CN114317557B

CN114317557B - 玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用

Info

Publication number: CN114317557B
Application number: CN202210011039.8A
Authority: CN
Inventors: 王桂凤; 田秋珍; 申清文; 马雪霞; 陈洪宇; 王永彦
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114317557A

Abstract

本发明公开了一种玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用。本发明的玉米ZmRIBA1基因参与了玉米籽粒的发育，调控玉米胚和胚乳发育及胚乳细胞的细胞周期，影响籽粒储藏物质的积累，在提高玉米赖氨酸含量具有重要作用，为玉米种质资源分析、分子辅助遗传育种等方面提供了技术支持。

Description

玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用

技术领域

本发明涉及作物分子育种技术领域，具体涉及一种玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用。

背景技术

玉米是世界上第一大粮食作物，兼具粮食、饲料、工业原料和能源作物于一体的独特优势。随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们对玉米的消费需求不断增长，

然而，玉米总蛋白中含有较高的醇溶蛋白，该类蛋白缺乏人和动物必需的氨基酸如赖氨酸和色氨酸，这会导致以玉米为主食的人群、牲畜和家禽得不到均衡的营养，影响人类健康和畜禽生产性能。

因此，培育高赖氨酸的优质玉米新品种是植物基因工程领域的重点研发方向之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明研究发现o18-1突变体籽粒中赖氨酸含量较野生型增加76.4%。采用用图位克隆方法得到调控玉米核黄素合成和籽粒发育的ZmRIBA1基因。

本发明将玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

作为本发明所述应用的优选实施方式，提供了一种扩增所述基因的引物对，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

作为本发明所述应用的优选实施方式，基于突变体和野生型在该位点的单碱基差异，开发了可用于鉴定ZmRIBA1突变体的dCAPS分子标记，所述基因的分子标记包括如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对；和/或

如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1. 本发明的玉米ZmRIBA1基因参与了玉米籽粒的发育，调控玉米胚和胚乳发育及胚乳细胞的细胞周期，影响籽粒储藏物质的积累，在提高玉米赖氨酸含量具有重要作用。

2. 本发明ZmRIBA1突变位点的分子标记，为该基因的利用提供了高效检测标记，检测方法准确性高、操作简单，为玉米种质资源分析、分子辅助遗传育种等方面提供了技术支持。

附图说明

图1为ZmRIBA1突变体（o18-1）籽粒表型及生化分析；

图中，A：分离果穗上籽粒表型；B：ZmRIBA1突变籽粒粉质胚乳表型图；C：野生型（WT）和突变体籽粒纵切面比较；D：野生型和突变体籽粒发苗差异E：野生型和突变体籽粒百粒重差异；F：野生型和突变体籽粒淀粉含量差异；G：野生型和突变体籽粒非醇溶蛋白、醇溶蛋白和总蛋白含量差异；H：野生型和突变体籽粒氨基酸含量差异。

图2为野生型和突变体籽粒的细胞学分析；

图中，A：授粉后10天的突变体和野生型籽粒石蜡切片比较；B：授粉后15天的突变体和野生型籽粒石蜡切片比较；C：授粉后20天突变体和野生型籽粒的胚的比较；D和E：突变型(D)和野生型（E）胚乳基底转移层比较；F：突变型和野生型中胚乳基底转移层特异表达基因的表达差异；G和H：突变型（G）和野生型（H）胚乳淀粉粒填充比较；I-L：突变体和野生型胚乳透射电镜下的淀粉粒和蛋白体比较。

图3为ZmRIBA1（o18-1）基因图位克隆、基因结构及功能验证图；

图中，A：ZmRIBA1基因的图位克隆；B：ZmRIBA1基因结构示意图；C：o18-1与ZmRIBA1基因提前终止突变体o18-2的等位测试验证；D：o18-1与ZmRIBA1基因CRISPR/CAS9突变体o18-3的等位测试验证；

图4为dCAPS1-F1R1和dCAPS1-F2R2分子标记图；

图中A为o18-1成熟野生型（WT）籽粒和突变体(MU)籽粒表型；图中B为dCAPS1-F1R1PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带；图中C为dCAPS1-F2R2 PCR产物经Sma1酶切后，在10% 的核酸PAGE胶中的电泳条带。

图5为发育时期的野生型和突变型胚乳线粒体复合物的丰度和活性分析；

图中，A：野生型和突变型胚乳中的FMN（黄素单核苷酸）和FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）相对含量。B：野生型和突变型胚乳中线粒体复合物丰度分析；C：野生型和突变型胚乳中线粒体复合物Ⅰ活性分析；D：野生型和突变型胚乳中线粒体复合物Ⅱ活性分析；E：野生型和突变型胚乳中共价结合FAD的线粒体蛋白含量检测；F：野生型和突变型胚乳中线粒体蛋白的Western blotting分析；G-H：15DAP（G）和20DAP（H）的突变型和野生型胚乳细胞透射电镜观察。

图6为发育时期突变型和野生型胚乳细胞倍性分析；

图中，A-C：授粉后7天（A），10天（B），15天（C）胚乳细胞倍性分析。

图7 为ZmRIBA1基因自然变异与玉米籽粒赖氨酸含量相关分析；

图中，A：ZmRIBA1基因区段内与赖氨酸显著关联的SNP位点的连锁不平衡 (LD) 分析，示意图显示了5.5-kb片段，包括约800-bp启动子区域和1-kp 3'-下游区域，起始密码子(ATG) 标记为“+1”，每个点代表一个单核苷酸多态性 (SNP)位点，P值以-log10显示，阴影颜色表示 LD 的程度；B：ZmRIBA1基因在玉米自然变异中的单倍型，n表示属于每个单倍型的基因型数，每个单倍型的赖氨酸含量由箱线图显示。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的分析软件如无特别说明，均为常规软件；所涉及的测算方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：玉米ZmRIBA1影响籽粒贮藏物质积累和赖氨酸含量

取源于美国玉米种质中心( Maize Genetics Coorperation stock center，网址为：http://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/ )的EMS诱变突变体（o18-1）。o18-1背景为3605K (dnj*-N1534, o18-1)，由Gerald Neuffer等通过EMS诱变产生的单基因隐性突变体。对o18-1成熟突变体籽粒表型观察发现，胚乳蜡质区域减少粉质区域增加，胚较小而畸形（见图1A-C）。发苗实验发现突变体不能发苗（见图1D）。突变体百粒重较野生型显著降低（见图1E）。

利用生化分析技术对成熟突变型和野生型籽粒淀粉和蛋白含量分析发现，突变体籽粒淀粉含量较野生型显著减少（见图1F）；突变体总蛋白含量与野生型无显著差异，但醇溶蛋白含量较野生型显著降低，非醇溶蛋白含量较野生型显著升高（见图1G）；对突变型和野生型籽粒氨基酸含量分析发现突变型籽粒赖氨酸含量较野生型升高76.4%。

进一步对授粉后10 天（10 DAP）和15天（15 DAP）的突变型和野生型籽粒进行石蜡切片观察和透射电镜观察比较发现，突变体胚乳基底转移层细胞排列疏松且内增生减少，突变体胚乳淀粉粒和蛋白体填充较野生型减少（见图2）。

实施例2：ZmRIBA1基因的克隆和功能验证

利用来源于美国玉米种质中心的EMS诱变突变体（o18-1）与W64A玉米杂交得到F₁代群体，F₁自交得到F₂代分离群体，通过遗传分析和图位克隆，将目的基因定位于玉米第5染色体上约140 kb的物理区间内（见图3A）。

图位克隆过程中用到的连锁标记及其序列见表1。候选区段内基因注释及测序分析表明，编码催化核黄素合成的第一步反应的Zm00001d016902基因（CDS序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）是潜在候选基因，在突变体（o18-1）中Zm00001d016902基因包含7个外显子，第3个外显子+1199bp处存在一个G到A的单碱基突变，导致其编码的185号氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸（见图3B）。

Zm00001d016902基因的制备方法如下：

1）在研钵中用液氮研磨授粉后10天的突变型和野生型胚乳，利用植物多糖多酚RNA提取试剂盒，按照要求进行RNA提取。用无RNase的双蒸水充分溶解总RNA。用DNase I去除可能残留的DNA。

2）用琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA质量，NanoDrop仪器检测RNA浓度及RNA的260纳米和280纳米光吸收值，OD260/280在1.8至2.2之间，完整性良好（28S : 18S > 1.0），并且无蛋白质和DNA的污染。

3）以获得的RNA为模版进行逆转录，得到cDNA后分装于-20℃冰箱保存备用。

4）根据玉米B73中的Zm00001d016902转录本参考序列，设计扩增引物：

F: 5’ ATGCCTTCGATTGCGCCACCGT 3’；（SEQ ID No.3）

R: 5’ ATGATTCTCTTCTGTGCTCTGGCTGC 3’；（SEQ ID No.4）

为了验证该候选基因，从玉米EMS突变体库 ( http://elabcaas.cn/memd/ )购买了Zm00001d16902提前终止突变体材料（o18-2）；另外，利用CRISPR/Cas9的方法构建了Zm00001d16902基因的敲除载体并转化玉米自交系KN5585的幼胚，并获得转基因敲除株系（o18-3）。将+/ o18-2和+/ o18-3分别与+/o18-1正反交，对杂交得到的F₁果穗进行表型观察和分离比统计，结果表明F₁果穗野生型与突变型籽粒符合3：1的分离比。表明Zm00001d16902为造成o18-1突变表型的功能基因，并命名为ZmRIBA1。

表1 ZmRIBA1图位克隆所用引物及序列

实施例3：玉米ZmRIBA1的分子标记

针对o18-1突变位点开发易于检测的PCR分子标记dCAPS1，具体如下：

o18-1突变位点在玉米B73参考基因组第四版本的实际位置为179,648,012，设计如下dCAPS1引物：

dCAPS1-F1: 5’ ACAGAGGGCTTCACATCAATTG 3’；（SEQ ID No.5）

dCAPS1-R1: 5’ CGTTTCAGAACACCCCCTTCT 3’；（SEQ ID No.6）

dCAPS1-F2: 5’ GAGGCTATGGCTTTTATAGTAAGGCCC 3’；（SEQ ID No.7）

dCAPS1-R2: 5’ CACTGTAACAGTGAAAGCAGTGC 3’；（SEQ ID No.8）

其中，dCAPS1-F1R1为外侧引物对，可以特异性的扩增ZmRIBA1基因序列（见图4B）；dCAPS1-F2R2为内侧引物对，以dCAPS1-F1R1的PCR产物为模板进行第二轮扩增。

针对o18-1突变体的分子标记检测，包括以下步骤：

（1）反应体系为：

（2）dCAPS1-F1R1的PCR扩增程序为：

1 cycle 95℃预变性3 min

35 cycles 95℃变性15 s、56℃退火20 s、72℃延伸75 s

Delay 72℃ 5 min

Soak 25℃；

（3）dCAPS1-F2R2的PCR扩增程序为：

1 cycle 95℃预变性3 min

35 cycles 95℃变性15 s、58℃退火20 s、72℃延伸15 s

Delay 72℃ 5 min

Soak 25℃；

dCAPS1-F2R2的PCR产物用限制性内切酶Sma Ⅰ酶切，然后用10%的核酸PAGE胶检测，野生型材料酶切后为较低的条带（见图4C）。

实施例4：ZmRIBA1影响玉米籽粒线粒体功能、调控细胞周期进程

为明确ZmRIBA1对玉米籽粒线粒体的影响，进行 BN-PAGE胶内活性染色实验、SDS-PAGE胶内荧光分析实验，结果表明：o18-1突变体线粒体复合物I和II的活性降低（见图5B,C, D），o18-1突变体中黄素蛋白含量减少（见图5E）；蛋白免疫印迹分析实验进一步表明线粒体复合物1、II、III的蛋白亚基丰度强烈降低（见图5F），通过透射电镜分析表明o18-1突变体籽粒中线粒体结构异常（见图5G, H）。

利用流式细胞术对授粉后7天的o18-1突变型和野生型胚乳细胞有丝分裂情况分析（见图6A），结果表明o18-1突变型胚乳细胞在G1和S期积累；对授粉后10天和15天的o18-1突变型和野生型胚乳细胞DNA倍性分析（见图6B, C），结果表明o18-1突变型胚乳细胞内增生受到抑制。

以上结果表明ZmRIBA1影响玉米籽粒线粒体功能进而调控细胞周期进程。

实施例6：玉米ZmRIBA1的自然变异与赖氨酸含量显著相关

采集包含热带、亚热带和温带的507份玉米自交系材料的表型数据，种质来源由GME材料（Germplasm Enhancement of Maize）、CIMMYT材料和中国自交系材料组成，各种农艺性状、赖氨酸含量等表型数据和SNP信息来源于MaizeGo网站（http://www.maizego.org/Resources.html）。将上述表型数据和 ZmRIBA1基因上游-791bp到下游+4711bp范围内的24个SNP位点进行关联分析，发现ZmRIBA1基因与籽粒赖氨酸含量极显著相关。

分析结果如图7所示：图A中，在P＜0.001的情况下，ZmRIBA1基因区段一共有4个SNP与玉米赖氨酸性状极显著关联，在这4个SNP中，SNP1898、1931和1979位于内含子中，SNP4118位于3’非翻译区，这四个SNPs贡献了赖氨酸含量变异的8.4%。基于这些与赖氨酸性状显著相关的SNPs，将这些自然群体中的317份分为四种单倍型（图7B），在这四种单倍型中，Hap1和Hap2的赖氨酸含量较低且差异不显著，Hap3和Hap4的赖氨酸含量较高差异也不显著，P值分别为0.126和0.763，因此将Hap1/ Hap2和Hap3/ Hap4各划为一组（图7B），两组之间赖氨酸含量差异达极显著水平（P=5.07*10^-7），后一组赖氨酸含量比前者高出11.5%，表明Hap3/ Hap4可以作为赖氨酸含量的最优单倍型，同时也说明SNP4118是一个与玉米赖氨酸积累相关的关键位点。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1665

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atgccttcga ttgcgccacc gtcttcctcc gtcgctgccc tcacccgcca accggtgcaa 60

ttcttcaaag ggtgcagtgt atccaaggag acaaagggac cggtccgcag tttcttcact 120

gcaaattcaa agagcaccaa ggtgaaatca gcgggcttga aagtagcgtc atccttcaaa 180

aatgatggtg gttatccagc tggcggtgtc tcttggaagg acgacactct attgccaaaa 240

agcacaacca ttcgtggcca ggaccatccg gttgctgacc ctgtactccc aatggattcc 300

atgattacgc cagaaatcct ctctgctaat gtggaacgtg ttatagacat gtttgcagat 360

gatgacactg atactgaact tgatttggat agcccgacag agggcttcgc atcaattgca 420

gaagccattg aggacataca gcaaggaaaa cttgtgattg ttgttgatga tgaatcaagg 480

gaaaatgaag gagatctgat aatggctgcc tccttggtta ccccagaggc tatggctttt 540

atagtaaggc atgggacagg aattgtttgt gtcagcatga aagaagatga tctggaaaga 600

ctgagccttc ctttgatggt taccacaaaa gaaaatgagg agaagctatg cactgctttc 660

actgttacag tggatgcaaa agagggcaca actactgggg tatctgccaa ggacagggca 720

aaaacggtca tgactcttgc atctcctgac tctaagcctg aggacctcaa ccgccctggt 780

catattttcc ctttgaaata cagagaaggg ggtgttctga aacgagctgg acacaccgag 840

gcatctgttg accttgccat gttggctgga ttacctcctg ttgctgtcct ttgtgaaatt 900

gtggatgatg cagatggttc tatggctcgc ctaccaaagt tacgtgtctt tgctgaaaag 960

gagaacttaa agattatatc tattgctgac ttgattaggt ataggaggaa aagagacagg 1020

ctaattgaac gcgcttctgt tgcacgcttg cctttgaaat ggggcaatgt ccatgcctat 1080

tgctacaaat ctgttattga tggcattgag catattgcca tggtgaaagg tgatattggt 1140

gacggccaag acattttggt gagggtgcac tctgagtgcc tcacaggcga catttttgga 1200

tccgcaagat gtgattgtgg cgaccagctt gcgatggcaa tggagatgat tgagaaggct 1260

ggaaggggtg tattagtcta tctccgtgga catgaaggaa ggggtattgg tctgggccac 1320

aagcttcgtg cttataactt acaggatgat gggcgtgata ctgtggaagc taacgaggaa 1380

cttggtcttc ctgtggactc acgggaatat gggattggcg cacagatatt gcgggatcta 1440

ggagtccgtt caatgaagct gatgactaat aaccctgcga aatatagtgg tctcaagggc 1500

tatggattga gcattgcggg cagggtgccc ttgattacgc caattaccag tgagaaccgt 1560

aggtacctgg agactaaaag aacaaagatg ggacatgtat atgggttggc caatgcgcag 1620

gccaaccaag caaatggcag ccagagcaca gaagagaatc attag 1665

<210> 2

<211> 554

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Met Pro Ser Ile Ala Pro Pro Ser Ser Ser Val Ala Ala Leu Thr Arg

1 5 10 15

Gln Pro Val Gln Phe Phe Lys Gly Cys Ser Val Ser Lys Glu Thr Lys

20 25 30

Gly Pro Val Arg Ser Phe Phe Thr Ala Asn Ser Lys Ser Thr Lys Val

35 40 45

Lys Ser Ala Gly Leu Lys Val Ala Ser Ser Phe Lys Asn Asp Gly Gly

50 55 60

Tyr Pro Ala Gly Gly Val Ser Trp Lys Asp Asp Thr Leu Leu Pro Lys

65 70 75 80

Ser Thr Thr Ile Arg Gly Gln Asp His Pro Val Ala Asp Pro Val Leu

85 90 95

Pro Met Asp Ser Met Ile Thr Pro Glu Ile Leu Ser Ala Asn Val Glu

100 105 110

Arg Val Ile Asp Met Phe Ala Asp Asp Asp Thr Asp Thr Glu Leu Asp

115 120 125

Leu Asp Ser Pro Thr Glu Gly Phe Ala Ser Ile Ala Glu Ala Ile Glu

130 135 140

Asp Ile Gln Gln Gly Lys Leu Val Ile Val Val Asp Asp Glu Ser Arg

145 150 155 160

Glu Asn Glu Gly Asp Leu Ile Met Ala Ala Ser Leu Val Thr Pro Glu

165 170 175

Ala Met Ala Phe Ile Val Arg His Gly Thr Gly Ile Val Cys Val Ser

180 185 190

Met Lys Glu Asp Asp Leu Glu Arg Leu Ser Leu Pro Leu Met Val Thr

195 200 205

Thr Lys Glu Asn Glu Glu Lys Leu Cys Thr Ala Phe Thr Val Thr Val

210 215 220

Asp Ala Lys Glu Gly Thr Thr Thr Gly Val Ser Ala Lys Asp Arg Ala

225 230 235 240

Lys Thr Val Met Thr Leu Ala Ser Pro Asp Ser Lys Pro Glu Asp Leu

245 250 255

Asn Arg Pro Gly His Ile Phe Pro Leu Lys Tyr Arg Glu Gly Gly Val

260 265 270

Leu Lys Arg Ala Gly His Thr Glu Ala Ser Val Asp Leu Ala Met Leu

275 280 285

Ala Gly Leu Pro Pro Val Ala Val Leu Cys Glu Ile Val Asp Asp Ala

290 295 300

Asp Gly Ser Met Ala Arg Leu Pro Lys Leu Arg Val Phe Ala Glu Lys

305 310 315 320

Glu Asn Leu Lys Ile Ile Ser Ile Ala Asp Leu Ile Arg Tyr Arg Arg

325 330 335

Lys Arg Asp Arg Leu Ile Glu Arg Ala Ser Val Ala Arg Leu Pro Leu

340 345 350

Lys Trp Gly Asn Val His Ala Tyr Cys Tyr Lys Ser Val Ile Asp Gly

355 360 365

Ile Glu His Ile Ala Met Val Lys Gly Asp Ile Gly Asp Gly Gln Asp

370 375 380

Ile Leu Val Arg Val His Ser Glu Cys Leu Thr Gly Asp Ile Phe Gly

385 390 395 400

Ser Ala Arg Cys Asp Cys Gly Asp Gln Leu Ala Met Ala Met Glu Met

405 410 415

Ile Glu Lys Ala Gly Arg Gly Val Leu Val Tyr Leu Arg Gly His Glu

420 425 430

Gly Arg Gly Ile Gly Leu Gly His Lys Leu Arg Ala Tyr Asn Leu Gln

435 440 445

Asp Asp Gly Arg Asp Thr Val Glu Ala Asn Glu Glu Leu Gly Leu Pro

450 455 460

Val Asp Ser Arg Glu Tyr Gly Ile Gly Ala Gln Ile Leu Arg Asp Leu

465 470 475 480

Gly Val Arg Ser Met Lys Leu Met Thr Asn Asn Pro Ala Lys Tyr Ser

485 490 495

Gly Leu Lys Gly Tyr Gly Leu Ser Ile Ala Gly Arg Val Pro Leu Ile

500 505 510

Thr Pro Ile Thr Ser Glu Asn Arg Arg Tyr Leu Glu Thr Lys Arg Thr

515 520 525

Lys Met Gly His Val Tyr Gly Leu Ala Asn Ala Gln Ala Asn Gln Ala

530 535 540

Asn Gly Ser Gln Ser Thr Glu Glu Asn His

545 550

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> synthesis

<400> 3

atgccttcga ttgcgccacc gt 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> synthesis

<400> 4

atgattctct tctgtgctct ggctgc 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> synthesis

<400> 5

acagagggct tcacatcaat tg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> synthesis

<400> 6

cgtttcagaa cacccccttc t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> synthesis

<400> 7

gaggctatgg cttttatagt aaggccc 27

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> synthesis

<400> 8

cactgtaaca gtgaaagcag tgc 23

Claims

1.玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.依据权利要求1所述玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用，其特征在于，所述基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.依据权利要求1所述玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用，其特征在于，所述基因的扩增引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.依据权利要求1所述玉米ZmRIBA1基因在高赖氨酸玉米育种中的应用，其特征在于，所述基因的分子标记包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对；和

如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对。