシンレベルの２倍までの増加及び遊離トレオニンのレベルの４倍までの増加を示した。最も多く発現する系統では、高レベルのα−アミノアジピン酸を検出することができた。この化合物は穀類種子におけるリシンの異化作用の中間体であることが知られているが、その低レベルの蓄積のために放射性トレーサー実験によってのみ通常検出される。高レベルのこの中間体の蓄積は、これらの形質転換された系統の種子において多量のリシンが生産され、異化経路を通って流れていることを示す。α−アミノアジピン酸の蓄積は、種子においてエシェリキア・コリＤＨＤＰＳのみまたはＡＫIII−Ｍ４のみを発現する形質転換体では見られなかった。これらの結果は高レベルの遊離リシンを生成するために両方の酵素を同時に発現させることが必要であることを示す。表７ＢＴ５７０形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域＊遊離アミノ酸サンプルがα−アミノアジピン酸を有することを示す。実施例１３タバコ形質転換のための選択マーカーとしてのｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子の使用バイナリーベクターｐＺＳ９７Ｋ中の３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子（ｐＢＴ５４２、実施例７参照）をタバコの形質転換の選択遺伝子マーカーとして用いた。高濃度のリシン及びトレオニンはタバコ葉盤からのシュートの成長を阻害する。活性のあるリシン及びトレオニン非感受性ＡＫIII−Ｍ４の発現はこの成長阻害を取り消す（実施例７参照）。バイナリーベクターｐＢＴ５４２を３親接合によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、得られた形質転換されたシュートを３ｍＭリシン及び３ｍＭトレオニンを含有する分蘭培地で選択した。３ｍＭリシン及び３ｍＭトレオニンを含有する発根培地にシュートを移した。根を下ろしたシュートから植物を成長させた。植物からの葉盤を３ｍＭリシン及び３ｍＭトレオニンを含有する分蘭培地上に置いた。この培地で葉盤の周りで起こるシュート増殖により形質転換された植物を同定した。実施例１４３５Ｓプロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡキメラ遺伝子でのタバコの形質転換３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’キメラ遺伝子を３．０ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ消化したバイナリーベクターｐＺＳ９７Ｋ（図５）に挿入し、プラスミドｐＦＳ８５２を生ぜしめた。バイナリーベクターは実施例７に記述されている。実施例７において記述した方法により、キメラｃｏｒｄａｐＡ遺伝子を含有するバイナリーベクターを３親接合によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いてタバコ葉盤に接種し、得られたトランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の葉におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、以下の改変を含んで実施例７において記述したようにタンパク質を抽出した。１回目の硫酸アンモニウム沈殿からの上清、約１８ｍＬをさらに１２ｍＬの冷えた飽和硫酸アンモニウムと混合した。実施例７において記述したように混合物を氷上で３０分間置き、遠心分離した。上清をデカントし、ＤＨＤＰＳタンパク質を含有するペレットを１ｍＬのＴＮＥ中に再懸濁し、セファデックスＧ−２５Ｍカラム（ＣｏｌｕｍｎＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通すことにより脱塩した。実施例４において記述したように葉抽出物をＤＨＤＰＳタンパク質及び酵素活性に関してアッセイした。コリネバクテリアＤＨＤＰＳ酵素活性をリシン阻害に対するその非感受性によりタバコＤＨＤＰＳ活性から区別することができた。ウェスタンブロットにより検出されるタンパク質及び活性のある酵素の両方として、１１のうち８の形質転換体がコリネバクテリアＤＨＤＰＳ発現を示した。実施例７において記述したように葉から遊離アミノ酸を抽出した。コリネバクテリアＤＨＤＰＳの発現は葉における遊離リシンのレベルの大きな増加をもたらした（表８）。しかしながら、ＤＨＤＰＳの発現のレベルと蓄積される遊離リシンの量の間に十分な相関関係はなかった。非形質転換タバコより２から５０倍まで高い遊離リシンレベルが見られた。また、高レベルの遊離リシンを示す系統では全葉リシンのレベルの２ないし２．５倍の増加もあった。表８ＦＳ５８６形質転換体：３５Ｓプロモーター／Ｃａｂリーダー／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／Ｎｏｓ３’ 植物を開花させ、自家受粉させ、種子にした。実施例８において記述したように成熟した種子を採取し、遊離アミノ酸組成に関してアッセイした。非形質転換タバコ種子に比較して形質転換体の遊離リシン含有量の違いはなかった。実施例１５ＫＴＩ３プロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡまたはファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ及びファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子でのタバコの形質転換キメラ遺伝子カセット、ＫＴＩ３５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＫＴＩ３３’領域とファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’ 領域とファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’（実施例６）をバイナリーベクターｐＺＳ９７（図６）中で合わせた。バイナリーベクターは実施例８に記述されている。これを成し遂げるために、ＫＴＩ３５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＫＴＩ３３’領域キメラ遺伝子カセットを３．３ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ消化したｐＢＴ５４９（実施例８）に挿入し、ｐＦＳ８８３を生ぜしめた。このバイナリーベクターは反対向きに挿入されたキメラ遺伝子、ＫＴＩ３５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＫＴＩ３３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を有する。各末端のＨｉｎｄIII部位をＢａｍＨＩ部位に転化するためにオリゴヌクレオチドアダプターを用いてファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域キメラ遺伝子カセットを改変した。次に、遺伝子カセットを２．７ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ消化したｐＢＴ５４９（実施例８）に挿入し、ｐＦＳ９０３を生ぜしめた。このバイナリーベクターは同じ向きに挿入された両方のキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を有する。実施例７において記述した方法により、バイナリーベクターｐＦＳ８８３及びｐＦＳ９０３を３親接合によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に導入し、アグロバクテリウム形質転換体を用いタバコ葉盤に接種し、得られたトランスジェニック植物を再生させた。形質転換された植物の種子におけるキメラ遺伝子の発現をアッセイするために、植物を開花させ、自家受粉させ、種子にした。実施例８において記述したように成熟した種子から全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより分析した。試験した２２のうち２１の形質転換体がＤＨＤＰＳタンパク質を発現し、そしてこれらのうちの１８がＡＫIIIタンパク質も発現した（表８）。１つを除いてタンパク質が検出された全ての試験した系統の成熟した種子において酵素的に活性のあるコリネバクテリアＤＨＤＰＳが見られた。種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、実施例８において記述したように成熟した種子から遊離アミノ酸を抽出し、分析した。より高レベルのＤＨＤＰＳ及びＡＫIIIタンパク質の両方を発現する形質転換体とより高いレベルの遊離リシン及びトレオニンを有するものの間に十分な相関関係があった。最も多く発現する系統は種子における遊離リシンレベルの３倍までの増加及び遊離トレオニンのレベルの８倍までの増加を示した。実施例１２において記述したように、リシン異化作用を表す高レベルのα−アミノアジピン酸が形質転換された系統の多くで見られた（表９において星印で示す）。コリネバクテリアＤＨＤＰＳ遺伝子の発現を導くＫＴＩ３またはファゼオリン調節配列を有する形質転換体の間で遊離アミノ酸組成またはタンパク質発現のレベルに大きな違いはなかった。表９ＦＳ８８３形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファ４／ファゼオリン３’ ＫＴＩ３５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＫＴＩ３３’ ＦＳ９０３形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’ ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’ ＊遊離アミノ酸サンプルがα−アミノアジピン酸を有することを示す。また、単一遺伝子カセット挿入として分離する２つの系統の発生中の種子においても遊離アミノ酸組成並びにバクテリアＤＨＤＰＳ及びＡＫIIIタンパク質の発現を分析した（表１０参照）。予想されるように、ＫＴＩ３プロモーターの制御下のＤＨＤＰＳタンパク質の発現は、ファゼオリンプロモーターの制御下のＡＫIIIタンパク質のものより早い時期に検出された。開化後１４日で両方のタンパク質は高レベルで発現され、通常の種子に比較して遊離リシンのレベルの約８倍の増加があった。これらの結果は、リシン非感受性ＤＨＤＰＳ及びリシン非感受性ＡＫの同時発現により種子において高レベルの遊離リシンの生成がもたらされることを立証する。しかしながら、遊離リシンはさらに高いレベルまで蓄積し続けない。成熟した種子において遊離リシンは通常の成熟した種子におけるより２ないし３倍高いレベルであり、リシン分解生成物のα−アミノアジピン酸が蓄積する。これらの結果は、種子においてリシン異化作用が起こり、リシン非感受性ＤＨＤＰＳ及びリシン非感受性ＡＫを発現する形質転換体で生産される高レベルの遊離リシンの蓄積を防ぐさらなる証拠を与える。表１０ＦＳ８８３形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域ＫＴＩ３５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＫＴＩ３３’領域の発生中の種子＊遊離アミノ酸サンプルがα−アミノアジピン酸を有することを示す。実施例１６ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ及びファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子でのアブラナの形質転換キメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域とファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ −Ｍ４／ファゼオリン３’（実施例６）を、実施例８において記述したｐＳＺ９７Ｋと同様であるバイナリーベクターｐＺＳ１９９（図７Ａ）に挿入した。ｐＺＳ１９９では、マーカー遺伝子のよりよい発現を与えるためにカリフラワーモザイクウイルスからの３５ＳプロモーターがＮＰＴ IIの発現を導くＮｏｓプロモーターに置き換わり、そして複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するポリリンカーの向きが逆であった。ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を挿入するために、（実施例１５において記述したように）遺伝子カセットを２．７ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ消化したｐＺＳ１９９に挿入し、プラスミドｐＦＳ９２６（図７Ｂ）を生ぜしめた。このバイナリーベクターは３５Ｓ／ＮＰＴ II／ｎｏｓ３’マーカー遺伝子と同じ向きに挿入されたキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を有する。ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を挿入するために、遺伝子カセットを３．３ｋｂＥｃｏＲＩ〜ＳｐｅＩフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ消化したｐＺＳ１９９に挿入し、プラスミドｐＢＴ５９３（図７Ｃ）を生ぜしめた。このバイナリーベクターは３５Ｓ／ＮＰＴ II／ｎｏｓ３’マーカー遺伝子と同じ向きに挿入されたキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を有する。２つのカセットを合わせるために、オリゴヌクレオチドアダプターを用いてｐＢＴ５９３のＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩ部位に転化し、得られたベクターをＢａｍＨＩで切断し、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域遺伝子カセットを２．７ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、挿入し、ｐＢＴ５９７（図７Ｄ）を生ぜしめた。このバイナリーベクターは３５Ｓ／ＮＰＴ II／ｎｏｓ３’マーカー遺伝子と同じ向きに挿入された両方のキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を有する。適切なバイナリーベクターを保有する安全化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４と実生断片の共培養によりブラシカ・ナパス栽培変種植物「Ｗｅｓｔａｒ」を形質転換した。１０％（ｖ／ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ、０．１％ＳＤＳ中で３０分間撹拌することによりブラシカ・ナパス種子を滅菌し、次に、滅菌蒸留水で完全にすすいだ。３０ｍＭＣａＣｌ₂及び１．５％寒天を含有する滅菌培地上で種子を発芽させ、２４℃で暗闇で６日間成長させた。植物形質転換のためのアグロバクテリウムの液体培養物を１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する最少Ａ（ＭｉｎｉｍａｌＡ）培地中で２８℃で一晩増殖させた。バクテリア細胞を遠心分離によりペレットにし、１００μＭアセトシリンゴンを含有する液体ムラシゲ・スクーグ最少有機培地中に１０⁸細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。ブラシカ・ナパス実生胚軸を５ｍｍセグメントに切断し、それらをすぐにバクテリア懸濁液中に入れた。３０分後に胚軸断片をバクテリア懸濁液から取り出し、１００μＭアセトシリンゴンを含有するＢＣ−３５カルス培地上に置いた。植物組織及びアグロバクテリアを薄暗い光の中で２４℃ で３日間共培養した。アグロバクテリアを殺すための２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び形質転換された植物細胞成長を選択するための２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＢＣ− ３５カルス培地に胚軸断片を移すことにより共培養をやめた。実生断片を連続光下で２４℃で３週間この培地でインキュベートした。３週後に、２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＳＢ−４８再生培地に断片を移した。カルス培地に対して記述した同じ培養条件下で、植物組織を新しい選択再生培地で２週毎に継代培養した。一般に形質転換されたカルスは再生培地で速く成長すると考えられ；カルスが約２ｍｍの直径に達すると、それらを胚軸断片から取り除き、カナマイシンを欠いた同じ培地上に置いた。ＢＳ−４８再生培地に移した後数週以内にシュートが現れ始めた。シュートが識別できる茎を形成するやいなや、それらをカルスから切り出し、ＭＳＶ−１Ａ伸長培地に移し、２４℃で１６：８時間の光周期に移した。シュートがいったん数節間伸長すると、それらを寒天表面の上で切断し、切断末端をＲｏｏｔｏｎｅ中に浸した。処理したシュートを湿ったＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３５０の土壌を用いない鉢植え培地中に直接植えた。鉢をプラスチック袋で覆い、約１０日後に、植物が明らかに成長している場合それらを取り除いた。形質転換の結果を表１１に示す。形質転換された植物をバイナリーベクターの各々で得た。最少Ａバクテリア増殖培地蒸留水に：１０．５ｇリン酸カリウム、二塩基４．５ｇリン酸カリウム、一塩基１．０ｇ硫酸アンモニウム０．５ｇクエン酸ナトリウム、二水和物を溶解する。蒸留水で９７９ｍｌにする。オートクレーブする２０ｍＬのフィルター滅菌した１０％ショ糖を添加する。１ｍｌのフィルター滅菌した１ＭＭｇＳＯ₄を添加する。ブラシカカルス培地ＢＣ−３５リットル当たり：ムラシゲ・スクーグ最少有機培地（ＭＳ塩類、１００ｍｇ／Ｌｉ−イノシトール、０．４ｍｇ／Ｌチアミン；ＧＩＢＣＯ＃５１０−３１１８）３０ｇショ糖１８ｇマンニトール０．５ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ０．３ｍｇ／Ｌキネチン０．６％寒天ｐＨ５．８ブラシカ再生培地ＢＳ−４８ムラシゲ・スクーグ最少有機培地ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン類（ＳＩＧＭＡ＃１０１９）１０ｇグルコース２５０ｍｇキシロース６００ｍｇＭＥＳ０．４％寒天ｐＨ５．７フィルター滅菌し、オートクレーブした後添加する：２．０ｍｇ／Ｌゼアチン０．１ｍｇ／ＬＩＡＡブラシカシュート伸長培地ＭＳＶ−１Ａムラシゲ・スクーグ最少有機培地ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン類１０ｇショ糖０．６％寒天ｐＨ５．８表１１カノラ形質転換体２３℃の日中温度及び１７℃の夜間温度で、１６：８時間の光周期下で植物を成長させた。最初の開花する茎が伸長し始めると、異系交配を防ぐためにメッシュ花粉封じ込め袋でそれを覆った。植物を毎日数回振り動かすことにより自家受粉を促進した。自家受粉から得られた成熟した種子を植え付け後約３カ月で採取した。ある程度脱脂された種子荒粉を以下のように調製した：４０ｍｇの成熟した乾燥種子を液体質素下で乳鉢及び乳棒で細粉にすりつぶした。１ｍｌのヘキサンを添加し、混合物を室温で１５分間振盪した。荒粉をエッペンドルフ遠心機でペレットにし、ヘキサンを取り除き、ヘキサン抽出を繰り返した。次に、ヘキサンを完全に蒸発させるまで荒粉を６５℃で１０分間乾燥させ、乾燥粉末が残された。成熟した種子から全タンパク質を以下のように抽出した。約３０−４０ｍｇの種子を１．５ｍＬの使い捨てプラスチック微量遠心チューブに入れ、０．２５ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、２ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中で粉砕した。微量遠心チューブ中に合うように設計された使い捨てプラスチック回転軸を有する電動式粉砕機を用いて粉砕を実施した。微粒子を除くために、得られた懸濁液を微量遠心機で室温で５分間遠心分離した。３容量の抽出物を１容量の４ｘＳＤＳ−ゲルサンプルバッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、６．７％ＳＤＳ、１６．７％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、３３％（ｖ／ｖ）グリセロール）と混合し、サイズ基準として用いるバクテリアで生産されたＤＨＤＰＳまたはＡＫII I及び陰性コントロールとして用いる非形質転換タバコ種子から抽出したタンパク質と共に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでレーン当たり各抽出物からの５μ Ｌを泳動した。次に、それらのタンパク質を電気泳動的にニトロセルロース膜上にブロットした。ＢｉｏＲａｄにより提供される標準プロトコールを用いてそのＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔキットで１：５０００希釈のウサギ血清でＤＨＤＰＳまたはＡＫIII抗体に膜をさらした。結合していない一次抗体を除くためにすすいだ後、１：３０００希釈で二次抗体、西洋わさびペルオキシダーゼに結合したロバ抗−ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に膜をさらした。結合していない二次抗体を除くためにすすいだ後、Ａｍｅｒｓｈａｍ化学発光試薬及びＸ線フィルムに膜を露出した。８のうち８のＦＳ９２６形質転換体及び７のうち７のＢＴ５９７形質転換体がＤＨＤＰＳタンパク質を発現した。単一のＢＴ５９３形質転換体及び７のうち５のＢＴ５９７形質転換体がＡＫIII−Ｍ４タンパク質を発現した（表１２）。従って、アブラナ種子においてこれらのタンパク質を発現させることは容易である。種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、室温で１２ｖ／５ｖ／３ｖの比率で混合した０．６ｍＬのメタノール／クロロホルム／水（ＭＣＷ）中で４０ｍｇの脱脂荒粉から遊離アミノ酸を抽出した。混合物をボルテックスし、次に、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離した。約０．６ｍＬの上清をデカントし、ペレットにさらに０．２ｍＬのＭＣＷを添加し、次にそれをボルテックスし、上記のように遠心分離した。２回目の上清、約０．２ｍＬを１回目のものに添加した。これに、０．２ｍＬのクロロホルム、続いて０．３ｍＬの水を添加した。混合物をボルテックスし、次に、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離し、約１．０ｍＬの上部水相を取り出し、ＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で乾燥させた。１１０−１２０℃で２４時間窒素下で６Ｎ塩酸、０．４％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中でサンプルを加水分解し；１／４のサンプルをカラム後ニンヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。種子における相対的遊離アミノ酸レベルをロイシンに対するリシンまたはトレオニンの比率として、このようにロイシンを内部基準として用いて比較した。タバコ種子と対照的に、コリネバクテリアＤＨＤＰＳの発現はアブラナ形質転換体において遊離リシンの蓄積の大きい増加をもたらした。最も多く発現する系統は種子における遊離リシンレベルの１００倍より大きい増加を示した。コリネバクテリアＤＨＤＰＳの非存在下でＡＫIII−Ｍ４を発現する形質転換体は、種子における遊離トレオニンのレベルの５倍の増加を示した。両方の酵素の同時発現は高レベルの遊離リシンの蓄積をもたらしたが、トレオニンはそうではなかった。リシン異化作用を表す高レベルのα−アミノアジピン酸が形質転換された系統の多くで見られた。従って、リシンケトグルタル酸還元酵素の不活化によりリシン異化作用を防ぐことは、種子における遊離リシンの蓄積をさらに増やすはずである。あるいはまた、ペプチドまたはリシンに富んだタンパク質へのリシンの取り込みは異化作用を防ぎ、種子におけるリシンの蓄積の増加をもたらす。成熟した種子の全アミノ酸組成を測定するために、２ｍｇの脱脂荒粉を１１０ −１２０℃で２４時間窒素下で６Ｎ塩酸、０．４％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中で加水分解し；サンプルの１／１００をカラム後ニンヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。種子における相対的アミノ酸レベルを全アミノ酸に対するリシン、トレオニンまたはα −アミノアジピン酸のパーセンテージとして比較した。ＤＨＤＰＳタンパク質の発現と形質転換体の種子における高レベルのリシンの蓄積の間に十分な相関関係があった。非形質転換コントロールに比較してリシンレベルの５−１００％の増加を有する種子が見られた。最も高いレベルを有する形質転換体において、リシンはあらゆる以前に知られているアブラナ種子よりかなり高い全種子アミノ酸の約１３％を構成する。この形質転換体は高レベルのエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４及びコリネバクテリアＤＨＤＰＳの両方を発現する。表１２ＦＳ９２６形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’ ＢＴ５９３形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’ ＢＴ５９７形質転換体：ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’ ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’ ＡＡはα−アミノアジピン酸である。実施例１７選択マーカーとしてキメラｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子を用いるトウモロコシの形質転換「II型カルス」組織培養応答を生じるために交配させたトウモロコシ系統の穀粒から切断した未成熟胚（約１．０ないし１．５ｍｍ）から胚形成カルス培養を開始した。受粉後１０ないし１２日で胚を切断し、軸側を下にしてアガロースで凝固させた０．５ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄを補足したＮ１６培地［Ｃｈｕ等（１９７４）ＳｃｉＳｉｎ１８：６５９−６６８］（Ｎ６−０．５）と接触して置いた。胚を２７℃で暗闇中に置いた。胚柄構造上に生じた体細胞前胚及び体細胞胚を含む分化していない細胞の塊からなる砕けやすい胚形成カルスが、未成熟胚の胚盤から増殖した。個々の胚から単離されたクローン胚形成カルスを同定し、Ｎ６−０．５培地で２ないし３週毎に継代培養した。カルス培養細胞に遺伝子を導入するために粒子衝撃法を用いた。これらの実験のためにＢｉｏｌｉｓｔｉｃ^TM（商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（ＢｉｏＲＡＤＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いた。トウモロコシにおける構成的遺伝子発現のために設計されたキメラ遺伝子ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＨＨ２−１３’領域（実施例６参照）を含有するプラスミドｐＢＴ５７３を金粒子の表面上に沈殿させた。これを成し遂げるために、（約１ｍｇ／ｍＬの濃度で水中）２．５μｇのｐＢＴ５７３を水に懸濁した２５ｍＬの金粒子（１．５μｍの平均直径）（６０ｍｇの金／ｍＬ）に添加した。次に、チューブをボルテックスしながら金−ＤＮＡ懸濁液に塩化カルシウム（２５ｍＬの２．５Ｍ溶液）及びスペルミジン（１０ｍＬの１．０Ｍ溶液）を添加した。金粒子を微量遠心機で１０秒間遠心分離し、上清を除いた。次に、金粒子を２００ｍＬの無水エタノールに再懸濁し、再び遠心分離し、上清を除いた。最後に、金粒子を２５ｍＬの無水エタノールに再懸濁し、１秒間２回超音波処理した。次に、５μＬのＤＮＡで被覆された金粒子を各マクロ担体ディスク（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｄｉｓｋ）上に載せ、エタノールを蒸発させて除き、ＤＮＡで被覆された金粒子をディスク上に乾燥して残した。０．２５Ｍソルビトール及び０．２５Ｍマンニトールを補足したＮ６−０．５培地を含有する１００ｘ２０ｍｍペトリ皿の中心で約６ｃｍ直径の円形領域に（＃１３２．２．２と称するカルス系統からの）胚形成カルスを並べた。前処理として衝撃前に２時間この培地上に組織を置き、衝撃工程中培地上のままであった。２時間の前処理期間の最後に、組織を含有するペトリ皿をＰＤＳ−１０００／Ｈｅの室中に置いた。次に、２８インチのＨｇの真空状態まで室中の空気を排出した。衝撃管中のＨｅ圧力が１１００ｐｓｉに達すると破裂する破裂膜を用いてヘリウム衝撃波でマクロ担体を加速した。組織を停止遮壁から約８ｃｍに置いた。４プレートの組織をＤＮＡで被覆した金粒子で衝撃を与えた。衝撃後すぐに、カルス組織を補足的ソルビトールまたはマンニトールを含まないＮ６−０．５培地に移した。衝撃後７日目にカルス組織の小さい（２−４ｍＭ直径）塊をカゼインまたはプロリンを欠いているが各２ｍＭのリシン及びトレオニン（ＬＴ）を補足したＮ６ −０．５培地に移した。組織はこの培地でゆっくりと成長し続け、それを２週毎にＬＴを補足した新しいＮ６−０．５培地に移した。１２週後にＬＴを補足した培地を含有する２枚の別個のプレートで２クローンの活発に成長するカルスを同定した。これらのクローンは選択培地で継代培養した場合に成長し続けた。選択したクローンにおけるｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子の存在をＰＣＲ分析により確かめた。植物再生を促進する培地にカルスを移した。実施例１８構成的トウモロコシプロモーター／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ及び構成的トウモロコシプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４でのトウモロコシの形質転換キメラ遺伝子カセット、ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ＨＨ２−１３’領域及びＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＨＨ２−１３’領域（実施例６）をベクターｐＧｅｍ９ｚに挿入してトウモロコシ形質転換ベクターを作製した。プラスミドｐＢＴ５８３（実施例６）をＳａｌＩで消化し、ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ＨＨ２−１３ ’領域遺伝子カセットを含有する１８５０ｂｐフラグメントを単離した。ＸｈｏＩで消化した、ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＨＨ２−１３’領域を保有するｐＢＴ５７３（実施例６）にこのＤＮＡフラグメントを挿入した。両方のキメラ遺伝子を同じ向きに有する得られたベクターをｐＢＴ５８６と称した。粒子衝撃法を用いて胚形成トウモロコシカルス組織にベクターｐＢＴ５８６を導入した。胚形成カルス培養の樹立及び粒子衝撃のパラメーターは実施例１７において記述したとおりであった。選択マーカーを含有する２つのプラスミドベクターのいずれか一つを形質転換に用いた。一つのプラスミド、ｐＡＬＳＬＵＣ［Ｆｒｏｍｍ等（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９］はトウモロコシアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子のｃＤＮＡを含有した。ＡＬＳｃＤＮＡは、遺伝子によりコードされる酵素がクロルスルフロンに耐性であるようにインビトロで突然変異されていた。また、このプラスミドはカリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター及びノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域を使用してホタルルシフェラーゼコーディング領域［ｄｅＷｅｔ等（１９８７）Ｍｏｌｅｃ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７：７２５−７３７］を発現させる遺伝子も含有する。もう一つのプラスミド、ｐＤＥＴＲＩＣは除草剤グルホシネートに対する耐性を与えるストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）からのｂａｒ遺伝子を含有した［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９８７）ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ６：２５１９−２５２３］。そのバクテリア遺伝子は植物における適切な翻訳開始のためにＧＴＧからＡＴＧに変化したその翻訳コドンを有した［ＤｅＢｌｏｃｋ等（１９８７）ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ６：２５１３−２５１８］。ｂａｒ遺伝子はカリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーターにより導かれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのオクトピンシンターゼ遺伝子からの終結及びポリアデニル化シグナルを用いる。衝撃のために、２．５μｇの各プラスミド、ｐＢＴ５８６及び２つの選択マーカープラスミドのいずれかを実施例１７において記述したように金粒子の表面上に共沈殿させた。胚形成組織培養物の衝撃も実施例１７において記述したとおりであった。衝撃後７日目に組織を選択培地に移した。クロルスルフロン（３０ｎｇ／Ｌ）を含有し、カゼインまたはプロリンを欠いたＮ６−０．５培地に選択マーカーｐＡＬＳＬＵＣを有する衝撃を与えた組織を移した。２ｍｇ／Ｌのグルホシネートを含有し、カゼインまたはプロリンを欠いたＮ６−０．５培地に選択マーカーｐＤＥＴＲＩＣを有する衝撃を与えた組織を移した。これらの選択培地上で組織はゆっくりと成長し続けた。さらに２週後に組織を選択薬剤を含有する新しいＮ６ −０．５培地に移した。さらに６−８週後にクロルスルフロン及びグルホシネート耐性のカルスクローンを同定することができた。これらのクローンは選択培地に移した場合に成長し続けた。形質転換されたクローンにおけるｐＢＴ５８６の存在はＰＣＲ分析により確かめられている。各々２ｍＭのリシン及びトレオニンを含有するＮ６−０．５培地上で形質転換されたクローンを平板培養することにより、導入されたＡＫ酵素の機能性を試験した（ＬＴ選択；実施例１３参照）。全てのクローンがＬＴ培地上で成長することができ、エシェリキア・コリアスパルテートキナーゼが発現され、適切に機能していることを示した。エシェリキア・コリＤＨＤＰＳ酵素が機能的であることを試験するために、リシン類似体で植物ＤＨＤＰＳの強力なインヒビターの２μＭ２−アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）を含有するＮ６−０．５培地上で形質転換されたカルスを平板培養した。形質転換されたカルス組織はＡＥＣに耐性であり、植物酵素よりＡＥＣに対して約１６倍感受性が低い導入されたＤＨＤＰＳが生産され、機能的であることを示した。いくつかの形質転換されたクローンから植物を再生させ、成熟するまで成長させる。実施例１９ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ及びファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４キメラ遺伝子でのダイズの形質転換キメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域とファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’（実施例６）をダイズ形質転換ベクターｐＢＴ６０３（図８Ａ）中に挿入した。このベクターは改変されたｐＧＥＭ９ｚプラスミド中にＮｏｓ３’ 領域を含むエシェリキア・コリβ−グルクロニダーゼ遺伝子［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等（１９８６）Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８４４７−８４５１］の発現を導くカリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーターよりなるダイズ形質転換マーカー遺伝子を有する。ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を挿入するために、遺伝子カセットを３．３ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメントとして単離し、ＨｉｎｄIII消化したｐＢＴ６０３に挿入し、プラスミドｐＢＴ６０９を生ぜしめた。このバイナリーベクターは３５Ｓ／ＧＵＳ／Ｎｏｓ３’マーカー遺伝子から反対向きに挿入されたキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を有する。ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を挿入するために、遺伝子カセットを（実施例１５において記述したように）２．７ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ消化したｐＢＴ６０９に挿入し、プラスミドｐＢＴ６１４を生ぜしめた（図８Ｂ）。このベクターは同じ向きに挿入された両方のキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を有し、両方とも３５Ｓ／ＧＵＳ／Ｎｏｓ３’マーカー遺伝子から反対向きにある。米国特許第５，０１５，５８０号に記述された方法に従ってダイズをプラスミドｐＢＴ６１４で形質転換した。ダイズ形質転換はＡｇｒａｃｅｔｕｓＣｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）により実施された。５つの形質転換された系統からの種子を得、分析した。導入遺伝子は形質転換された植物のＲ１種子において分離していると考えられた。形質転換マーカー遺伝子を保有する種子を同定するために、種子の小片をかみそりで切断し、使い捨てプラスチックマイクロタイタープレートのウェルに入れた。１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆、０。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ｍｇ／ｍＬ５−ブロモ−４ −クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グルクロン酸からなるＧＵＳアッセイミックスを調製し、０．１５ｍＬを各マイクロタイターウェルに添加した。マイクロタイタープレートを３７℃で４５分間インキュベートした。青色の発色は種子におけるＧＵＳの発現を表した。７つのうち５つの形質転換された系統がＧＵＳ発現の約３：１分離を示し、ＧＵＳ遺伝子がダイズゲノム中の単一部位で挿入されたことを示す。別の形質転換体は９：１及び１５：１分離を示し、ＧＵＳ遺伝子が２つの部位に挿入されたことを示唆する。細粉に粉砕することにより個々の種子の断片から荒粉を調製した。１ｍｇを０．１ｍＬの４３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、１．７％ＳＤＳ、４．２％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、８％（ｖ／ｖ）グリセロールに添加し、懸濁液をボルテックスし、２−３分間沸騰させ、再びボルテックスすることにより全タンパク質を荒粉から抽出した。微粒子を除くために、得られた懸濁液を微量遠心機で室温で５分間遠心分離し、サイズ基準として用いるバクテリアで生産されたＤＨＤＰＳまたはＡＫIIIと共に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでレーン当たり各抽出物からの１０μＬを泳動した。次に、タンパク質を電気泳動的にニトロセルロース膜にブロットした。ＢｉｏＲａｄにより提供される標準プロトコールを用いてそのＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔキットでそれぞれ１：５０００または１：１０００希釈のウサギ血清でＤＨＤＰＳまたはＡＫIII抗体に膜をさらした。結合していない一次抗体を除くためにすすいだ後、１：３０００希釈で二次抗体、西洋わさびペルオキシダーゼに結合したロバ抗−ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に膜をさらした。結合していない二次抗体を除くためにすすいだ後、Ａｍｅｒｓｈａｍ化学発光試薬及びＸ線フィルムに膜を露出した。７つのうち６つの形質転換体がＤＨＤＰＳタンパク質を発現した。ＤＨＤＰＳを発現した６つの形質転換体において、個々の種子のＧＵＳとＤＨＤＰＳの発現の間に優れた相関関係があった（表１３）。それ故、ＧＵＳ及びＤＨＤＰＳ遺伝子はダイズゲノム中の同じ位置に組み込まれている。７つのうち４つの形質転換体がＡＫIIIタンパク質を発現し、再び、個々の種子のＡＫIII、ＧＵＳ及びＤＨＤＰＳの発現の間に優れた相関関係があった（表１３）。従って、これら４つの形質転換体において、ＧＵＳ、ＡＫIII及びＤＨＤＰＳ遺伝子はダイズゲノム中の同じ位置に組み込まれている。１つの形質転換体はその種子においてＧＵＳのみを発現した。種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、室温で１２ｖ／５ｖ／３ｖの比率で混合した１．０ｍＬのメタノール／クロロホルム／水（ＭＣＷ）中で８−１０ｍｇの荒粉から遊離アミノ酸を抽出した。混合物をボルテックスし、次に、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離し；約０．８ｍＬの上清をデカントした。この上清に、０．２ｍＬのクロロホルム、続いて０．３ｍＬの水を添加した。混合物をボルテックスし、次に、エッペンドルフ微量遠心機で約３分間遠心分離し、約１．０ｍＬの上部水相を取り出し、ＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で乾燥させた。１１０−１２０℃で２４時間窒素下で６Ｎ塩酸、０．４％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中でサンプルを加水分解し；サンプルの１／１０をカラム後ニンヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。種子における相対的遊離アミノ酸レベルをロイシンに対するリシンの割合として、このようにロイシンを内部基準として用いて比較した。コリネバクテリアＤＨＤＰＳを単独及びエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４と同時に発現するダイズ形質転換体はそれらの種子に高レベルの遊離リシンを蓄積した。遊離リシンレベルの２０倍から１２０倍までの増加が見られた（表１３）。高レベルのリシンを含有する種子では、リシン異化作用を表す高レベルのサッカロピンも見られた。従って、リシンケトグルタル酸還元酵素の不活化によりリシン異化作用を防ぐことは、種子における遊離リシンの蓄積をさらに増やすはずである。あるいはまた、ペプチドまたはリシンに富んだタンパク質へのリシンの取り込みは異化作用を防ぎ、種子におけるリシンの蓄積の増加をもたらす。成熟した種子の全アミノ酸組成を測定するために、１−１．４ｍｇの種子荒粉を１１０−１２０℃で２４時間窒素下で６Ｎ塩酸、０．４％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール中で加水分解し；サンプルの１／５０をカラム後ニンヒドリン検出を用いてＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ６３００アミノ酸分析機に流した。種子におけるリシン（及び他のアミノ酸）レベルを全アミノ酸のパーセンテージとして比較した。コリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現するダイズ種子は全種子リシンの蓄積の実質的な増加を示した。非形質転換コントロールに比較して全リシン含有量の５− ３５％の増加を有する種子が見られた。これらの種子においてリシンは全種子アミノ酸の７．５−７．７％を構成する。エシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４と同時にコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現するダイズ種子は、コリネバクテリアＤＨＤＰＳのみを発現するものよりかなり多い全種子リシンの蓄積を示した。全リシン含有量の４倍より多い増加を有する種子が見られた。これらの種子においてリシンはあらゆる以前に知られているダイズ種子よりかなり高い全種子アミノ酸の約２０−２５％を構成する。表１３実施例２０植物リシンケトグルタル酸還元酵素遺伝子の単離リシンケトグルタル酸還元酵素（ＬＫＲ）酵素活性は発生中のトウモロコシ種子の未成熟内乳において観察されている［Ａｒｒｕｄａ等（１９８２）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．６９：９８８−９８９］。ＬＫＲ活性は内乳発生の開始から急に増加し、受粉後約２０日で最高レベルに達し、次に減少する［Ａｒｒｕｄａ等（１９８３）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：２６８７−２６８９］。トウモロコシＬＫＲ遺伝子をクローン化するために、受粉後１９日目に発生中の種子からＲＮＡを単離した。ベクターＬａｍｂｄａＺａｐ IIにおけるｃＤＮＡライブラリーの注文合成のためにこのＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、（ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）に送った。次に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより提供されるプロトコルに従って、ＬａｍｂｄａＺａｐ II ライブラリーのファージミドライブラリー、次にプラスミドライブラリーへの転化を成し遂げた。いったんプラスミドライブラリーに転化されると、得られたアンピシリン耐性クローンはベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）中にｃＤＮＡインサートを保有する。ｃＤＮＡの発現はベクター上のｌａｃＺプロモーターの制御下にある。１００μＬ対１μＬのＬａｍｂｄａＺａｐ IIファージ及び糸状ヘルパーファージの混合物を用いて２つのファージミドライブラリーを作製した。１００μＬのＬａｍｂｄａＺａｐ II対１０μＬのヘルパーファージ及び２０μＬのＬａｍｂｄａＺａｐ II対１０μＬのヘルパーファージの混合物を用いてさらに２つのライブラリーを作製した。ファージミド調製物の力価は用いた混合物にかかわらず同様であり、宿主としてエシェリキア・コリ株ＸＬ−１−Ｂｌｕｅを用いて約２ｘ１０³アンピシリン耐性トランスフェクタント／ｍＬ、そして宿主としてＤＥ１２６（以下参照）を用いて約１ｘ１０³であった。ＬＫＲ遺伝子を保有するクローンを選択するために、特別に設計されたエシェリキア・コリ宿主、ＤＥ１２６を構築した。ＤＥ１２６の構築は数段階で生じた。（１）標準法（方法はＪ．Ｍｉｌｌｅｒ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓを参照）を用いてＴＳＴｌ［Ｆ^-、ａｒａＤ１３９、Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）２０５、ｆｌｂ５３０１、ｐｔｓＦ２５、ｒｅｌＡ１、ｒｐｓＬ１５０、ｍａｌＥ５２：：Ｔｎ１０、ｄｅｃＣ１、λ^- ］（Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ＃６１３７）の培養物の感染により大腸菌ファージＰ１ｖｉｒの普遍形質導入ストックを製造した。（２）受容体として株ＧＩＦ１０６Ｍ１［Ｆ^-、ａｒｇ^-、ｉ１ｖＡ２９６、ｌｙｓＣ１００１、ｔｈｒＡ１１０１、ｍｅｔＬ１０００、λ^-、ｒｐｓＬ９、ｍａｌＴ１、ｘｙｌ−７、ｍｔｌ−２、ｔｈｉｌ（？）、ｓｕｐＥ４４（？）］（Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ＃５０７４）を用いる形質導入交配（方法はＪ．Ｍｉｌｌｅｒ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓを参照）においてこのファージストックを供与体として用いた。抗生物質テトラサイクリン含有する強化（ｒｉｃｈ）培地（ＤＡＰを補足したＬ）で組み換え体を選択した。テトラサイクリン耐性を与えるトランスポゾンＴｎ１０は株ＴＳＴ１のｍａｌＥ遺伝子中に挿入されている。この交配から得られるテトラサイクリン耐性形質導入体はｍａｌＥの近くにエシェリキア・コリ染色体の２分までを含有すると思われる。遺伝子ｍａ１Ｅ及びｌｙｓＣは十分に同時形質導入距離内のO.５分未満で離れている。（３）２００個のテトラサイクリン耐性形質導入体を完全に表現型分類し；適切な発酵及び栄養形質を評点した。受容体株ＧＩＦ１０６Ｍ１はｔｈｒＡ、ｍｅｔＬ及びｌｙｓＣの突然変異のためにアスパルトキナーゼアイソザイムを完全に欠いており、それ故、増殖のためにトレオニン、メチオニン、リシン及びメソージアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の存在を必要とする。ＴＳＴ１からのｍａｌＥ：：Ｔｎ１０と共にｌｙｓＣ ⁺を受け継いだ形質導入体は、炭素及びエネルギー源として働くグルコースに加えてビタミンＢ１、Ｌ−アルギニン、Ｌ−イソロイシン及びＬーバリンを含有する最少培地で増殖すると考えられる。さらに、ｌｙｓＣ ⁺ 、ｍｅｔＬ ^-及びｔｈｒＡ ^-の遺伝子組成を有する株はリシン感受性のアスパルトキナーゼのみを発現する。従って、最少培地へのリシンの添加は、トレオニン、メチオニン及びＤＡＰの飢餓状態を導くことによりｌｙｓＣ ⁺組み換え体の増殖を防ぐはずである。調べた２００個のテトラサイクリン耐性形質導入体のうち４９個がトレオニン、メチオニン及びＤＡＰを欠いた最少培地で増殖した。さらに、４９個全てが最少培地へのＬ−リシンの添加により阻害された。これらの形質導入体のうちの１つをＤＥ１２５と称した。ＤＥ１２５はテトラサイクリン耐性、アルギニン、イソロイシン及びバリンの増殖要求、並びにリシンに対する感受性の表現型を有する。この株の遺伝子型はＦ^- ｍａｌＥ５２：：Ｔｎ１０ａｒｇ^- ｉｌｖＡ２９６ｔｈｒＡ１１０１ｍｅｔＬ１０００ λ^- ｒｐｓＬ９ｍａｌＴ１ｘｙｌ−７ｍｔｌ−２ｔｈｉl（？）ｓｕｐＥ４４（？）である。（４）この工程は株ＤＥ１２５の雄性誘導体の製造を含む。株ＤＥ１２５を雄性株ＡＢ１５２８［Ｆ’１６／Δ（ｇｐｔ−ｐｒｏＡ）６２、１ａｃＹ１またはｌａｃＺ４、ｇｌｎＶ４４、ｇａｌＫ２ｒａｃ^-（？）、ｈｉｓＧ４、ｒｆｂｄ１、ｍｇｌ−５１、ｋｄｇＫ５１（？）、ｉｌｖＣ７、ａｒｇＥ３、ｔｈｉ−１］（Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ＃１５２８）と接合の方法により接合させた。Ｆ’１６はｉｌｖＧＭＥＤＡＹＣ遺伝子集団を保有する。各株の増殖を許容するリッチ培地で２つの株を交差接種した。インキュベーション後、テトラサイクリン、アルギニン、ビタミンＢ１及びグルコースを含有する合成培地にプレートをレプリカプレートした。ＤＥ１２５はイソロイシンを合成できないのでこの培地で生育できない。抗生物質テトラサイクリンを含み、合成培地からプロリン及びヒスチジンを除くことによりＡＢ１５２８の生育は妨げられる。一部の細胞がこの選択培地で増殖した。これらの組み換え細胞は同じ培地で単一コロニー単離を受けた。１個のクローンの表現型は、ＡＢ１５２８からＤＥ１２５へのＦ’１６の単純導入と一致した、Ｉｌｖ ⁺、Ａｒｇ^-、ＴｅｔＲ、リシン感受性、雄性特異的ファージ（ＭＳ２）感受性であると決定された。このクローンをＤＥ１２６と称し、それは遺伝子型Ｆ’１６／ｍａｌＥ５２：：Ｔｎ１０、ａｒｇ、ｉｌｖＡ２９６、ｔｈｒＡ１１０１、ｍｅｔＬ１００、ｌｙｓＣ ⁺ 、λ^-、ｒｐｓＬ９、ｍａｌＴ１、ｘｙｌ−７、ｍｔｌ−２、ｔｈｉ−１？、ｓｕｐＥ４４？を有する。それは合成培地中２０μｇ／ｍＬのＬ−リシンにより阻害される。ＬＫＲ遺伝子を保有するトウモロコシｃＤＮＡライブラリーからクローンを選択するために、Ｌ培地中で増殖させたＤＥ１２６の一晩培養物１００μ Ｌと１００μＬのファージミドライブラリーを混合し、ビタミンＢ１、Ｌ−アルギニン、炭素及びエネルギー源としてのグルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン並びに２０、３０または４０μｇ／ｍＬのＬ−リシンを含有する合成培地で細胞を平板培養した。３つの異なるリシン濃度の各々で４枚のプレートを調製した。ファージミド及びＤＥ１２６細胞の量はプレート当たり約１ｘ１０⁵アンピシリン耐性トランスフェクタントを生じると考えられた。プレート当たり１０ないし３０個のリシン耐性コロニー（５０００アンピシリン耐性コロニー当たり約１個のリシン耐性）が増殖した。１０個の独立したコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＥ１２６中に再形質転換した。１０のうち７つのＤＮＡがリシン耐性クローンを生成し、リシン耐性形質がプラスミド上に保有されることを示した。クローン化されたＤＮＡのいくつかをシークエンスし、生化学的に特性決定した。挿入されたＤＮＡフラグメントはトウモロコシｃＤＮＡよりむしろエシェリキア・コリゲノムに由来することが見いだされ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより供給されたｃＤＮＡライブラリーが汚染されていることを示した。ＬＫＲをコードする植物ｃＤＮＡを同定するために別の方法を用いた。この方法は植物ＬＫＲとサッカロピンデヒドロゲナーゼをコードする真菌遺伝子の間の予想される相同性に基づいた。真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ(リシン形成)は真菌リシン生合成経路の最後の２段階を触媒する。植物ＬＫＲ及び真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（リシン形成）は正及び逆の両方の反応を触媒し、同一基質を用い、類似した補因子を使用する。同様に、リシン異化経路の第二段階を触媒する植物サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）は、真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）のように正及び逆の両方の反応において働き、同一基質を用い、類似した補因子を使用する。ヒト及びウシ研究から得られた生化学的及び遺伝学的証拠から、哺乳類のＬＫＲ及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）酵素活性が約１１７，０００のモノマー分子量を有する単一タンパク質上に存在することが示されている。これは別個のタンパク質上に保有される真菌酵素、約４４，０００の分子量を有するサッカロピンデヒドロゲナーゼ（リシン形成）及び約５１，０００の分子量を有するサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）と対照的である。植物ＬＫＲは約１４０，０００の分子量を有することが報告されており、ＬＫＲ及びサッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）の両方の酵素活性が単一タンパク質上に存在する動物異化作用タンパク質のようであることを示唆している。真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼのいくつかの遺伝子が単離され、シークエンスされている［Ｘｕａｎ等（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４７９５−４８０６、Ｆｅｌｌｅｒ等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：６４１１−６４１８］。これらの遺伝子配列から推定される真菌タンパク質配列を用いて真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼに相同な植物タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントに関して植物ｃＤＮＡデータベースを検索した。真菌サッカロピンデヒドロゲナーゼ（グルタメート形成）と相同な、それぞれ、ポリペプチド配列番号：１０４及び配列番号：１０５をコードするアラビドプシス・サリアナからの２つの植物ｃＤＮＡフラグメント、配列番号：１０２及び配列番号：１０３が見いだされた。真菌と植物ポリペプチドの間の配列類似性（図９参照）から、これらのｃＤＮＡがアラビドプシスサッカロピンデヒドロゲナーゼをコードすることが示される。オリゴヌクレオチド配列番号：１０８及び配列番号：１０９を合成し、アラビドプシスゲノムＤＮＡからの２．２４ｋｂＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のために用いた。そのフラグメントのＤＮＡシークエンシングから、それがＬＫＲ／ＳＤＨをコードすることが確かめられた。ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍのＤｉｇ−ＨｉｇｈＰｒｉｍｅキット及びプロトコルを用いてフラグメントをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識した。このプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションによりＣＤ４−８Ｌａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａゲノムライブラリーをスクリーニングした。３７℃で一晩増殖させた宿主エシェリキア・コリＬＥ３９２上で約２．７ｘ１０⁵個の組み換えファージを平板培養した。プロトコルは５５℃に設定したハイブリダイゼーション温度でＤＩＧＷａｓｈａｎｄＢｌｏｃｋＳｅｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）に記述されたとおりであった。５個の陽性クローンを単離し；１個をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^R（商標）ＳＫ +/-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローン化し、ＤＨ５α^TM(商標)コンピテント細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中に形質転換し、シークエンスした。アラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨ遺伝子の完全なゲノム配列を配列番号：１１０に示す。その配列は約２ｋｂの５’非コーディング配列及び５００ｂｐの３’非コーディング配列及び２３個のイントロンを含む。ＲＴ−ＰＣＲによりアラビドプシス全ＲＮＡから対応するｃＤＮＡの重複するフラグメントを単離した。ＬＫＲ−ＳＤＨｃＤＮＡの配列分析から、１１７ｋｄのタンパク質が予測される３．１６ｋｂのＯＲＦが明らかになり、ＬＫＲ及びＳＤＨ酵素が１個のポリペプチド上に存在することを立証する。ｃＤＮＡから得られたアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨ遺伝子の完全なタンパク質コーディング配列を配列番号：１１１に示す。アラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定されるアミノ酸配列を配列番号：１１２に示す。そのタンパク質はＮ末端のターゲッティングシグナルを欠いており、リシン分解経路が植物細胞サイトゾルに位置することを意味する。アラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨアミノ酸配列と他のＬＫＲタンパク質のものとの比較に基づいて縮重オリゴヌクレオチド、配列番号：１１３及び配列番号：１１４を設計した。発生中のダイズまたはトウモロコシ種子から単離されたｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡからＰＣＲを用いてダイズ及びトウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡフラグメントを増幅するためにこれらを用いた。ダイズ及びトウモロコシのＰＣＲにより作製されたｃＤＮＡフラグメントをクローン化し、シークエンスした。ダイズＬＫＲ／ＳＤＨｃＤＮＡフラグメントの配列を配列番号：１１５に示し、トウモロコシｃＤＮＡフラグメントの配列を配列番号：１１６に示す。ダイズＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を配列番号：１１７に示し、トウモロコシＬＫＲ／ＳＤＨタンパク質の推定される部分アミノ酸配列を配列番号：１１８に示す。上記のＰＣＲにより得られたトウモロコシ及びダイズＬＫＲ／ＳＤＨをコードする部分ｃＤＮＡをこれらの機能のために配列情報を伸ばすプロトコルにおいて用いた。ＲＡＣＥ及び重複するクローンの同定のためのｃＤＮＡライブラリーへの直接ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを含んだこれらのプロトコルは当業者によく知られている。これらの作業から、ＬＫＲ／ＳＤＨのトウモロコシ及びダイズｃＤＮＡのより完全な配列が得られた。配列番号：１１９及び１２０にそれぞれダイズ及びトウモロコシからのＬＫＲ／ＳＤＨコーディング領域のほぼ全長配列を挙げる。これらのダイズ及びトウモロコシｃＤＮＡによりコードされる推定タンパク質配列をそれそれ配列番号：１２１及び１２２に示す。イネの根及び葉から、そしてコムギ実生から調製したライブラリーにおいてイネ及びコムギからのＬＫＲ／ＳＤＨの部分ｃＤＮＡクローンを同定した。Ｕｎｉ −ＺＡＰ^TM（商標）ＸＲベクター中に製造業者のプロトコル（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製した。Ｕｎｉ−ＺＡＰ^TM ＸＲライブラリーのプラスミドライブラリーへの転化をＳｔｒａｔａｇｅｎｅにより提供されるプロトコルに従って成し遂げた。転化時に、ｃＤＮＡインサートはプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に含まれる。挿入されたｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により組み換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含有する無作為に選択したバクテリアコロニーからのｃＤＮＡインサートを増幅するかまたは培養したバクテリア細胞からプラスミドＤＮＡを調製した。増幅されたインサートＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを色素−プライマーシークエンシング反応でシークエンスして部分ｃＤＮＡ配列（発現された配列タグまたは「ＥＳＴ」；Ａｄａｍｓ、Ｍ．Ｄ．等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６５１を参照）を生成した。得られたＥＳＴをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＭｏｄｅｌ３７７蛍光シーケンサーを用いて分析した。ＥＳＴによりコードされる可能なタンパク質産物をアラビドプシスＬＫＲ／ＳＤＨの全長配列（配列番号：１１２）と比較した。イネからの部分ｃＤＮＡのコンティグを構築し、配列番号：１２５に示す。ｃＤＮＡコンティグからの推定されるタンパク質フラグメントを配列番号：１２６に示す。ＬＫＲ／ＳＤＨコーディング領域の３’末端に相当するイネからのもう１つのｃＤＮＡが同定され、この配列を配列番号：１２７に記述する。推定されるタンパク質フラグメントを配列番号：１２８に示す。部分コムギクローンが同定され、配列番号：１２９に示される配列を保有する。このｃＤＮＡによりコードされる推定タンパク質フラグメントを配列番号：１３０に記述する。ＳＤＨコーディング領域はアラビドプシスｃＤＮＡクローンの３’末端上の１．４ｋｂを包含し（配列番号：１３１）、約５２ｋｄのタンパク質（配列番号：１３２）をコードする。適切な制限酵素部位を付加するＰＣＲプライマーを用いてＳＤＨをコードするＤＮＡフラグメントを作製し、真核生物発現ベクターｐＢＴ４３０中に連結した（実施例２参照）。制限酵素切断部位の付加は２番目のコドンによりコードされるｔｈｒからａｌａへの変異をもたらした。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ宿主でアラビドプシスＳＤＨの高レベルの発現を得た。１．４ｋｂのインサートを保有するベクターで形質転換されたＩＰＴＧ誘導細胞からの抽出物をＳＤＳ −ＰＡＧＥで分析し、予想される大きさのタンパク質がこれらの細胞において過剰生産された。細胞抽出物をその上清（可溶性）及びペレット（不溶性）画分に分離することにより、かなりの量のタンパク質が両方に存在することが示された。バクテリア抽出物の可溶性画分においてＳＤＨ活性が測定された。未修飾ベクターで形質転換された細胞からの抽出物ではいかなるＳＤＨ活性も見られなかった。ＳＤＨｃＤＮＡインサートを含有する細胞からの抽出物はかなりの量のＮＡＤ⁺をＮＡＤＨに転化した。ＳＤＨ基質サッカロピンの非存在下ではいかなる顕著な活性も見られなかったので反応はＳＤＨ特異的であった。これらのバクテリア抽出物からＳＤＨタンパク質を精製し、タンパク質に対するウサギ抗体を作製するために用いた。形質転換された植物においてＬＫＲ遺伝子の発現を阻止するために、ＬＫＲ遺伝子または遺伝子フラグメントを上記の植物プロモーター配列のいずれかに連結することによりＬＫＲの共抑制のために設計されたキメラ遺伝子を構築する。（共抑制により植物遺伝子発現を阻止するための方法論は米国特許第５，２３１，０２０号を参照）。ＰＣＲを用いて位置７にＮｃｏＩ部位、そして位置１２６５にＫｐｎＩ部位を導入することによりトウモロコシＬＫＲ遺伝子、配列番号：１２０を改変した。トウモロコシＬＫＲ遺伝子フラグメントを含有するこのＮｃｏＩ及びＫｐｎＩＤＮＡフラグメントをグルテリン２プロモーター及び１０ｋＤゼイン３’領域を含有するプラスミド中に挿入して（実施例２５参照）トウモロコシ内乳におけるＬＫＲ発現の抑制のためのキメラ遺伝子を作製した。ＰＣＲを用いて位置２にＮｃｏＩ部位、そして位置６９０にＫｐｎＩ部位を導入することによりダイズＬＫＲ遺伝子、配列番号：１１９を改変した。ダイズＬＫＲ遺伝子フラグメントを含有するこのＮｃｏＩ及びＫｐｎＩＤＮＡフラグメントをＫＴＩ３プロモーター及びＫＴＩ３３’領域を含有するプラスミド中に挿入して（実施例６参照）ダイズ種子におけるＬＫＲ発現の抑制のためのキメラ遺伝子を作製した。あるいはまた、上記の植物プロモーター配列のいずれかにＬＫＲ遺伝子または遺伝子フラグメントを逆向きに連結することによりＬＫＲの全部または一部のアンチセンスＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子を構築する。（アンチセンスＲＮＡにより植物遺伝子発現を阻止するための方法論は米国特許第５，１０７，０６５号を参照。）他の実施例、例えば実施例１８または実施例１９において記述したように形質転換により共抑制またはアンチセンスキメラ遺伝子のいずれかを植物中に導入する。内因性ＬＫＲ遺伝子の発現が減少されるかまたは除かれる形質転換体を選択する。実施例２１発現ベクターｐＳＫ５における合成遺伝子の構築以下に記述する合成遺伝子の構築及び発現を容易にするために、以下の特質：１．配列の挿入が唯一の部位を生じるようにＥａｒＩ制限エンドヌクレアーゼ部位がない、２．増殖及び有毒なタンパク質の発現中にプラスミドの喪失を避けるためにテトラサイクリン耐性遺伝子を含有すること、３．エシェリキア・コリにおける挿入配列の発現のためにＴ７プロモーター及びターミネーターセグメントを含むプラスミドｐＢＴ４３０からの約２９０ｂｐを含有すること、４．オリゴヌクレオチド配列を挿入できるようにＴ７プロモーターの後ろの適切な位置に唯一のＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有すること、を有するプラスミドベクターを構築することが必要であった。特質１及び２を獲得するために、出願人等はアンピシリン遺伝子及びその遺伝子の近くのＥａｒＩ部位が除かれたｐＢＲ３２２の自発突然変異体であるプラスミドｐＳＫ１を用いた。プラスミドｐＳＫ１はテトラサイクリン耐性遺伝子、塩基１に唯一のＥｃｏＲＩ制限部位及び塩基２３５３に単一のＥａｒＩ部位を保持した。ｐＳＫ１の塩基２３５３のＥａｒＩ部位を除くために、ｐＳＫ１を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＡＢＩ１３０６ＢＤＮＡ合成機で製造業者の方法を用いて合成された各１μｇのオリゴヌクレオチドＳＭ７０及びＳＭ７１と約１０フェムトモルのｐＳＫ１を混合した。ｐＳＫ１鋳型上のこれらのオリゴヌクレオチドのプライミング部位を図１０に示す。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓキット（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いて同じ会社により製造されたサーモサイクラーで販売業者の説明書に従ってＰＣＲを実施した。２５サイクルは９５℃で１分、４２℃で２分、そして７２℃で１２分であった。ＥａｒＩ部位のまわりの３０ｂｐフラグメントを除いて全ｐＳＫ１プラスミドの複製をプライムするようにオリゴヌクレオチドを設計した（図１０参照）。１００μＬの反応生成物のうち１０μＬを１％アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色し、複製されたプラスミドの予測される大きさに相当する約３．０ｋｂのバンドを示した。ＰＣＲ反応混合物の残り（９０μＬ）を２０μＬの２．５ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）と混合し、３０ユニットのクレノウ酵素を添加し、混合物を３７℃で３０分間、続いて６５℃で１０分間インキュベートした。ＰＣＲにより生成されたふぞろいな末端を埋めるためにクレノウ酵素を用いた。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥させ、水に再懸濁した。次に、キナーゼバッファー中１ｍＭＡＴＰの存在下でＤＮＡをＴ４ＤＮＡキナーゼで処理した。この混合物を３７℃で３０分間、続いて６５℃で１０分間インキュベートした。１０μＬのキナーゼ処理した調製物に、２μＬの５ｘライゲーションバッファー及び１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加した。ライゲーションを１５℃で１６時間実施した。ライゲーション後にＤＮＡを半分に分け、片方をＥａｒＩ酵素で消化した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］中に記述されたようにクレノウ、キナーゼ、ライゲーション及び制限エンドヌクレアーゼ反応を実施した。クレノウ、キナーゼ、リガーゼ及び大部分の制限エンドヌクレアーゼをＢＲＬから購入した。いくつかの制限エンドヌクレアーゼはＮＥＮＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］中に記述されたようにＣａＣｌ₂法を用いて両方の連結されたＤＮＡサンプルをコンピテントＪＭ１０３［ｓｕｐＥｔｈｉ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^q ｌａｃＺ ΔＭ１５］制限マイナス］細胞中に別個に形質転換し、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する培地で平板培養した。ＥａｒＩ消化してもしなくても同じ数の形質転換体が回収され、Ｅａｒｌ部位がこれらの構築物から除かれていることを示唆した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］中に記述されたようにアルカリ溶解ミニプレップ法でＤＮＡを調製し、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化分析によりクローンをスクリーニングした。テトラサイクリン耐性であり且つＥａｒＩ部位を含まない単一のクローンを選択した。このベクターをｐＳＫ２と称した。プラスミドをＥｃｏＲＩで完全に消化し、クレノウで末端を埋め、そして連結することによりｐＳＫ２の残っているＥｃｏＲＩ部位を壊した。ＥｃｏＲＩ部位を含まないクローンをｐＳＫ３と称した。上記の特質３及び４を獲得するために、プラスミドｐＢＴ４３０（実施例２参照）からのバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター／ターミネーターセグメントをＰＣＲにより増幅した。Ｔ７プロモーター／ターミネーター配列に及ぶｐＢＴ４３０からの３００ｂｐフラグメントをプライムするようにオリゴヌクレオチドプライマーＳＭ７８（配列番号：１８）及びＳＭ７９（配列番号：１９）を設計した（図１０参照）。ｐＢＴ４３０を鋳型として用いて先に記述したようにＰＣＲ反応を実施し、３００ｂｐのフラグメントを生成した。上記のようにフラグメントの末端をクレノウ酵素を用いて埋め、リン酸化した。プラスミドｐＳＫ３からのＤＮＡをＰｖｕ II酵素で完全に消化し、次に、５’リン酸を除くために仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で処理した。方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］中に記述されたとおりであった。切断し、脱リン酸化したｐＳＫ３ＤＮＡをエタノール沈殿により精製し、Ｔ７プロモーター配列を含有するＰＣＲで作製されたフラグメントとのライゲーション反応に一部を用いた。ライゲーション混合物をＪＭ１０３［ｓｕｐＥｔｈｉ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’ ［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^q ｌａｃＺ ΔＭ１５］制限マイナス］中に形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーをスクリーニングした。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解ミニプレップ法により調製し、ＰＣＲ産物の挿入及び向きを検出するために制限エンドヌクレアーゼ分析を実施した。２個のクローンを配列分析のために選択した：プラスミドｐＳＫ５は図１０に示される向きにフラグメントを有した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^R（商標）Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）及び製造業者の勧めるプロトコルを用いてアルカリ変性した二本鎖ＤＮＡで実施した配列分析から、ｐＳＫ５がＴ７プロモーター／ターミネーター配列内にＰＣＲ複製エラーを含まないことが示された。ＥａｒＩ部位に基づく反復された合成遺伝子配列の構築の方法を図１１に示す。第一段階は１４アミノ酸の基礎遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド配列の挿入であった。このオリゴヌクレオチドインサートは１つまたはそれ以上のヘプタド反復をコードするオリゴヌクレオチドを続いて挿入するための唯一のＥａｒＩ制限部位を含有し、そして植物ベクターへの遺伝子配列の導入に用いるための唯一のＡｓｐ７１８制限部位を付加した。オリゴヌクレオチド組の突出末端はベクターｐＳＫ５の唯一のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位への挿入を可能にした。プラスミドｐＳＫ５からのＤＮＡをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、アガロースゲル電気泳動により精製した。精製したＤＮＡ（０．１μｇ）を各１μｇのオリゴヌクレオチドＳＭ８０（配列番号：１４）及びＳＭ８１（配列番号：１３）と混合し、連結させた。ライゲーション混合物をエシェリキア・コリ株ＪＭ１０３［ｓｕｐＥｔｈｉ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^q ｌａｃＺ ΔＭ１５］制限マイナス］中に形質転換し、迅速プラスミドＤＮＡ調製及びそれに続く制限消化分析によりテトラサイクリン耐性形質転換体をスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの適切な挿入を示す各々１個のＥａｒＩ、ＮｃｏＩ、Ａｓｐ７１８及びＥｃｏＲＩ部位を有するクローンを選択した。このクローンをｐＳＫ６と称した（図１２）。Ｔ７プロモーターの後のＤＮＡの領域のシークエンシングにより、予想される配列のオリゴヌクレオチドの挿入が確かめられた。基礎遺伝子の唯一のＥａｒＩ部位に直接連結することができるオリゴヌクレオチド対を作製することにより、反復ヘプタドコーディング配列を上記の基礎遺伝子構築物に付加した。オリゴヌクレオチドＳＭ８４（配列番号：２３）及びＳＭ８５（配列番号：２４）はＳＳＰ５ヘプタドの反復をコードする。オリゴヌクレオチドＳＭ８２（配列番号：２５）及びＳＭ８３（配列番号：２６）はＳＳＰ７ヘプタドの反復をコードする。オリゴヌクレオチド組を連結させ、精製し、発現ベクターへの挿入のために複数のヘプタド反復をコードするＤＮＡフラグメントを得た。全部で約２μｇの各組からのオリゴヌクレオチドをリン酸化し、室温で２時間連結させた。オリゴヌクレオチド絹の連結されたマルチマーを１８％非変性２０Ｘ２０Ｘ０．０１５ｃｍポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）で分離した。バンドを含有するポリアクリルアミドの小片を細片に切断し、１．０ｍＬの０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を添加し、チューブを３７℃で一晩回転させることにより、１６８ｂｐ（８ｎ）またはそれより大きいとしてゲルで分離するマルチマー型を精製した。ポリアクリルアミドを遠心分離により落とし、上清に１μｇのｔＲＮＡを添加し、ＤＮＡフラグメントを−７０ ℃で２容量のエタノールで沈殿させ、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、乾燥させ、１０μＬの水に再懸濁した。１０μｇのｐＳＫ６ＤＮＡをＥａｒＩ酵素で完全に消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。切断し、脱リン酸したベクターＤＮＡを低融点アガロースゲルで電気泳動した後、バンドを形成したＤＮＡを切り出し、５５℃でアガロースを液化し、製造業者の勧める方法に従ってＮＡＣＳＰＲＥＰＡＣカラム（ＢＲＬ）で精製することにより単離した。約０．１μｇの精製したＥａｒＩ消化してホスファターゼ処理したｐＳＫ６ＤＮＡを５μＬのゲル精製したマルチマーオリゴヌクレオチド組と混合し、連結させた。連結混合物をエシェリキア・コリ株ＪＭ１０３［ｓｕｐＥｔｈｉ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^q ｌａｃＺ ΔＭ１５］制限マイナス］中に形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。挿入されたＤＮＡの長さを決定するために迅速プラスミド調製ＤＮＡの制限消化によりコロニーをスクリーニングした。通常、プラスミドＤＮＡをＡｓｐ７１８及びＢｇｌIIで消化し、続いて、１８％非変性ポリアクリルアミドゲルでフラグメントを分離することにより、制限エンドヌクレアーゼ分析を実施した。臭化エチジウムでのフラグメントの視覚化により、基礎遺伝子セグメントのみが存在する場合１５０ｂｐのフラグメントが生成されることが示された。オリゴヌクレオチドフラグメントの挿入はこの大きさを２１塩基の倍数で増やした。このスクリーニングから、ＤＮＡ配列分析及びエシエリキア・コリにおけるコード配列の発現のためにいくつかのクローンを選択した。表１４各構築物の配列に隣接する最初及び最後のＳＳＰ５ヘプタドは上記の基礎遺伝子からである。下線を引くことによりインサートを示す。オリゴヌクレオチドのオリゴマー型のゲル精製はより長い（すなわち、＞８ｎ）インサートの期待される濃縮を与えなかったので、出願人等は次の回の挿入構築物に対して異なる方法を用いた。このシリーズの構築物のためにそれぞれＳＳＰ８、９、１０及び１１アミノ酸配列をコードするもう４組のオリゴヌクレオチドを作製した：上記のようにオリゴヌクレオチドをリン酸化し、連結させた後にオリゴヌクレオチド組のマルチマー型を精製するために以下のＨＰＬＣ法を用いた。ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ液体クロマトグラプ装置、モデル１０９０Ｍでクロマトグラフィーを実施した。流出液吸光度を２６０ｎｍでモニターした。連結されたオリゴヌクレオチドを１２，０００ｘｇで５分間遠心分離し、０．５ミクロンインラインフィルター（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を備えた２．５ミクロンＴＳＫＤＥＡＥ−ＮＰＲイオン交換カラム（３５ｃｍｘ４．６ｍｍｉ．ｄ．）に注入した。勾配溶出及び２つのバッファー移動相［バッファーＡ：２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．０及びバッファーＢ：バッファーＡ＋１ＭＮａＣｌ］を用いてオリゴヌクレオチドを長さに基づいて分離した。バッファーＡ及びＢの両方を使用前に０．２ミクロンフィルターに通した。以下の勾配プログラムを３０℃で１ｍＬ／分の流速で用いた：３分ないし９分の間で画分（５００μＬ）を集めた。プラスミドＤＮＡの制限消化物のコントロール分離から測定した場合に１２０ｂｐないし２０００ｂｐの間の長さに相当する画分をプールした。１０μｇのｔＲＮＡ及び９．０ｍＬのエタノールを添加することにより各オリゴヌクレオチド組のプールした画分の４．５ｍＬを沈殿させ、７０％エタノールで２回すすぎ、５０μＬの水に再懸濁した。１０μＬの再懸濁したＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを上記のＥａｒＩ切断して脱リン酸したｐＳＫ６ＤＮＡ０．１μｇに添加し、１５℃で一晩連結させた。また、リン酸化し、自己連結させたが、ゲルまたはＨＰＬＣにより精製しなかった上記の全ての６つのオリゴヌクレオチド組もｐＳＫ６ベクターとの別のライベーション反応に用いた。ライゲーション混合物をエシェリキア・コリ株ＤＨ５α［ｓｕｐＥ４４ ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺ ΔＭ１５）ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｇｙｒ１９６ｔｈｉ１ｒｅｌＡ１］中に形質転換し、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。ＤＨ５α［ｓｕｐＥ４４ ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺ Δ Ｍ１５）ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｇｙｒ１９６ｔｈｉ１ｒｅｌＡ１］株は非常に高い形質転換率を有し、ｒｅｃＡ^-であるので、出願人等は全ての後の研究にこの株を用いることを選択した。ｒｅｃＡ^-表現型は、これらの反復的ＤＮＡ構造がマルチマー配列の欠失をもたらす相同組み換えの基質である可能性があるという懸念を排除する。クローンを上記のようにスクリーニングした。６つのオリゴヌクレオチド組の各々の挿入を示すためにいくつかのクローンを選択した。表１５配列に隣接する最初及び最後のＳＳＰ５ヘプタドは基礎遺伝子配列を表す。インサート配列に下線を引く。文字「Ｈ」を含んでいるグローン番号はＨＰＬＣにより精製されたオリゴヌクレオチドを示す。クローン８２−４の最初の基礎遺伝子反復の喪失は、ベクターｐＳＫ６をｒｅｃＡ ^-株に導入する前に基礎遺伝子反復５．５間の相同組み換えから生じた可能性がある。ＨＰＬＣ法は基礎遺伝子へのオリゴヌクレオチド組のより長いマルチマー型の挿入を高めなかったが、連結されたオリゴヌクレオチドの効率より精製として役立った。ＳＳＰ配列の混合物をコードし、できるだけ多くのコドン使用を変えるオリゴヌクレオチドを設計した。いったん合成遺伝子が植物中に形質転換された場合に組み換えによる反復インサートの欠失の可能性を減らすため及び構築される遺伝子セグメントの長さを伸ばすためにこれを実施した。これらのオリゴヌクレオチドは４反復のヘプタドコーディング単位（２８アミノ酸残基）をコードし、先に構築したクローンのいずれかの唯一のＥａｒＩ部位に挿入することができる。ＳＭ９６及びＳＭ９７はＳＳＰ（５）₄をコードし、ＳＭ９８及びＳＭ９９はＳＳＰ（７）₄をコードし、ＳＭ１００及びＳＭ１０１はＳＳＰ８．９．８．９をコードする。クローン８２−４及び８４−Ｈ３からのＤＮＡをＥａｒＩ酵素で完全に消化し、ホスファターゼで処理し、ゲル精製した。約０．２μｇのこのＤＮＡを先にリン酸化した１．０μｇの各々のオリゴヌクレオチド組ＳＭ９６及びＳＭ９７、ＳＭ９８及びＳＭ９９またはＳＭ１００及びＳＭ１０１と混合した。ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを一晩連結させ、次に、ライゲーション混合物をエシェリキア・コリ株ＤＨ５α中に形質転換した。オリゴヌクレオチドインサートの存在に関して上記のようにテトラサイクリン耐性コロニーをスクリーニングした。クローンをそれらの制限エンドヌクレアーゼ消化パターンに基づいて配列分析のために選択した。表１６挿入されたオリゴヌクレオチドセグメントに下線を引く。クローン２−９はクローン８２−４（上記参照）のＥａｒＩ部位に連結されたオリゴヌクレオチドＳＭ１００（配列番号：７１）及びＳＭ１０１（配列番号：７２）から得られた。クローン３−５（配列番号：７８）はクローン８２−４（配列番号：５３）のＥａｒＩ部位へのオリゴヌクレオチド組ＳＭ９６（配列番号：６５）及びＳＭ９７（配列番号：６６）の最初の２２塩基の挿入から得られた。この部分挿入はこれらの非常に反復の多いオリゴの誤ったアニーリングを示す可能性がある。クローン５−１（配列番号：７６）はクローン８４−Ｈ３（配列番号：５５）のＥａｒＩ部位に連結されたオリゴヌクレオチドＳＭ９８（配列番号：６８）及びＳＭ９９（配列番号：６９）から得られた。方法II．ＤＮＡ及びアミノ酸配列の両方のより多くの柔軟性を可能にするために合成遺伝子配列の構築のための第二の方法を実施した。この方法を図１３及び図１４に示す。第一段階は１６アミノ酸の基礎遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド配列を元のベクターｐＳＫ５に挿入することであった。このオリゴヌクレオチドインサートは１つまたはそれ以上のヘプタド反復をコードするオリゴヌクレオチドの次の挿入に用いるために先の基礎遺伝子構築物におけるように唯一のＥａｒＩ部位を含有した。また、基礎遺伝子は３’末端にＢｓｐＨ１部位も含んだ。ＮｃｏＩ突出末端を用いて「インフレーム」タンパク質融合ができるようにこの切断部位の突出末端を設計する。それ故、図１４に示した重複スキームを用いて遺伝子セグメントを増やすことができる。オリゴヌクレオチド組の突出末端はベクターｐＳＫ５の唯一のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位への挿入を可能にした。上の方法Ｉにおいて記述したようにｐＳＫ５ベクターにオリゴヌクレオチド組を挿入した。得られたプラスミドをｐＳＫ３４と称した。上記のような方法を用いて３５アミノ酸「セグメント」をコードするオリゴヌクレオチド組をｐＳＫ３４基礎遺伝子の唯一のＥａｒＩ部位に連結した。この場合、オリゴヌクレオチドをゲルまたはＨＰＬＣ精製せず、単にアニーリングさせ、ライゲーション反応に用いた。以下のオリゴヌクレオチド組を用いた：制限消化及びそれに続く６％アクリルアミドゲルでのフラグメントの分離により挿入されたセグメントの存在に関してクローンをスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの適切な挿入をＤＮＡ配列分析により確かめた。セグメント３、４及び５をそれぞれ含有するクローンをｐＳＫｓｅｇ３、ｐＳＫｓｅｇ４及びｐＳＫｓｅｇ５と称した。これらの「セグメント」クローンを図１４に示すような重複スキームに用いた。１０μｇのプラスミドｐＳＫｓｅｇ３をＮｈｅＩ及びＢｓｐＨ１で完全に消化し、Ｗｈａｔｍａｎ紙技術を用いて１５０３ｂｐフラグメントをアガロースゲルから単離した。１０μｇのプラスミドｐＳＫｓｅｇ４をＮｈｅＩ及びＮｃｏＩで完全に消化し、２１０９ｂｐバンドをゲル単離した。等量のこれらのフラグメントを連結させ、テトラサイクリンで組み換え体を選択した。制限消化によりクローンをスクリーニングし、それらの配列を確かめた。得られたプラスミドをｐＳＫｓｅｇ３４と称する。上記と同様にｐＳＫｓｅｇ３４及びｐＳＫｓｅｇ５プラスミドＤＮＡを消化し、フラグメントを単離し、連結させてセグメント３及び４に融合したセグメント５をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを作製した。この構築物をｐＳＫｓｅｇ５３４と称し、それは以下のアミノ酸配列をコードする：実施例２２植物の種子における発現のためのＳＳＰキメラ遺伝子の構築植物種子において実施例２１に記述した合成遺伝子産物を発現させるために、種子プロモーターベクターｐＣＷ１０８、ｐＣＷ１０９またはｐＭＬ１１３にそれらの配列を導入した（図１５）。ベクターｐＣＷ１０８及びｐＭＬ１１３はマメファゼオリンプロモーター（塩基＋１から塩基−４９４まで）及びマメファゼオリン遺伝子からの１１９１塩基の３’配列を含有する。プラスミドｐＣＷ１０９はダイズβ−コングリシニンプロモーター（塩基＋１から塩基−６１９まで）及びマメファゼオリン遺伝子からの同じ１１９１塩基の３’配列を含有する。唯一のＮｃｏｌ及びＡｓｐ７１８部位にコーディング配列を直接クローニングできるようにこれらのベクターを設計した。また、これらのベクターは適切なバイナリーベクターに直接プロモーター／コーディング領域／３’配列を移すことができるように５’及び３’末端に部位（ＨｉｎｄIIIまたはＳａｌＩ）も与える。合成貯蔵タンパク質遺伝子配列を挿入するために、１０μｇのベクターＤＮＡをＡｓｐ７１８及びＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。１５ボルトで１．０％アガロースゲルで一晩の電気泳動により直鎖状にしたベクターを精製した。バンドの前でアガロースを切断し、１０ｘ５ｍｍ片のＷｈａｔｍａｎ３ＭＭ紙をアガロース中に挿入し、フラグメントを紙に電気泳動することによりフラグメントを集めた［Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１８：１７］。遠心分離によりフラグメント及びバッファーを紙から出し、１０ｍｇのｔＲＮＡ、１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム及び２００μＬのエタノールを添加することにより〜１００μＬ中のＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％エタノールで２回洗浄し、真空下で乾燥させた。フラグメントＤＮＡを２０μＬの水に再懸濁し、ライゲーション反応に用いるために一部を１０倍希釈した。（ＳＳＰ３−５コーディング配列を保有する）クローン３−５からのプラスミドＤＮＡ（１０ｍｇ）及び（ＳＳＰ５３４コーディング配列を保有する）ｐＳＫ５３４をＡｓｐ７１８及びＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。消化産物を１８％ポリアクリルアミド非変性ゲルで分離した。所望するフラグメントを含有するゲル切片をゲルから切断し、ゲル切片を１％アガロースゲルに挿入し、１００ボルトで２０分間電気泳動することにより精製した。ＤＮＡフラグメントを１０ｘ５ｍｍ切片のＷｈａｔｍａｎ３ＭＭ紙上に集め、バッファー及びフラグメントを遠心分離により出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。フラグメントを６μＬの水に再懸濁した。１μＬの上記の希釈したベクターフラグメント２μＬの５ｘライゲーションバッファー及び１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加した。混合物を15℃で一晩連結させた。ライゲーション混合物をエシェリキア・コリ株ＤＨ５α［ｓｕｐＥ４４ ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺ ΔＭ１５）ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｇｙｒ１９６ｔｈｉ１ｒｅｌＡ１］中に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。迅速プラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化分析及びＤＮＡシークエンシングによりクローンをスクリーニングした。実施例２３キメラ遺伝子ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４及び β−コングリシニンプロモーター／ＳＳＰ３−５を含有するタバコ植物タバコ植物に実施例２２のキメラＳＳＰ３−５遺伝子並びに実施例４のキメラエシェリキア・コリｄａｐＡ及びｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子を導入するためにバイナリーベクターｐＺＳ９７を用いた。バイナリーベクターｐＺＳ９７（図６）はアグロバクテリウム・ツメファシエンスのバイナリーＴｉプラスミドベクター系［Ｂｅｖａｎ、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２０］の一部である。ベクターは：（１）形質転換された植物細胞の選択マーカーとしてのキメラ遺伝子ノパリンシンターゼ：：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｏｓ：：ＮＰＴII）［Ｂｅｖａｎ等、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０４：１８４−１８６］、（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左及び右境界［Ｂｅｖａｎ、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１ −８７２０］、（３）ポリリンカー領域中に唯一のＳａｌＩ部位（ｐＳＫ９７Ｋ）または唯一のＨｉｎｄIII部位（ｐＺＳ９７）を有するエシェリキア・コリｌａｃＺ α−相補性セグメント［Ｖｉｅｒａ等、（１９８２）Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６７］、（４）シュードモナスプラスミドｐＶＳ１からのバクテリアの複製起点［Ｉｔｏｈ等、（１９８４）Ｐｌａｓｍｉｄ１１：２０６−２２０］及び（５）形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの選択マーカーとしてのバクテリアβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。プラスミドｐＺＳ９７ＤＮＡをＨｉｎｄIII酵素で完全に消化し、消化したプラスミドをゲル精製した。ＨｉｎｄIII消化したｐＺＳ９７ＤＮＡをＨｉｎｄII I消化してゲル単離した実施例２２のキメラＳＳＰ３−５遺伝子と混合し、連結させ、形質転換し、アンピシリンでコロニーを選択した。カルベニシリン耐性を選択するアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４［Ｈｏｃｋｅｍａ等、（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９− １８０］に３親接合［Ｒｕｖｋｉｎ等、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２８９：８５−８８］によりキメラ遺伝子を含有するバイナリーベクターを導入した。バイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムの培養物を用いてタバコ葉盤を形質転換した［Ｈｏｒｓｃｈ等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９− １２３１］。トラスジェニック植物をカナマイシンを含有する選択培地で再生させた。キメラ遺伝子、β−コングリシニンプロモーター／ＳＳＰ３−５／ファゼオリン３’領域を含有する形質転換されたタバコ植物をこのようにして得た。ＳＳＰ３−５遺伝子の単一部位挿入を保有する２つの形質転換系統、ｐＳＫ４４ −３Ａ及びｐＳＫ４４−９Ａをカナマイシン耐性のマーカー遺伝子の３：１分離に基づいて同定した。次に、導入遺伝子がホモである一次形質転換体の子孫、ｐＳＫ４４−３Ａ−６及びｐＳＫ４４−９Ａ−５をこれらの植物の種子におけるカナマイシン耐性の４：０分離に基づいて同定した。同様に、キメラ遺伝子ファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域及びファゼオリン５’領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域を有する形質転換されたタバコ植物を実施例１２において記述したように得た。ＤＨＤＰＳ及ＡＫ遺伝子の単一部位挿入を保有する形質転換系統、ＢＴ５７０−４５Ａをカナマイシン耐性のマーカー遺伝子の３：１分離に基づいて同定した。次に、導入遺伝子がホモである一次形質転換体の子孫、ＢＴ５７０−４５Ａ−３及ＢＴ５７０−４５Ａ−４をこれらの植物の種子におけるカナマイシン耐性の４：０分離に基づいて同定した。３つ全てのキメラ遺伝子を保有する植物を作製するためにホモの親を用いて遺伝交配を実施した。温室条件で植物を成熟するまで成長させた。開花の１日前に雄性植物及雌性植物として用いる花を選択し、開花したより古い花を取り除いた。交配のために、葯が裂開性でない場合、開花のすぐ前の時点で雌性花を選択した。花冠を片側で開き、葯を除いた。同じ日に開花し、成熟した花粉を落としている裂開性の約を有する花として雄性花を選択した。葯を取り出し、葯を除いた雌性花の雌しべに受粉するために用いた。次に、さらなる受粉を防ぐために雌しべをプラスチック管て覆った。莢を発生させ、４−６週間乾燥させ、採取した。各交配から２ないし３個の別個の莢を回収した。以下の交配を実施した：各交配から乾燥した莢をつぶして開き、種子を集め、プールした。各交配に対して３０個の種子を数え、コントロールには各親の自殖させた花からの種子を用いた。実施例８において記述したように二重反復種子サンプルを加水分解し、全アミノ酸含有量をアッセイした。２．５６％のリシンを含有する野生型種子に対する全種子アミノ酸のパーセントとしてのリシンの増加の量を種子の内乳における各遺伝子のコピー数と共に表１６に示す。表１７＊コピー数は種子の集団の平均である。これらの交配の結果から、リシン生合成遺伝子及び高リシンタンパク質ＳＳＰ３−５の同等発現により種子の全リシンレベルを増加できることが示される。雑種タバコ植物から得られる種子では、生合成遺伝子が雌性親から得られる場合にこの相乗作用が最も強い。生合成遺伝子及びリシンに富んだタンパク質遺伝子が全てホモである場合、リシンレベルはさらに増加されると考えられる。実施例２４キメラ遺伝子ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ、ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４及びファゼオリンプロモーター／ＳＳＰ３−５を含有するダイズ植物キメラ遺伝子、ファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファゼオリン３’領域及びファゼオリンプロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ファゼオリン３’領域を発現する形質転換されたダイズ植物を実施例１９において記述した。実施例１９において記述したように同等なダイズ形質転換ベクタープラスミドｐＭＬ６３（図１６）にキメラ遺伝子、ファゼオリンプロモーター／ＳＳＰ３−５／ファゼオリン３’領域を単離したＨｉｎｄIIIフラグメントとして挿入し、形質転換を実施することによりキメラ遺伝子を発現する形質転換されたダイズ植物を得た。胚軸から離れた種子の側から小片を切断することにより一次形質転換体からの種子のサンプルを取った。分離する種子のどれが導入遺伝子を保有するかを決定するために実施例１９において記述したように小片をＧＵＳ活性に関してアッセイした。半分の種子をすりつぶして荒粉にし、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＳＳＰ３−５タンパク質の発現に関してアッセイした。以下のように実施した：ＰｈａｒｍａｃｉａｐＧＥＸＧＳＴ遺伝子融合システム（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ１６．７．１−８（１９８９）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ）の使用によりグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＳＳＰ３−５遺伝子産物の融合タンパク質を作製した。グルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ）またはグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ビーズでのアフィニティークロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）フィルターを用いて濃縮し、次に、さらなる精製のためにＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（１５％アクリルアミド、１９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）に供した。ゲルをクーマシーブルーで３０分間染色し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸で脱色し、ＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｌｕｔｅｒＭｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ（ＰａｕｌＴ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ編集、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＭｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９）を用いてタンパク質バンドを電気溶出した。同じように調製して泳動したもう１枚のゲルを酢酸を含有しない染色［９の割合の５０％（ｖ／ｖ）メタノール中０．１％のクーマシーブルーＧ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び１の割合の蒸留水中のセルバブルー（ＳｅｒｖａＢｌｕｅ）（Ｓｅｒｖａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）］中で１−２時間染色した。ＧＳＴ−ＳＳＰ３ −５バンドがちょうどわずかに見えるまで２０％（ｖ／ｖ）メタノール、３％（ｖ／ｖ）グリセロール中でゲルを０．５− １時間しばらく脱色させた。このバンドをゲルから切り出し、ニュージーランドウサギを免疫する際に抗原として用いるためにＨａｚｅｌｔｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに電気溶出した物質と共に送った。全部で１ｍｇの抗原を用いた（ゲル中の０．８ｍｇ、溶液中の０．２ｍｇ）。試験出血が３週毎にＨａｚｅｌｔｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供された。タンパク質及び血清の異なる希釈でＴ７プロモーターの制御下にＳＳＰ３−５遺伝子を含有する細胞からのエシェリキア・コリ抽出物のウェスタンブロッティングによりおおよその力価を試験した。プロテインＡセファロースカラムを用いてＩｇＧを血清から単離した。ＩｇＧをウェル当たり５μｇでマイクロタイタープレート上に被覆した。ＩｇＧの別の部分をビオチン化した。通常、１μｇの全タンパク質を含有するサンプルから出発して、トランスジェニック植物からの水性抽出物を希釈し、ウェルに添加した。希釈物の少なくとも１つが同じプレート上に作製した標準曲線の範囲内である結果を示すことを確実にするためにサンプルをもう数倍希釈した。化学的に合成したＳＳＰ３−５タンパク質を用いて標準曲線を作製した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、プレートを洗浄した。次に、ビオチン化したＩｇＧをウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した。ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した。１Ｍジエタノールアミン中１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェートからなる基質をウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。５％ＥＤＴＡ停止溶液をウェルに添加し、４０５ｎｍマイナス６５０ｎｍの読み取りで吸光度を読み取った。トランスジェニックダイズ植物はＳＳＰ３−５として０．５ないし２．０％の水抽出できるタンパク質を含有した。ＧＵＳ及びＳＳＰ３−５タンパク質に関して陽性の残りの半分の種子を植え、温室条件で成熟するまで育てた。ＧＵＳ表現型のホモ接合体を決定するために、これらのＲ１植物からの種子を上記のようにＧＵＳ活性の分離に関してスクリーニングした。次に、ファゼオリン／ＳＳＰ３−５遺伝子がホモの植物をコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子産物を発現するかまたはコリネバクテリアｄａｐＡ遺伝子産物とエシェリキア・コリｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子産物を発現するホモのトランスジェニックダイズと交配させる。遺伝交配によりキメラＳＳＰ遺伝子とキメラｃｏｒｄａｐＡ遺伝子及びエシェリキア・コリｌｙｓＣ−Ｍ４遺伝子を一緒にする好ましい変わりのものとして、実施例１９において記述したように全ての遺伝子を保有する単一のダイズ形質転換ベクターを上記の遺伝子フラグメントから構築し、ダイズ中に形質転換することができる。実施例２５形質転換されたトウモロコシの胚及び内乳におけるコリネバクテリアＤＨＤＰＳ、ｌｙｓ^rートウモロコシＤＨＤＰＳ、エシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４及びＳＳＰ３−５タンパク質の発現のためのキメラ遺伝子の構築トウモロコシへの形質転換のために以下のキメラ遺伝子を作製した：グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域グロブリン１プロモーター／ＳＳＰ３−５／グロブリン１３’ 領域グルテリン２プロモーター／ＳＳＰ３−５／１０ｋＤ３’領域グロブリン１プロモーター／トウモロコシｌｙｓ^r−突然変異体ＤＨＤＰＳ遺伝子／グロブリン１３’領域グルテリン２プロモーター／トウモロコシｌｙｓ^r−突然変異体ＤＨＤＰＳ遺伝子／１０ｋＤ３’領域公開された配列［Ｒｅｉｎａ等（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：６４２６−６４２６］に基づいたプライマーでＰＣＲを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡからグルテリン２プロモーターをクローン化した。プロモーターフラグメントはＡＴＧ翻訳開始コドンから上流の１０２０ヌクレオチドを含む。直接翻訳融合を可能にするためにＡＴＧ開始部位にＰＣＲによりＮｃｏＩ部位を導入した。プロモーターの５’末端にＢａｍＨＩ部位を挿入した。１．０２ｋｂのＢａｍＨＩ〜ＮｃｏＩプロモーターフラグメントを植物発現ベクターｐＭＬ６３（実施例２４参照）のＢａｍＨＩ〜ＮｃｏＩ部位にクローン化し、３５Ｓプロモーターを置き換えてベクターｐＭＬ９０を作製した。このベクターはＧＵＳコーディング領域に連結されたグルテリン２プロモーター及びＮＯＳ３’を含有する。公開された配列［Ｋｉｒｉｈａｒａ等（１９８８）Ｇｅｎｅ７１：３５９− ３７０］に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより作製された１０ｋＤゼイン遺伝子クローンから１０ｋＤゼイン３’領域を得た。３’領域は停止コドンから９４０ヌクレオチド伸びる。クローニングを容易にするためにオリゴヌクレオチド挿入によりＫｐｎＩ、ＳｍａＩ及びＸｂａＩ部位の制限エンドヌクレアーゼ部位をＴＡＧ終止コドンのすぐ後に付加した。１０ｋＤ３’領域を含有するＳｍａＩ〜ＨｉｎｄIIIセグメントを単離し、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII消化したｐＭＬ９０に連結してＮｏｓ３’配列を１０ｋＤ３’領域で置き換え、このようにしてプラスミドｐＭＬ１０３を作製した。ｐＭＬ１０３はグルテリン２プロモーター、ＧＵＳ遺伝子のＡＴＧ開始コドンにＮｃｏＩ部位、終止コドンの後にＳｍａＩ及びＸｂａＩ並びに９４０ヌクレオチドの１０ｋＤゼイン３’配列を含有する。グロブリン１遺伝子の公開された配列［Ｋｒｉｚ等（１９８９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１：６３６］に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いてＣｌｏｎｔｅｃｈトウモロコシゲノムＤＮＡライブラリーからグロブリン１プロモーター及び３’配列を単離した。クローン化されたセグメントはＡＴＧ翻訳開始コドンから１０７８ヌクレオチド上流に伸びるプロモーターフラグメント、イントロンを含む全グロブリンコーディング配列及び翻訳終止から８０３塩基伸びる３’配列を含有する。グロブリン１コーディング配列を他のコーディング配列で置き換えることができるように、ＰＣＲによりＮｃｏＩ部位をＡＴＧ開始コドンに導入し、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩ部位を翻訳終止コドンの後に導入してベクターｐＣＣ５０を作製した。グロブリン１プロモーターフラグメント内にもう一つのＮｃｏＩ部位がある。グロブリン１遺伝子カセットにはＨｉｎｄIII部位が隣接している。植物アミノ酸生合成酵素は葉緑体に局在化されることが知られており、それ故、葉緑体ターゲッティングシグナルを有して合成される。ＤＨＤＰＳ及びＡＫII Iのようなバクテリアのタンパク質にはそのようなシグナルがない。それ故、以下に記述するキメラ遺伝子中のｃｏｒｄａｐＡ及びｌｙｓＣ−Ｍ４コーディング配列に葉緑体移行配列（ｃｔｓ）を融合した。トウモロコシでは、用いたｃｔｓはトウモロコシからのリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのｃｔｓに基づき［Ｌｅｂｒｕｎ等（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：４３６０］、それをダイズｃｔｓから区別するためにｍｃｔｓと称する。オリゴヌクレオチド配列番号：９４−９９を合成し、実施例６において記述したように用いた。キメラ遺伝子：グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域を構築するために、プラスミドｐＢＴ５５８（実施例６参照）からｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４コーディング配列を含有するＮｃｏＩ〜ＨｐａＩフラグメントを単離し、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩ消化したｐＣＣ５０中に挿入し、プラスミドｐＢＴ６６３を作製した。キメラ遺伝子：グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域を構築するために、プラスミドｐＢＴ５７６（実施例６参照）からｍｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡＫコーディング配列を含有するＮｃｏＩ〜ＫｐｎＩフラグメントを単離し、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ消化したｐＣＣ５０中に挿入し、プラスミドｐＢＴ６６２を作製した。次に、以下のようにｅｃｏｄａｐＡコーディング配列をｃｏｒｄａｐＡコーディング配列で置き換えた。ｃｏｒｄａｐＡコーディング配列に融合したｍｃｔｓの末端の２／３を含有するＡｆｌII〜ＫｐｎＩフラグメントをＡｆｌII〜ＫｐｎＩ消化したｐＢＴ６６２に挿入してプラスミドｐＢＴ６７７を作製した。キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域を構築するために、プラスミドｐＢＴ５５８（実施例６参照）からｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４コーディング配列を含有するＮｃｏＩ〜ＨｐａＩフラグメントを単離し、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩ消化したｐＭＬ９０に挿入し、プラスミドｐＢＴ５８０を作製した。キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域を構築するために、プラスミドｐＢＴ６７７からｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡコーディング配列を含有するＮｃｏＩ〜ＫｐｎＩフラグメントを単離し、ＮｃｏＩ〜ＫｐｎＩ消化したｐＭＬ９０に挿入し、プラスミドｐＢＴ６７９を作製した。キメラ遺伝子：グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域及びグロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域を以下のように１つのプラスミド上で連結した。ｐＢＴ６７７をＨｉｎｄIIIで部分消化し、全長の直鎖状プラスミドＤＮＡを単離した。グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域を保有するＨｉｎｄIIIフラグメントをｐＢＴ６６３から単離し、直鎖状のｐＢＴ６７７プラスミドに連結してｐＢＴ６８０（図１７）を作製した。キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域及びグルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域を以下のように１つのプラスミド上で連結した。ｐＢＴ５８０をＳａｌＩで部分消化し、全長の直鎖状プラスミドＤＮＡを単離した。グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域を保有するＳａｌＩフラグメントをｐＢＴ６７９から単離し、直鎖状にしたｐＢＴ５８０プラスミドに連結してｐＢＴ６８１（図１８）を作製した。キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／ＳＳＰ３−５／１０ｋＤ３’領域を構築するために、グルテリン２プロモーター及び１０ｋＤゼイン３’領域を含有するプラスミドｐＭＬ１０３（上記）をＮｃｏＩ及びＳｍａＩ部位で切断した。ＸｂａＩで切断し、続いて、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて付着末端を埋め、次に、Ｎｃｏｌで切断することによりＳＳＰ３−５コーディング領域（実施例２２）をＮｃｏＩ〜平滑末端フラグメントとして単離した。１９３塩基対のＮｃｏＩ〜平滑末端フラグメントをＮｃｏＩ及びＳｍａＩ切断したｐＭＬ１０３に連結してｐＬＨ１０４（図１９）を作製した。キメラ遺伝子：グロブリン１プロモーター／ＳＳＰ３−５／グロブリン１ 3’ 領域を構築するために、ＳＳＰ３−５コーディング領域を含有する１９３塩基対のＮｃｏＩ及びＸｂａＩフラグメント（実施例２２）をグロブリン１５’ないし３’領域の間でプラスミドｐＣＣ５０（上記）中に挿入してｐＬＨ１０５（図２０）を作製した。トウモロコシＤＨＤＰＳｃＤＮＡ遺伝子は以前にクローン化され、シークエンスされた［Ｆｒｉｓｃｈ等（１９９１）ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２２８：２８７−２９３］。リシンによるフィードバック阻害に対してタンパク質を非感受性にする突然変異を遺伝子に導入した。この突然変異はタンパク質の単一アミノ酸置換をもたらす；ａｌａ１６６をｖａｌに変える単一ヌクレオチド変異である。ｌｙｓ^rトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子をミネソタ大学のＢｕｒｌｅＧｅｎｇｅｎｂａｃｈ博士から入手した。以下のプライマー：を用いてＰＣＲにより遺伝子の翻訳開始コドンにＮｃｏＩ部位を導入し、遺伝子の翻訳終止コドンのすぐ後にＫｐｎＩ部位を導入した。キメラ遺伝子：グロブリン１プロモーター／ｌｙｓ^rトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子／グロブリン１３’領域を構築するために、ｌｙｓ^rトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子を含有する１１４４塩基対のＮｃｏｌ及びＫｐｎＩフラグメントをグロブリン１５’ないし３’領域の間でプラスミドｐＣＣ５０（上記）中に挿入し、ｐＢＴ７３９（図２１）を作製した。キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／ｌｙｓ^rトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子／１０ｋＤ３’領域を構築するために、ｌｙｓ^rトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子を含有する１１４４塩基対のＮｃｏＩ及びＫｐｎＩフラグメントをグルテリン２プロモーター及び１０ｋＤゼイン３’領域を含有するプラスミドに挿入し、プラスミドｐＢＴ７５６（図２２）を作製した。以下のことを除いて、実施例１７及び１８において記述したようにトウモロコシ形質転換を実施した：１）衝撃に用いる正確な培養物をＬＨ１３２．５．ＸまたはＬＨ１３２．６．Ｘと称したことを除いて、胚形成細胞培養発生は実施例１７において記述したとおりであった。２）これらの実験のために用いた選択マーカーは、実施例１８において記述したようなｐＤＥＴＲＩＣからの３５Ｓ／ｂａｒ遺伝子または３５Ｓ／Ａｃ、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター及び３’ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの制御下の合成ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子［Ｅｃｋｅｓ等、（１９８９）ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＳｕｐｐｌ１３Ｄ］のいずれかであった。３）金粒子上に１．５μｇの各々のＤＮＡ（３５Ｓ／ｂａｒもしくは３５Ｓ／Ａｃ、ｐＢＴ６８１及びｐＬＨ１０４または３５Ｓ／Ａｃ、ｐｂｔ６８０及びｐＬＨ１０５）を共沈殿させることにより「３衝撃」として衝撃を実施したことを除いて、衝撃パラメーターは実施例１７及び１８に記述したとおりであった。４）組織を衝撃後２４時間内に選択培地上に置いたことを除いて、トランスジェニック細胞系統の選択は実施例１８におけるようにグルホシネート選択に対して記述したとおりであった。実施例２６胚及び内乳におけるコリネバクテリアＤＨＤＰＳ及びエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４またはｌｙｓ^r−トウモロコシＤＨＤＰＳの発現のためのキメラ遺伝子を含有するトウモロコシ植物トウモロコシをキメラ遺伝子：・グロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域と共にかもしくはそれなしのグロブリン１プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域；または・グルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｌｙｓＣ−Ｍ４／ＮＯＳ３’領域と共にかもしくはそれなしのグルテリン２プロモーター／ｍｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ＮＯＳ３’領域で実施例２５において記述したように形質転換した。形質転換されたカルスから再生された植物をサザンブロットまたはＰＣＲにより完全な導入遺伝子の存在に関して分析した。植物を自殖させるかまたは優等系統に他配させてＦ１種子を生成する。６ないし８個の種子をプールし、ウェスタンブロット分析によりコリネバクテリアＤＨＤＰＳタンパク質及びエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４タンパク質の発現に関してアッセイした。種子の遊離アミノ酸組成及び全アミノ酸組成を先の実施例において記述したように測定した。グロブリン１またはグルテリン２プロモーターのいずれかにより導かれるコリネバクテリアＤＨＤＰＳタンパク質の発現がトウモロコシ種子において見られた（表１２）。また、グルテリンプロモーターにより導かれるエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４タンパク質の発現もトウモロコシ種子において見られた。種子における遊離リシンレベルはコントロール種子における約１．４％の遊離アミノ酸からグロブリン１プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する３つの異なる形質転換体の種子における１５−２７％まで増加した。増加した遊離リシン及びリシン異化作用を表す高レベルのサッカロピンは両方ともグロブリン１プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する種子では胚に局在化された。エシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４と共にかまたはそれなしにグルテリン２プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する種子では遊離リシンの増加は見られなかった。リシン異化作用は胚より内乳においてかなり大きいと考えられ、おそらくこのためにグルテリン２プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳとエシェリキア・コリＡＫIII−Ｍ４を発現する種子ではリシンの増加したレベルの蓄積が妨げられる。通常、リシンは種子アミノ酸含有量の約２．３％に相当する。それ故、全種子アミノ酸のパーセントとしてのリシンの１３０％の増加がグロブリン１プロモーターからコリネバクテリアＤＨＤＰＳを発現する種子において見いだされたことは表１２から明らかである。表１２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者エペルバウム，サビーネ・ウルスラアメリカ合衆国デラウエア州19807ウイルミントン・プレジデンシヤルドライブ115 シー

Claims

【特許請求の範囲】１．リシンケトグルタル酸還元酵素の全部または一部をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。２．核酸配列が配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１１２、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０または配列番号：１３２により記述されるポリペプチドに本質的に類似したポリペプチドをコードする請求の範囲１の核酸フラグメント。３．核酸配列が配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１５、配列番号・１１６、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２３、配列番号：１２５、配列番号：１２７、配列番号：１２９または配列番号：１３１のものに本質的に類似している核酸配列を含んでなる請求の範囲１の核酸フラグメント。４．配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２３、配列番号：１２５、配列番号：１２７、配列番号：１２９または配列番号：１３１の核酸配列を含んでなる請求の範囲１の核酸フラグメント。５．核酸配列が配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１１２、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０または配列番号：１３２に記述されるようなポリペプチドをコードする請求の範囲１の核酸フラグメント。６．適当な種子特異的調節配列に機能的に連結された、リシンケトグルタル酸還元酵素をコードする請求の範囲１の単離された核酸フラグメントまたはそのサブフラグメントを含んでなるキメラ遺伝子であって、該キメラ遺伝子で形質転換された植物の種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を下げるキメラ遺伝子。７．単離された核酸フラグメントが配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２３、配列番号：１２５、配列番号：１２７、配列番号：１２９または配列番号：１３１のものに本質的に類似した核酸配列またはそのサブ配列を含んでなる請求の範囲６のキメラ遺伝子。８．リシンケトグルタル酸還元酵素をコードする遺伝子の突然変異のためにリシンケトグルタル酸還元酵素活性が減少している植物細胞。９．請求の範囲６または７のキメラ遺伝子で形質転換された植物細胞であって、減少したリシンケトグルタル酸還元酵素活性を有する該形質転換された植物細胞。１０．リシンケトグルタル酸還元酵素をコードする遺伝子の突然変異のためにリシンケトグルタル酸還元酵素活性が減少している植物種子。１１．請求の範囲６または７のキメラ遺伝子で形質転換された植物種子であって、減少したリシンケトグルタル酸還元酵素活性を有する該形質転換された植物種子。１２．該植物細胞がアラビドプシス、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、コムギ及びイネよりなる植物の群から選択される請求の範囲９の植物細胞。１３．該植物細胞（→種子？）がアラビドプシス、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、コムギ及びイネよりなる植物の群から選択される請求の範囲１１の植物種子。１４．（ａ）請求の範囲６または７のキメラ遺伝子で植物細胞を形質転換し；（ｂ）種子を得るために適当な条件下で工程（ａ）から得られた形質転換された植物細胞から稔性の成熟した植物を再生させ；（ｃ）工程（ｂ）の子孫種子を減少したリシンケトグルタル酸還元酵素活性に関してスクリーニングし；そして（ｄ）種子が減少したリシンケトグルタル酸還元酵素活性を含有する系統を選択することを含んでなる植物種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を減少するための方法。１５．請求の範囲１４の植物から得られる種子。１６．（ａ）請求の範囲６または７の第一のキメラ遺伝子及び（ｂ）リシンによる阻害に対して実質的に非感受性であるジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸フラグメントが植物葉緑体移行配列及び植物種子特異的調節配列に機能的に連結されている第二のキメラ遺伝子を含んでなる核酸フラグメント。１７．形質転換された植物の種子においてリシンケトグルタル酸還元酵素活性を下げる請求の範囲６または７の第一のキメラ遺伝子並びにリシンによる阻害に対して実質的に非感受性であるジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸フラグメントが植物葉緑体移行配列及び植物種子特異的調節配列に機能的に連結されている第二のキメラ遺伝子をゲノム中に含んでなる植物。１８．請求の範囲１６の核酸フラグメントをゲノム中に含んでなる植物。１９．第一及び第二のキメラ遺伝子をゲノム中に含んでなる請求の範囲１７の植物から得られる種子。２０．請求の範囲１６の核酸フラグメントをゲノム中に含んでなる請求の範囲１８の植物から得られる種子。