EA007028B1 - Метод определения степени метилирования специфических цитозинов в геномной днк в контексте последовательности 5'-cpg-3' - Google Patents

Abstract

В изобретении описан метод определения степени метилирования специфического цитозина в контексте последовательности 5'-CpG-3' образца геномной ДНК. На первой стадии геномную ДНК подвергают химической обработке таким образом, чтобы основания цитозина, кроме оснований 5-метилцитозина, преобразовать в урацил. Далее сегменты геномной ДНК, которые содержат указанный специфический цитозин, амплифицируют, снабжают амплифицированные продукты меткой для их выявления, и на следующих стадиях степень гибридизации амплифицированных продуктов определяют на двух классах олигонуклеотидов выявлением меток амплифицированных продуктов. Вывод о степени метилирования указанного специфического цитозина в образце геномной ДНК делается из соотношения меток, выявленных на двух классах олигонуклеотидов, как следствие гибридизации.

Description

Изобретение относится к методу обнаружения степени метилирования специфического цитозина в контексте последовательности 5'-CpG-3' образца геномной ДНК.

Уровни наблюдения, которые были хорошо изучены в молекулярной биологии по разработкам в методах в последние годы, включают сами гены, транскрипцию этих генов в РНК и генетическую трансляцию в белки. В процессе развития человека то, какой ген включается и как контролируется активация и ингибирование некоторых генов в некоторых клетках и тканях, можно коррелировать степенью и характером метилирования генов или генома. В этой связи патогенные состояния также экспрессируются модифицированным характером метилирования отдельных генов или генома.

Настоящее изобретение описывает метод, с помощью которого многие основания цитозина в данном образце ДНК можно исследовать одновременно на наличие метиловой группы в положении 5 посредством гибридизации. В изобретении также описываются нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды и олигомеры ПНК, которые используют в применении метода для диагностики существующих заболеваний или предрасположенности к определенным заболеваниям.

5-Метилцитозин представляет собой основание, которое наиболее частое модифицируется ковалентными связями в ДНК эукариотных клеток. Например, он играет роль в регуляции транскрипции, в генетическом импринтинге и в опухолеобразовании. Таким образом, идентификация 5-метилцитозина как компонента генетической информации представляет значительный интерес. Однако положения 5метилцитозина нельзя идентифицировать секвенированием, поскольку поведенческая модель 5метилцитозина в спаривании оснований та же, что и у цитозина. Кроме того, в случае ПЦРамплификации эпигенетическая информация, которую несет 5-метилцитозин, полностью теряется.

Метилирование CpG-островков часто приравнивают к инертности транскрипции. Хотя существует явное свидетельство того, что CpG-островки имеются в промоторах генов, не все CpG-островки и сайты метилирования локализуются в известных промоторах. В различных тканеспецифичных и импринтирующих генах CpG-островки локализуются на значительном расстоянии в прямом направлении от начала транскрипции, и, кроме того, многие гены имеют множественные промоторы. Было выявлено, что метилирование CpGдинуклеотидов является причинным фактором ряда заболеваний. В отличие от классических мутаций, метилирование ДНК включает механизм, который описывает замену на основании без модифицирования кодирующей функции гена. Эта взаимосвязь между эпигенетической модификацией и классическими мутациями играет важную роль в опухолеобразовании. Например, фокальное гиперметилирование и обобщенное геномное деметилирование являются признаками многих опухолей разных типов. Высказано предположение, что образование и развитие опухолей вызваны, во-первых, гиперметилированием событий индуцированной мутации и, во-вторых, выключением генов, контролирующих клеточную пролиферацию, и/или индуцированной реактивацией генов, которые обычно используются только для эмбриологического развития, через деметилирование.

В наследственном неполипозном раке толстого кишечника и прямой кишки, например большинство не мутационных случаев рака толстого кишечника, основано скорее на гиперметилировании промотора hMLH1 и связанной с ним отсутствием экспрессии hMLH1, восстановительного гена при ошибочном спаривании оснований (Bevilacqua RA, Simpson AJ, Methylation of the hMLH1 promoter but no hMLH1 mutations in sporadic gastric carcinomas with high-level microsatellite instability. Int J Cancer. 2000 Jul 15; 87 (2):200-3). В патогенезе рака легких потеря экспрессии коррелируется с метилированием CpG-островков в последовательности промотора гомолога RAS-эффектора. (Dammann R, Li С, Yoon JH, Chin PL, Bates S, Pfeifer GP, Nucleotide. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet. 2000 Jul; 25(3):315-9). Эпигенетическая инактивация гена подавления опухоли LKB1, включая гиперметилирование промотора, связана с синдромом Пейтца-Егерса (Esteller М, Avizienyte E, Corn PG, Lothe RA, Baylin SB, Aaltonen LA, Herman JG, Epigenetic inactivation of LKB1 in primary tumors associated with the Peutz-Jeghers syndrome/Oncogene, 2000 Jan 6; 19(1):164-8).

Множество заболеваний, ассоциированных с метилированием, имеют в своей этиологии близкую связь с генами подавления опухоли р16 или р15. Таким образом, предполагается наличие связи между микозом грибков и гиперметилированием гена p16(INK4a) (Navas IC, Ortiz-Romero PL, Villuendas R, Martinez P, Garcia C, Gomez E, Rodriguez JL, Garcia D, Vanaclocha F, Iglesias L, Piris MA, Algara P), pl6(INK4a)gene alterations are frequent in lesions of mycosis fungoides. Am J Pathol. 2000 May; 156(5):1565-72). Кроме того, существует большая корреляция между отключением транскрипции гена р16 в карциноме желудка и de novo метилированием нескольких специфических CpG-сайтов (Song SH, Jong HS, Choi HH, Kang SH, Ryu MH, Kim NK, Kim WH, Bang YJ, Methylation of specific CpG sites in the promotor region could significally down-regulate p16(INK4a) in gastric adenocarcinoma. Int J Cancer. 2000 Jul 15; 87 (2): 236-40). Патогенез холангиокарциномы, который ассоциируется с первичным склерозирующим холангитом, связан с инактивацией гена подавления опухоли p16, которая также зависит от метилирования промотора р16 (Ahrendt SA, Eisenberger CF, Yip L, Rashid A, Chow JT, Pitt HA, Sidransky D, Chromosome 9p21 loss and pl6 inactivation in primary sclerosing cholangitis-associated cholangiocarcinoma. J Surg Res. 1999 Jun 1; 84(1):88-93). Инактивация гена pl6 гиперметилированием играет роль в генезе лейкоза и в развитии острого лимфобластозного лейкоза (Nacamura М, Sugita K, Inukai Т, Goi K, Iijima K, Tezuka Т, Kojika S, Shiraishi K, Miyamoto N, Karakida N, Kagami K, O-Koyama T, Mori T, Nakazawa S, p16/MTS1/INK4A gene is frequently inactivated by hypermethylation in childhood acute lymphoblastic leukemia

- 1 007028

with 11q23 translocation. Leukemia. 1999 Jun; 13(6):884-90). Кроме того, известно, что гиперметилирование генов p16 и р15 играет решающую роль в образовании опухолей множественной миеломы (Ng МН, Wong IH, Lo KW, DNA methylation changes and multiple myeloma. Leuk Lymphoma. 1999 Aug; 34 (5-6) : 463-72). Считается, что ген VHL, который инактивируется метилированием, участвует в предрасположенности к раку почки (Glavac D, Ravnic-Glavac M, Ovcak Z, Masera A, Genetic changes in the origin and development of renal cell carcinoma (RCC). Pfugers Arch. 1996; 431(6 Suppl 2):R193-4). Дивергентное метилирование островка 5'CpG может участвовать в возникновении рака носоглотки, возможно инактивированием транскрипции гена p16 (Lo KW, Cheung ST, Leung SF, van Hasselt A, Tsang YS, Mak KF, Chung YF, Woo JK, Lee Jc, Huang DP, Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 1996 Jun 15;56(12):2721-5). В раке клетки печени была выявлена инактивация белка р16. Здесь наиболее часто встречаются механизмы гиперметилирования промотора и гомозиготные делеции (Jin M, Piao Z, Kim NG, Park С, Shin EC, Park JH, Jung HJ, Kim CG, Kim H, p16 is a major inactivation target in hepatocellular carcinoma. Cancer, 2000 Jul 1; 89(1):60-8). Метилирование ДНК как контроль экспрессии гена было выявлено для гена BRCA1 в раке молочной железы (Magdinier F, Billard LM, Wittmann G, Frappart L, Benchaib M, Lenoir GM, Guerin JF, Dante R, Regional methylation of the 5' end CpG island of BRCA1 is asssociated with reduced gene expression in human somatic cells FASEB J 2000 Aug; 14(11):1585-94). Предполагается также корреляция между метилированием и злокачественным лимфогранулематозом (болезнь Ходжкина) (Martinez-Delgado В, Richart K, Garcia MJ, Robledo M, Osorio A, Cebrian A, Rivas С, Benitez J, Hypermethylation of P16ink4a and P15ink4b genes as a marker of desease in the follow-up of non-Hodgkin's lymphomas. Br J Haematol. 2000 Apr; 109(1):97-103). Метилирование CpG также способствует развитию лейкоза Т-клетки (лимфоцита), который связан с уменьшением экспрессии гена CDKN2A (Nosaka K, Maeda M, Tamiya S, Sakai T, Mitsuya H, Matsuoka M, Increasing methylation of the CDKN2A gene is associated with the progression of adult T-cell leukemia. Cancer Res. 2000 Feb 15;60(4):1043-8). Повышенное метилирование островков CpG было установлено в раке мочевого пузыря (Salem С, Liang G, Tsai YC, Coulter J, Khowles MA, Feng AC, Groshen S, Nichols PW, Jones PA, Progressive increases in de novo methylation of CpG islands in bladder cancer. Cancer Res. 200 May 1; 60(9):2473-6). Инактивация транскрипции плоскоклеточным раком пищевода связана с метилированием гена FHIT, который участвует в развитии болезни (Shimada Y, Sato F, Watanabe G, Yamasaki S, Kato M, Maeda M, Imamura M, Loss of fragile histidine triad gene expression is associated with progression of esophageal squamous cell carcinoma, but not with the patient's prognosis and smoking history. Cancer. 2000 Jul 1; 89(1):5-11). Нейтральная эндопептидаза 24.11 (NEP) инактивирует увеличение нейропептидов, участвующих

в росте неандрогенного рака предстательной железы. Потеря экспресиии NEP гиперметилированием промоторов NEP может способствовать развитию неандрогенного рака предстательной железы, стимулированного нейропептидами (Usmani BA, Shen R, Janeczko M, Papandreou CN, Lee WH, Nelson WG, Nelson JB, Nanus DM,

Methylation of the neutral endopeptidase gene promoter in human prostate cancers. Clin Cancer Res. 2000 May; 6 (5):1664-70). Адренокортикальные опухоли у взрослых демонстрируют структурные отклонения в опухолевой ДНК. Среди прочего, эти отклонения включают чрезмерную экспрессию гена IGF2 в корреляции с деметилированием ДНК в этом локусе (Wilkin F, Gagne N, Paquette J, Olygny LL, Deal C, Pediatric adrenocortical

tumors: molecular events leading to insulin-like growth factor II gene overexpression. J Clin Endocrinol Metab. 2000 May; 85(5):2048-56). Review). Предполагается, что метилирование ДНК в нескольких экзонах в гене бластомы сетчатки глаза содействует заболеванию (Mancini D, Singh S, Ainsworth P, Rodenhiser D, Constitutively methylated CpG dinucleotides as mutation hot spots in the retinoblastoma gene (RB1). Am J Hum Genet. 1997 Jul; 61(1):80-7). В хроническом миелоидном лейкозе предполагается связь между нарушением регуляции гена р53 и изменением характера метилирования с развитием заболевания (Guinn BA, Mills KI, p53 mutations, methylations and genomic instability in the progression of chronic myeloid leukaemia. Leuk Lymphoma. 1997 Jul; 26 (34):211-26). Связь с метилированием была также обнаружена в остром миелоидном лейкозе (Melki JR, Vincent

PC, Clark SJ. Concurrent DMA hypermethylation of multiple genes in acute myeloid leukemia. Cancer Res. 1999 Aug 1; 59(15):3730-40). Был определен специфичный опухолевой сайт метилирования в гене подавления опухоли Вилмза (Kleymenova EV, Yuan X, LaBate ME, Walker CL, Identification of a tumorspecific methylation site in the Wilms tumor suppressor gene. Qncogene. 1998 Feb 12;16(6):713-20). В лимфоме Беркитта несколько промоторов имеют полное метилирование CpG (Tao Q, Robertson KD, Manns A, Hildesheim A, Ambinder RF, Epstein-Barr virus (EBV) in endemic Burkitt's lymphoma: molecular analysis of primary tumor tissue. Blood. 1998 Feb 15; 91 (4):1373-81). Предполагают, что метилирование ДНК играет роль в раке щитовидной железы (Venkataraman GM, Yatin M, Marcinek R, Ain KB, Restoration of iodide uptake in dedifferentiated thyroid carcinoma: relationship to human Na+/1-symporter gene methylation status. J Clin Endocrinol Metab. 1999 Jul; 84(7):2449-57).

С метилированием связаны не только многие раковые заболевания, но также и многие другие болезни. Исследования воспалительного артрита показали, что это заболевание связано с гипометилированием геномной ДНК (Kim YI, Logan JW, Mason JB, Roubenoff R, DNA hypomethylation in inflammatory arthritis: reversal with methotrexate. J Lab Clin Med. 1996 Aug; 128(2):165-72). Экспрессия, регулируемая метилированием, была выявлена в ICF синдроме (Kondo Т, Bobek MP, Kuick R, Lamb В, Zhu X, Narayan A, Bourc'his D, ViegasPequignot E, Ehrlich M, Hanash SM, Whole-genome methylation scan in ICF syndrome; hypomethylation of nonsatellite DNA repeats D4Z4 and NBL2). Участие метилирования предполагается в системной красной волчанке (Vallin Н, Perers A, Alm GV, Ronnblom L, Antidoublestranded DNA antibodies and immunostimulatory plasmid DNA in combination mimic the endogenous IFN-alpha inducer in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 1999

- 2 007028

Dec; 163(11):6306-13); и к тому же может быть связь между геном сухотки спинного мозга, болезнью Дюшенна и CpG-богатым островком (Banerjee S, Singh РВ, Rasberry С, Cattanach ВМ, Embryonic inheritance of the chromatin organisation of the imprinted H19 domain in mouse spermatozoa. Mech Dev. 2000 Feb; 90(2):217-26; Bumeister M, Lehrach H, Long-range restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene. Nature. 1986 Dec 11-17; 324(6097):582-5). Наличие эпигенетического эффекта, включающего гиперметилирование белка предшественника амилоида [гена], который связан с развитием заболевания, предполагается в болезни Альцгеймера (West RL, Lee JM, Maroun LE, Hypomethylation of the amyloid precursor protein gene in the brain of an Alzheimer's desease patient. J Mol Neurosci. 1995;6(2);141-6). Состояние метилирования также играет важную роль на хромосомном уровне. Например, в синдромах умственной отсталости, которые связаны с слабостью Х хромосомы, степень хромосомной слабости определяется метилированием (de Muniain AL, Cobo AM, Poza JJ, Saenz A, [Diseases due to instability of DNA]. Neurologia. 1995 Dec; 10 Supple 1:12-9).

Относительно новый метод, который со временем стал наиболее широко использоваться для исследования ДНК на 5-метилцитозин, основан на специфической реакции бисульфита с цитозином, который после последующего щелочного гидролиза преобразуют в урацил, поведенческая модель которого в спаривании оснований соответствует тимидину. В отличие от него, эти условия не влияют на модификацию 5метилцитозина. Таким образом, первоначальную ДНК преобразуют так, что метилцитозин, который первоначально невозможно отличить от цитозина по его поведению в гибридизации, можно выявить «стандартными» методами молекулярной биологии как единственно остающийся цитозин, например, амплификацией и гибридизацией или секвенированием. Все эти методы основаны на спаривании оснований, которое сейчас обширно используется. Известный уровень, касающийся чувствительности, определяется методом, который включает исследуемую ДНК в агарозную матрицу, что препятствует диффузии и ренатурации ДНК (бисульфит реагирует только на одноцепочечную ДНК) и все стадии осаждения и очистки заменяются быстрым диализом. (Olek, А и др., Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064-5066). Отдельные клетки можно исследовать этим методом, который иллюстрирует его возможности. Конечно, до настоящего времени были исследованы только отдельные участки длиной приблизительно до 3000 пар оснований; глобальное исследование клеток на тысячи возможных анализов на метилирование невозможно. Конечно, этим методом нельзя надежно анализировать очень малые фрагменты небольших количеств образца. Это приведет к потере, несмотря на защиту от диффузии через матрицу.

Представление о других известных возможностях для обнаружения 5-метилцитозинов можно получить из обзорной статьи Rein, Т., DePamphilis, M.L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

В исследованиях, за некоторыми исключениями, применялся и ранее бисульфитный метод (например, Zechnigk, M. Et al., Eur.J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98). Однако, короткие специфические сегменты известного гена всегда амплифииировали после обработки бисульфитом и либо полностью секвенировали (Olek, A. and Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276), либо отдельные положения цитозина выявляли реакцией удлинения сегмента затравки (Gonzalgo, M.L. and Jones, P.A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent 95-00669) или ферментной стадией (Xiong, Z and Liard, P.W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 25322534). Было также описано выявление гибридизацией (Olek et al., WO-A 99/28,498).

Есть другие публикации, связанные с применением бисульфитного метода для выявления метилирования в случае отдельных генов, это следующие публикации: Xiong, Z. and Laird, P.W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M.L. and Jones, P.A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. Et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V et al. (1995), Gene 157, 261; WO-A 97/46,705, WO-A 95/15, 373 и WO-A 95/45, 560.

Обзор известного уровня в получении решетки олигомеров проведен в специальном издании Nature Genetics, опубликованном в январе 1999 года (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) и источниках, указанных там.

Для сканирования иммобилизированной решетки ДНК использовали зонды с множественными флуоресцентными метками. Наиболее приемлемым способом для флуоресцентного мечения является простое введение Су3 и Су5 красителей в 5'-ОН соответствующего зонда. Флуоресценция гибридизированных зондов обнаруживается, например, посредством конфокального микроскопа. В отличие от других, красители Су3 и Су5 имеются в свободной продаже.

Лазерная масс-спектрометрия десорбции/ионизации через матрицу (MALDI-TOF) является очень мощным достижением в анализе биомолекул (Karas, M and Hillenkamp, F(1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Fnal. Chem. 60^л 2299-2301). Анализируемое вещество заливают в светопоглощаюшую матрицу. Матрицу выпаривают короткой лазерной пульсацией и молекулу анализируемого вещества переносят нефрагментированной в газообразную фазу. Анализируемое вещество ионизируют столкновениями с молекулами матрицы. Приложенное напряжение ускоряет ионы в трубке полета свободной от поля. Ионы ускоряются с различными скоростями в зависимости от их различных масс. Более мелкие ионы достигают детектора скорее, чем крупные.

MALDI-TOF спектрометрия очень хорошо подходит для анализа пептидов и белков. Анализ нуклеиновых кислот несколько затруднен (Gut, I.G. and Beck, S. (1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Nass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innivations and Future Trends 1:147-157).

- 3 007028

Для нуклеиновых кислот чувствительность приблизительно раз в 100 хуже, чем для пептидов, и пропорционально снижается с увеличением размера фрагмента. Для нуклеиновых кислот, у которых основа с множественным отрицательным зарядом, процесс ионизации через матрицу гораздо менее эффективен. В MALDI-TOF спектрометрии выбор матрицы играет особенно важную роль. Для десорбции пептидов было найдено несколько очень мощных матриц, которые дают очень мелкую кристаллизацию. Для ДНК также были разработаны несколько эффективных матриц, но разница в чувствительности не была снижена. Разницу в чувствительности можно снизить химическим модифицированием ДНК таким образом, чтобы она напоминала пептид. Нуклеиновые кислоты фосфоротиоата, в которых обычные фосфаты основы замещаются тиофосфатами, можно преобразовать простым алкилированием в ДНК с нейтральным зарядом (Gut, I.G. und Beck, S (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Связывание метки заряда с этой модифицированной ДНК обеспечивает повышение чувствительности на тот же порядок величины, которая выявлена для пептидов. Другим преимуществом мечения зарядом является повышение стабильности анализа в присутствии примесей, которые делают обнаружение не модифицированных подложек очень трудным.

Геномную ДНК получают из ДНК клеток, тканей или других тестуемых образцов стандартными методами. Эта стандартная методика представлена в ссыпках, например, Fritsch and Maniatis, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Настоящее изобретение представляет наиболее эффективный и надежный метод, который позволяет посредством гибридизации одновременно исследовать многие основания цитозина в данном образце ДНК на наличие метиловой группы в положении 5. В методе присутствуют олигонуклеотиды и ПНК-олигомеры, которые наиболее приемлемы для применения метода в диагностике существующих заболеваний и предрасположенности к заболеваниям анализом ряда генетических и/или эпигенетических параметров.

Генетическими параметрами в значении настоящего изобретения являются мутации и полиморфизм заявленных нуклеиновых кислот (Seq.ID 1-Seq.ID 40712) и дополнительные последовательности необходимые для их регуляции. В качестве мутаций это инсерции, делеции, точковые мутации, инверсии и полиморфизм и наиболее предпочтительны SNPs (полиморфизмы одного нуклеотида). Однако полиморфизмами могут быть также инсерции, делеции или инверсии.

Эпигенетическими параметрами в значении изобретения являются метилирования цитозинов и другие химические модификации оснований ДНК заявленных нуклеиновых кислот (Seq.ID 1 - Seq.ID 40712) и дополнительных последовательностей необходимых для их регуляции. Другими эпигенетическими параметрами являются, например, ацетилирование гистонов, хотя их невозможно непосредственно анализировать описанным методом; однако он коррелируется с метилированием ДНК.

Данный метод служит для определения степени метилирования по меньшей мере одного специфического цитозина в контексте последовательности 5'-CpG-3' образца геномной ДНК. Метод наиболее предпочтителен для одновременного обнаружения многих различных положений метилирования.

Задача изобретения решается методом определения степени метилирования специфического цитозина в контексте последовательности 5'-CpG-3' образца геномной ДНК, и характеризуется тем, что

a) геномную ДНК обрабатывают, в результате чего основания цитозина преобразуют в урацил, но не основания 5-метилцитозина;

b) сегменты геномной ДНК, которые содержат указанный специфический цитозин, амплифицируют, в процессе чего амплифицированные продукты снабжают обнаруживаемой меткой;

c) амплифицированные продукты гибридизуют с двумя классами олигонуклеотидов и/или ПНКлигомеров, каждый из которых [класс] имеет по меньшей мере один член;

d) степень гибридизации амплифицированных продуктов с двумя классами определяют выявлением метки амплифицированных продуктов;

e) заключение о степени метилирования указанного специфического цитозина в образце геномной ДНК делают из соотношения меток, выявленных на двух классах олигонуклеотидов как следствие гибридизации.

Метод особенно предпочтителен, где гибридизацию амплифицированных продуктов проводят на стадии с) на двух классах олигомеров (олигонуклеотидах и/или ПНК-олигомерах), каждый из которых [класс] имеет по меньшей мере один член, в результате чего олигомеры первого класса гибридизуют с последовательностью, получающейся из химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в метилированном состоянии, а олигомеры второго класса гибридизуют с последовательностью, получающейся из химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в неметилированном состоянии. Один из этих двух классов олигомеров можно сформировать, например, олигонуклеотидами, содержащими в середине CG, а другой класс - олигонуклеотидами, имеющими в середине TG (или СА в противоцепи). Остальные сегменты последовательностей олигомера в обоих классах остаются теми же. В этом случае, олигонуклеотиды первого класса гибридизуют с последовательностью (вокруг исследуемого специфического цитозина), если она была в наличии в метилированном состоянии до преобразования бисульфитом, и наоборот, олигонуклеотиды второго класса гибридизуют с последовательностью, если она была в наличии в неметилированном состоянии до преобразования бисульфитом.

- 4 007028

Метод особенно приемлем, если гибридизацию амплифицированных продуктов проводят на стадии с) на двух классах олигомеров (олигонуклеотидах и/или ПНК-олигомерах), каждый из которых имеет по меньшей мере один член, в результате чего олигомеры первого класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, которая получается после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в метилированном состоянии в геномной ДНК, и менее предпочтительно гибридизуют с последовательностью, которая получается после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в неметилированном состоянии в геномной ДНК, и в результате чего олигомеры второго класса гибридизуют с амплифицированным продуктом, предназначенным для исследования, независимо от степени метилирования указанного специфического цитозина в геномной ДНК.

Соответственно, метод особенно предпочтителен, если гибридизацию амплифицированных продуктов проводят на стадии с) с двумя классами олигомеров (олигонуклеотидами и/или ПНК-олигомерами), каждый из которых имеет по меньшей мере один член, в результате чего олигомеры первого класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, которая получается после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в неметилированном состоянии в геномной ДНК, и менее предпочтительно гибридизуют с последовательностью, которая появляется после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в метилированном состоянии в геномной ДНК, и в результате чего олигомеры второго класса гибридизуют с амплифицированным продуктом, предназначенным для исследования, независимо от степени метилирования указанного специфического цитозина в геномной ДНК.

Таким образом, в этих случаях второй класс олигомеров гибридизуют с амплифицированным продуктом без получения существенной специфичности метилирования, и соответственно с положением амплифицированного продукта, которое не соответствует положениям цитозина, способным к метилированию. Следовательно, интенсивностью гибридизации определяется только концентрация амплифицированного продукта. В этой связи гибридизация с первым классом олигонуклеотидов может быть рассмотрена как функция степени метилирования исследуемого специфического цитозина.

Желательно, чтобы способ проводился не только с образцом геномной ДНК, но и логически со стандартной ДНК, в которой известно, присутствует ли цитозин в указанном специфическом положении в метилированном или неметилированном состоянии, и соотношения меток, определенных по двум классам олигонуклеотидов, измеряемых каждый раз неметилированной стандартной ДНК, служат величиной калибровки для степени метилирования 0, и соответственно, соотношения меток, определенных по двум классам олигонуклеотидов, измеряемых каждый раз метилированной стандартной ДНК, служат величиной калибровки для степени метилирования 1, и эти величины калибровки используют для определения степени метилирования образцов геномной ДНК.

Желательно, чтобы для калибровки использовались дополнительные известные стандартные образцы ДНК, каждая из которых обладает какой-либо известной степенью метилирования указанного специфического цитозина. Каждый используемый стандартный образец ДНК и образец (амплифицированный продукт, полученный из геномной ДНК) снабжают отдельной меткой. Каждый из используемых стандартных образцов ДНК также помечается последовательно разными метками.

Метод также приемлем в том случае, если амплифицированные продукты, исходящие от образцов разных геномных ДНК, снабжены разными метками. В этом случае можно измерять разные образцы одновременно с одной подборкой олигонуклеотидов двух классов, например, на решетке олигомера, который содержит нуклеотиды двух классов.

Метод особенно предпочтителен, если амплифицированные продукты, исходящие от образцов той же геномной ДНК, снабдить разными метками с тем, чтобы повысить точность измерения усреднением величин, полученных из разных методов определения. Например, это можно осуществить мечением разными флуоресцентными красителями. В этом случае измерение проводят флуоресцентным сканером, который обеспечивает несколько каналов для измерения отдельных длин волн излучения флуоресцентных красителей.

Естественно, метод также пригоден в случае флуоресцентных меток.

В соответствии с изобретением желательно, чтобы метка была флуоресцентной и определялась хемиолюминисценцией, УФ-абсорбцией или флуоресцентной поляризацией.

В соответствии с изобретением наиболее желательно, чтобы обработку ДНК на стадии а) проводили растворам бисульфита (=кислого сульфита, дисульфита). В методе также предпочтительно использовать для амплификации олигонуклеотиды, которые включают сегмент последовательности предварительно химически обработанной ДНК длиной по меньшей мере в 18 оснований в соответствии с одной из

последовательностей Seq.ID 1 - Seq.ID 40712. Кроме того, дополнительно к обработанной бисульфитом

ДНК используют затравки, которые могут амплифицировать регуляторные области (CpG-островки) и которые впоследствии можно исследовать на метилирование.

В данном предпочтительном методе на стадии гибридизации используют олигонуклеотиды и/или олигомеры пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), которые гибридизуют с сегментом последовательности длиной по меньшей мере в 9 оснований предварительно химически обработанной ДНК в соответствии с одной из Seq.ID 1 - Seq.ID 40712 или соответствуют этому сегменту, в результате чего последо- 5 007028

вательность основания содержит по меньшей мере один CpG-динуклеотид и CpG-динуклеотид находится приблизительно в средней трети олигомера. С помощью этих олигонуклеотиды можно исследовать специфические положения CpG относительно их степени метилирования по изобретению. Они связываются с амплифицированными продуктами обработанной ДНК, которая берет начало от образца геномной ДНК, метилированной в соответствующих положениях цитозина.

Желательно, чтобы метками были радионуклиды.

Желательно также, чтобы метки представляли собой съемные метки массы, которые определяются масс-спектрометром. Также в соответствии с изобретением желательно, чтобы ПЦР-продукты в целом или их характерные фрагменты определялись масс-спектрометром и, таким образом, четко отличались своей массой.

Желательно, чтобы олигомеры (олигонуклеотиды и/или олигомеры ПНК) одного класса включали последовательность 5'-CG-3'.

Желательно также, чтобы олигомеры (олигонуклеотиды и/или олигомеры ПНК) одного класса включали последовательность 5'-TG-3' и/или последовательность 5'-СА-3'.

Кроме того, наиболее предпочтительно, чтобы олигонуклеотиды первого класса включали последовательность 5'-CG-3', а олигонуклеотиды второго класса - последовательность 5'-TG-3' и/или последовательность 5'-СА-3'.

Кроме того, желательно, чтобы олигонуклеотиды первого и второго классов иммобилизировались на общей твердой фазе, а именно располагались на плоской твердой фазе в прямоугольном или шестиугольном гриде, и сайт специфических олигонуклеотидов на твердой фазе коррелировался с их соответствующей последовательностью.

Олигомеры первого и второго классов лучше иммобилизировать на гранулах, кодированных рядом индивидуально определяемых меток. Метки служат для идентификации гранулы, т.е. последовательности, связанной с определенной гранулой. Затем амплифицированные продукты, связанные с гранулами, идентифицируют посредством других меток, связанных с амплифицированными продуктами. Оснащение для проведения таких измерений на гранулах предлагает компания Luminex.

Стадию b) в методе по изобретению наиболее предпочтительно проводить в две суб-стадии следующим образом:

a) предварительная амплификация в ПЦР по меньшей мере одной парой затравок с разной последовательностью с неспецифической гибридизацией с образцом ДНК, предварительно обработанным по п.1 и получение более одного амплифицированного продукта на стадии ПЦР;

b) ПЦР-амплификация продукта, полученного в предварительной амплификации, затравками другой последовательности, из которых каждая идентична или инверсионно комплементарна к сегменту образца ДНК [(+) цепь или (-) цепь], прошедшему предварительную обработку в соответствии с п.1, и гибридизация с конкретной ДНК, предназначенной для амплификации.

В связи с этим изобретением гибридизацию следует понимать как гибридизацию двух одноцепочечных ДНК, которые полностью инверсионно комплементарны по отношению друг к другу по правилам ВатсонаКрика без ошибочного спаривания оснований. Урацил в этой связи рассматривается как тимин.

Желательно, чтобы амплификация нескольких сегментов ДНК проводилась в одной реакционной емкости.

Для амплификации лучше использовать теплоустойчивую полимеразу ДНК. Наиболее предпочтительно, чтобы олигонуклеотиды-затравка, используемые для амплификации, содержали либо только основания Ί, А и С, либо основания Ί, А и G.

По меньшей мере 10 CpG-положений в разном контексте последовательности желательно анализировать одновременно. Лучше по меньшей мере 50 CpG-положений в разном контексте последовательности анализировать одновременно. Еще лучше по меньшей мере 100 CpG-положений в разном контексте последовательности анализировать одновременно, а еще лучше анализировать одновременно 500 CpG положений в разном контексте последовательности и далее - 1000.

Предпочтительно применять метод изобретения, в котором образец геномной ДНК получают из клеточных линий, крови, мокроты, стула, мочи, цереброспинальной жидкости, ткани, залитой парафином, например, ткани глаз, кишечника, почки, мозга, сердца, предстательной железы, легкого, молочной железы или печени, гистологических слайдов или других возможных их комбинаций.

Метод по изобретению полезен в применении для диагностики и/или прогнозирования неблагоприятных явлений для больных, если такие неблагоприятные явления входят по меньшей мере в одну из следующих категорий: нежелательная лекарственная интерференция; раковые заболевания; CNS дисфункции, нарушения или заболевания; симптомы агрессии или поведенческие реакции; клинические, психологические или социальные последствия нарушения мозговой деятельности; психотические расстройства и изменения личности; старческое слабоумие и/или сопутствующие синдромы; сердечнососудистые заболевания, расстройства и нарушения; расстройства, нарушения и заболевания желудочнокишечного тракта; расстройства, нарушения и заболевания дыхательной системы; повреждение, воспаление, инфекция, состояния иммунитета и/или выздоровления; дисфункции, нарушения или заболевания организма как отклонение в развитии; патология, повреждения или заболевания кожи, мышц, соедини- 6 007028

тельной ткани или костей; нарушения, дисфункции или заболевания эндокринной системы и нарушения обменных процессов; головные боли или расстройства функции половой сферы.

Метод по изобретению также применяется для различения типов клеток или тканей или для исследования клеточной дифференциации.

Объектом изобретения является также комплект, включающий реагент, содержащий бисульфит, олигонуклеотиды-затравку для получения амплифицированных продуктов и/или олигонуклеотиды, иммобилизированные на твердой фазе, а также инструкции для проведения метода по изобретению. Олигонуклеотиды-затравку и иммобилизированные олигонуклеотиды, как указано выше, получают из последовательностей Seq IDs 1 - Seq IDs 40712.

Этот образец геномной ДНК был получен из клеточных линий, крови, мокроты, стула, мочи, цереброспинальной жидкости, ткани, залитой парафином, например ткани глаз, кишечника, почки, мозга, сердца, предстательной железы, легкого, молочной железы или печени, гистологических слайдов или других их возможных комбинаций.

На первой стадии в этом методе образец геномной ДНК обрабатывают таким образом, что за исключением оснований 5-метилцитозина, все основания цитозина преобразуются в урацил. Эту химическую обработку проводят раствором бисульфита (=кислого сульфита, дисульфита). Эту стадию метода можно проводить не только с образцом геномной ДНК, но и со стандартной ДНК, в которой известно, присутствует ли цитозин в указанном специфическом положении в метилированном или неметилированном состоянии.

На второй стадии метода амплифицируют сегменты геномной ДНК, содержащие указанный специфический цитозин. Эту стадию предпочтительно проводят в две суб-стадии.

1. Первая, предварительную PCR амплификацию проводят по меньшей мере одной парой затравок с разной последовательностью, которую гибридизуют с предварительно обработанной химически ДНК. Эту химическую обработку проводят таким образом, что основания цитозина преобразуют в урацил, но не основания 5-метилцитозина.

2. ПЦР-амплификацию продукта, образованного в предварительной амплификации, проводят затравками с разной последовательностью. Эти затравки идентичны или инверсионно комплементарны сегменту предварительно химически обработанной ДНК [(+) цепь или (-) цепь] и специфически гибридизуются с ДНК, предназначенной для амплификации. Желательно, чтобы амплифицированные продукты включали метку для обнаружения.

На следующей третьей стадии метода гибридизацию амплифицированных продуктов проводят предпочтительно с двумя классами олигонуклеотидов, каждый из которых [классов] имеет по меньшей мере один член. В наиболее предпочтительном варианте метода олигонуклеотиды первого класса включают последовательность 5'-CG-3' и олигонуклеотиды второго класса включают последовательность 5'TG-3' и/или последовательность 5'-СА-3'. Олигонуклеотиды первого и второго классов предпочтительно иммобилизируют на общей твердой фазе. Олигонуклеотиды располагают на плоской твердой фазе в прямоугольной или шестиугольной сетке (гриде) и сайт специфических олигонуклеотидов на твердой фазе коррелируют с их соответствующей последовательностью.

Олигонуклеотиды первого класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, которая получена после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в метилированном состоянии в геномной ДНК. Олигонуклеотиды второго класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, полученной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в неметилированном состоянии в геномной ДНК.

Амплификацию нескольких сегментов ДНК лучше проводить в одной реакторной емкости. .Амплификацию проводят полимеразной цепной реакцией (ПЦР), в которой используют теплоустойчивую полимеразу ДНК.

Олигонуклеотиды-затравка, применяемые для амплификации, включают предпочтительно либо только основания Т, А и С, либо основания Т, А и G.

На четвертой стадии метода степень гибридизации амгшифицированных продуктов с двумя классами олигонуклеотидов определяют обнаружением меток на амплифицированных продуктах. Метки лучше выбирать из флуоресцентных, радионуклидов или съемных меток массы, которые выявляются в масс-спектрометре. Их можно также выявить хемилюминесценцией, УФ-абсорбцией или флуоресцентной поляризацией. Продукты ПЦР можно также определить в целом или в виде их характерных фрагментов в масс-спектрометре. Таким образом, продукты ПЦР легко отличаются своей массой.

На последней стадии метода делается вывод о степени метилирования указанного специфического цитозина в образце геномной ДНК из соотношения меток, выявленных по двум классам олигонуклеотидов как следствие гибридизации.

Соотношения меток, выявленных по двум классам олигонуклеотидов, которые измеряют каждый раз неметилированной стандартной ДНК, служат величиной калибровки для степени метилирования 0.

Соответственно, соотношения меток, обнаруженных по двум классам олигонуклеотидов, которые измеряют каждый раз метилированной стандартной ДНК, служат величиной калибровки для степени

- 7 007028

метилирования 1. Величины калибровки применяют для определения степени метилирования образцов геномной ДНК.

Для калибровки также предпочтительно применять образцы дополнительной известной стандартной ДНК, каждый из которых имеет какую-то известную степень метилирования указанного специфического цитозина.

Кроме того, метод отличается тем, что по меньшей мере 10 положений CpG в разном контексте последовательности анализируют одновременно. Одновременно можно анализировать по меньшей мере 50 положений CpG в разном контексте последовательности. Кроме того, одновременно можно анализировать по меньшей мере 100 положений CpG в разном контексте последовательности. Возможен одновременный анализ по меньшей мере 500 положений CpG в разном контексте последовательности. И наконец предпочтителен одновременный анализ по меньшей мере 1000 положений CpG в разном контексте последовательности. Описанный метод применяют для диагностики и/или неблагоприятных явлений для больных, если такие неблагоприятные явления входят по меньшей мере в одну из следующих категорий: нежелательная лекарственная интерференция; раковые заболевания; CNS дисфункции, нарушения или заболевания; симптомы агрессии или поведенческие реакции; клинические, психологические или социальные последствия нарушения мозговой деятельности; психотические расстройства и изменения личности; старческое слабоумие и/или сопутствующие синдромы; сердечно-сосудистые заболевания, расстройства и нарушения; расстройства, нарушения и заболевания желудочно-кишечного тракта; расстройства, нарушения и заболевания дыхательной системы; повреждения, воспаление, инфекция, состояния иммунитета и/или выздоровления; дисфункции, нарушения или заболевания организма как отклонение в развитии; патология, повреждения или заболевания кожи, мьшц, соединительной ткани или костей; нарушение, дисфункции или заболевания эндокринной системы и обменных процессов; головные боли или расстройства функции половой сферы.

Метод по изобретению также применяется для различения типов клеток или тканей или для исследования клеточной дифференциации.

В определении соотношений гибридизации между двумя классами используемых олигонуклеотидов (например, содержащих CG/TG) метод не зависит от интенсивности общей гибридизации образцов неизвестной ткани.

Неметилированные и метилированные эталонные образцы используют в качестве стандартов для калибровки образцов неизвестной ткани.

Компонентом этого метода является также комплект, который включает реагент, содержащий бисульфит, олигонуклеотиды-затравку для получения амплифицированных продуктов и/или олигонуклеотиды, иммобилизированные на твердой фазе. Олигонуклеотиды (первый класс) включают последовательность 5'-CG-3'. Олигонуклеотиды (второй класс) включают последовательность 5'-TG-3' и/или последовательность 5'-СА-3'. Инструкция для проведения метода также включены в комплект.

Объектом настоящего изобретения являются также нуклеиновые кислоты, которые особенно пригодны для проведения метода.

Объектом изобретения является также ряд по меньшей мере из 10 олигомерных зондов (олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры), которые служат для определения состояния метилирования цитозина в предварительно химически обработанной геномной ДНК. (Seq.ID 1 - Seq.ID 40712). C этими зондами возможно проведение анализа ряда генетических и/или эпигенетических параметров для диагностики существующих заболеваний или для диагностики предрасположенности к специфическим заболеваниям.

Объектом настоящего изобретения является также сегмент последовательности обработанной ДНК, которая в соответствии с одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712 имеет длину по меньшей мере в 18 оснований. Эти сегменты в 18 пар оснований в длину, включающие Seq. ID 1 - Seq. ID 40712, используют для амплификации обработанной геномной ДНК. Олигомеры с длиной по меньшей мере в 9 нуклеотидов используют в качестве детекторов этих сегментов.

Предпочтительно олигомеры включают по меньшей мере один CpG-динуклеотид. Цитозин соответствующего CpG-динуклеотида выявлен приблизительно в средней трети олигомера. Решающим фактором является то, что по меньшей мере один олигонуклеотид из Seq. ID 1 - Seq. ID 40712 присутствует в соответствующем ряде олигомеров по меньшей мере для каждого из CpG-динуклеотидов.

Олигомеры получают на подложке в фиксированном расположении, где по меньшей мере один олигомер связан с твердой фазой. Методы связывания олигомерных зондов с твердыми фазами известны специалистам данной области техники.

В этой связи важно, что в последовательностях присутствуют не отдельные CpG-динуклеотиды, а большое количество CpG-динуклеотидов, по которым необходимо проводить анализ для диагностики генетических и/или эпигенетических параметров заявленных нуклеиновых кислот (Seq. ID 1 - Seq. ID 40712). В наиболее предпочтительном варианте метода исследуют все CpG-динуклеотиды, имеющиеся в последовательностях.

Желательно, чтобы все олигомерные зонды были одной длины. Кроме того, наиболее предпочтительны все 18-mer сегменты, имеющие CpG-динуклеотиды в центре и гибридизующиеся с одной из Seq. ID 1- Seq. ID 40712 без ошибочного спаривания оснований.

- 8 007028

В другом предпочтительном варианте метода используются по меньшей мере десять из олигомеров для определения состояния метилирования цитозина и/или полиморфизмов одного нуклеотида (SNPs) в предварительно обработанной химически геномной ДНК.

Применяя анализ структур метилирования, олигомеры используют для диагностики нежелательной лекарственной интерференции; раковых заболеваний; CNS дисфункции, нарушения или заболевания; симптомов агрессии или поведенческих реакций; клинических, психологических или социальных последствий нарушения мозговой деятельности; психотических расстройств и изменений личности; старческого слабоумия и/или сопутствующих синдромов; сердечно-сосудистых заболеваний, расстройств и нарушений; расстройств, нарушений и заболеваний желудочно-кишечного тракта; расстройств, нарушений и заболеваний дыхательной системы; повреждений, воспалений, наличия инфекции, состояний иммунитета и/или выздоровления; расстройств, нарушений или заболеваний организма как отклонения в развитии; нарушений функции, повреждений или заболеваний кожи, мышц, соединительной ткани или костей; нарушений, дисфункций или заболеваний эндокринной системы и обменных процессов; головных болей или расстройств функций половой сферы.

К тому же из указанных в протоколе последовательностей (Seq. ID 1 - Seq. ID 40712) нуклеиновых кислот или их значительных сегментов, по меньшей мере одна будет использоваться для анализа ряда генетических и/или эпигенетических параметров для диагностики существующих нарушений или для диагностики предрасположенности к определенным нарушениям.

Среднему специалисту понятно, что олигомеры выполняют ту же задачу, что и тимин, преобразованный в урацил.

Геномную ДНК для анализа получают предпочтительно из обычных источников ДНК, таких как клеточные линии, кровь, мокрота, стул, моча, цереброспинальная жидкость, ткань, залитая парафином, например, ткань глаз, кишечника, почки, мозга, сердца, предстательной железы, легкого, молочной железы или печени, гистологические слайды или другие их возможные комбинации.

Объектом настоящего изобретения являются также нуклеиновые кислоты, содержащие сегмент последовательности предварительно химически обработанной ДНК длиной в 18 оснований в соответствии с одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712.

Объектом настоящего изобретения является также олигомер (олигонуклеотид или олигомер пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК)) для определения состояния метилирования цитозина в предварительно химически обработанной ДНК, каждый включающий по меньшей мере одну последовательность оснований с длиной по меньшей мере в 9 нуклеотидов, который гибридизируют с предварительно химически обработанной ДНК (Seq. ID 1 - Seq. ID 40712). В соответствии с изобретением также предпочтительно, чтобы последовательность оснований содержала по меньшей мере один динуклеотид. И желательно, чтобы цитозин CpG-дануклеотида был приблизительно в средней трети олигомера.

Объектом изобретения является также ряд олигомеров по изобретению, включающий по меньшей мере один олигомер по меньшей мере для одного из CpG-динуклеотидов одной из последовательностей из Seq. ID 1 - Seq. ID 40712. Предпочтителен ряд олигомеров, включающий по меньшей мере один олигомер для каждого из CpG-динуклеотидов одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712.

Объектом изобретения является также ряд по меньшей мере двух нуклеиновых кислот, используемых в качестве олигонуклеотидов-затравки для амплификации по изобретению по меньшей мэре одной из Seq. ID 1 - Seq. ID 40712 или ее сегментов. Желательно, чтобы по меньшей мере один олигонуклеотид был связан с твердой фазой.

Объектом изобретения является также ряд зондов олигомеров для определения состояния метилирования цитозина и/или полиморфизмов одного нуклеотида (SNPs) в предварительно химически обработанной геномной ДНК в соответствии с одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712, содержащей по меньшей мере десять из вышеупомянутых олигомеров по изобретению.

Объектом изобретения является также метод получения расположения различных олигомеров (решетки), фиксированных на подложке, для анализа нарушений, связанных с состоянием метилирования CpG динуклеотидов одной из последовательностей Seq.ID 1 -Seq. ID 40712, в которой по меньшей мере один олигомер в соответствии с изобретением связан с твердой фазой.

Объектом изобретения является также расположение различных олигомеров (решетки), связанных с твердой фазой.

Объектом настоящего изобретения является также решетка разных последовательностей олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров, которые расположены на плоской твердой фазе в форме четырехугольной или шестиугольной решетки. Поверхность твердой фазы выполнена предпочтительно из кремния, стекла, полистирена, алюминия, стали, железа, меди, никеля, серебра или золота.

В объект изобретения также входит решетка ДНК и/или ПНК для анализа нарушений, связанных с состоянием метилирования генов, которые включают по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как описано выше.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Получение неметилированной и метилированной ДНК и обработка бисульфитом.

Для получения метилированной ДНК, геномную ДНК человека обрабатывали S-аденозилметионином и CpG-метилазой (Sssl, New England Biolabs,) в соответствии с информацией производителя.

- 9 007028

Для получения неметилированной ДНК фрагмент ELK-1 гена (доступное число ер59011) амплифицировали в ПЦР затравками GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA и AGGTGGTGGTGGCGGTGG, начиная с геномной ДНК человека. Неметилированную и метилированную ДНК, полученную таким образом, а также геномную ДНК человека обрабатывали применением бисульфита (=кислого сульфита, дисульфита) так, что все цитозины, неметилированные в 5-положении основания, менялись таким образом, что образовывалось основание, которое вело себя иначе в спаривании оснований, в то время как цитозины, метилированные в 5-положении, оставались не измененными. Если в реакции применять бисульфит в концентрации от 0,1М до 6М, на основаниях неметилированного цитозина имеет место присоединение. Кроме того, должен присутствовать денатурирующий агент или растворитель, а также ловушка для радикалов. Затем последующий щелочной гидролиз ведет к преобразованию гетероциклических оснований нуклеиновых кислот неметилированного цитозина в урацил. Такая преобразованная ДНК служит для определения метилированных цитозинов.

Пример 2. Получение зондов гена, меченных Су5.

Начиная с образцов ДНК, обработанных бисульфитом, амплифицировали взятый фрагмент длиной в 529 пар оснований от участка промотора ELK-1 гена (доступное число ер59011). Амплификацию проводили олигонуклеотидами-затравкой TGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT и TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT. При использовании олигонуклеотидов-затравки, помеченных флуоресцентной краской Су5, фрагмент непосредственно помечали в ПЦР. (1) Неметилированную ДНК, (2) метилированную ДНК и (3) геномную ДНК человека, обработанные бисульфитом (кислым сульфитом, дисульфитом) использовали как матричную ДНК. Затем эти три разных фрагмента ДНК исследовали в отдельных гибридизациях на их степень метилирования в специфическом CpG-положении.

Пример 3. Проведение гибридизации и оценка чипа с гибридизованной ДНК.

Зонды гена, полученные в примере 2, гибридизуют с ДНК на чипе. Первое, олигонуклеотиды иммобилизируют на чипе. Последовательности олигонуклеотидов получают из амплифицированного фрагмента ELK-1, указанного в примере 2, и они представляют собой CG-динуклеотид, включающий непосредственно прилегающие участки. Длина олигонуклеотидов доходит до 14-22 нуклеотидов; положение CG-динуклеотида внутри олигонуклеотида переменное. После гибридизации ДНК-чип сканируют (см. фиг. 1) и сигналы гибридизации оценивают по номерам (данные не представлены). Результат гибридизации для олигонуклеотидов CTACTCAACGAAAACAAA и СТАСТСААСАААААСААА показан на фиг. 1 и 2. CTACTCAACGAAAACAAA гибридизируется, если цитозин ELK-1 фрагмента, который выявлен в положении 103 амплифицированного продукта, метилирован; СТАСТCAAСАААААСAАА гибридизируется, если этот цитозин не метилирован.

ДНК-чип показан на фиг. 1 после гибридизации с ELK-1 фрагментом. После сканирования показано полученное псевдоцветовое изображение. В отличие от черно-белого изображения, показанного здесь, сканером получено цветовое изображение. Интенсивность разных оттенков представляет степень гибридизации, и степень гибридизации уменьшается от красного (это представлено в виде светлых пятен на фиг. 1) до синего (представлено темными пятнами на фиг. 1).

	Образец A (неметилированный)	Образец В (неизвестный)	Образец С (метилированный)
Последовательность обнаружения сяигсмера	Флуоресценция (подсчет)	Средняя величина	Флуоресценция (подсчет)	Средняя величина	Флуоресценция (подсчет)	Средняя величина
ctactcaaogaaaacaaa	3352		6102		6002
ctactcaaogaaaacaaa	2950		6775		7898
ctactcaaogaaaacaaa	4196		6360		7485
ctactcaaogaaaacaaa	5181		5521		11401
		3920		6190		8197
ctactcaacaaaaacaaa	20577		7074		7290
ctactcaacaaaaacaaa	19707		9171		9985
ctactcaacaaaaacaaa	24130		7603		9286
ctactcaacaaaaacaaa	21601		9434		12435
		21504		8321		9749
CG/CA		0.28		0.74		0.84

На фиг. 2А показаны фрагменты изображения из фиг. 1. Пары олигонуклеотидов в виде пятен обведены белой окружностью, чтобы выделить картину гибридизации: ctactcaacaaaaacaaa (слева) и ctactcaacgaaaacaaa (справа).

Выделенные фрагменты на фиг. 2В показывают характер пятен для неизвестного состояния метилирования образца ткани и выделенные фрагменты на фиг. 2С показывают состояние метилирования для метилированного эталонного образца.

- 10 007028

Средняя величина указывается каждый раз для длины волны в 635 нм. В колонке А представлены величины для неметилированного [эталонного] образца, в колонке В для неизвестного состояния метилирования образца ткани и в колонке С - величины для метилированного эталонного образца. Соотношение CG/CA представляет состояние метилирования соответствующего образца. Величина 0,74 показывает, что образец присутствует в основном в метилированной форме.

Пример 4. Следующий пример относится к фрагменту hMLH1 гена, связанного с наследственным

неполипозным раком толстого кишечника и прямой кишки, в котором на метилирование исследуют специфическое CG-положение.

На первой стадии геномную последовательность обрабатывают бисульфитом (кислым сульфитом, дисульфитом) таким образом, что все неметилированные цитозины в положении 5 основания модифицируются

так, что образуется основание, у которого другая поведенческая модель в спаривании оснований, в то время

как цитозины, которые метилируюгся в положении 5, остаются неизмененными. Если для реакции использовать бисульфит в диапазоне концентрации между 0,1М и 6М, введение имеет место в неметилированных основаниях цитозина. Кроме того, должны присутствовать денатурирующий реагент или растворитель, а также ловушка для радикалов. Далее последующий щелочной гидролиз ведет к преобразованию гетероциклических оснований нуклеиновых кислот неметилированного цитозина в урацил. Эта преобразованная ДНК служит для обнаружения метилированных цитозинов. На второй стадии метода обработанный образец ДНК разбавляют водой или водным раствором. Далее желательно провести десульфирование ДНК (10-30 мин, 90-100°С) при щелочном рН. На третьей стадии метода образец ДНК амплифицируют в полимеразной цепной реакции, предпочтительно теплоустойчивой полимеразой ДНК. В данном примере исследуют цитозины hMLH1 гена, от 5'-фланкирующего участка длиной в 1551 пар оснований. Определенный фрагмент длиной в 719 пар оснований амплифицируют для этой цели специфическими олигонуклеотидами-затравками AGCAACACCTCCATGCACTG и TTGATTGGA-CAGCTTGAATGC. Этот амплифицированный продукт служит образцом, который гибридизируют с олигонуклеотидом, предварительно связанным с твердой фазой, с образованием дуплексной структуры, например, GAAGAGCGGACAG, в результате чего цитозин выявлен в положении 588 амплифицированного продукта. Определение продукта гибридизации проводят по олигонуклеотидам-затравкам, которые применяли для амплификации и которые были помечены флуоресцентными красителями Су3 и Су5. Реакция гибридизации амплифицированной ДНК с олигонуклеотидами происходит только, если метилированный цитозин присутствовал в этом сайте в обработанной бисульфитом ДНК. Таким образом, состояние метилирования соответствующего исследуемого цитозина определяет продукт гибридизации.

Пример 5. Получение ДНК, модифицированной бисульфитом, с агарозными гранулами.

В настоящем эксперименте амплифицируют определенный фрагмент длиной в 529 пар оснований от области промотора ELK-1 гена (доступное число ер59011), начиная с ДНК, обработанной бисульфитом. Фрагмент метят непосредственно в ПЦР использованием олигонуклеотидов-затравок ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT и TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT, которые помечены флуоресцентным красителем ALEXA 488. Олигонуклеотиды первого класса (здесь, например, ATTAATAGCGTTTTGGTT) и второго класса (здесь например, ATTAATAGCGTTTTGGTT) иммобилизируют на поверхности гранул, которые различаются отдельным цветовым кодированием. На следующей стадии амплифицированные продукты ELK-1 гена, полученные вышеуказанными олигонуклеотидамизатравками, соединяют со смесью гранул обоих классов, вследствие чего амплифицированные продукты гибридизуются с иммобилизированными олигонуклеотидами, здесь, например, ATTAATAGCGTTTTGGTT и ATTAATAGTGTTTTGGTT, в результате чего искомые С или Т каждый раз выявляют в положении 476 амплифицированного продукта. Затем гранулы с флуоресцентными параметрами по их цветовому кодированию разделяют и степень гибридизации определяют измерением интенсивности флуоресценции, которая свойственна флуоресцентному красителю ALEXA 488.

Пример 6. Использование множественных красителей для внутренней калибровки.

Амплифицируют определенный фрагмент длиной в 529 пар оснований от области промотора ELK-1 гена, начиная с ДНК, обработанной бисульфитом. Фрагмент метят непосредственно в ПЦР использованием меченных флуоресцентным красителем олигонуклеотидов-затравок ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT и TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT. Для ПЦР, которую проводят на термоциклическом реакторе (Eppendorf GmbH), берут 10 нг обработанной бисульфитом ДНК, 6рМ каждой затравки, 200 μΜ каждого dNTP, 1,5 мМ MgC12 и 1U HotstartTaq (Qiagen AG). Другие условия соблюдают в соответствии с информацией производителя. Для амплификации денатурацию проводят в течение 14 мин при 96°C с последующими 39 циклами в условиях: 60 с при 96°C, 45 с при 55°C и 75 с при 72°C. В заключение в течение 10 мин при 72°C проводят элонгацию. В данном случае образцы для исследования, здесь ткань здоровых и больных людей, помечают красителем Су 2. Для внутренней калибровки состояния метилирования для амплификации образцов в калибровке используют олигонуклеотиды-затравку, которые метят флуоресцентными красителями Су3 и CY5. Амплифицированные продукты из образцов для калибровки представляют известное состояние метилирования, с одной стороны, состояние 100% метилирования, и с другой стороны, неметилированное состояние. Поскольку в этом методе соотношение цветовой интенсивности флуоресцентных красителей, которая измеряется применением ScanArray

- 11 007028

4000XL, Packard BioScience-BioChip Technologies, рассчитывается для двух классов олигонуклеотидов, здесь, например, ATTAATAGCGTTTTGGTT и ATTAATAGTGTTTTGGTT, в которых С или Т выявлены каждый раз в положении 476 амплифицированного продукта, можно определить соотношение метилированного к неметилированному состоянию неизвестного образца.

Пример 7. Применение множественных красителей для увеличения общего объема образца и повышения сложности анализа.

Настоящий эксперимент служит для анализа разных образцов в одной стадии гибридизации и увеличения общего объема образца. Для этой цели определенный фрагмент длиной в 529 пар оснований от области промотора ELK-1 гена, взятый от каждого из четырех отдельных людей, начиная с обработанной бисульфитом ДНК, амплифицируют олигонуклеотидами-затравкой ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT и TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT. Эти фрагменты от четырех людей помечают четырьмя разными флуоресцентньми красителями Су3, Су5, Су2 и Су7 и гибридизируют с иммобилизированными олигонуклеотидами, здесь, например, ATTAATAGCGTTTTGGTT и ATTAATAGTGTTTTGGTT, в результате чего искомые С или Т выявляют каждый раз в положении 476 амплифицированного продукта. Затем образцы с разными флуоресцентными метками анализируют на разных длинах волн без взаимной интерференции от флуоресцентного красителя.

С другой стороны, возможно также получение разных подборок фрагментов от одного образца ДНК, которые помечают разными красителями, здесь Су2, Су3, Су5. Если ряд зондов олигонуклеотидов для 64 генов (ряд 1) иммобилизировать на чипе, специфичности достаточно, чтобы проанализировать 64 фрагмента, например, помеченных Су3, независимо один от другого. Благодаря тому, что образцы ряда 1 помечены флуоресцентньы красителем Су3, а образцы ряда 2 - флуоресцентным красителем Су5 (и ряда 3 - Су2), амплифицированные продукты ряда 2 и 3 с флуоресцентным мечением не влияют на определение состояния метилирования при измерении флуоресцентной интенсивности фрагментов ряда 1 (и наоборот). Поэтому, несмотря на повышенную сложность амплифицированных продуктов, представляется возможным получить такие же надежные данные для амплифицированных продуктов меньшей сложности, чем эти 64.

Пример 8. Применение множественных красителей для подтверждения экспериментальной воспроизводимости.

В этом эксперименте те же амплифицированные продукты ПЦР помечают четырьмя разными флуоресцентными красителями и подтверждают на надежность 4Х повтором. Для этой цели, начиная с обработанной бисульфитом ДНК, определенный фрагмент длиной в 529 пар оснований от области промотора ELK-1 гена, амплифицируют олигонуклеотидами-затравкой ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT и TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT и гибридизуют с иммобилизированными олигонуклеотидами, здесь, например, ATTAATAGTGTTTTGGTT и ATTAATAGTGTTTTGGTT, в результате чего искомые С или Т выявляют каждый раз в положении 476 амплифицированного продукта. Соотношения образцов с разными флуоресцентными метками сравнивают использованием олигонуклеотидов-затравки, помеченных флуоресцентными красителями Су3, Су5, Су2 и Су7, и таким образом достигается большая экспериментальная надежность.

Список последовательностей к описанию изобретения приложен на CD-ROM.

Claims (50)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ определения степени метилирования специфического цитозина в контексте последовательности 5'-CpG-3' образца геномной ДНК, отличающийся тем,что

   a) геномную ДНК подвергают химической обработке, посредством которой основания цитозина, но не основания 5-метилцитозина, преобразуют в урацил;

   b) сегменты геномной ДНК, содержащие указанный специфический цитозин, амплифицируют и для обнаружения амплифицированные продукты снабжают меткой;

   c) амплифицированные продукты гибридизуют с двумя классами олигонуклеотидов и/или ПНКолигомеров, каждый из которых [классов] имеет по меньшей мере один член;

   d) степень гибридизации амплифицированных продуктов с двумя классами олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров определяют обнаружением метки амплифицированных продуктов;

   e) вывод о степени метилирования указанного специфического цитозина в образце геномной ДНК делают из соотношения меток, выявленных для двух классов олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров, как следствие гибридизации.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гибридизацию амплифицированных продуктов на стадии с) проводят на двух классах олигомеров (олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров), каждый из которых [класс] имеет по меньшей мере один член, посредством чего олигомеры первого класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, полученной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в метилированном состоянии, и посредством чего олигомеры второго класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, получен- 12 007028

   ной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в неметилированном состоянии.
3. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гибридизацию амплифицированных продуктов на стадии с) проводят на двух классах олигомеров (олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров), каждый из которых [класс] имеет по меньшей мере один член, посредством чего олигомеры первого класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, полученной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в метилированном состоянии, менее предпочтительно гибридизуют с последовательностью, полученной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в неметилированном состоянии, и посредством чего олигомеры второго класса гибридизуют с амплифицированным продуктом, который исследуют независимо от степени метилирования указанного специфического цитозина в геномной ДНК.
4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гибридизацию амплифицированных продуктов на стадии с) проводят на двух классах олигомеров (олигонуклеотидов и/или ПНК-олигомеров), каждый из которых [класс] имеет по меньшей мере один член, посредством чего олигомеры первого класса предпочтительно гибридизуют с последовательностью, полученной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в неметилированном состоянии, менее предпочтительно гибридизуют с последовательностью, полученной после химической обработки геномной ДНК, если указанный специфический цитозин присутствовал в геномной ДНК в метилированном состоянии, посредством чего олигомеры второго класса гибридизуют с амплифицированным продуктом, который исследуют независимо от степени метилирования указанного специфического цитозина в геномной ДНК.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что его проводят не только с образцом геномной ДНК, но и логически со стандартной ДНК, в которой известно, находится ли цитозин в указанном специфическом положении в метилированном или неметилированном состоянии, и соотношения меток, определяемых на двух классах олигонуклеотидов, которые измеряют каждый раз неметилированной стандартной ДНК, указанной в п.1, служат величиной калибровки для степени метилирования 0 и соответственно, соотношения меток, определяемых на двух классах олигонуклеотидов, которые измеряют каждый раз метилированной стандартной ДНК по п.1, служат величиной калибровки для степени метилирования 1, и эти величины калибровки применяют для определения степени метилирования образца геномной ДНК.
6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что для калибровки применяют образцы дополнительной известной стандартной ДНК, каждый из которых имеет какую-либо известную степень метилирования указанного специфического цитозина.
7. 7. Способ по одному из пп.5 или 6, отличающийся тем, что каждая ДНК, применяемая в качестве стандартной, имеет отдельную метку и образец (амплифицированный продукт из геномной ДНК, полученный по п. 1) снабжен также отличительной меткой.
8. 8. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что амплифицированные продукты, полученные от разных образцов геномной ДНК, снабжают разными метками.
9. 9. Способ по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что амплифицированные продукты, исходящие от тех же образцов геномной ДНК, снабжают разными метками с целью достижения повышенной точности измерения усреднением величин, полученных в разных методах определения.
10. 10. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанными метками являются флуоресцентные метки.
11. 11. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что химическую обработку проводят раствором бисульфита (=кислого сульфита, дисульфита).
12. 12. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что для амплификации применяют олигонуклеотиды, включающие сегмент последовательности ДНК с предварительной химической обработкой с длиной по меньшей мере в 18 оснований одной из [последовательностей] Seq.ID 1 Seq. ID 40712.
13. 13. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии гибридизации используют олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры (пептидной нуклеиновой кислоты), которые гибридизуют с сегментом последовательности ДНК с предварительной химической обработкой длиной по меньшей мере в 9 оснований из Seq.ID 1 - Seq. ID 40712, или соответствующим этой последовательности, в результате чего последовательность основания включает по меньшей мере один CpGдинуклеотид, и CpG-динуклеотид выявлен приблизительно в средней трети олигомера.
14. 14. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанную метку обнаруживают хемилюминесценцией, УФ-абсорбцией или флуоресцентной поляризацией.
15. 15. Способ по одному из пп.1-13, отличающийся тем, что метками являются радионуклиды.
16. 16. Способ по одному из пп.1-13, отличающийся тем, что метками являются съемные метки массы, которые обнаруживаются в масс-спектрометре.

    - 13 007028
17. 17. Способ по одному из пп.1-13, отличающийся тем, что продукты ПЦР в целом или их характерные фрагменты определяют в масс-спектрометре и они четко различаются своей массой.
18. 18. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигомеры (олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры) одного класса включают последовательность 5'-CG-3'.
19. 19. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигомеры (олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры) включают последовательность 5'-TG-3' и/или последовательность 5'СА-3'.
20. 20. Способ по одному из пп.18 или 19, отличающийся тем, что олигомеры (олигонуклеотиды и/или ПНК-олигомеры) первого класса включают последовательность 5'-CG-3', а олигомеры второго класса включают последовательность 5'-TG-3' и/или последовательность 5'-СА-3'.
21. 21. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигомеры первого и второго классов иммобилизируют на общей твердой фазе.
22. 22. Способ по п.11, отличающийся тем, что олигонуклеотиды располагают на плоской твердой фазе в форме прямоугольной или шестиугольной решетки и сайт специфических олигонуклеотидов на твердой фазе коррелируют с их соответствующей последовательностью.
23. 23. Способ по пп.1-20, отличающийся тем, что олигомеры первого и второго классов иммобилизируют на гранулах, которые кодируют подборкой отдельно выявляемых меток.
24. 24. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию b) п.1 проводят в две субстадии следующим образом:

    a) предварительная амплификация в ПНР по меньшей мере одной парой затравок с разной последовательностью, которые неспецифично гибридизуются с образцом ДНК, подвергнутым предварительной обработке по п.1, и получение более одного амплифицированного продукта на стадии ПЦР;

    b) ПЦР-амплификация продукта, образованного в предварительной амплификации, затравками с разной последовательностью, каждая из которых идентична или инверсионно комплементарна сегменту образца ДНК [(+)цепь или (-) цепь], предварительно обработанного по п.1, и гибридизация специфически с ДНК, подлежащей амплификации.
25. 25. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что амплификацию нескольких сегментов ДНК проводят в одном реакторе.
26. 26. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что для амплификации используют теплостойкую полимеразу ДНК.
27. 27. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигонуклеотидызатравка, применяемые для амплификации, включают либо только основания Т, А и С, либо основания Т, А и G.
28. 28. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что в разных контекстах

    последовательности одновременно анализируют по меньшей мере 10 CpG-положений.
29. 29. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что в разных контекстах последовательности одновременно анализируют по меньшей мере 50 CpG-положений.
30. 30. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что в разных контекстах последовательности одновременно анализируют по меньшей мере 100 CpG-положений.
31. 31. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что в разных контекстах последовательности одновременно анализируют по меньшей мере 500 CpG-положений.
32. 32. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся таи, что в разных контекстах последовательности одновременно анализируют по меньшей мере 1000 CpG-положений.
33. 33. Способ по одному из предшествующих пунктов, в котором образец геномной ДНК получают из клеточных линий, крови, мокроты, стула, мочи, цереброспинальной жидкости, ткани, залитой парафином, например ткани глаз, кишечника, почки, мозга, сердца, предстательной железы, легкого, молочной железы или печени, гистологических слайдов или других возможных их комбинаций.
34. 34. Применение способа по одному из предшествующих пунктов для диагностики и/или прогнозирования неблагоприятных явлений для больных, если такие неблагоприятные явления входят по меньшей мере в одну из следующих категорий: нежелательная лекарственная интерференция; раковые заболевания; CNS дисфункции, нарушения или заболевания; симптомы агрессии или поведенческие реакции; клинические, психологические или социальные последствия нарушения мозговой деятельности; психотические расстройства и изменения личности; старческое слабоумие и/или сопутствующие синдромы; сердечно-сосудистые заболевания, расстройства и нарушения; расстройства, нарушения и заболевания желудочно-кишечного тракта; расстройства, нарушения и заболевания дыхательной системы; повреждение, воспаление, инфекция, состояния иммунитета и/или выздоровления; дисфункции, нарушения или заболевания организма как отклонение в развитии; патология, повреждения или заболевания кожи, мышц, соединительной ткани или костей; нарушение, дисфункции или заболевания эндокринной системы и нарушение обменных процессов; головные боли или расстройства функции половой сферы.
35. 35. Применение способа по любому из предшествующих пунктов для дифференцирования типов клеток или тканей или для исследования клеточной дифференцировки.

    - 14 007028
36. 36. Набор, включающий реагент, содержащий бисульфит, олигонуклеотиды-затравку для получения амплифицированных продуктов и/или предпочтительно олигонуклеотиды, меченные как указано в п.10, иммобилизированные на твердой фазе, а также инструкцию по проведению метода по одному из предшествующих пунктов.
37. 37. Нуклеиновые кислоты, включающие сегмент последовательности предварительно химически обработанной ДНК длиной по меньшей мере в 18 оснований в соответствии с одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712.
38. 38. Олигомер (олигонуклеотид и/или олигомер пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК)) для определения состояния метилирования цитозина в предварительно химически обработанной ДНК, каждый включающий по меньшей мере одну последовательность основания длиной по меньшей мере в 9 нуклеотидов, который гибридизируется с предварительно химически обработанной ДНК (Seq. ID 1 - Seq. ID 40712).
39. 39. Олигомер по п.38, в котором последовательность основания включает по меньшей мере один

    CpG-динуклеотид.
40. 40. Олигомер по п.39, далее отличающийся тем, что цитозин Ср-динуклеотида выявлен приблизительно в средней трети олигомера.
41. 41. Ряд олигомеров по п.39, включающий по меньшей мере один олигомер по меньшей мере для одного из CpG-динуклеотидов одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712.
42. 42. Ряд олигомеров по п.41, включающий по меньшей мере один олигомер для каждого из CpGдинуклеотидов одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712.
43. 43. Ряд по меньшей мере двух нуклеиновых кислот, применяемых в качестве олигонуклеотидовзатравки для амплификаци по п.1 по меньшей мере одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712 или ее сегментов.
44. 44. Рад олигонуклеотидов по п.43, далее отличающийся тем, что по меньшей мере один олигонуклеотид связан с твердой фазой.
45. 45. Ряд зондов олигомера для определения состояния метилирования цитозина и/или полиморфизмов (SNPs) отдельно взятого нуклеотида в предварительно химически обработанной ДНК в соответствии с одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712, содержащих по меньшей мере десять из олигомеров по любому из пп.38-40.
46. 46. Способ получения расположения разных олигомеров (решетки), фиксированных на опорном материале для анализа нарушений, связанных с состоянием метилирования CpG-динуклеотидов одной из последовательностей Seq. ID 1 - Seq. ID 40712, в которой по меньшей мере один олигомер по любому из пп.2-4 связан с твердой фазой.
47. 47. Решетка разных олигомеров по любому из пп.38-40, связанная с твердой фазой.
48. 48. Решетка по п.47, отличающаяся тем, что олигомеры расположены на плоской твердой фазе в форме прямоугольного или шестиугольного грида.
49. 49. Решетка по любому из пп.47 или 48, отличающаяся тем, что поверхность твердой фазы выполнена из кремния, стекла, полистирена, алюминия, стали, железа, меди, никеля, серебра или золота.
50. 50. Решетка ДНК или ПНК для анализа нарушений и расстройств, связанных с состоянием метилирования генов, которые включают по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту в соответствии с одним из пп.38-40.