ES2299520T3 - Procedimiento para la determinacion del grado de metilacion de determinadas citosinas en dna genomico en el contexto secuencial 5'-cpg-3'. - Google Patents
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Abstract
Proceso para la detección del grado de metilación de una citosina determinada en el contexto secuencial 5''- CpG-3'' de una muestra de DNA genómico, caracterizado porque a) se trata químicamente el DNA genómico, transformándose las bases citosina en uracilo, pero no las bases 5-metilcitosina; b) se amplifican fragmentos definidos, que contienen dicha citosina determinada, conservando los amplificados una marcación detectable; c) se hibridan los amplificados en dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA en cada caso con un miembro de dicha citosina determinada; d) se determina la magnitud de la hibridación de los amplificados en las dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA por detección de la marcación de los amplificados; e) se deduce de la relación de las marcaciones detectadas en las dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA como consecuencia de la hibridación el grado de metilación de dicha citosina determinada en la muestra de DNA genómico.
Description
Procedimiento para la determinación del grado de
metilación de determinadas citosinas en DNA genómico en el contexto
secuencial 5'-CpG-3'.
La invención se refiere a un procedimiento para
la detección del grado de metilación de una citosina determinada en
el contexto secuencial 5'-CpG-3' en
una muestra de DNA genómico.
Los niveles de observación bien estudiados
después de los desarrollos metódicos de los últimos años en la
biología molecular son los genes propiamente dichos, la traducción
de estos genes en RNA y las proteínas formadas a partir de ellos.
En qué momento del transcurso del desarrollo de un individuo se
activa un gen determinado y de qué modo se controla la activación y
la inhibición de determinados genes en determinadas células y
tejidos, está en correlación con la extensión y el carácter de la
metilación del gen o del genoma. En relación con esto, se
manifiestan estados patológicos en un modelo de metilación
modificado de genes individuales o del genoma.
La presente invención describe un procedimiento,
con el cual pueden investigarse muchas bases de citosina en una
muestra de DNA dada simultáneamente en cuanto a la presencia de un
grupo metilo en la posición 5 por medio de hibridación. La
invención describe además ácidos nucleicos, oligonucleótidos y
oligómeros PNA que son útiles para emplear el procedimiento para el
diagnóstico de enfermedades existentes o de la predisposición a
enfermedades.
La 5-metilcitosina es la base
modificada covalentemente más frecuente en el DNA de las células
eucariotas. La misma juega por ejemplo un papel en la regulación de
la transcripción, en la impresión de la huella genética y en la
génesis de los tumores. La identificación de
5-metilcitosina como constituyente de información
genética presenta por tanto un interés considerable. Las posiciones
de 5-metilcitosina no pueden, sin embargo,
identificarse por secuenciación, dado que la
5-metilcitosina exhibe el mismo comportamiento de
apareamiento de bases que la citosina. Adicionalmente, en el caso
de una amplificación por PCR, se pierde por completo la información
epigenética que llevan las 5-metilcitosinas.
La metilación de las islas CpG se equipara a
menudo con inactividad de transcripción. Aunque existen pruebas
inequívocas a favor de que las islas de CpG puedan encontrarse en
los promotores de los genes, no todas las islas de CpG y puntos de
metilación están localizados en promotores conocidos. En el caso de
diferentes genes específicos de tejidos e "impresores de la
huella", las islas de CpG están localizadas a distancias
considerables aguas abajo del comienzo de la transcripción y,
adicionalmente, muchos genes poseen promotores múltiples. Para una
multiplicidad de enfermedades, se ha documentado como causante la
metilación de dinucleótidos de CpG. En contraposición a las
mutaciones clásicas, en el caso de la metilación del DNA se trata de
un mecanismo que describe una sustitución de bases, sin modificar
la fracción codificante de un gen. Este cambio entre modificación
epigenética y mutaciones clásicas juega un papel importante en la
génesis de los tumores. Por ejemplo, la hipermetilación focal y la
desmetilación genómica generalizada son características de muchos
tipos de tumores diferentes. Está aceptado que la génesis de los
tumores y la progresión de los mismos están causadas por una parte
por hipermetilación de episodios de mutación inducidos y por otra
parte por la desactivación de genes, que controlan la proliferación
celular y/o la reactivación inducida de genes por desmetilación,
que son utilizados únicamente para el desarrollo embriológico.
En el caso del cáncer colorrectal hereditario
distinto de la poliposis, por ejemplo, la mayor parte de los casos
de cáncer de intestino grueso negativos en cuanto a mutaciones
depende más probablemente de la hipermetilación del promotor hMLH1
y de la falta de expresión subsiguiente de hMLH1, un gen reparador
de los apareamientos erróneos (Bevilacqua RA, Simpson AJ,
Methylation of the hMLH1 prometer but no hMLH1 mutations in sporadic
gastric carcinomas with high-level microsatellite
instability. Int J Cancer. 2000 Jul 15; 87
(2):200-3.). En la patogénesis del cáncer de
pulmón, la pérdida de expresión está correlacionada con la
metilación de islas de CpG en la secuencia promotora de un
efector-homólogo RAS. (Dammann R, Li C, Yoon JH,
Chin PL, Bates S, Pfeifer GP, Nucleotide. Epigenetic inactivation
of a RAS association domain family protein from the lung tumour
suppressor locus 3p21.3. Nat Genet. 2000 Jul;
25(3):315-9). Una desactivación epigenética
del gen supresor de tumores LKB1, que incluye la hipermetilación
del promotor, está asociada con el Síndrome de
Peutz-Jeghers (Esteller M, Avizienyte E, Corn PG,
Lothe RA, Baylin SB, Aaltonen LA, Herman JG, Epigenetic inactivation
of LKBI in primary tumors associated with the
Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene. 2000 Jan 6;
19(1):164-8).
Una multiplicidad de enfermedades, que están
asociadas con la metilación, exhiben en su etiología una asociación
estrecha con los genes supresores de tumores p16 o p15. Así, está
aceptada una relación entre Mycoso fungoides y la hipermetilación
del gen p16(INK4a) (Navas IC, Ortiz-Romero
PL, Villuendas R, Martínez P, García C, Gómez E, Rodríguez JL,
García D, Vanaclocha F, Iglesias L, Piris MA, Algara P, p16 (INK4a)
gene alterations are frequent in lesions of mycosis fungoides. Am J
Pathol. 2000 May; 156(5):1565-72). Se parte
también de una correlación estrecha entre la desactivación de la
transcripción del gen p16 en el carcinoma gástrico y la metilación
de novo de varios puntos de CpG menos específicos (Song SH, Jong HS,
Choi HH, Kang SH, Ryu MH, Kim NK, Kim WH, Bang YJ, Methylation of
specific CpG sites in the prometer region could significantly
down-regulate p16(INK4a) expression in
gastric adenocarcinoma. Int J Cancer. 2000 Jul 15;
87(2):236-40). La patogénesis del
colangiocarcinoma, que está asociado con la colangitis esclerosante
primaria, está relacionada con la desactivación del gen supresor de
tumores p16, que depende a su vez de la metilación del promotor p16
(Ahrendt SA, Eisenberger CF, Yip L, Rashid A, Chow JT, Pitt HA,
Sidransky D. Chromosome 9p21 loss and p16 inactivation in primary
sclerosing cholangitis-associated
cholangiocarcinoma. J Surg Res. 1999 Jun 1;
84(1):88-93). En la génesis de la leucemia y
en el progreso de la leucemia linfática aguda juega un papel la
desactivación del gen p16 por hipermetilación (Nakamura M, Sugita
K, Inukai T, Goi K, Iijima K, Tezuka T, Kojika S, Shiraishi K,
Miyamoto N, Karakida N, Kagami K, O-Koyama T, Mori
T, Nakazawa S. pl6/MTS1/INK4A gene is frequently inactivated by
hypermethylation in childhood acute lymphoblastic leukemia with
11q23 translocation. Leukemia. 1999 Jun; 13(6):
884-90). Adicionalmente, se ha postulado que la
hipermetilación de los genes p16 y p15 juega un papel decisivo en
la génesis de los tumores del mieloma múltiple (Ng MH, Wong IH, Lo
KW. DNA methylation changes and multiple myeloma. Leuk Lymphoma.
1999 Aug; 34(5-6):463-72). En
la predisposición para el carcinoma renal parece estar implicado el
gen VHL desactivado por metilación (Glavac D,
Ravnik-Glavac M, Ovcak Z, Masera A, Genetic changes
in the origin and development of renal cell carcinoma (RCC).
Pflugers Arch.1996; 431(6 Suppl 2):R193-4).
Una metilación anómala de la isla 5'CpG está implicada posiblemente
en la desactivación de la transcripción del gen p16 en el caso del
carcinoma nasofaríngeo (Lo KW, Cheung ST, Leung SF, van Hasselt A,
Tsang YS, Mak KF, Chung YF, Woo JK, Lee JC, Huang DP,
Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma.
Cancer Res. 1996 Jun 15; 56(12):2721-5). En
el caso del carcinoma de las células hepáticas, se ha documentado
una desactivación de la proteína p16. La hipermetilación de
promotores y deleciones homocigóticas forman parte en este caso de
los mecanismos frecuentes (Jin M, Piao Z, Kim NG, Park C, Shin EC,
Park JH, Jung HJ, Kim CG, Kim H, p16 is a major inactivation target
in hepatocellular carcinoma. Cancer. 2000 Jul 1; 89(1):
60-8). La metilación del DNA como control de la
expresión génica se ha documentado para el gen BRCA1 en el caso del
cáncer de mama (Magdinier F, Billard LM, Wittmann G, Frappart L,
Benchaib M, Lenoir GM, Guerin JF, Dante R Regional methylation of
the 5' end CpG island of BRCA1 is associated with reduced gene
expression in human somatic cells FASEB J. 2000 Aug;
14(11):1585-94). Una correlación entre
metilación y linfoma no-Hodgkin está admitida
también (Martínez-Delgado B, Richart A, García MJ,
Robledo M, Osorio A, Cebrián A, Rivas C, Benítez J,
Hypermethylation of Pl6ink4a and Pl5ink4b genes as a marker of
disease in the follow-up of
non-Hodgkin's lymphomas. Br J Haematol. 2000 Apr;
109(1):97-103).
La metilación de CpG provoca también la
progresión de la leucemia de las células T, que está relacionada con
la expresión disminuida del gen CDKN2A (Nosaka K, Maeda M, Tamiya
S, Sakai T, Mitsuya H, Matsuoka M, Increasing methylation of the
CDKN2A gene is associated with the progression of adult
T-cell leukemia. Cancer Res. 2000 Feb 15;
60(4):1043-8). En el caso del cáncer de
vejiga, se ha comprobado una metilación incrementada de las islas
CpG (Salem C, Liang G, Tsai YC, Coulter J, Knowles MA, Feng AC,
Groshen S, Nichols PW, Jones PA, Progressive increases in de novo
methylation of CpG islands in bladder cancer. Cancer Res. 2000 May
1; 60(9):2473-6). La desactivación de la
transcripción de los carcinomas epiteliales de placas del esófago
está relacionada con la metilación del gen FHIT, que está asociado
a la progresión de la enfermedad (Shimada Y, Sato F, Watanabe G,
Yamasaki S, Kato M, Maeda M, Imamura M, Loss of fragile histidine
triad gene expression is associated with progression of esophageal
squamous cell carcinoma, but not with the patient's prognosis and
smoking history. Cancer. 2000 Jul 1;
89(1):5-11). La endopeptidasa neutra 24.11
(NEP) desactiva el crecimiento de neuropéptidos que están
implicados en el progreso del cáncer de próstata independiente de
andrógenos. Una pérdida de la expresión de NEP por hipermetilación
del promotor de NEP contribuye posiblemente al desarrollo del cáncer
de próstata independiente de andrógenos estimulados por
neuropéptidos (Usmani BA, Shen R, Janeczko M, Papandreou CN, Lee
WH, Nelson WG, Nelson JB, Nanus DM, Methylation of the neutral
endopeptidase gene prometer in human prostate cancers. Clin Cancer
Res. 2000 May; 6(5):1664-70). El tumor
adrenocortical en los adultos exhibe anormalidades estructurales en
el DNA del tumor. Estas anormalidades comprenden entre otras una
sobreexpresión del gen IGF2 en correlación con una desmetilación
del DNA en este locus (Wilkin F, Gagne N, Paquette J, Oligny LL,
Deal C, Pediatric adrenocortical tumors: molecular events leading to
insulin-like growth factor II gene overexpression.
J Clin Endocrinol Metab. 2000 May;
85(5):2048-56. Revisión). Está admitido que
en el caso del gen del retinoblastoma están implicadas en la
enfermedad metilaciones del DNA en varios exones (Mancini D, Singh
S, Ainsworth P, Rodenhiser D, Constitutively methylated CpG
dinucleotides as mutation hot spots in the retinoblastoma gene
(RB1). Am J Hum Genet. 1997 Jul; 61(1):60-7).
En la leucemia mieloide crónica se sospecha una relación entre la
desregulación del gen p53 y una alteración del modelo de metilación
con la progresión de la enfermedad (Guinn BA, Mills KI, p53
mutations, methylation and genomic instability in the progression
of chronic myeloid leukaemia. Leuk Lymphoma. 1997 Jul;
26(3-4):211-26). También para
la leucemia mieloide aguda se ha documentado una relación con la
metilación (Melki JR, Vincent PC, Clark SJ. Concurrent DNA
hypermethylation of multiple genes in acute myeloid leukemia.
Cancer Res. 1999 Aug 1; 59(15): 3730-40). Se
ha identificado un punto de metilación específico del tumor en el
gen supresor del tumor de Wilms (Kleymenova EV, Yuan X, LaBate ME,
Walker CL, Identification of a tumor-specific
methylation site in the Wilms tumor suppressor gene. Oncogene. 1998
Feb 12; 16(6):713-20). En el linfoma de
Burkitt, varios promotores exhiben una metilación total de CpG (Tao
Q, Robertson KD, Manns A, Hildesheim A, Ambinder RF,
Epstein-Barr virus (EBV) in endemic Burkitt's
lymphoma: molecular analysis of primary tumor tissue. Blood. 1998
Feb 15; 91(4):1373-81). Se ha documentado
que en el caso del carcinoma de tiroides juega un papel la
metilación del DNA (Venkataraman GM, Yatin M, Marcinek R, Ain KB,
Restoration of iodide uptake in dedifferentiated thyroid carcinoma:
relationship to human Na+/I-symporter gene
methylation status. J Clin Endocrinol Metab. 1999 Jul; 84 (7) :
2449-57).
No sólo muchas enfermedades cancerosas están
asociadas con la metilación, sino que también están relacionadas
con la metilación muchas enfermedades no cancerosas. Así,
investigaciones para la artritis inflamatoria apuntan a que esta
enfermedad está asociada con una inframetilación del DNA genómico
(Kim YI, Logan JW, Mason JB, Roubenoff R, DNA hypomethylation in
inflammatory arthritis: reversal with methotrexate. J Lab Clin Med.
1996 Aug; 128(2):165-72). Para el síndrome
ICF se ha documentado una expresión regulada de la metilación (Kondo
T, Bobek MP, Kuick R, Lamb B, Zhu X, Narayan A, Bourc'his D,
Viegas-Pequignot E, Ehrlich M, Hanash SM,
Whole-genome methylation scan in ICF syndrome:
hypomethylation of nonsatellite DNA repeats D4Z4 and NBL2). Se
sospecha la implicación de la metilación en el lupus eritematoso
sistémico (Vallin H, Perers A, Alm GV, Ronnblom L,
Antidouble-stranded DNA antibodies and
immunostimulatory plasmid DNA in combination mimic the endogenous
IFN-alpha inducer in systemic lupus erythematosus.
J Immunol. 1999 Dec1; 163(11):6306-13); y
asimismo una relación entre la distrofia muscular de Duchenne y una
isla rica en CpG (Banerjee S, Singh PB, Rasberry C, Cattanach BM,
Embryonic inheritance of the chromatin organisation of the imprinted
H19 domain in mouse spermatozoa. Mech Dev. 2000 Feb;
90(2):217-26; Burmeister M, Lehrach H, Long
range restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene.
Nature. 1986 Dec 11-17;
324(6097):582-5). Un efecto epigenético que
está implicado en la infradesmetilación de la proteína precursora
del amiloide, y que está relacionado con el desarrollo de la
enfermedad, se sospecha en el caso de la enfermedad de Alzheimer
(West RL, Lee JM, Maroun LE, Hypomethylation of the amyloid
precursor protein gene in the brain of an Alzheimer's disease
patient. J Mol Neurosci. 1995; 6(2):141-6).
También al nivel cromosómico juega un papel importante el estado de
metilación. Por ejemplo, en el caso de síndromes de retraso mental
que están asociados con la fragilidad del cromosoma X, el grado de
la fragilidad cromosómica está determinado por la metilación (de
Muniain AL, Cobo AM, Poza JJ, Sáenz A, [Diseases due to instability
of DNA]. Neurologia, diciembre de 1995; suplemento 10
1:12-9).
Un método relativamente nuevo y utilizado
actualmente con gran frecuencia para la investigación de DNA de
5-metilcitosina se basa en la reacción específica de
bisulfito con citosina, que se transforma después de hidrólisis
alcalina subsiguiente en uracilo, que corresponde en su
comportamiento de apareamiento de bases a la timidina. Por el
contrario, La 5-metilcitosina no se ve modificada en
estas condiciones. De este modo, el DNA original se transforma de
tal manera que la metilcitosina, que originalmente no puede
diferenciarse de la citosina por su comportamiento de hibridación,
puede documentarse ahora por técnicas "normales" de biología
molecular como única citosina residual por ejemplo por amplificación
e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas dependen del
apareamiento de bases, que es muy utilizado ahora. El estado de la
técnica, por lo que concierne a la sensibilidad, está definido por
un procedimiento, que encierra el DNA a investigar en una matriz de
agarosa, impidiéndose de este modo la difusión y renaturalización
del DNA (el bisulfito reacciona solamente con DNA monocatenario) y
sustituyéndose todos los pasos de precipitación y purificación por
diálisis rápida (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996,
24, 5064-5066). Con este método pueden investigarse
células individuales, lo cual ilustra el potencial del método. Sin
embargo, hasta ahora solamente se investigan regiones individuales
de hasta 3000 pares de bases de longitud, no siendo posible una
investigación global de células hasta millares de posibles análisis
de metilación. Sin embargo, este procedimiento no puede analizar
fiablemente fragmentos muy pequeños a partir de cantidades de
muestra escasas. Éstas se pierden a pesar de la protección contra
la difusión a través de la matriz.
Una ojeada acerca de las posibilidades
adicionales conocidas para detectar
5-metilcitosinas, puede deducirse del artículo de
reseña siguiente: Rein, T., DePamphilis, M.L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
La técnica del bisulfito se emplea hasta ahora,
salvo unas cuantas excepciones (p.ej. Zechnigk, M. et al.,
Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) solamente en
investigación. No obstante, se amplifican siempre fragmentos
específicos cortos de un gen conocido después de un tratamiento con
bisulfito y, o bien se secuencian completamente (Olek A. Walter,
J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276) o se detectan
posiciones individuales de citosina por una "reacción de
extensión de iniciadores" (Gonzalgo, M.L. y Jones, P.A., Nucl.
Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, patente WO 9500669)
o un corte enzimático (Xiong, Z. y Laird, P.W., Nucl. Acids Res.
1997, 25, 2532-2534). Adicionalmente, se ha
descrito la detección por hibridación (Olek et al.,
WO-A-99/28498).
Otras publicaciones que tratan de la aplicación
de la técnica del bisulfito a la detección de la metilación en
genes individuales, son: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl.
Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl
Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16,
431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6,
387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695;
Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261;
WO-A 97/46705, WO-A 95/15373 und
WO-A 95/45560.
Una reseña acerca del estado de la técnica en la
producción de redes de oligómeros puede tomarse de una edición
especial aparecida en enero de 1999 de Nature Genetics (Nature
Genetics Supplement, volumen 21, enero de 1999) y de la
bibliografía citada en dicho lugar.
Para la exploración de una red de DNA
inmovilizada se han utilizado un gran número de sondas marcadas por
fluorescencia. Particularmente apropiada para la marcación por
fluorescencia es la incorporación simple de los colorantes Cy3 y
Cy5 en el 5'-OH de la sonda respectiva. La detección
de la fluorescencia de las sondas hibridadas se realiza por ejemplo
por medio de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5
están, además de muchos otros, disponibles comercialmente.
La espectrometría de masas por
desorción/ionización con láser asistido por matriz
(MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficiente para el
análisis de biomoléculas (Karas, M. y Hillenkamp, F. (1988), Laser
desorption ionization of protein with molecular masses exceeding
10.000 Daltons, Anal. Chem. 60: 2299-2301). Un
analito se encapsula en una matriz fotoabsorbente. Mediante un
breve pulso de láser, se evapora la matriz y la molécula del analito
así desfragmentada se lleva a la fase gaseosa. Mediante choques con
moléculas de la matriz se consigue la ionización del analito. Una
tensión aplicada acelera los iones en un tubo de vuelo exento de
campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran
considerablemente de modo diferente. Los iones más pequeños
alcanzan el detector antes que los de mayor tamaño.
La espectrometría MALDI-TOF es
muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis
de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut, I.G. und Beck, S.
(1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass
Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future
Trends 1: 147-157.) Para ácidos nucleicos, la
sensibilidad es aproximadamente 100 veces peor que para péptidos y
disminuye de forma desproporcionada con el tamaño creciente de los
fragmentos. Para ácidos nucleicos que tienen una cadena principal
con carga negativa múltiple, el proceso de ionización por la matriz
es esencialmente ineficiente. En la espectrometría
MALDI-TOF, la elección de la matriz juega un papel
muy importante. Para la desorción de péptidos se han encontrado
varias matrices muy eficientes, que dan como resultado una
cristalización muy fina. En el caso del DNA, aunque es cierto que
existen actualmente algunas matrices convenientes, sin embargo la
diferencia de sensibilidad no disminuye por ello. La diferencia de
sensibilidad puede reducirse modificando químicamente el DNA de tal
modo que el mismo se vuelva análogo a un péptido. Ácidos nucleicos
de tipo fosforotioato, en los cuales los fosfatos normales de la
cadena principal están sustituidos por tiofosfatos, pueden
transformarse por química de alquilación simple en un DNA con carga
neutra (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective
DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acide
Res. 23: 1367-1373). El acoplamiento de un
"marcador de carga" a este DNA modificado da como resultado el
aumento de la sensibilidad en la misma magnitud que se ha
encontrado para los péptidos. Una ventaja adicional de la
"marcación de carga" es la mayor estabilidad del análisis
frente a impurezas, que dificultan acusadamente la detección de los
sustratos no modificados.
El DNA genómico se obtiene por métodos estándar
a partir de DNA de células, tejidos u otras muestras de ensayo.
Esta metodología estándar se encuentra en referencias tales como
Fritsch y Maniatis, compiladores, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 1989.
La presente invención proporciona un
procedimiento particularmente eficiente y fiable, que permite
investigar simultáneamente muchas bases de citosina en una muestra
de DNA dada en presencia de un grupo metilo en la posición 5 por
hibridación. A este fin, se proporcionan adicionalmente
oligonucleótidos y oligómeros PNA, que son particularmente
apropiados para la utilización del procedimiento para diagnosis de
enfermedades existentes y de la predisposición para enfermedades
por análisis de una serie de parámetros genéticos y/o
epigenéticos.
Particularmente pueden designarse como
mutaciones inserciones, deleciones, mutaciones puntuales,
inversiones y polimorfismos, y de modo particularmente preferido
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). No obstante, los
polimorfismos pueden ser también inserciones, deleciones o
inversiones.
Parámetros epigenéticos en el contexto de esta
invención son particularmente metilaciones de citosina y secuencias
adicionalmente necesarias para su regulación. Otros parámetros
epigenéticos son por ejemplo la acetilación de histonas, que si
bien no puede analizarse directamente con el procedimiento descrito,
está correlacionada a su vez con la metilación del DNA.
El presente procedimiento sirve para la
detección del grado de metilación de al menos una citosina
determinada en el contexto secuencial
5'-CpG-3' de una muestra de DNA
genómico. De modo particularmente preferido, el procedimiento se
utiliza para la detección simultánea de muchas posiciones de
metilación diferentes.
El objetivo se resuelve de acuerdo con la
invención por un procedimiento para la detección del grado de
metilación de una citosina determinada en el contexto secuencial
5'-CpG-3' de una muestra de DNA
genómico, que se caracteriza porque
- a)
- se trata el DNA genómico, transformándose las bases citosina en uracilo, pero no las bases 5-metilcitosina;
- b)
- se amplifican fragmentos definidos, que contienen dicha citosina determinada, conservando los amplificados una marcación detectable;
- c)
- se hibridan los amplificados en dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA en cada caso con un miembro de dicha citosina determinada;
- d)
- se determina la magnitud de la hibridación de los amplificados en las dos clases de oligonucleótidos por detección de la marcación de los amplificados;
- e)
- se deduce de la relación de las marcaciones detectadas en las dos clases de oligonucleótidos como consecuencia de la hibridación el grado de metilación de dicha citosina determinada en la muestra de DNA genómico.
En este contexto es particularmente preferido un
procedimiento en el cual en el paso c) se realiza una hibridación
de los amplificados en dos clases de oligómeros (oligonucleótidos
y/u oligómeros PNA) en cada caso con un miembro de dicha citosina
determinada, donde los oligómeros de la primera clase se hibridan
preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento químico
del DNA genómico, si dicha citosina determinada en el DNA genómico
se encontrara metilada, y donde los oligómeros de la segunda clase
se hibridan preferiblemente a la secuencia que resulta del
tratamiento químico del DNA genómico si dicha citosina determinada
en el DNA genómico se encontrara no metilada. Una de estas dos
clases de oligómeros podría estar formada por ejemplo por
oligonucleótidos que contienen en su punto medio una estructura CG,
y la otra clase por oligonucleótidos que contienen en su punto
medio una estructura CG (o una estructura CA, en la cadena opuesta).
Las partes restantes de las secuencias de oligómeros deberían ser
preferiblemente compatibles entre ambas clases. En este caso los
oligonucleótidos de la primera clase se hibridarían a la secuencia
(en torno a la citosina determinada a investigar), que se
encontraría en el caso metilado después de transformación con
bisulfito, y por el contrario, los de la segunda clase se
hibridarían a la secuencia que se encontraría en el caso no metilado
después de transformación con bisulfito.
Se prefiere también particularmente un
procedimiento en el cual en el paso c) se realiza una hibridación de
los amplificados en dos clases de oligómeros (oligonucleótidos y/u
oligómeros PNA) con al menos un miembro en cada caso, donde los
oligómeros de la primera clase se hibridan preferiblemente a la
secuencia que resulta del tratamiento químico del DNA genómico, si
dicha citosina determinada en el DNA genómico se encontrara metilada
y menos preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento
químico del DNA genómico, si dicha citosina determinada en el DNA
genómico se encontrara no metilada, y donde los oligómeros de la
segunda clase se hibridan al amplificado a investigar de modo
esencialmente independiente del grado de metilación de dicha
citosina determinada en el DNA genómico.
De acuerdo con ello, se prefiere también un
procedimiento, en el cual en el paso c) se realiza una hibridación
de los amplificados en dos clases de oligómeros (oligonucleótidos
y/u oligómeros PNA) en cada caso con un miembro para dicha citosina
determinada, donde los oligómeros de la primera clase se hibridan
preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento químico
del DNA genómico, si dicha citosina determinada en el DNA genómico
se encontrara no metilada y menos preferiblemente a la secuencia que
resulta del tratamiento químico del DNA genómico, si dicha citosina
determinada en el DNA genómico se encontrara metilada, y donde los
oligómeros de la segunda clase se hibridan al amplificado a
investigar de modo esencialmente independiente del grado de
metilación de dicha citosina determinada en el DNA genómico.
En estos casos se hibrida por tanto la segunda
clase de oligómeros al amplificado, sin que se produzca una
especificidad de metilación esencial, y por tanto preferiblemente en
una posición del amplificado que no corresponde a ninguna posición
metilable de citosina. Con ello, la concentración del amplificado se
determina finalmente sólo por la intensidad de la hibridación. En
relación con ello, la hibridación en la primera clase de
oligonucleótidos tiene lugar dependiendo del grado de metilación de
la citosina determinada a investigar.
Se prefiere que el procedimiento se realice no
sólo con la muestra de DNA genómico, sino también análogamente con
DNA estándar presente como es bien sabido en la posición de dicha
citosina determinada metilado o no metilado, donde las relaciones
medidas en cada caso con el DNA estándar no metilado de las
marcaciones detectadas en ambas clases de oligonucleótidos sirven
como valor de contraste para un grado de metilación de 0 y,
correspondientemente, las relaciones medidas en cada caso con el
DNA estándar metilado de las marcaciones detectadas en ambas clases
de oligonucleótidos sirven como valor de contraste para un grado de
metilación de 1, y estos valores de contraste se emplean para la
determinación del grado de metilación del DNA genómico de
muestra.
muestra.
Se prefiere particularmente que muestras de DNA
estándar conocidas adicionales se empleen para el contraste, que
exhiben en cada caso un grado de metilación conocido cualquiera de
dicha citosina determinada.
Las muestras de DNA estándar empleadas y la
muestra (el amplificado producido a partir de un DNA genómico) se
marcan preferiblemente de manera diferente en cada caso. Las
muestras de DNA estándar empleadas se marcan a su vez en cada caso
preferiblemente de manera diferente.
Se prefiere también particularmente un
procedimiento en el cual amplificados, que resultan de muestras de
DNA genómico diferentes, están provistos de marcaciones diferentes.
En este caso es posible medir simultáneamente con una serie de
oligonucleótidos de las dos clases diferentes muestras, sea por
ejemplo en una red de oligómeros, que contiene oligonucleótidos de
las dos clases.
Es también particularmente preferido un
procedimiento en el cual amplificados, que resultan de las mismas
muestras de DNA genómico, se proveen de marcaciones diferentes, a
fin de alcanzar por una determinación del valor medio de los
valores obtenidos por diversos procedimientos de detección un
aumento de la exactitud de la medida. Esto puede realizarse por
ejemplo por marcaciones con colorantes de fluorescencia diferentes.
La medida se realiza en este caso por medio de un escáner de
fluorescencia, que dispone de varios canales para la medida de las
longitudes de onda de emisión individuales de los colorantes de
fluorescencia.
Por consiguiente es también particularmente
preferido un procedimiento en el cual las marcaciones son
marcaciones de fluorescencia.
Adicionalmente, se prefiere de acuerdo con la
invención que dicha marcación sea una marcación de fluorescencia.
En este contexto se prefiere que dicha marcación se detecte por
quimioluminiscencia, su absorción UV o polarización de
fluorescencia.
Es muy particularmente preferido de acuerdo con
la invención que el tratamiento del DNA en el paso a) se realice
con una solución de un bisulfito (= hidrogenosulfito,
disulfito).
Se prefiere también que las marcaciones sean
radionucleidos.
Adicionalmente se prefiere que las marcaciones
sean marcaciones separables, que se detecten en un espectrómetro de
masas.
De acuerdo con la invención, es particularmente
preferido que los productos PCR en su totalidad o sus fragmentos
característicos se detecten en el espectrómetro de masas y se
caractericen por consiguiente inequívocamente por su masa.
De acuerdo con la invención es particularmente
preferible que los oligómeros (oligonucleótidos y/u oligómeros PNA)
comprendan una sola clase de la secuencia
5'-CG-3'.
De acuerdo con la invención, se prefiere
particularmente que los oligómeros (oligonucleótidos y/u oligómeros
PNA) comprendan una sola clase de la secuencia
5'-TG-3' y/o la secuencia
5'-CA-3'.
Es además también adicionalmente preferido, que
los oligonucleótidos de la primera clase comprendan la secuencia
5'-CG-3' y los oligonucleótidos de
las segundas clases comprendan la secuencia
5'-TG-3' y/o la secuencia
5'-CA-3'.
Se prefiere también que los oligonucleótidos de
la clase primera y segunda estén inmovilizados en una fase sólida
común. Asimismo, se prefiere en este contexto que los
oligonucleótidos estén dispuestos en una sola fase sólida plana en
una trama rectangular o hexagonal, y el sitio de determinados
oligonucleótidos en la fase sólida esté correlacionado con su
secuencia respectiva.
Es asimismo particularmente preferido que los
oligómeros de la primera y la segunda clase estén inmovilizados
sobre perlas, que están codificadas con una serie de marcaciones
detectables por separado. Las últimas sirven para la identificación
de las perlas, es decir de las secuencias fijadas a la perla
respectiva. Los amplificados unidos a las perlas se identifican
luego por medio de otras marcaciones, que se fijan a los
amplificados. Instrumentos para la realización de tales medidas
basadas sobre perlas son vendidos por ejemplo por la firma
Luminex.
Muy particularmente, se prefiere un
procedimiento correspondiente a la invención, en el cual el paso b)
se realiza en dos pasos parciales como sigue:
- a)
- una preamplificación por PCR con al menos un par de iniciadores de secuencia diferente, que se hibridan inespecíficamente a una muestra de DNA pretratada según la reivindicación 1 y dan por tanto en el paso PCR más de un amplificado;
- b)
- una amplificación por PCR del producto formado en la preamplificación con iniciadores de secuencia diferente, que son respectivamente idénticos o inversamente complementarios a una sección de la muestra de DNA pretratada según la reivindicación 1 [cadena (+) o cadena (-)] y se hibridan específicamente al DNA a amplificar.
Bajo hibridación, en el contexto de esta
invención se entiende una hibridación de dos cadenas de DNA de
acuerdo con las reglas de Watson-Crick totalmente
complementarias de modo inverso una a otra, sin que se produzca un
apareamiento de bases erróneo. En este contexto el uracilo se
considera como timina.
De acuerdo con la invención, se prefiere
adicionalmente que la amplificación de varias secciones de DNA se
realice en un solo recipiente de reacción.
Adicionalmente, se prefiere de acuerdo con la
invención que para la amplificación se utilice una
DNA-polimerasa térmicamente estable. Se prefiere
también particularmente, que los oligonucleótidos iniciadores
utilizados para la amplificación contengan o bien solamente las
bases T, A y C o las bases T, A y G.
Es preferible también que se analicen al menos
10 posiciones CpG en contexto secuencial diferente al mismo tiempo.
Particularmente, se prefiere que se analicen simultáneamente al
menos 50 posiciones CpG en contexto secuencial diferente. Muy
particularmente, se prefiere que se analicen simultáneamente al
menos 100 posiciones CpG en contexto secuencial diferente. Es muy
preferido que se analicen simultáneamente al menos 500 posiciones
CpG en contexto secuencial diferente. Lo más preferible es que se
analicen simultáneamente al menos 1000 posiciones CpG en contexto
secuencial diferente.
De acuerdo con la invención, se prefiere el
procedimiento en el cual la muestra de DNA genómico se ha obtenido
a partir de líneas de células, sangre, esputo, heces, orina, líquido
cefalorraquídeo, tejido encapsulado en parafina, por ejemplo tejido
de los ojos, el intestino, los riñones, el cerebro, el corazón, la
próstata, el pulmón, la mama o el hígado, portaobjetos histológicos
o todas las combinaciones posibles de los mismos.
Se prefiere la utilización de un procedimiento
correspondiente a la invención para el diagnóstico y/o pronóstico
de episodios perniciosos para pacientes o individuos, en el cual
estos episodios perniciosos pertenecen al menos a una de las
categorías siguientes: reacciones indeseables de medicamentos;
enfermedades cancerosas; disfunciones, deterioro o enfermedad del
CNS; síntomas de agresión o trastornos del comportamiento;
consecuencias clínicas y psicológicas de daños cerebrales;
alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia
y/o síndromes asociados; enfermedad, disfunción y deterioro
cardiovascular; disfunción, deterioro o enfermedad del tracto
gastrointestinal; disfunción, deterioro o enfermedad del sistema
respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia; disfunción, deterioro o enfermedad del cuerpo como
anomalía en el proceso de desarrollo, disfunción, deterioro o
enfermedad de la piel, los músculos, el tejido conjuntivo o los
huesos; disfunción, deterioro o enfermedad endocrina y metabólica;
dolores de cabeza o disfunción sexual.
Adicionalmente, se prefiere la utilización de un
procedimiento correspondiente a la invención para la diferenciación
de tipos de células o tejidos o para la investigación de la
diferenciación celular.
Objeto de la presente invención es un kit, que
comprende un reactivo que contiene bisulfito, oligonucleótidos
iniciadores para la producción de los amplificados y/o
preferiblemente oligonucleótidos inmovilizados en una fase sólida
así como instrucciones para la realización del procedimiento
correspondiente a la invención.
Esta muestra de DNA genómico se obtiene
preferiblemente a partir de líneas de células, sangre, esputo,
heces, orina, líquido cefalorraquídeo, tejido encapsulado en
parafina, por ejemplo tejido de los ojos, el intestino, los
riñones, el cerebro, el corazón, la próstata, el pulmón, la mama o
el hígado, portaobjetos histológicos, o todas las combinaciones
posibles de los mismos.
En este procedimiento, se trata en el primer
paso una muestra de DNA genómico de tal manera que, a excepción de
las bases de 5-metilcitosina, todas las bases de
citosina se transforman en uracilo. Este tratamiento químico se
realiza preferiblemente con la solución de un bisulfito (=
hidrogenosulfito, disulfito).
Este paso del procedimiento puede realizarse no
sólo con la muestra de DNA genómico, sino análogamente de modo
preferible también con, como es sabido, DNA estándar existente
metilado o no metilado en la posición de dicha citosina
determinada.
En el segundo paso del procedimiento, se
amplifican las partes del DNA genómico, que contienen dicha citosina
determinada. Este paso puede realizarse de modo particularmente
preferido en dos pasos parciales:
- 1.
- En primer lugar se realiza una preamplificación por PCR con al menos un par de iniciadores de secuencia diferente, que se hibridan a un DNA pretratado químicamente. Este pretratamiento se realiza químicamente de tal manera que las bases citosina se transforman en uracilo, pero no las bases 5-metilcitosina.
- 2.
- Se realiza una amplificación por PCR del producto formado en la preamplificación, con iniciadores de secuencia diferente. Estos iniciadores son complementariamente idénticos o inversos a una sección del DNA pretratado químicamente [cadena (+) o cadena (-)] y se hibridan específicamente al DNA a amplificar. Los amplificados contienen preferiblemente un marcador detectable.
En el tercer paso siguiente del procedimiento se
realiza una hibridación de los amplificados a preferiblemente dos
clases de oligonucleótidos en cada caso con un miembro. En una
variante particularmente preferida del procedimiento, los
oligonucleótidos de la primera clase comprenden la secuencia
5-CG-3' y los oligonucleótidos de
la segunda clase la secuencia
5'-TG-3' y/o la secuencia
5'-CA-3'. Los oligonucleótidos de la
primera y la segunda clase están preferiblemente inmovilizados
sobre una fase sólida común. Los oligonucleótidos están dispuestos
sobre una fase sólida plana en una trama rectangular o hexagonal, y
el sitio de los oligonucleótidos determinados está correlacionado
en la fase sólida con la secuencia respectiva.
Los oligonucleótidos de la primera clase se
hibridan preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento
químico del DNA genómico, si dicha citosina determinada se
encontrara metilada en el DNA genómico. Los oligonucleótidos de la
segunda clase se hibridan preferiblemente a la secuencia que resulta
del tratamiento químico del DNA genómico, si dicha citosina
determinada se encontrara no metilada en el DNA genómico.
La amplificación de varias secciones de DNA se
realiza preferiblemente en un solo recipiente de reacción.
Preferiblemente, la amplificación se conduce con la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) utilizándose preferiblemente una
DNA-polimerasa térmicamente estable.
Los oligonucleótidos iniciadores utilizados para
la amplificación contienen preferible o solamente las bases T, A y
C o las bases T, A y G.
En el cuarto paso del procedimiento, se
determina la magnitud de hibridación de los amplificados a las dos
clases de oligonucleótidos por la detección de las marcaciones de
los amplificados. Las marcaciones son de modo particularmente
preferible marcaciones fluorescentes, radionucleidos o marcaciones
másicos separables, que se detectan en un espectrómetro de masas.
Las marcaciones se detectan preferiblemente asimismo por
quimioluminiscencia, absorción UV o polarización de fluorescencia.
Los productos PCR pueden detectarse también preferiblemente en su
totalidad o como sus fragmentos característicos en el espectrómetro
de masas. De este modo, los productos PCR se caracterizan
inequívocamente por su masa.
En el último paso del procedimiento, se deduce
de la relación de las marcaciones detectadas como consecuencia de
la hibridación, a las dos clases de oligonucleótidos el grado de
metilación de dicha citosina determinada en la muestra de DNA
genómico.
Las relaciones medidas en cada caso con el DNA
estándar no metilado de las marcaciones detectadas en ambas clases
de oligonucleótidos sirven preferiblemente como valor de contraste
para un grado de metilación de 0.
Correspondientemente, las relaciones medidas en
cada caso con el DNA estándar metilado de las marcaciones
detectadas en las dos clases de oligonucleótidos sirven
preferiblemente como valor de contraste par aun grado de metilación
de 1. Estos valores de contraste se emplean de modo particularmente
preferible para la determinación del grado de metilación de las
muestras del DNA genómico.
Para la calibración, pueden utilizarse
preferiblemente también otras muestras conocidas de DNA estándar,
que exhiben en cada caso un grado de metilación discrecional
conocido de dicha citosina determinada.
El procedimiento se caracteriza porque de modo
preferible se analizan simultáneamente al menos 10 posiciones CpG
en contexto secuencial diferente. Por otra parte, pueden analizarse
simultáneamente de modo preferible al menos 50 posiciones CpG en
contexto secuencial diferente. Se prefiere además, que se realicen
simultáneamente al menos 100 posiciones CpG en contexto secuencial
diferente. Es muy preferible el análisis simultáneo de al menos 500
posiciones CpG en contexto secuencial diferente. Por ultimo, es
particularmente preferido, el análisis simultáneo de al menos 1000
posiciones CpG en contexto secuencial diferente.
El procedimiento descrito se utiliza
preferiblemente para el diagnóstico y/o el pronóstico de episodios
perniciosos para pacientes o individuos, en donde estos episodios
perniciosos pertenecen al menos a una de las categorías siguientes:
reacciones indeseables de medicamentos; enfermedades cancerosas;
disfunciones, deterioro o enfermedad del CNS; síntomas de agresión
o alteraciones del comportamiento; consecuencias clínicas,
psicológicas y sociales de daños cerebrales; alteraciones
psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes
asociados; enfermedad, disfunción y deterioro cardiovascular;
disfunción, deterioro o enfermedad del tracto gastrointestinal;
disfunción, deterioro o enfermedad del sistema respiratorio; lesión,
inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; disfunción,
deterioro o enfermedad del cuerpo como anomalía en el proceso de
desarrollo; disfunción, deterioro o enfermedad de la piel, los
músculos, el tejido conjuntivo o los huesos; disfunción, deterioro
o enfermedad endocrina y metabólica; dolores de cabeza o disfunción
sexual.
El presente procedimiento se utiliza de modo
particularmente preferible para la diferenciación de tipos de
células o tejidos o para la investigación de la diferenciación
celular.
Por determinación de las relaciones de
hibridación entre las dos clases de oligonucleótidos empleadas
(p.ej. que contienen CG/TG) se consigue la independencia de la
intensidad de la hibridación total de las muestras de tejido
desconocidas.
Para la calibración de muestras de tejidos
desconocidas se emplean como estándares muestras comparativas no
metiladas y totalmente metiladas.
Componente de este procedimiento es
adicionalmente un kit, que comprende un reactivo que contiene
bisulfito, oligonucleótidos iniciadores para la producción de los
amplificados y/o preferiblemente oligonucleótidos inmunizados en
una fase sólida. Los oligonucleótidos (primera clase) comprenden la
secuencia 5'-CG-3'. Los
oligonucleótidos (segunda clase) comprenden la secuencia
5'-TG-3' y/o la secuencia
5'-CA-3'. Forman parte también del
kit instrucciones para la realización del procedimiento.
Los oligómeros pueden contener al menos un
dinucleótido CpG. La citosina del dinucleótido CpG correspondiente
se encuentra aproximadamente en el tercio medio del oligómero.
Los oligómeros pueden producirse sobre un
material portador en una disposición fija, donde al menos un
oligómero está acoplado a una fase sólida. Procedimientos para la
fijación de sondas de oligómeros en fases sólidas son conocidos por
los expertos.
Es posible que todas las sondas de oligómeros
tengan la misma longitud. De modo particularmente preferible, todas
las sondas son además 18-meros, que contienen en su
punto medio un dinucleótido CG y que se hibridan a una de las Seq.
ID 1 a Seq. ID 40712 sin apareamientos de bases erróneos.
Los oligómeros pueden utilizarse para el
diagnóstico de reacciones indeseables de medicamentos, enfermedades
cancerosas, disfunciones, deterioro o enfermedades del CNS, síntomas
agresivos o alteraciones del comportamiento, consecuencias clínicas
y psicológicas de lesiones cerebrales, alteraciones psicóticas y
trastornos de la personalidad, demencia y/o síndromes asociados,
enfermedad, cardiovascular, disfunción, deterioro o afección del
tracto gastrointestinal, disfunción, deterioro o afección del
sistema respiratorio, lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia, deterioro o afección del cuerpo como anomalía en el
proceso del desarrollo, disfunción, deterioro o afección de la
piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos,
disfunción, deterioro o afección endocrina y metabólica, dolores de
cabeza y disfunciones sexuales por análisis de patrones de
metilación.
Los expertos comprenderán que los oligómeros en
el caso de un cambio de timina por uracilo en las secuencias
utilizadas cumplen la misma finalidad.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El DNA genómico a analizar se obtiene
preferiblemente a partir de las fuentes habituales de DNA, como
p.ej. línea de células, sangre, esputo, heces, orina, líquido
cefalorraquídeo, tejidos encapsulados en parafina, por ejemplo
tejido de los ojos, el intestino, los riñones, el cerebro, el
corazón, la próstata, el pulmón, la mama o hígado, portaobjetos
histológicos y todas sus posibles combinaciones.
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para la preparación de DNA totalmente metilado
se trató DNA genómico humano con S-adenosilmetion
[sic] y la CpG-metilasa (SssI, New England
Biolabs.) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Para la
preparación de DNA no metilado, se amplificó por PCR el fragmento
de gen ELK-1 (número de acceso ep59011) con el
iniciador [SEQ ID NO: 1] GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA Y [SEQ ID No: 2]
AGGTGGTGGTGGCGGTGG procedente de DNA genómico humano. El DNA no
metilado y totalmente metilado así producido, al igual que DNA
genómico humano, se trató con empleo de bisulfito
(hidrogenosulfito, disulfito) de tal manera que todas las citosinas
no metiladas en la posición 5 de la base se modifican de tal modo
que se forma una base diferente en lo que respecta al comportamiento
de apareamiento de bases, mientras que las citosinas metiladas en
la posición 5 quedaban inalteradas. Si se emplea para la reacción
bisulfito en el intervalo de concentraciones comprendido entre 0,1 M
y 6 M, entonces se produce una adición en las bases de citosina no
metiladas. Adicionalmente, debe estar presente un reactivo
desnaturalizador o disolvente, así como un eliminador de radicales
libres. Una hidrólisis alcalina subsiguiente conduce en tal caso a
la transformación de las nucleobases de citosina no metiladas en
uracilo. Este DNA transformado sirve para detectar las citosinas
metiladas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Partiendo de las muestras de DNA tratadas con
bisulfito, se amplifica en cada caso un fragmento decidido de 529
pb de longitud a partir de la región promotora del gen
ELK-1 (número de acceso ep59011). La amplificación
se realiza con los oligonucleótidos iniciadores [SEQ ID NO: 3]
ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT y [SEQ ID No: 4]
TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT. Por utilización de oligonucleótidos
iniciadores, que están marcados con el colorante fluorescente Cy5,
se marca el fragmento directamente durante la PCR. Como DNA matriz
se utiliza DNA tratado con bisulfito (hidrogenosulfito, disulfito)
(1) no metilado, (2) totalmente metilado y (3) DNA genómico humano.
A continuación, se investigan estos tres fragmentos diferentes de
DNA en hibridaciones separadas respecto a su grado de metilación en
una posición CpG específica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las sondas de gen preparadas en el Ejemplo 2, se
hibridan a un chip de DNA. En el chip están inmovilizados
previamente oligonucleótidos. Las secuencias de oligonucleótidos se
derivan del fragmento amplificado del gen
ELK-1mencionado en el Ejemplo 2, y representan los
dinucleótidos CG, que incluyen el entorno inmediato. La longitud de
los oligonucleótidos es 14-22 nucleótidos, y la
posición del dinucleótido CG dentro de los oligonucleótidos es
variable. Después de la hibridación, se escanea el chip de DNA
(véase Fig. 1) y se evalúa numéricamente la señal de hibridación
(datos no presentados). El resultado de la hibridación para los
oligonucleótidos [SEQ ID NO: 5] CTACTCAACGAAAACAAA und [SEQ ID No:
6] CTACTCAACAAAAAC-AAA se muestra en Fig. 1 y Fig.
2. En este caso se hibrida preferiblemente [SEQ ID NO: 5]
CTACTCAACGAAAACAAA, si la citosina del fragmento
ELK-1, que se encuentra en la posición 103 del
amplificado, está metilada, y [SEQ ID NO: 6] CTACTCAACAAAAACAAA si
esta citosina no está metilada.
En la Figura 1 se representa un chip de DNA
después de hibridación con el fragmento ELK-1. Se
representa la imagen falsamente coloreada, tal como se obtiene
después del escaneo. Frente a la imagen en blanco y negro aquí
representada, se obtiene del escáner una imagen en color. La
intensidad de los diferentes colores representa el grado de
hibridación, disminuyendo el grado de hibridación desde rojo
(reconocible en la Figura 1 como puntos brillantes) a azul
(reconocible en la Figura 1 como puntos oscuros).
La Figura 2A representa una imagen parcial de la
Figura 1. Para el esclarecimiento del esquema de hibridación, los
pares de oligonucleótidos punteados están contorneados de blanco:
[SEQ ID NO: 6] ctactcaacaaaaacaaa (izquierda) y [SEQ ID NO: 5]
ctactcaacgaaaacaaa (derecha).
La imagen parcial de la Figura 2B muestra el
modelo de punteado para un estado de metilación desconocido de la
muestra de tejido y la imagen parcial Figura 2C el estado de
metilación para la muestra de comparación totalmente metilada.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El valor medio se indica en cada caso para una
longitud de onda de 635 nm. En la columna A se dan los valores para
la muestra no metilada, en la columna B para un estado de metilación
desconocido de una muestra de tejido, y en la columna C los valores
para la muestra de comparación totalmente metilada. Las relaciones
CG/CA representan el estado de metilación de la muestra respectiva.
El valor de 0,74 indica que la muestra se encuentra esencialmente
en forma totalmente metilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El ejemplo siguiente se refiere a un fragmento
del gen hMLH1 asociado al cáncer colorrectal hereditario y distinto
de poliposis, en el cual se investiga una determinada posición CG
respecto a la metilación.
En el primer paso se trata una secuencia
genómica con utilización de bisulfito (hidrogenosulfito, disulfito)
de tal manera que todas las citosinas no metiladas en la posición 5
de la base se alteran de tal manera que se forma una base diferente
con respecto al comportamiento de apareamiento de bases, mientras
que las citosinas metiladas en la posición 5 quedan inalteradas. Si
se utiliza para la reacción bisulfito en el campo de concentraciones
comprendido entre 0,1 M y 6 M, entonces tiene lugar una adición a
las bases de citosina no metiladas. Adicionalmente, tiene que estar
presente un reactivo desnaturalizante o disolvente y un eliminador
de radicales libres. Una hidrólisis alcalina subsiguiente conduce
luego a la transformación de las nucleobases de citosina no
metiladas en uracilo. Este DNA transformado sirve para detectar las
citosinas metiladas. En el segundo paso del procedimiento, se
diluye la muestra de DNA tratada con agua o con un disolvente
acuoso. Preferiblemente se realiza a continuación una desulfonación
del DNA (10-30 min, 90-100ºC) a un
valor de pH alcalino. En el tercer paso del procedimiento se
amplifica la muestra de DNA en una relación de cadena de polimerasa,
preferiblemente con una DNA-polimerasa térmicamente
estable. En el ejemplo presente se investigan citosinas del gen
hMLH1, en este caso a partir de una región flanqueante 5' de tamaño
1551 pb. A este fin se amplifica con los oligonucleótidos
iniciadores específicos [SEQ ID NO: 7] AGCAACACCTCCATGCACTG y [SEQ
ID No: 8] TTGATTGGACAGCTTGAATGC un fragmento definido de 719 pb de
longitud. Este amplificado sirve como muestra, que se hibrida a un
oligonucleótido unido previamente a una fase sólida con formación
de una estructura dúplex, por ejemplo [SEQ ID No: 3] GAAGAGCGGACAG,
donde la citosina a detectar se encuentra en la posición 588 del
amplificado. La detección del producto de hibridación se basa en
los oligonucleótidos iniciadores marcados fluorescentemente Cy3 y
Cy5, que se han utilizado para la amplificación. Solamente cuando
en el DNA tratado con bisulfito se ha cargado inicialmente en este
punto una citosina metilada, se produce una reacción de hibridación
del DNA amplificado con el oligonucleótido. Por consiguiente, el
estado de metilación de la citosina respectiva a investigar decide
acerca del producto de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
En el presente experimento se amplifica, a
partir de DNA tratado con bisulfito, un fragmento definido de 529
pb de longitud a partir de la región promotora del gen
ELK-1 (número de acceso ep59011). Por utilización de
los oligonucleótidos iniciadores [SEQ ID NO: 3]
ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT y [SEQ ID No: 4]
TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT, que están marcados con el colorante
fluorescente ALEXA 488, se marca el fragmento directamente durante
la PCR. Los oligonucleótidos de la primera clase (en este caso por
ejemplo [SEQ ID NO: 10] ATTAATAGCGTTTTGGTT) y la segunda clase (en
este caso: por ejemplo [SEQ ID NO: 11] ATTAATAGTGTTTTGGTT) se
inmovilizan en las superficies de las perlas, que se diferencian
por una codificación de color individual. En un paso subsiguiente,
se ponen en contacto los amplificados producidos con los
oligonucleótidos iniciadores arriba mencionados del gen
ELK-1, con una mezcla de ambas clases de las perlas
donde los amplificados se hibridan contra los oligonucleótidos
inmovilizados, en este caso por ejemplo [SEQ ID No: 10]
ATTAATAGCGTTTTGGTT y [SEQ ID No: 11] ATTAATAGTGTTTTGGTT,
encontrándose el C o T a detectar en todos los casos en la posición
476 del amplificado. A continuación se aíslan las perlas, se
identifican luego por medida de fluorescencia con ayuda de su
codificación de color y por medida de las intensidades de
fluorescencia, que son específicas para el colorante fluorescente
ALEXA 488, se determina el grado de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
A partir de DNA tratado con bisulfito, se
amplifica un fragmento definido de 529 pb de longitud de la región
promotora del gen ELK-1. Por utilización de
oligonucleótidos iniciadores marcaciones de fluorescencia [SEQ ID
NO: 3] ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT y [SEQ ID NO: 4]
TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT, se marca el fragmento directamente
durante la PCR. Para la reacción PCR, que se realiza en un
termociclador (Eppendorf GmbH), se emplean 10 ng de DNA tratado con
bisulfito, 6 pmol de cada iniciador, 200 \mum de cada dNTP,
MgCl_{2} 1,5 mM y 1 U de HotstartTaq (Qiagen AG). Las restantes
condiciones se seleccionan de acuerdo con las indicaciones del
fabricante. Para la amplificación se realiza una desnaturalización
durante 14 min a 96ºC, efectuándose a continuación 39 ciclos con
las condiciones de 60 s a 96ºC, 45 s a 55ºC y 75 s a 72ºC. Por
último, se realiza una elongación durante 10 min a 72ºC. En el caso
presente, las muestras a investigar, en este caso tejido de
personas sanas y enfermas, se marcan con el colorante Cy2. Para la
calibración interna del estado de metilación se utilizan
oligonucleótidos iniciadores para la amplificación de las muestras
para la calibración, que están marcadas con los colorantes
fluorescentes Cy3 y Cy5. Los amplificados procedentes de las
muestras para la calibración representan un estado de metilación
conocido, por una parte, un estado de metilación 100% y por otra un
estado no metilado. Dado que en este procedimiento las relaciones de
las intensidades de color de los colorantes fluorescentes, que se
miden con utilización del equipo ScanArray 4000 XL, Packard
BioScience-BioChip Technologies, se calculan entre
dos clases de oligonucleótidos, en este caso por ejemplo [SEQ ID NO:
10] ATTAATAGCGTTTTGGTT y [SEQ ID NO: 11] TTAATAGTGTTTTGGTT, donde
el C o T a detectar se encuentra en todos los casos en la posición
476 del amplificado, puede determinarse la relación de estado
metilado a no metilado de muestras desconocidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El presente experimento sirve para analizar
diversas muestras en solo paso de hibridación y aumentar con ello
el caudal volumétrico de muestras. Para ello se amplifica un
fragmento definido de cuatro individuos en cada caso a partir de la
región promotora del gen ELK-1 sendos fragmentos
definidos de 529 pb de longitud a partir de DNA tratado con
bisulfito, con los oligonucleótidos iniciadores [SEQ ID NO: 3]
ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT y [SEQ ID NO: 4]
TAAACCCRAAAAAAAAAACCCAATAT. Estos fragmentos procedentes de los
cuatro individuos se marcan con los cuatro colorantes fluorescentes
diferentes Cy3, Cy5, Cy2 y Cy7 y se hibridan frente a
oligonucleótidos inmovilizados, en este caso por ejemplo [SEQ ID
NO: 10] ATTAATAGCGTTTTGGTT y [SEQ ID NO: 11] ATTAA
TAGTGTTTGGGTT, donde el C o T a detectar se encuentra en todos los casos en la posición 476 del amplificado. Estas muestras diferentes marcadas fluorescentemente se analizan a continuación a longitudes de onda diferentes, sin que se produzca una influencia recíproca basada en un colorante fluorescente.
TAGTGTTTGGGTT, donde el C o T a detectar se encuentra en todos los casos en la posición 476 del amplificado. Estas muestras diferentes marcadas fluorescentemente se analizan a continuación a longitudes de onda diferentes, sin que se produzca una influencia recíproca basada en un colorante fluorescente.
Inversamente, es también posible, a partir de
una muestra de DNA producir distintas series diferentes de
fragmentos, que se marcan con colorantes diferentes, en este caso
Cy2, Cy3 y Cy5. Si se inmoviliza una serie de sondas de
oligonuleótidos para el gen 64 (serie 1) en un chip, entonces la
especificidad es suficiente para analizar 64 fragmentos marcados
p.ej. Cy3 independientemente unos de otros. Dado que las muestras de
la serie 1 se marcan con el colorante fluorescente Cy3 y las
muestras de la serie 2 con el colorante fluorescente Cy5 (y la
serie 3 con Cy2), la detección del estado de metilación en los
fragmentos de la serie 1 no se ve influida por la medida de las
intensidades de fluorescencia de los amplificados marcados
fluorescentemente de las series 2 y 3 (y viceversa). Por
consiguiente, es posible, a pesar de la complejidad incrementada de
los amplificados, obtener datos fiables del mismo modo que en el
caso de una complejidad de 64 amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
En el presente experimento se marcan
amplificados PCR iguales con cuatro colorantes fluorescentes
distintos y se verifican éstos en redundancia cuádruple. Para ello,
partiendo de DNA tratado con bisulfito, se amplifica un fragmento
definido de 529 pb de longitud a partir de la región promotora del
gen ELK-1 con los oligonucleótidos iniciadores [SEQ
ID NO: 3] ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT y [SEQ ID NO: 4]
TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAA
TAT, y se hibridan contra oligonucleótidos inmovilizados, en este caso por ejemplo [SEQ ID NO: 10] ATTAA
TAGCGTTTTGGTT y [SEQ ID NO: 11] ATTAATAGTGTTTTGGTT, donde el C o T a detectar se encuentra en todos los casos en la posición 476 del amplificado. Por utilización de oligonucleótidos iniciadores marcados fluorescentemente con Cy3, Cy5, Cy2 y Cy7 se comparan las relaciones de las distintas muestras marcadas fluorescentemente y de este modo se obtiene una mayor seguridad experimental.
TAT, y se hibridan contra oligonucleótidos inmovilizados, en este caso por ejemplo [SEQ ID NO: 10] ATTAA
TAGCGTTTTGGTT y [SEQ ID NO: 11] ATTAATAGTGTTTTGGTT, donde el C o T a detectar se encuentra en todos los casos en la posición 476 del amplificado. Por utilización de oligonucleótidos iniciadores marcados fluorescentemente con Cy3, Cy5, Cy2 y Cy7 se comparan las relaciones de las distintas muestras marcadas fluorescentemente y de este modo se obtiene una mayor seguridad experimental.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Epigenomics AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la determinación
del grado de metilación de determinadas citosinas en DNA genómico
en el contexto secuencial
5'-CpG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160>11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctatggt cttgtctaac cgta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtggtggt ggcggtgg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggttttgt ttaatygtag agttgttt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211>27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaacccraa aaaaaaaaac ccaatat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctactcaacg aaaacaaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctactcaaca aaaacaaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211>20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcaacacct ccatgcactg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgattggac agcttgaatg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagagcgga cag
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaatagcg ttttggtt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaatagtg ttttggtt
\hfill18
Claims (34)
1. Proceso para la detección del grado de
metilación de una citosina determinada en el contexto secuencial
5'-CpG-3' de una muestra de DNA
genómico, caracterizado porque
- a)
- se trata químicamente el DNA genómico, transformándose las bases citosina en uracilo, pero no las bases 5-metilcitosina;
- b)
- se amplifican fragmentos definidos, que contienen dicha citosina determinada, conservando los amplificados una marcación detectable;
- c)
- se hibridan los amplificados en dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA en cada caso con un miembro de dicha citosina determinada;
- d)
- se determina la magnitud de la hibridación de los amplificados en las dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA por detección de la marcación de los amplificados;
- e)
- se deduce de la relación de las marcaciones detectadas en las dos clases de oligonucleótidos y/u oligómeros PNA como consecuencia de la hibridación el grado de metilación de dicha citosina determinada en la muestra de DNA genómico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en el paso c) se realiza una hibridación
de los amplificados en dos clases de oligómeros (oligonucleótidos
y/u oligómeros PNA) en cada caso con un miembro de dicha citosina
determinada, donde los oligómeros de la primera clase se hibridan
preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento químico
del DNA genómico, si dicha citosina determinada en el DNA genómico
se encontrara metilada, y donde los oligómeros de la segunda clase
se hibridan preferiblemente a la secuencia que resulta del
tratamiento químico del DNA genómico si dicha citosina determinada
en el DNA genómico se encontrara no
metilada.
metilada.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en el paso c) se realiza una hibridación
de los amplificados en dos clases de oligómeros (oligonucleótidos
y/u oligómeros PNA) en cada caso con un miembro de dicha citosina
determinada, donde los oligómeros de la primera clase se hibridan
preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento químico
del DNA genómico, si dicha citosina determinada en el DNA genómico
se encontrara metilada y menos preferiblemente a la secuencia que
resulta del tratamiento químico del DNA genómico, si dicha citosina
determinada en el DNA genómico se encontrara no metilada, y donde
los oligómeros de la segunda clase se hibridan al amplificado a
investigar de modo esencialmente independiente del grado de
metilación de dicha citosina determinada en el DNA genómico.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en el paso c) se realiza una hibridación
de los amplificados en dos clases de oligómeros (oligonucleótidos
y/u oligómeros PNA) en cada caso con un miembro para dicha citosina
determinada, donde los oligómeros de la primera clase se hibridan
preferiblemente a la secuencia que resulta del tratamiento químico
del DNA genómico, si dicha citosina determinada en el DNA genómico
se encontrara no metilada y menos preferiblemente a la secuencia que
resulta del tratamiento químico del DNA genómico, si dicha citosina
determinada en el DNA genómico se encontrara metilada, y donde los
oligómeros de la segunda clase se hibridan al amplificado a
investigar de modo esencialmente independiente del grado de
metilación de dicha citosina determinada en el DNA genómico.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el procedimiento
se realiza no sólo con la muestra de DNA genómico, sino también
análogamente con DNA estándar presente como es bien sabido en la
posición de dicha citosina determinada metilado o no metilado, donde
las relaciones medidas en cada caso de acuerdo con la
reivindicación 1 con el DNA estándar no metilado de las marcaciones
detectadas en ambas clases de oligonucleótidos sirven como valor de
contraste para un grado de metilación de 0 y, correspondientemente,
las relaciones medidas en cada caso de acuerdo con la reivindicación
1 con el DNA estándar metilado de las marcaciones detectadas en
ambas clases de oligonucleótidos sirven como valor de contraste para
un grado de metilación de 1, y estos valores de contraste se
emplean para la determinación del grado de metilación del DNA
genómico de muestra.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque se utilizan muestras de DNA estándar
conocidas adicionales para la calibración, las cuales tienen en
todos los casos un grado de metilación cualquiera conocido de dicha
citosina determinada.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque los DNAs
utilizados como estándar están marcados en cada caso de manera
diferente y la muestra (el amplificado producido a partir de un DNA
genómico correspondiente a la reivindicación 1) está provista a su
vez de un marcador distinto de ellos.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los
amplificados, procedentes de diversas muestras de DNA genómico,
están provistos de marcaciones diferentes.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los
amplificados, procedentes de las mismas muestras de DNA genómico,
se proveen de marcaciones diferentes, a fin de conseguir por una
determinación del valor medio de los valores obtenidos a partir de
distintos procedimientos de detección un aumento de la exactitud de
la medida.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas
marcaciones son marcaciones fluorescentes.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
tratamiento químico se realiza con una solución de un bisulfito (=
hidrogeno sulfito, disulfito).
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho
marcador se detecta por su quimioluminiscencia, su absorción UV o
su polarización de fluorescencia.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las marcaciones
son radionucleidos.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las marcaciones
son marcaciones másicas separables, que se detectan en un
espectrómetro de masas.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los productos
PCR globalmente o sus fragmentos característicos se detectan en el
espectrómetro de masas y por consiguiente se caracterizan
inequívocamente por su masa.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
oligómeros (oligonucleótidos y/u oligómeros PNA) comprenden una
clase de la secuencia 5'-CG-3'.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
oligómeros (oligonucleótidos y/u oligómeros PNA) comprenden una
clase de la secuencia 5'-TG-3' o la
secuencia 5'-CA-3'.
18. Procedimiento según las reivindicaciones 16
y 17, caracterizado porque los oligómeros (oligonucleótidos
y/o PNA-oligómeros) de la primera clase contienen la
secuencia 5'-CG-3' y los oligómeros
de la segunda clase la secuencia
5'-TG-3' o la secuencia
5'-CA-3'.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
oligómeros de la primera y de la segunda clase están inmovilizados
sobre una fase sólida común.
20. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque los oligonucleótidos están dispuestos
sobre una fase sólida plana en una trama rectangular o hexagonal y
el sitio de determinados oligonucleótidos en la fase sólida está
correlacionado con su secuencia respectiva.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-18, caracterizado porque
los oligómeros de la primera y de la segunda clase están
inmovilizados sobre perlas, que están codificadas con una serie de
marcaciones detectables por separado.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso b)
de la reivindicación 1 se realiza en dos pasos parciales como
sigue:
- a)
- una preamplificación por PCR con al menos un par de iniciadores de secuencia diferente, que se hibridan inespecíficamente a una muestra de DNA pretratada según la reivindicación 1 y dan por tanto en el paso PCR más de un amplificado;
- b)
- una amplificación por PCR del producto formado en la preamplificación con iniciadores de secuencia diferente, que son respectivamente idénticos o inversamente complementarios a una sección de la muestra de DNA pretratada según la reivindicación 1 [cadena (+) o cadena (-)] y se hibridan específicamente al DNA a amplificar.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
amplificación de varias partes de DNA se realiza en un solo
recipiente de reacción.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para la
amplificación se utiliza una DNA-polimerasa
térmicamente estable.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para la
amplificación se utilizan oligonucleótidos iniciadores que
contienen o bien solamente las bases T, A y C o las bases T, A y
G.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se analizan
simultáneamente al menos 10 posiciones CpG en contexto secuencial
diferente.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se analizan
simultáneamente al menos 50 posiciones CpG en contexto secuencial
diferente.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se analizan
simultáneamente al menos 100 posiciones CpG en contexto secuencial
diferente.
29. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se analizan
simultáneamente al menos 500 posiciones CpG en contexto secuencial
diferente.
30. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se analizan
simultáneamente al menos 1000 posiciones CpG en contexto secuencial
diferente.
31. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual la muestra de DNA genómico
se ha obtenido de líneas de células, sangre, esputo, heces, orina,
líquido cefalorraquídeo, tejido encapsulado en parafina, por
ejemplo tejido de los ojos, el intestino, los riñones, el cerebro,
el corazón, la próstata, el pulmón, la mama o el hígado,
portaobjetos histológicos o todas las combinaciones posibles de los
mismos.
32. Utilización de un procedimiento según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el diagnóstico
y/o pronóstico de episodios perniciosos para pacientes o individuos,
donde estos episodios perniciosos pertenecen al menos a una de las
categorías siguientes: reacciones indeseables de medicamentos;
enfermedades cancerosas; disfunciones, deterioro o enfermedad del
CNS; síntomas de agresión o alteraciones del comportamiento;
consecuencias clínicas o psicológicas de daños cerebrales;
alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia
y/o síndromes asociados; enfermedad, disfunción y deterioro
cardiovascular; disfunción, deterioro o enfermedad del tracto
gastrointestinal; disfunción, deterioro o enfermedad del sistema
respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia; disfunción, deterioro o enfermedad del cuerpo como
anomalía en el proceso de desarrollo; disfunción, deterioro o
enfermedad de la piel, los músculos, el tejido conjuntivo o los
huesos; disfunción, deterioro o enfermedad endocrina y metabólica;
dolores de cabeza o disfunción sexual.
33. Utilización de un procedimiento según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la diferenciación
de tipos de células o tejidos o para la investigación de la
diferenciación celular.
34. Kit para la realización de un procedimiento
según cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente
que comprende
- (a)
- un reactivo que contiene bisulfito;
- (b)
- oligonucleótidos iniciadores para la preparación de amplificados definidos;
- (c)
- dos clases de oligonucleótidos, que están inmovilizadas en una fase sólida; donde
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- (d)
- indicaciones para la realización del procedimiento.
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