KR102512282B1 - 식도암 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
식도암 검출용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102512282B1 KR102512282B1 KR1020207018984A KR20207018984A KR102512282B1 KR 102512282 B1 KR102512282 B1 KR 102512282B1 KR 1020207018984 A KR1020207018984 A KR 1020207018984A KR 20207018984 A KR20207018984 A KR 20207018984A KR 102512282 B1 KR102512282 B1 KR 102512282B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- target
- detecting
- esophageal cancer
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산을 포함하고, 상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두인 식도암 검출용 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 또한 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산 및 표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 항체를 포함하고; 상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두이며; 상기 표적 단백질은 SNCG인 식도암 검출용 조성물을 제공한다. 또한 상기 조성물을 포함하는 시험키트, 및 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트 제조에서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 바이오 기술분야로서, 식도암 검출용 조성물 및 질병 검출에서의 이의 용도에 관한 것이며, 구체적으로는 식도암 검출용 조성물, 이의 대응되는 시험키트 및 용도에 관한 것이다.
식도암은 일반적인 소화관 종양으로서, 중국 종양 예방 부서의 자료에 따르면 2015년 중국 식도암 발병률은 10만명당 478건이고, 사망률은 만명당 375건으로 일반 암 중에서 각각 4위와 3위를 기록했다. 식도암의 질병 사망률은 80 %에 근접하는 바, 이는 악성 정도가 매우 높은 암으로, 해마다 전 세계적으로 약 30만명이 식도암으로 사망하며 그 중 절반은 중국인이다.
식도암의 사망률을 높이는 중요한 요인은 조기 식도암의 진단율이 낮다는 점이다. 조기 식도암의 완치율은 중기 및 후기보다 훨씬 높으나 명확하고 특이한 증상이 없으므로 대부분의 피험자들은 확진된 경우 이미 중기와 말기로 진행되어 있는 상황이다. 임상 연구에서는 병소로부터 피험자에게 임상 증상이 나타날 때까지 암 형성 과정은 평균 몇년이 걸린다는 사실을 발견하였는데, 이는 조기 식도암의 발견 및 조기 식도암의 진단율 향상에 효과적인 잠복기를 제공하는 바, 상기 잠복기를 충분히 이용한다면 식도암 치료 효과가 향상되고 식도암 사망률이 감소될 것으로 기대된다.
현재 임상에서 적용되는 식도암 진단 기술은 조기 식도암의 검출 및 스크리닝 측면에서 제한적인데 그 원인으로는 주로1) 조직 생검은 침습성이 강해 조기 암 스크리닝에 적합하지 않고; 2) 영상학 검출 기술(예를 들어, 식관 조영 검사 및 내시경 검사)은 기기 비용, 운영 기술 및 침습성 등 측면에서 제한적이므로 암 스크리닝 기술로서 널리 보급되기 어려우며; 3) 종래의 혈청 종양 표지자(예를 들어, AFP, CEA, CA125, 및 CA199 등)는 식도암 검출에 대한 감도가 낮아 조기 암 스크리닝의 요구를 충분히 만족시킬 수 없기 때문이다.
이에, 본 발명은 기존의 식도암 검출 기술에서 검출이 불편하고 감도가 낮으며 비용이 높은 문제점을 감안하여 민감하고 특이적으로 식도암을 검출할 수 있는 식도암 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 시험키트 및 식도암 검출에서의 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 시험키트는 우수한 식도암 검출 감도를 구비하여 편리하고 신속하며 효과적으로 식도암을 검출할 수 있다.
본 발명은 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물, 시험키트, 이의 용도, 및 상기 시험키트에 기반하여 검출을 수행하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 내용에 관한 것이다.
1. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물로서,
상기 조성물은 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산을 포함하고,
상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다.
3. 제1항에 있어서, 상기 EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은,
상기 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하고,
상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 더 포함하고,
상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실로 전환시키는 시약을 더 포함한다.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은,
비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제를 더 포함한다.
8. 제7항에 있어서,
상기 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열이거나, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열이고,
상기 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편은 SEQ ID NO:7의 서열 또는 SEQ ID NO:11의 서열이며,
차단제는 SEQ ID NO:8의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열이다.
9. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드로서,
상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 포함한다.
10. 제9항에 있어서,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 더 포함한다.
11. 제10항에 있어서,
비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제를 더 포함한다.
12. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드로서,
SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열을 포함한다.
13. 제12항에 있어서,
SEQ ID NO:7의 서열을 더 포함한다.
14. 제13항에 있어서,
SEQ ID NO:8의 서열을 더 포함한다.
15. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드로서,
SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열을 포함한다.
16. 제15항에 있어서,
SEQ ID NO:11의 서열을 더 포함한다.
17. 제16항에 있어서,
SEQ ID NO:12의 서열을 더 포함한다.
18. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트 제조에서의 MT1A 유전자의 용도.
19. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트 제조에서의 EPO 유전자의 용도.
20. 시험키트로서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 올리고 뉴클레오티드를 포함한다.
21. 제20항에 있어서,
뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 폴리머라제 및 상기 DNA 폴리머라제 기능에 필요한 버퍼로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분을 더 포함한다.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 설명서를 더 포함한다.
23. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트 제조에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 올리고 뉴클레오티드의 용도.
24. 제18항, 제19항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트는,
1) 검출할 바이오 샘플에서 표적 유전자의 표적 서열 또는 이의 단편을 포함하는 DNA 샘플을 분리하는 단계;
2) 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
3) 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 검출 결과에 따라 바이오 샘플의 상태를 판단함으로써 식도암에 대한 체외 검출을 구현하는 단계를 포함하는 방법을 통해 식도암을 검출한다.
25. 제24항에 있어서, 상기 방법은,
검출할 바이오 샘플의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
추출된 게놈 DNA를 시약으로 처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환시키는 단계;
시약으로 처리된 DNA 샘플을 DNA 폴리머라제 및 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머와 접촉시키고, 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제의 존재하에 DNA 중합 반응을 수행하는 단계;
프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계; 및
상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다.
26. 제25항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트 시약이다.
27. 식도암 검출 방법으로서,
검출할 바이오 샘플에서 표적 유전자의 표적 서열 또는 이의 단편을 포함하는 DNA 샘플을 분리하는 단계;
상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 검출 결과에 따라 바이오 샘플의 상태를 판단함으로써 식도암에 대한 체외 검출을 구현하는 단계를 포함한다.
28. 식도암 검출 방법으로서,
검출할 바이오 샘플의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
추출된 게놈 DNA를 시약으로 처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환시키는 단계;
시약으로 처리된 DNA 샘플을 DNA 폴리머라제 및 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머와 접촉시키고, 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제의 존재하에 DNA 중합 반응을 수행하는 단계;
프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계; 및
상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두이다.
30. 제29항에 있어서, 상기 MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다.
31. 제29항에 있어서, 상기 EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다.
32. 제28항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트 시약이다.
33. 제28항에 있어서, 상기 프라이머는,
상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편이다.
33. 제28항에 있어서, 상기 차단제는 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제이다.
34. 제28항에 있어서, 상기 프로브는,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편이다.
35. 제33항에 있어서, 상기 프라이머는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열이거나, 또는 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열이다.
36. 제33항에 있어서, 상기 차단제는 SEQ ID NO:8의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열이다.
37. 제34항에 있어서, 상기 프로브는 SEQ ID NO:7의 서열 또는 SEQ ID NO:11의 서열이다.
38. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물로서,
표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산; 및
표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 항체를 포함하고,
상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두이며,
상기 표적 단백질은 SNCG, 즉 γ-시누클레인(γ-synuclein)이다.
39. 제38항에 있어서, 상기 MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다.
40. 제38항에 있어서, 상기 EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다.
41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은,
상기 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하고,
상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 더 포함하고,
상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실로 전환시키는 시약을 더 포함한다.
44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은,
비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제를 더 포함한다.
45. 제44항에 있어서,
상기 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열이거나, 또는 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열이고,
상기 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편은 SEQ ID NO:7의 서열 또는 SEQ ID NO:11의 서열이며,
차단제는 SEQ ID NO:8의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열이다.
46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은,
표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 시약을 더 포함하고, 상기 시약은 효소결합 면역흡착 분석 시약이며, 예를 들어, 상기 시약은 표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 항체 코팅된 반응 플레이트, SNCG 프로테아제 결합물, 기질 용액, 세척 용액 및 종결 용액을 포함한다.
47. 시험키트로서, 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드를 포함한다.
48. 제47항에 있어서,
뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 폴리머라제 및 상기 DNA 폴리머라제 기능에 필요한 버퍼로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분; 및
표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 항체 코팅된 반응 플레이트, SNCG 프로테아제 결합물, 기질 용액, 세척 용액 및 종결 용액으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분을 더 포함한다.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 설명서를 더 포함한다.
50. 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트 제조에서의 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 올리고 뉴클레오티드의 용도.
51. 제18항, 제19항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트는,
1) 피험자의 바이오 샘플 중 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
2) 피험자의 바이오 샘플 중 상기 표적 단백질의 농도를 결정하는 단계; 및
3) 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도의 검출 결과를 결합시켜 피험자가 식도암을 앓고 있는지 여부를 판단함으로써, 식도암에 대한 체외 검출을 구현하는 단계를 포함한다.
52. 제51항에 있어서, 상기 방법은,
피험자의 말초혈액을 채취하여 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계;
혈장 또는 혈청에서 유리 DNA를 추출하는 단계;
추출된 유리 DNA를 시약으로 처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환시키는 단계;
시약으로 처리된 DNA 샘플을 DNA 폴리머라제 및 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머와 접촉시키고, 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제의 존재하에 DNA 중합 반응을 수행하는 단계;
프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계;
상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
SNCG항체를 사용하여 면역 반응을 통해 혈장 또는 혈청 중 SNCG의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
53. 제52항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트 시약이다.
54. 식도암 검출 방법으로서,
피험자의 바이오 샘플을 채취하는 단계;
피험자의 바이오 샘플 중 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
피험자의 바이오 샘플 중 상기 표적 단백질의 농도를 결정하는 단계; 및
상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도의 검출 결과를 결합시켜 피험자가 식도암을 앓고 있는지 여부를 판단함으로써, 식도암에 대한 체외 검출을 구현하는 단계를 포함한다.
55. 식도암 검출 방법으로서,
피험자의 말초혈액을 채취하여 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계;
혈장 또는 혈청에서 유리 DNA를 추출하는 단계;
5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환시키는 단계;
시약으로 처리된 DNA 샘플을 DNA 폴리머라제 및 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머와 접촉시키고, 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제의 존재하에 DNA 중합 반응을 수행하는 단계;
프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계;
상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
SNCG항체를 사용하여 면역 반응을 통해 혈장 또는 혈청 중 SNCG의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
56. 제54항 또는 제55항에 있어서,
상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두이고,
상기 표적 단백질은 SNCG이다.
57. 제56항에 있어서, 상기 MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다.
58. 제56항에 있어서, 상기 EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다.
59. 제55항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트 시약이다.
60. 제55항에 있어서, 상기 프라이머는,
상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편이다.
61. 제55항에 있어서, 상기 차단제는 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제이다.
62. 제55항에 있어서, 상기 프로브는,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편이다.
63. 제60항에 있어서, 상기 프라이머는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열이거나, 또는 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열이다.
64. 제61항에 있어서, 상기 차단제는 SEQ ID NO:8의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열이다.
65. 제62항에 있어서, 상기 프로브는 SEQ ID NO:7의 서열 또는 SEQ ID NO:11의 서열이다.
본 발명의 발명인은 후성 유전학 및 바이오 정보학 기술을 이용하여 식도암 조직 및 암 부근 대조군의 게놈 전체 메틸화 데이터를 분석함으로써 식도암과 관련된 2개의 메틸화 유전자를 발견하고 이 두 식도암 메틸화 유전자가 비정상적 메틸화의 표적 서열을 발생하는 것을 결정하였으며; 나아가, 본 발명의 발명인은 이 두 식도암 메틸화 유전자의 표적 서열을 통해 민감하고 특이적으로 이 두 유전자의 메틸화 상태를 검출할 수 있어 말초혈액에서 유리 DNA의 검출에 사용될 수 있음을 발견하였다. 식도암 환자 및 정상 대조 개체의 말초혈액 샘플에 대한 검출은 본 발명에 기술된 조성물 및 검출 방법을 통해 편평세포암종 및 선암종을 포함한 상이한 세포 유형의 일반적인 식도암을 민감하고 특이적으로 검출할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 중요한 임상 적용 가치를 갖는, 체외에서 식도암을 검출할 수 있는 조성물 및 검출 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명의 발명인은 많은 종양 단백질 표지자 중 SNCG 단백질과 상기 표적 유전자의 메틸화를 결합시켜 검출함으로써 식도암의 검출을 현저히 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 중요한 임상 적용 가치를 갖는, 체외에서 식도암을 검출할 수 있는 조성물 및 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 아래 구체적인 설명 및 청구범위를 통해 상세히 설명될 것이다.
본 발명의 상기 및 다른 특징은 아래 도면 및 그 상세한 설명을 통해 추가로 설명될 것이다. 이들 도면은 본 발명에 따른 몇몇 예시적인 실시형태만 도시하므로 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안됨을 이해해야 한다. 별도로 설명하지 않는 한, 도면은 축척대로 도시된 것이 아니며, 유사한 부호는 유사한 부재를 나타낸다.
도 1은 본 발명에 따른 표적 유전자를 스크리닝한 결과도이다.
도 2는 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법을 사용하여 백혈구 게놈 DNA(표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 음성 기준품) 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA(표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 양성 기준품)에 대한 검출을 도시한다. 그 결과, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법을 통해 백혈구 게놈 DNA를 검출한 검출 결과는 음성이고, DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA를 검출한 검출 결과는 양성임을 나타낸다.
도 3은 상기 조성물 및 검출 방법을 이용하여 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출함으로써 식도암에 대한 체외 비침습적 검출을 구현하는 결과도이다.
도 4는 상기 조성물 및 검출 방법을 이용하여 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질의 농도를 검출함으로써, 식도암에 대한 체외 비침습적 검출을 구현하는 결과도이다.
도 2는 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법을 사용하여 백혈구 게놈 DNA(표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 음성 기준품) 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA(표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 양성 기준품)에 대한 검출을 도시한다. 그 결과, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법을 통해 백혈구 게놈 DNA를 검출한 검출 결과는 음성이고, DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA를 검출한 검출 결과는 양성임을 나타낸다.
도 3은 상기 조성물 및 검출 방법을 이용하여 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출함으로써 식도암에 대한 체외 비침습적 검출을 구현하는 결과도이다.
도 4는 상기 조성물 및 검출 방법을 이용하여 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질의 농도를 검출함으로써, 식도암에 대한 체외 비침습적 검출을 구현하는 결과도이다.
한편, 본 발명은 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물로서, 표적 유전자의 표적 서열 내 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산 및 표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 항체를 포함하고; 상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중 하나 또는 둘 모두이며, 상기 표적 단백질은 SNCG인, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 표적 서열을 포함하여 식도암에서 비정상적인 메틸화를 방출하는 한 그룹의 표적 유전자의 표적 서열을 제공한다. MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1-2로 표시되고, EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3-4로 표시된다.
MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다.
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO: 1의 상보적 서열은 SEQ ID NO: 2로 표시된다.
SEQ ID NO:2
바람직하게, EPO 유전자의 표적 서열의 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다.
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO: 3의 상보적 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시된다.
바람직하게, 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 바이설파이트를 사용하여 검출할 샘플 DNA를 전환시킬 경우, 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 표적 유전자의 표적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
보다 바람직하게, 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 바이설파이트를 사용하여 검출할 샘플 DNA를 전환시킬 경우, 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 조성물은 표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실로 전환시키는 시약을 더 포함하고, 보다 바람직하게, 상기 시약은 바이설파이트이다.
바람직하게, 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 비메틸화 상태인 DNA와 우선적으로 결합하는 차단제를 더 포함한다.
바람직하게, 상기 조성물은 하기와 같은 프라이머, 프로브 및/또는 차단제 중 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
MT1A 프라이머 F
SEQ ID NO:5
MT1A 프라이머 R
SEQ ID NO:6
MT1A 프로브
SEQ ID NO:7
MT1A 차단제
SEQ ID NO:8
EPO 프라이머 F
SEQ ID NO:9
EPO 프라이머R
SEQ ID NO:10
EPO 프로브
SEQ ID NO:11
EPO 차단제
SEQ ID NO:12
다른 한편, 본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드를 제공한다.
바람직하게, 상기 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편; 및/또는 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드는 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 더 포함한다.
바람직하게, 상기 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드는 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드는 비메틸화 상태인 DNA와 우선적으로 결합하는 차단제를 더 포함한다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열을 포함하고, SEQ ID NO:7의 서열 및 SEQ ID NO:8의 서열을 더 포함한다.
다른 구체적인 실시형태에서, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열을 포함하고, SEQ ID NO:11의 서열 및 SEQ ID NO:12의 서열을 더 포함한다.
다른 한편, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 시험키트를 제공한다. 상기 시험키트는 뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 폴리머라제 및 상기 DNA 폴리머라제 기능에 필요한 버퍼로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분을 더 포함한다.
본 발명에 따른 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물은 표적 단백질의 농도를 검출하기 위한 항체를 더 포함하고, 상기 표적 단백질은 γ-시누클레인(SNCG)이다.
본 발명은 또한 체외에서 식도암을 검출하기 위한 시험키트 제조에서의 MT1A 유전자, EPO 유전자, SNCG 단백질의 용도에 관한 것이다.
여기서, 상기 MT1A은 인간 제16번 염색체의 q13 영역에 위치한 메탈로티오네인 1A(영문명칭: metallothionein 1A)으로, 메탈로티오네인 유전자 패밀리에 속한다. 메탈로티오네인은 시스테인이 풍부하고 방향족기를 함유한 아미노산이 결여된 소분자 단백질로서, 2가 중금속 이온에 결합할 수 있으며, 또한 메탈로티오네인은 히드록실기를 함유하는 자유 라디칼의 손상으로부터 세포를 보호하고, 세포 내 금속 이온의 균형을 유지하며, 중이온의 독성을 제거하는 역할을 하는 항산화제이다. 따라서 메탈로티오네인 유전자의 기능 상실은 암 발생 등 병리학적 현상을 초래한다.
상기 EPO 유전자는 인간 제7호 염색체의 q22.1 영역에 위치한 에리트로포이에틴 유전자(영문명칭: erythropoietin)로서, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 세포에 의해 분비된, 글리코실화된 사이토카인(cytokine)이며, 에리트로포이에틴은 대응되는 수용체와 결합한 후, 적혈구의 합성을 촉진할 수 있다.
상기 SNCG 단백질은 SNCG 유전자의 산물인 시누클레인-γ(영문명칭: synuclein gamma)으로서 인간 제10번 염색체의 q23.2 영역에 위치한다. 상기 유전자는 시누클레인 유전자 패밀리의 구성원이며, 이의 단백질 서열은 하기와 같다.
SNCG 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 아래와 같다.
다른 한편, 본 발명은 식도암 체외 검출 방법을 제공하고, 상기 방법은,
1) 검출할 바이오 샘플 중 표적 유전자의 표적 서열 또는 이의 단편을 분리하는 단계;
2) 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
3)상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 검출 결과에 따라 바이오 샘플의 상태를 판단함으로써 식도암에 대한 체외 검출을 구현하는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 방법은,
1) 검출할 바이오 샘플의 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)에서 획득한 DNA 샘플을 시약으로 처리하여, 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환, 즉 표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기 우라실 또는 다른 염기로 전환시키되, 전환된 염기는 혼성화 성능 측면에서 5 부위의 비메틸화 시토신 염기와 상이하며, 또한 검출 가능한 것인 단계;
3) 단계 2)에서 처리된 DNA 샘플과 DNA 폴리머라제 및 상기 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머를 접촉시켜, 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열이 증폭되어 증폭 산물을 생성하거나 또는 증폭되지 않도록 하되; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되면 증폭 산물이 생성되고; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되지 않으면 증폭되지 않는 것인 단계;
4) 프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계; 및
5) 상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 더 포함한다.
다른 한편, 본 발명은 식도암 체외 검출 방법을 제공하고, 상기 방법은,
1) 피험자의 바이오 샘플 중 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
2) 피험자의 바이오 샘플 중 상기 표적 단백질의 농도를 결정하는 단계; 및
3) 상기 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도의 검출 결과를 결합시켜 피험자가 식도암을 앓고 있는지 여부를 판단함으로써, 식도암에 대한 체외 검출을 구현하는 단계를 포함한다.
여기서, 바이오 샘플은 피험자의 말초혈액에서 분리된 혈장 또는 혈청이다.
일부 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 방법은,
1) 피험자의 말초혈액을 채취하여 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계;
2) 혈장 또는 혈청에서 유리 DNA를 추출하는 단계;
3) 단계 2)에서 획득한 유리 DNA를 시약으로 처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환, 즉 표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기 우라실 또는 다른 염기로 전환시키되, 전환된 염기는 혼성화 성능 측면에서 5 부위의 비메틸화 시토신 염기와 상이하며, 또한 검출 가능한 것인 단계;
4) 단계 3)에서 처리된 유리 DNA와 DNA 폴리머라제 및 상기 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머를 접촉시켜, 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열이 증폭되어 증폭 산물을 생성하거나 또는 증폭되지 않도록 하되; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되면 증폭 산물이 생성되고; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되지 않으면 증폭되지 않는 것인 단계;
5) 프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계;
6) 상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
7) SNCG항체를 사용하여 면역 반응을 통해 혈장 또는 혈청 중 SNCG의 농도를 결정하는 단계를 더 포함한다.
바람직하게, 대표적인 프라이머는 상기 표적 유전자의 표적 서열의 단편을 포함하고, 상기 표적 유전자의 표적 서열의 단편은 SEQ ID NO:1-2 및 SEQ ID NO:3-4로부터 선택된 적어도 9개의 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적이거나 또는 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 이에 혼성화된 단편을 포함한다.
바람직하게, 대표적인 프로브는 상기 표적 유전자의 표적 서열의 단편을 포함하고, 상기 표적 유전자의 표적 서열의 단편은SEQ ID NO:1-2 및 SEQ ID NO:3-4로부터 선택된 적어도 15개의 뉴클레오티드와 동일하거나 상보적이거나 또는 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 이에 혼성화된 단편을 포함한다.
바람직하게, 대표적인 차단제는 비메틸화 상태인 DNA와 우선적으로 결합하는 차단제이다.
바람직하게, 상기 프라이머, 프로브 및/또는 차단제 중 하나 또는 하나 이상은 하기와 같다.
MT1A 프라이머 F
SEQ ID NO:5
MT1A 프라이머 R
SEQ ID NO:6
MT1A 프로브
SEQ ID NO:7
MT1A 차단제
SEQ ID NO:8
EPO 프라이머 F
SEQ ID NO:9
EPO 프라이머 R
SEQ ID NO:10
EPO 프로브
SEQ ID NO:11
EPO 차단제
SEQ ID NO:12
또한, 상기 접촉 또는 증폭은 다음 방법 중 적어도 하나를 사용한다. 즉 내열성 DNA 폴리머라제를 상기 증폭 효소로 사용하고, 5-3’엑소뉴클레아제 활성이 결여된 폴리머라제를 사용하며, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 검출 가능한 표지를 갖는 증폭 산물 핵산 분자를 생성한다.
일부 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태는 PCR 반응의 사이클 임계값인 Ct값에 의해 결정된다. PCR 반응을 통해 바이오 샘플에서 DNA를 분석하는 방법을 이용함으로써 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태에 대한 검출을 용이하게 구현할 수 있고, 또한 PCR 반응의 사이클 임계값에 따라 피검출 샘플이 양성인지 여부를 빠르고 편리하게 판단할 수 있으므로 비침습적이고 빠른 식도암 체외 검출 방법을 제공한다.
상기 바이오 샘플은 세포주, 조직학적 절편, 조직 생검/파라핀 매립된 조직, 체액, 대변, 결장 유출물, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 분리된 혈액 세포, 혈액으로부터 분리된 세포, 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 바이오 샘플은 말초혈액 전혈, 혈장, 또는 혈청으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 시험키트를 제공한다. 대표적으로, 상기 시험키트는 피험자의 바이오 샘플을 수용하기 위한 용기를 포함하고, 또한, 상기 시험키트는 검출 결과를 사용 및 해석하기 위한 설명서도 포함한다.
본 발명은 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질의 농도를 검출함으로써 체외에서 비침습적으로 식도암을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명인은 식도암 조직에서 MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태와 정상적인 식관 조직에서 상기 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태가 아래와 같은 현저한 차이가 존재함을 발견하였다. 즉 식도암 조직에서, MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 표적 서열은 메틸화되는 반면, 정상적인 식관 조직에서, MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 표적 서열은 메틸화되지 않는다. 따라서 본원 발명은 샘플 중 MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출함으로써 체외에서 식도암을 검출하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 비침습적으로 신속하게 식도암을 검출할 수 있다.
본 발명인은 또한, 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태에 대한 단독 검출에 비해, 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도에 대한 결합 검출은 식도암 검출율을 현저하게 향상시키는 동시에 검출 특이성에는 큰 영향을 미치지 않음을 발견하였다. 따라서 본원 발명은 샘플 중 MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 SNCG 단백질의 농도를 검출함으로써 체외에서 식도암을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 방법은 비침습적으로 신속하게 식도암을 검출할 수 있다.
다르게 정의되지 않은 한, 본 명세서의 기술 및 과학 관련 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서의 하기에 기술된 바와 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 실험 또는 실제 응용에 사용될 수 있으나, 충돌되는 경우, 본 명세서에 포함된 정의를 기준으로 하며, 이 밖에, 재료, 방법 및 예시는 설명을 위한 것일 뿐 한정하려는 것이 아니다.
본 발명은 또한 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도를 민감하고 특이적으로 검출 가능한 조성물; 및 체외에서 비침습적으로 식도암을 검출 가능한 방법 및 시험키트를 제공한다.
하기 설명은 본 발명의 조성물, 시험키트, 핵산 서열 및 검출 방법의 실시예이다. 첫번째 실시형태는 표적 유전자 및 표적 유전자의 표적 서열을 개시하고; 두번째 실시형태는 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산을 포함하여, 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출하기 위한 조성물을 개시하고; 세번째 실시형태는 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질의 농도를 검출함으로써 체외에서 비침습적으로 식도암을 검출하는 방법을 개시한다.
바람직하게, 상기 핵산에 의해 검출된 서열은 상기 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하며; 일부 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 바이설파이트를 사용하여 검출할 샘플 DNA를 전환시킬 경우, 상기 핵산에 의해 검출된 서열은 표적 유전자의 표적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
보다 바람직하게, 상기 핵산에 의해 검출된 서열은 각각 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서 상기 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하며; 일부 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 바이설파이트를 사용하여 검출할 샘플 DNA를 전환시킬 경우, 상기 핵산에 의해 검출된 서열은 중간 정도로 엄격하거나 엄격한 조건에서, 표적 유전자의 표적 서열을 바이설파이트로 전환시킨 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하되, 여기서 상기 뉴클레오티드의 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 유전자의 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실로 전환시키는 시약을 더 포함하고, 바람직하게, 상기 시약은 바이설파이트이다. DNA의 바이설파이트 변형은 CpG 메틸화 상태를 평가하기 위한 공지된 도구이다. 진핵 세포의 DNA에서, 5-메틸시토신은 가장 일반적인 공유 염기 변형이다. 5-메틸시토신과 사이토신은 동일한 염기페어링 거동을 가지므로 5-메틸시토신은 시퀀싱을 통해 감별될 수 없다. 이 밖에, PCR 증폭 과정에서, 5-메틸시토신이 구비한 후성 유전학적 정보는 완전히 상실된다. DNA에서 5-메틸시토신의 존재를 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 바이설파이트와 사이토신의 특이 반응에 기반하여 후속 알칼리 가수 분해 후, 메틸화되지 않은 사이토신은 페어링 거동에서 타민에 대응되는 우라실로 전환되나, 이러한 조건에서 5-메틸시토신은 변형되지 않는다. 이에 따라 원래의 DNA는 상기 방식으로 전환되어 이의 혼성화 거동에서 사이토신과 구별할 수 없었던 5-메틸시토신이 현재에는 유일하게 남은 사이토신으로서 통상적인 분자 생물학 기술, 예를 들어 증폭 및 혼성화에 의해 검출될 수 있게 된다. 이러한 모든 기술은 상이한 염기 페어링 특성을 기반으로 하며, 현재에는 충분히 이용할 수 있다. 따라서 대표적으로, 본원 발명은 표적 유전자의 표적 서열 내 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 상태를 결정하기 위한 바이설파이트 기술과 하나 또는 하나 이상의 메틸화 측정을 결합하여 사용하는 방법을 제공한다. 이 밖에, 본 발명의 방법은 혈액 또는 대변 중 저농도 종양 세포와 같은 이종 바이오 샘플을 분석하기에 적합하다. 따라서, 이러한 샘플 중 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 상태를 분석할 경우, 당업자는 정량적 측정법을 사용하여 메틸화 상태가 아닌 특정 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 수준(예를 들어 백분율, 부수, 비율, 비례 또는 정도)을 결정할 수 있다. 대응되게, 용어 메틸화 상황 또는 메틸화 상태는 또한 CpG 디뉴클레오티드 서열의 메틸화 상태를 반영하는 값을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
일부 실시형태에서, 본원 발명은 구체적으로, 1) 검출할 바이오 샘플의 게놈 DNA를 추출하는 단계; 2) 단계 1)에서 획득한 DNA 샘플을 시약으로 처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환, 즉 표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기 우라실 또는 다른 염기로 전환시키되, 전환된 염기는 혼성화 성능 측면에서 5 부위의 비메틸화 시토신 염기와 상이하며, 또한 검출 가능한 것인 단계; 3) 단계 2)에서 처리된 DNA 샘플과 DNA 폴리머라제 및 상기 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머를 접촉시켜, 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열이 증폭되어 증폭 산물을 생성하거나 또는 증폭되지 않도록 하되; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되면 증폭 산물이 생성되고; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되지 않으면 증폭되지 않는 것인 단계; 및 4) 프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계; 5) 및 상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 방법은 구체적으로, 1) 피험자의 말초혈액을 채취하는 단계; 2) 혈장 또는 혈청에서 유리 DNA를 추출하는 단계; 3) 단계 2)에서 획득한 유리 DNA를 시약으로 처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실 또는 다른 염기로 전환, 즉 표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기 우라실 또는 다른 염기로 전환시키되, 전환된 염기는 혼성화 성능 측면에서 5 부위의 비메틸화 시토신 염기와 상이하며, 또한 검출 가능한 것인 단계; 4) 단계 3)에서 처리된 DNA 샘플과 DNA 폴리머라제 및 상기 표적 유전자의 표적 서열의 프라이머를 접촉시켜, 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열이 증폭되어 증폭 산물을 생성하거나 또는 증폭되지 않도록 하되; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되면 증폭 산물이 생성되고; 상기 처리된 표적 유전자의 표적 서열은 DNA 중합 반응이 발생되지 않으면 증폭되지 않는 것인 단계; 5)프로브로 증폭 산물을 검출하는 단계; 6) 상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 7) SNCG항체를 이용하여 면역 반응(바람직하게, 효소 연결 면역 흡착 시험, ELISA)을 통해 혈장 또는 혈청 중 표적 단백질의 농도를 검출하는 단계를 포함한다.
대표적으로, 상기 접촉 또는 증폭은 다음 방법 중 적어도 하나를 사용한다. 즉 내열성 DNA 폴리머라제를 상기 증폭 효소로 사용하고, 5-3’엑소뉴클레아제 활성이 결여된 폴리머라제를 사용하며; PCR을 이용하여 검출 가능한 표지를 갖는 증폭 산물 핵산 분자를 생성한다. 바람직하게, PCR 방식으로 메틸화 상태를 측정하는 바, “형광 기반 실시간 PCR 기술”, 메틸화 민감성 단일화 뉴클레오티드 프라이머 연장 반응(Ms-SNuPE), 메틸화 특이성PCR(MSP), 및 메틸화 CpG 섬 증폭(MCA) 등 측정 방법을 사용하여 표적 유전자 표적 서열의 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태를 측정한다. 여기서, “형광 기반 실시간 PCR” 측정은 형광 기반 실시간 PCR(TaqMan) 기술을 사용하는 고중성자속 정량적 메틸화 측정이며, 이는 PCR 단계 이후 추가 조작이 필요하지 않다. 요약하면, “형광 기반 실시간 PCR” 방법은 표준 조작에 따라 소듐바이설파이트 반응에서 메틸화 의존적 서열 차이 혼합 셀로 전환되는 게놈 DNA의 혼합 샘플로 시작하고, 이어서 “바이어스(biased)” 반응(공지된 CpG 디뉴클레오티드와 중복되는 PCR프라이머 적용)에서 형광 기반 PCR을 수행하며, 증폭 수준 및 형광 검출 증폭 수준에서 서열 차이가 발생할 수 있다. “형광 기반 실시간 PCR” 측정은 게놈 DNA 샘플에서 메틸화 상태에 대한 정량적 테스트로서 사용될 수 있으며, 여기서 서열 구분은 프로브 혼성화 수준에서 발생하고, 상기 정량적 방식에서, 특정된 CpG 디뉴클레오티드와 중복되는 형광 프로브의 존재하에, PCR 반응은 메틸화 특이적 증폭을 제공하며, 출발 DNA양의 비 바이어스 대조는 프라이머 및 프로브가 어떠한 CpG 디뉴클레오티드도 커버하지 않는 반응에 의해 제공된다. “형광 기반 실시간 PCR” 방법은 “TaqMan”, “Lightcycler” 등과 같은 임의의 적합한 프로브와 함께 사용될 수 있고, TaqMan 프로브는 형광 리포터(Reporter) 및 퀀처(Quencher)로 이중 라벨링되고, PCR 사이클에서 정방향 또는 역방향 프라이머보다 약 10℃ 높은 온도에서 용해되도록 상대적으로 높은 GC 함량 영역으로 특이하게 설계되어, 이에 따라 TaqMan 프로브가 PCR 어닐링/연장 단계에서 충분한 혼성화를 유지한다. Taq 폴리머라제가 PCR에서 효소에 의해 새로운 가닥이 합성될 경우, 결국 어닐링된 TaqMan 프로브와 만나게 되고, 이어서 TaqMan 프로브를 분해하여 Taq 폴리머라제 5 내지 3’ 엔도뉴클레아제 활성을 대체함으로써, 실시간 형광 검출 시스템을 적용하여 현재 퀀칭되지 않은 신호의 정량적 검출을 위해 형광 리포터 분자를 방출한다. “형광 기반 실시간 PCR” 분석을 위한 대표적인 시약은, 표적 유전자의 표적 서열을 위한 PCR프라이머; 비특이적 증폭 차단제; TaqMan 또는 Lightcycler 프로브; 최적화된 PCR 버퍼 및 탈산 뉴클레오티드; 및 Taq 폴리머라제 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
여기서, 효소 면역 흡착법(ELISA)을 통해 혈청에서 SNCG 단백질의 발현 수준을 검출함으로써, SNCG항체 및 면역 반응을 이용하여 혈장 또는 혈청 중 SNCG의 농도를 결정한다.
바람직하게, 상기 ELISA는 “샌드위치 방법”이고, 상기 방법은 구체적으로,
1) SNCG 모노클로날 항체(마우스)를 사용하여 96 웰 플레이트를 코팅하는 단계;
2) 10배 희석된 임상 혈청 샘플 또는 혈장 샘플 및 연속 희석된 인간 SNCG 단백질 용액을 첨가하는 단계;
3) 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)로 표지된 마우스 항 인간 SNCG의 폴리클로날 항체(IgG)를 각 웰에 첨가하는 단계;
4) 상기 혼합물이 담긴 면역 반응 플레이트를 실온의 진탕 조건에서 인큐베이션하고, 세척 용액으로 반응 웰을 세척한 후 발색 기질을 첨가하는 단계;
5) 종결 용액을 첨가하여 발색 반응을 종결시킨 후, 플레이트 리더를 사용하여 각 반응 웰의 스펙트럼을 검출하는 단계; 및
6) 연속 희석된 인간 SNCG 단백질 용액의 검출 값을 이용하여 표준 곡선을 구축하고 표준 곡선에 기반하여 임상 혈청 샘플을 정량화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서, 일정 양의 식도암 샘플 및 정상 샘플의 SNCG 유전자의 혈청 또는 혈장 단백질 수준에 기반하여, SNCG 유전자의 혈청 또는 혈장 단백질 수준에 대한 식도암 및 정상적인 임계값이 결정된다.
실시예
실시예 1
본 발명인은 233명의 식도암 조직 및 171개의 정상적인 식도 조직의 게놈 전체의 메틸화 칩(Illumina사의 HumanMethylation450k 칩) 데이터를 분석함으로써, 식도암 조직에서 MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 메틸화 수준이 정상적인 식도 조직보다 현저히 높음을 발견하였으며(분석 결과는 도 1에 도시된 바와 같음), 나아가, 본 발명인은 게놈 전체의 메틸화 칩에서 MT1A 유전자 및 EPO 유전자의 프로브 서열 및 대응되는 메틸화율 데이터를 분석함으로써 식도암 조직 및 정상적인 식도 조직에서 상기 두개의 표적 유전자의 메틸화가 가장 현저한 서열 단편을 발견하여 상기 두개의 표적 유전자의 표적 서열로서 결정하였다.
MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시된다.
SEQ ID NO:1
MT1A 유전자의 표적 서열의 상보적 서열은 SEQ ID NO: 2로 표시된다.
SEQ ID NO:2
EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된다.
SEQ ID NO:3
EPO 유전자의 표적 서열의 상보적 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시된다.
SEQ ID NO: 4
실시예 2
제1 단계에서, 분석할 바이오 샘플의 DNA를 획득한다. 상기 공급원은 세포주, 조직학적 절편, 생검 조직, 파라핀 매립된 조직, 체액, 대변, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 분리된 혈액 세포, 혈액으로부터 분리된 세포 및 및 이들의 가능한 모든 조합과 같은 임의의 적합한 공급원일 수 있다. 다음, 종래 기술 중 임의의 표준 수단을 통해 상기 샘플로부터 DNA를 분리한다. 요약하면, DNA가 세포막에 피복될 경우, 상기 바이오 샘플은 파쇄되고 효소적, 화학적 또는 기계적 수단에 의해 분열 및 용해되어야 하고, 다음, 예를 들어 단백질 키나제 K의 분해를 통해 단백질 및 다른 오염물을 제거하며, 이어서 용액으로부터 DNA를 회수한다. 이는 염석, 유기 추출 또는 DNA를 고상 지지물에 결합시키는 방법을 포함하여 다양한 방법으로 구현될 수 있으며, 방법에 대한 선택은 시간, 비용 및 필요한 DNA 양을 포함한 다양한 요소의 영향을 받는다. 상기 샘플 DNA가 세포막에 피복되지 않는 경우(예를 들어, 혈액 샘플로부터의 사이클 DNA), 종래 기술에서 DNA분리 및/또는 정제하기 위한 표준 방법을 사용할 수 있는데, 이러한 방법은 구아니딘 히드로클로라이드 또는 우레아와 같은 카오트로픽염을 비롯한 단백질 분해 시약; 또는 나트륨 도데실설포네이트(SDS), 시아노겐브로마이드와 같은 세제를 사용할 수 있고, 다른 방법은 에탄올 침전 또는 프로판올 침전, 원심 분리에 의한 진공 농축 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 또한 초여과 필터, 실리콘 표면 또는 필름, 자성 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리스티렌 표면, 양전하를 띤 표면 및 양성 전하를 띤 필름, 하전된 필름, 하전된 표면, 하전된 변환 필름, 하전된 변환 표면 등을 이용할 수 있으며, 핵산이 추출되면 DNA가 분석에 사용된다.
본 실시형태에서, 바이오 샘플 DNA는 백혈구 게놈 DNA 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA이고, 백혈구 게놈 DNA의 표적 유전자의 표적 서열은 비메틸화 상태이므로, 백혈구 게놈 DNA는 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 음성 기준품이며, DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA의 표적 유전자의 표적 서열은 메틸화 상태이므로 DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA는 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 양성 기준품이다.
제2 단계에서, 5 부위에서 비메틸화 시토신 염기가 우라실, 타민 또는 혼성화 거동에서 사이토신에 사용되지 않은 다른 염기로 전환되도록 상기 두 DNA 샘플을 별도로 처리하며 바람직하게는 바이설파이트 시약 처리를 통해 구현된다. 용어 “바이설파이트 시약”은 바이설파이트, 산 설파이트 또는 이들의 조합을 포함하는 시약을 가리키며, 여기에 개시된 바와 같이 메틸화 및 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드 서열을 구분하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 바이설파이트 처리는 변성 용매, 예를 들어 n-알킬글리콜, 특히 디에틸렌글리콜 디메틸에테르 (DME) 또는 디옥산 또는 디옥산 유도체의 존재하에 수행되나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 상기 변성 용매는 1 % 내지 35 %(v/v)의 농도로 사용되고, 보다 바람직하게, 상기 바이설파이트 반응은 스캐빈저, 예를 들어 6-히드록실기-2,5,7,8,-테트라메틸크로마인 2-카복실산 또는 트리히드록시 벤조산 및 이의 유도체, 예를 들어 갈산의 존재하에 수행된다. 상기 바이설파이트 전환은 바람직하게 30℃ 내지 70℃의 반응 온도에서 수행되며, 여기서 반응 동안, 온도는 85℃ 이상으로 단기간에 증가되고, 바이설파이트 처리된 DNA는 바람직하게는 정량화 이전에 정제되는데, 이는 초여과와 같은 종래 기술에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
제3 단계에서, DNA의 단편은 본 발명의 프라이머 및 증폭 효소를 사용하여 증폭 처리된다. 동일한 반응 용기에서 여러종의 DNA 단편을 동시에 증폭할 수 있으며, 바람직하게, 상기 증폭 산물의 길이는 100 내지 2000개의 염기쌍이다. 검출할 바이오 샘플의 게놈 DNA가 메틸화 및 비메틸화 상태의 혼합물인 경우, 특히 암피험자의 말초혈액 중 유리 DNA와 같이 메틸화 상태의 DNA가 비메틸화 상태의 DNA보다 훨씬 작으면, PCR 증폭 프라이머의 증폭 특이성을 향상시키기 위해, 본 발명은 PCR 반응 시스템에서 표적 유전자의 표적 서열에 특이적인 차단제를 사용한다. 차단제의 뉴클레오티드 서열의 5단과 정방향 (F) 또는 역방향 (R) 프라이머의 3’단 뉴클레오티드 서열은 5개 뉴클레오티드보다 크거나 같은 중복 영역을 가지며; 차단제와 정방향(F) 또는 역방향 (R) 프라이머는 표적 유전자의 표적 서열 DNA의 동일한 가닥에 상보되고; 차단제의 멜팅 온도는 정방향(F) 또는 역방향 (R)프라이머보다 5℃ 높(포함)으며; 차단제의 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바이설파이트 전환된 비메틸화된 표적 유전자의 표적 서열 DNA의 서열과 상보된다. 따라서, 검출할 바이오 샘플의 게놈 DNA가 메틸화 및 비메틸화 상태의 혼합물인 경우, 특히 메틸화 상태의 DNA가 비메틸화 상태의 DNA보다 훨씬 작으면, 비메틸화 상태의 DNA는 바이설파이트 전환을 거친 후, 우선적으로 차단제와 결합하여 DNA 주형과 PCR프라이머의 결합을 억제하므로 PCR 증폭이 발생하지 않으며, 또한 메틸화 상태의 DNA는 차단제와 결합하지 않으므로 프라이머와 결합하게 되어 PCR 증폭이 발생한다. 다음, 증폭에 의해 수득된 단편을 직접 또는 간접적으로 검출하고, 표지물은 형광 표지물, 방사성 핵종 또는 부착 가능한 분자 단편의 형태인 것이 바람직하다.
표적 유전자의 표적 서열 SEQ ID NO:1-2 및 SEQ ID NO:3-4에 따르면, 본 발명은 MT1A 및 EPO 이 두 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출하기 위한 프라이머, 프로브 및 차단제 서열(SEQ ID NO:5-12)이 설계된다.
바람직하게, 상기 프라이머, 프로브 및/또는 차단제 중 하나 또는 하나 이상은 하기와 같이 표시된다.
MT1A 프라이머 F
SEQ ID NO:5
MT1A 프라이머 R
SEQ ID NO:6
MT1A 프로브
SEQ ID NO:7
MT1A 차단제
SEQ ID NO:8
EPO 프라이머 F
SEQ ID NO:9
EPO 프라이머 R
SEQ ID NO:10
EPO 프로브
SEQ ID NO:11
EPO 차단제
SEQ ID NO:12
본 발명에서, 다양한 상업용 실시간 PCR 기기 및 장비를 이용하여 종래 기술의 표준 조작에 따라 실시간 PCR 검출을 수행할 수 있다. 일부 구체적인 실시형태에 따르면, Life Technologies 기기(7500Fast)에서 실시간 PCR 검출이 수행된다. PCR 반응 혼합물은 바이설파이트 전환된 DNA 주형 25-40ng 및 300-600nM의 프라이머와 차단제, 150-300nM의 프로브, 1UTaq 폴리머라제, 50-400μM의 복수의 dNTP, 1 내지 10mM의 MgCl2 및 2XPCR을 통해 최종 부피 2㎕ 내지 100㎕로 완충된다. 프리 사이클로 샘플을 증폭시키기 위해 85 내지 99℃에서 3-60분 동안 지속한 후, 이어서 50 내지 72℃에서 1 내지 30동안 35-55회 사이클의 어닐링, 45 내지 80℃에서 5 내지 90초 동안 어닐링 및 연장, 85 내지 99℃에서 5 내지 90초 동안 변성을 수행한다. 메틸화된 표적 유전자의 표적 서열에서만 증폭을 관찰함으로써 5-메틸시토신을 함유한 표적 유전자의 표적 서열의 CpG 섬 영역의 특이성 프로브로 상기 유전자 단편을 검출한다. 또한, 일부 구체적인 실시형태에서, β 액틴 유전자(ACTB)를 PCR의 내부 참조로서 사용할 수 있는데, β 액틴 유전자 서열과 상보적인 프라이머를 사용하여 β 액틴 유전자 앰플리콘을 생성하고, 특정 프로브로 β 액틴 유전자 앰플리콘을 검출하며, 각각의 샘플에 대해 적어도 일회의 실시간 PCR을 수행하되, 일부 구체적인 실시형태에서는 2회 또는 3회의 실시간 PCR 검출을 수행한다.
실험 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법을 사용한 백혈구 게놈 DNA(표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 음성 기준품)에 대한 검출은 PCR 증폭이 발생되지 않았으며, 검출 결과는 음성인 것으로 나타났는바, 즉 피검출 DNA 샘플의 표적 유전자의 표적 서열은 메틸화가 발생되지 않았고; 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법을 사용한 DNA 메틸트랜스퍼라제로 처리된 백혈구 게놈 DNA(표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태의 양성 기준품)에 대한 검출은 PCR 증폭이 발생되고, 검출 결과는 양성으로 나타났는바, 즉 피검출DNA 샘플의 표적 유전자의 표적 서열은 메틸화가 발생되었다. 이로부터 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법은 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 특이적으로 검출할 수 있음을 판단할 수 있다.
실시예 3
본원 발명의 구체적인 실시형태에 따르면, 일정 양의 식도암 샘플 및 정상 샘플의 검출 결과의 평균 Ct값에 기반하여 식도암 및 정상적인 표적 유전자를 효과적으로 구분할 수 있는 Ct값, 즉 임계값을 결정한다. 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태는 폴리머라제 연쇄 반응의 사이클 임계값 Ct값에 의해 결정되며, 검출된 샘플의 Ct값과 미리 설정된 임계값을 비교함으로써 표적 유전자에 기반한 분석 결과가 음성(정상) 또는 양성(식도암)인지 여부를 결정한다.
본 실시예는 하기와 같은 단계를 포함한다.
우선, biochain사로부터 20명의 식도암 환자 및 22명의 정상인의 혈장 샘플을 공급받은 후 피검출 샘플의 말초혈액의 유리 DNA를 추출하고, 상기 DNA 샘플을 전처리하여 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실, 타민 또는 혼성화 거동에서 사이토신에 사용되지 않는 다른 염기로 전환시킨다. 본 실시예에서, 상기 전처리는 바이설파이트 시약 처리에 의해 구현되고, 상기 DNA의 추출 및 처리는 종래 기술 중 임의의 표준 수단에 의해 수행된다. 구체적으로, 본 실시예에서, 모든 샘플DNA의 추출 및 바이설파이트 DNA변형은 biochain사의 혈장 처리 시험키트를 사용하여 추출된다.
다음, 상기 처리 된 20명의 식도암 환자 및 22명의 정상인의 DNA 샘플에 상기 표적 유전자 프라이머, 프로브 및 차단제 조합물을 첨가하고, PCR을 통해 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출하였는데, 여기서 본 실험예에서 적용한 PCR은 Life Technologies 기기(7500)에서 수행되었다. PCR 반응 혼합물은 바이설파이트 전환된 DNA 주형 35ng, 450nM의 프라이머 및 차단제, 225nM의 프로브, 1UTaq 폴리머라제, 200μM의 각각의 dNTP, 4.5mM의 MgCl2 및 2XPCR을 통해 최종 부피 50㎕로 완충된다. 프리 사이클로 샘플을 증폭시키기 위해 94℃에서 20분 동안 지속한 후, 이어서 62℃에서 5초 동안 45회 사이클의 어닐링, 55.5℃에서35초 동안 어닐링 및 연장, 93℃에서 30초 동안 변성을 수행하였다.
마지막으로, 표적 유전자의 표적 서열에 대해 20명의 식도암 환자 및 22명의 정상인의 DNA 샘플의 실시간 PCR의 Ct값을 각각 측정하였는 바, 검출 결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 1) 특정된 임계값, 바람직하게는 임계값 Ct＝37을 선택하고, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 검출 방법으로 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태를 검출함으로써 식도암 환자를 효과적으로 검출할 수 있으며; 상기 실시예에서, 임계값으로서 Ct값이 37인 경우, 식도암을 검출하기 위한 표적 유전자의 표적 서열 메틸화 감도는 각각 55 %(MT1A) 및 45 %(EPO)이고; 2) 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화는 특이성이 우수하여 정상인의 검출에 있어서, 표적 유전자의 표적 서열 메틸화의 특이성은 95 %(MT1A) 및 95 %(EPO)를 나타내며; 3) MT1A 유전자 및 EPO 유전자를 결합시킨 메틸화 검출 결과, 식도암 검출 감도는 60 %로 증가되는 반면 특이성은 여전히 95 %로 불편하다.
실시예 4
다음, 63명의 식도암 피험자의 혈장 샘플을 추가로 공급받은 후, 혈장 내 유리 DNA를 추출하고 상기 게놈 DNA 샘플을 전처리하여 5’ 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실, 타민 또는 혼성화 거동에서 사이토신에 사용되지 않는 다른 염기로 전환시킨다. 본 실시예에서, 상기 전처리는 바이설파이트 시약 처리에 의해 구현되고, 상기 DNA의 추출 및 처리는 종래 기술 중 임의의 표준 수단에 의해 수행된다. 구체적으로, 본 실시예에서, 모든 샘플DNA의 추출 및 바이설파이트 DNA 변형은 biochain사의 혈장 처리 시험키트를 사용하여 추출된다. 다음, 상기 처리된 63명의 식도암 피험자의 DNA 샘플에 상기 MT1A 및 EPO 유전자 프라이머, 프로브 조합 및 내부 기준 유전자 ACTB 유전자 프라이머, 프로브 조합을 첨가하고, PCR을 통해 MT1A 및 EPO 유전자의 메틸화 상태를 검출하였다. 여기서, 본 실험예에서 적용한 PCR 증폭 조건은 하기와 같다. Life Technologies 기기(7500)에서 실시간 PCR을 수행하고, PCR 반응 혼합물은 바이설파이트 전환된 DNA 주형 35ng 및 450nM의 프라이머, 225nM의 프로브, 1UTaq 폴리머라제, 200uμm의 각각의 dNTP, 4.5mM의 MgCl2 및 2XPCR 버퍼를 통해 최종 부피 30u㎕로 구성된다. 94℃에서 20분 동안 예비 사이클로 샘플을 증폭시킨 후, 62℃에서 5초 동안 45회 사이클의 어닐링, 55.5℃에서 35초 동안 어닐링, 93℃에서 30초 동안 변성시켰다.
아울러, 이들 63명의 식도암 피험자의 혈장 샘플에 대해 SNCG 유전자 혈청 단백질 수준의 검출을 수행하고, 효소 결합 면역 흡착제 측정 기술(ELISA)을 통해 SNCG 유전자의 혈청 단백질 수준을 검출하였다. 상기 ELISA검출 기술은 “샌드위치 방법”을 통해 SNCG 유전자의 혈청 단백질 수준의 검출을 수행하였는 바, 우선 SNCG 모노클로날 항체(마우스)(공급원biochain사)로 96 웰 플레이트를 코팅(1㎍/웰)한 후; 10배 희석된 임상 혈청 샘플 및 연속 희석(2.5ng/mL ~ 0.04ng/mL)된 인간 SNCG 단백질 용액(50㎕/웰)을 첨가하고; 다음 각 튜브에 0.47㎍/mL의 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)로 표지된 마우스 항 인간 SNCG의 폴리클로날 항체(IgG)(공급원biochain사) 50㎕를 첨가하였다. 상기 혼합물이 담긴 면역 반응 플레이트를 실온의 진탕 조건에서 3시간 인큐베이션하고, 세척 용액으로 반응 웰을 세척한 후 발색 기질을 첨가하고, 황산 2M를 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더(예를 들어, Bio-RAD 550)를 사용하여 450nm 스펙트럼 대역에서 각 반응 웰을 검출하였으며, 마지막으로, 연속 희석된 인간 SNCG 단백질 용액의 검출 값을 이용하여 표준 곡선을 구축하고, 표준 곡선에 기반하여 임상 혈청 샘플을 정량화하였다. 식도암 및 정상 개체에서SNCG 유전자 혈청 수준의 임계값은 2.0ng/mL이다.
마지막으로, 로슈사(Roche)의 전기 화학적 발광 면역 검출 시스템을 이용하여 CEA, CA199, CA125, 및 AFP를 포함한 63명의 식도암 피험자 샘플 중 일반적인 암 표지자의 수준을 각각 측정하였다.
검출 결과(도 4), 식도암 피험자 중 MT1A 및 EPO 유전자의 메틸화 검출 및 SNCG 단백질에 의한 식도암 검출 양성률은 일반적인 암 표지자(예를 들어, CEA, CA199, CA125, 및 AFP)보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 아울러, MT1A 및 EPO 유전자 DNA 메틸화 및 SNCG 단백질의 결합 검출은 식도암 검출에서 뚜렷한 상보성을 가지며, 양자의 결합 검출은 식도암의 검출율을 크게 향상시킨다. 이 밖에, MT1A 및 EPO 유전자의 DNA 메틸화 검출 및 SNCG 단백질 검출의 상보성은 일반적인 암 표지자(예를 들어, CEA, CA199, CA125, 및 AFP)가 구비하지 못한 독특한 특성을 갖는다.
상기 실험 결과는 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도의 결합 검출을 통해 민감하고 특이적으로 식도암을 검출할 수 있음을 나타낸다. 본 발명에 따른 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 DNA를 검출함으로써 체외 비침습적 식도암 검출을 구현할 수 있고 또한 식도암의 검출율을 향상시킬 수 있다.
종합하면, 본원 발명은 상기 조성물, 핵산 서열, 시험키트 및 이의 용도, 및 상기 검출 방법을 이용하여 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질의 농도를 검출함으로써 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질의 농도를 이용하여 식도암 체외 검출을 구현한다. 따라서 식도암 체외 검출의 감도 및 특이성을 효과적으로 향상시키고, 혈장 샘플의 유리 DNA 실시간 PCR 분석 방법 및 혈장 내 표적 단백질 농도에 대한 ELISA 분석 방법을 이용하여 표적 유전자의 표적 서열의 메틸화 상태 및 표적 단백질 농도의 결합 검출을 용이하게 구현할 수 있고, 또한 실시간 PCR의 CT값 및 ELISA의 검출 농도에 따라 샘플이 양성인지 여부를 신속하고 편리하게 판단할 수 있어 비침습적이고 편리한 식도암 체외 검출 방법을 제공한다.
상기에서 본 발명의 다양한 양태 및 실시예를 개시하였으나 다른 양태 및 실시예는 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 상기에 개시된 다양한 양태 및 실시예는 설명의 목적을 위한 것일 뿐 한정하기 위한 것이 아니며 본 발명의 보호범위 및 요지는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해진다.
서열목록
<110> biochain(Beijing) technology co., LTD
<120> 식도암 검출용 조성물 및 이의 용도
<130> FB00063PCT
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 171
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> MT1A 유전자의 표적 서열
<400> 1
cacccagggg agctcagtgg actgtgcgcc ttgcctttct gctgcgcaaa gcccagtcca 60
ggtcatcacc tcgggcgggg cggactcggc tgggcggact cagcggggcg ggcgcaggcg 120
cagggcgggt cctttgcgtc cggccctctt tcccctgacc ataaaagcag c 171
<210> 2
<211> 171
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> SEQ ID NO：1의 상보적 서열
<400> 2
gctgctttta tggtcagggg aaagagggcc ggacgcaaag gacccgccct gcgcctgcgc 60
ccgccccgct gagtccgccc agccgagtcc gccccgcccg aggtgatgac ctggactggg 120
ctttgcgcag cagaaaggca aggcgcacag tccactgagc tcccctgggt g 171
<210> 3
<211> 259
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> EPO 유전자의 표적 서열
<400> 3
cgcgcacgca cacatgcaga taacagcccc gacccccggc cagagccgca gagtccctgg 60
gccaccccgg ccgctcgctg cgctgcgccg caccgcgctg tcctcccgga gccggaccgg 120
ggccaccgcg cccgctctgc tccgacaccg cgccccctgg acagccgccc tctcctccag 180
gcccgtgggg ctggccctgc accgccgagc ttcccgggat gagggccccc ggtgtggtca 240
cccggcgcgc cccaggtcg 259
<210> 4
<211> 259
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> SEQ ID NO：3의 상보적 서열
<400> 4
cgacctgggg cgcgccgggt gaccacaccg ggggccctca tcccgggaag ctcggcggtg 60
cagggccagc cccacgggcc tggaggagag ggcggctgtc cagggggcgc ggtgtcggag 120
cagagcgggc gcggtggccc cggtccggct ccgggaggac agcgcggtgc ggcgcagcgc 180
agcgagcggc cggggtggcc cagggactct gcggctctgg ccgggggtcg gggctgttat 240
ctgcatgtgt gcgtgcgcg 259
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> MT1A 프라이머 F
<400> 5
cggacgtaaa ggattc 16
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> MT1A 프라이머 R
<400> 6
gaaacgaact cgactaaacg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> MT1A 프로브
<400> 7
tgcgtttgcg ttcgtttcg 19
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> MT1A 차단제
<400> 8
caaactcaac taaacaaact caacaaaaca aac 33
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> EPO 프라이머 F
<400> 9
agtcgtagag tttttgggtt 20
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> EPO 프라이머 R
<400> 10
caacgcgata cgacg 15
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> EPO 프로브
<400> 11
cgcaacgaac gaccga 16
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 인공 서열
<220>
<223> EPO 차단제
<400> 12
gagtttttgg gttattttgg ttgtttgttg 30
<210> 13
<211> 127
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> SNCG 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열
<400> 13
Met Asp Val Phe Lys Lys Gly Phe Ser Ile Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Gly Ala Val Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Met Tyr Val Gly Ala Lys Thr Lys Glu Asn Val
35 40 45
Val Gln Ser Val Thr Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Asn
50 55 60
Ala Val Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Val Asn Thr Val Ala Thr Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Glu Ala Glu Asn Ile Ala Val Thr Ser Gly Val Val Arg
85 90 95
Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala Ser
100 105 110
Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp
115 120 125
Claims (44)
- 표적 유전자 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산을 포함하고,
상기 표적 유전자는 MT1A 유전자 및 EPO 유전자 중의 한 가지 또는 두 가지인, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 표적 단백질 농도를 검출하기 위한 항체를 더 포함하고, 상기 표적 단백질은 SNCG 유전자 산물인 γ 시누클레인(γ-synuclein)인, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 MT1A 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되고,
상기 EPO 유전자의 표적 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시되는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 상기 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하고,
상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 상기 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하고,
상기 단편은 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
표적 유전자의 표적 서열 5 부위의 비메틸화 시토신 염기를 우라실로 전환시키는 시약을 더 포함하고,
상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제 서열을 포함하고,
상기 차단제 서열은 SEQ ID NO:8의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열인, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 상기 표적 유전자의 표적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편을 포함하고, 상기 적어도 9개의 뉴클레오티드의 단편은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열을 포함하고,
상기 표적 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 핵산은 상기 표적 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편을 더 포함하고, 상기 적어도 15개의 뉴클레오티드의 단편은 SEQ ID NO:7의 서열 또는 SEQ ID NO:11의 서열을 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 표적 단백질 γ 시누클레인의 농도를 검출하기 위한 시약을 더 포함하고, 상기 시약은 효소결합 면역흡착 분석 시약인, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물로서,
SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열 중 적어도 9개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 SEQ ID NO:1 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편; 및/또는,
상기 SEQ ID NO:3 또는 이의 상보적 서열에 혼성화되는 적어도 15개의 뉴클레오티드이고 또한 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 더 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제10항에 있어서,
비메틸화 상태인 표적 서열과 우선적으로 결합하는 차단제 서열을 더 포함하고, 상기 차단제 서열은 SEQ ID NO:8의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열인, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물로서,
SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제12항에 있어서,
SEQ ID NO:7의 서열; 및/또는
SEQ ID NO:8의 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 더 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물로서,
SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10의 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 제14항에 있어서,
SEQ ID NO:11의 서열; 및/또는
SEQ ID NO:12의 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 더 포함하는, 체외에서 식도암을 검출하기 위한 조성물. - 시험키트로서,
제1항, 제2항, 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 시험키트. - 제16항에 있어서,
뉴클레오시드 트리포스페이트, DNA 폴리머라제 및 상기 DNA 폴리머라제 기능에 필요한 버퍼로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분;
표적 단백질 γ 시누클레인의 농도를 검출하기 위한 항체 코팅된 반응 플레이트, SNCG 프로테아제 결합물, 기질 용액, 세척 용액 및 종결 용액으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 성분; 및
설명서를 더 포함하는 시험키트. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711248825.5A CN109868320B (zh) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | 用于检测食道癌的组合物及其用途 |
| CN201711248825.5 | 2017-12-01 | ||
| CN201810989986.8A CN110863046B (zh) | 2018-08-28 | 2018-08-28 | 用于检测食道癌的组合物及其用途 |
| CN201810989986.8 | 2018-08-28 | ||
| PCT/CN2018/104076 WO2019105090A1 (zh) | 2017-12-01 | 2018-09-05 | 用于检测食道癌的组合物及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200095517A KR20200095517A (ko) | 2020-08-10 |
| KR102512282B1 true KR102512282B1 (ko) | 2023-03-23 |
Family
ID=66664317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020207018984A KR102512282B1 (ko) | 2017-12-01 | 2018-09-05 | 식도암 검출용 조성물 및 이의 용도 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3744858A4 (ko) |
| JP (2) | JP6924335B2 (ko) |
| KR (1) | KR102512282B1 (ko) |
| WO (1) | WO2019105090A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3744858A4 (en) * | 2017-12-01 | 2021-04-14 | Biochain (Beijing) Science & Technology, Inc. | COMPOSITION FOR DETECTING CANCER FROM SOPHAGE AND ASSOCIATED USE |
| CN113999915A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-02-01 | 杭州求臻医学检验实验室有限公司 | 用于食管癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009061819A1 (en) | 2007-11-05 | 2009-05-14 | The Regents Of The University Of Colorado | Minimally-invasive measurement of esophageal inflammation |
| US20110300536A1 (en) | 2010-06-03 | 2011-12-08 | China Medical University | Gene marker and method for detection of oral cancer |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1294947A2 (en) * | 2000-06-30 | 2003-03-26 | Epigenomics AG | Method and nucleic acids for pharmacogenomic methylation analysis |
| EA007028B1 (ru) * | 2000-09-01 | 2006-06-30 | Эпигеномикс Аг | Метод определения степени метилирования специфических цитозинов в геномной днк в контексте последовательности 5'-cpg-3' |
| US20090005268A1 (en) * | 2005-07-18 | 2009-01-01 | Epigenomics Ag | Compositions and Methods for Cancer Diagnostics Comprising Pan-Cancer Markers |
| CN101353695B (zh) * | 2007-07-23 | 2013-05-01 | 上海市肿瘤研究所 | 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒 |
| CN103667344B (zh) * | 2012-09-18 | 2018-03-27 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 一种激活促红细胞生成素基因表达的方法 |
| CN104513851B (zh) | 2013-10-08 | 2017-01-11 | 陈永恩 | 侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法 |
| WO2015069187A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Agency For Science, Technology And Research | Bladder Carcinoma Biomarkers |
| WO2015116837A1 (en) * | 2014-01-30 | 2015-08-06 | The Regents Of The University Of California | Methylation haplotyping for non-invasive diagnosis (monod) |
| CN107400704A (zh) * | 2016-05-20 | 2017-11-28 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种用于乳腺癌筛查的组合物及其应用 |
| CN107868822B (zh) * | 2016-09-22 | 2024-01-23 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 用于检测食道癌的组合物及其试剂盒和用途 |
| CN107475366B (zh) * | 2017-07-03 | 2020-04-28 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种用于检测疾病的组合物及其试剂盒和用途 |
| EP3744858A4 (en) | 2017-12-01 | 2021-04-14 | Biochain (Beijing) Science & Technology, Inc. | COMPOSITION FOR DETECTING CANCER FROM SOPHAGE AND ASSOCIATED USE |
-
2018
- 2018-09-05 EP EP18882701.8A patent/EP3744858A4/en active Pending
- 2018-09-05 JP JP2020545787A patent/JP6924335B2/ja active Active
- 2018-09-05 WO PCT/CN2018/104076 patent/WO2019105090A1/zh unknown
- 2018-09-05 KR KR1020207018984A patent/KR102512282B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-06-09 JP JP2021096963A patent/JP7331043B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009061819A1 (en) | 2007-11-05 | 2009-05-14 | The Regents Of The University Of Colorado | Minimally-invasive measurement of esophageal inflammation |
| US20110300536A1 (en) | 2010-06-03 | 2011-12-08 | China Medical University | Gene marker and method for detection of oral cancer |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NCBI Reference Sequence: NG_021471.2 (2017.09.15.)* |
| NCBI, GenBank: K01383.1 (1995.01.07.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7331043B2 (ja) | 2023-08-22 |
| WO2019105090A1 (zh) | 2019-06-06 |
| EP3744858A1 (en) | 2020-12-02 |
| EP3744858A4 (en) | 2021-04-14 |
| KR20200095517A (ko) | 2020-08-10 |
| JP2021503948A (ja) | 2021-02-15 |
| JP6924335B2 (ja) | 2021-08-25 |
| JP2021166515A (ja) | 2021-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11840739B2 (en) | Gene composition for detecting cell proliferative abnormality or grading disease degree and use thereof | |
| JP5808306B2 (ja) | 細胞増殖性疾患分析のための方法および核酸 | |
| US20180258487A1 (en) | Composite biomarkers for non-invasive screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
| US20090203011A1 (en) | Methods and nucleic acids for analyses of cell proliferative disorders | |
| CN108220428B (zh) | 用于检测胃癌的组合物及其试剂盒和用途 | |
| CN106834426B (zh) | 用于检测胰腺癌的组合物及其用途 | |
| JP2013150611A (ja) | 細胞増殖性障害の検出のための方法及び核酸 | |
| JP6017497B2 (ja) | 前立腺細胞増殖性障害の発症に関連する遺伝子の発現を解析する方法及び核酸 | |
| CN110484621B (zh) | 一种肝癌早期预警的方法 | |
| JP7331043B2 (ja) | 食道癌を検出するための組成物及びその使用 | |
| CN107868822B (zh) | 用于检测食道癌的组合物及其试剂盒和用途 | |
| CN109868320B (zh) | 用于检测食道癌的组合物及其用途 | |
| CN111088351A (zh) | 用于检测肺癌的组合物及其用途 | |
| CN110863046B (zh) | 用于检测食道癌的组合物及其用途 | |
| CN108277274A (zh) | 用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的组合物及其用途 | |
| CN111826440B (zh) | 用于检测食道癌的组合物及其用途 | |
| CN117721203A (zh) | 用于检测甲状腺癌的组合物及其用途 | |
| CN111826441A (zh) | 用于体外检测消化道五癌的体系，在该体系中使用的组合物，以及包含该组合物的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |