メチル化DNAは、ほとんどの腫瘍型の組織中におけるバイオマーカーの有力なクラスとして研究されている。多くの例において、DNAメチルトランスフェラーゼは、遺伝子発現のエピジェネティック制御として、シトシン-リン酸-グアニン(CpG)アイランド部位でDNAにメチル基を付加する。生物学的に興味深い機序では、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における後天的メチル化事象は、発現をサイレンシングし、それゆえ発がんに寄与すると考えられている。DNAメチル化は、RNAまたはタンパク質発現よりも、より化学的かつ生物学的に安定した診断ツールである可能性がある(Laird(2010)Nat Rev Genet 11:191-203)。さらに、散発性結腸癌のような他のがんでは、メチル化マーカーは、優れた特異性を提供し、個別のDNA変異であるものよりも、より広範な情報を有し、かつ感度が高い(Zou et al(2007)Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16:2686-96)。
CpGアイランドの分析は、動物モデル及びヒト細胞株に使用される場合、重要な知見をもたらしている。例えば、Zhang及び同僚らは、同じCpGアイランドの異なる部分からのアンプリコンが、異なるレベルのメチル化を有する可能性があることを見出した(Zhang et al.(2009)PLoS Genet 5:e1000438)。さらに、メチル化レベルは、高度なメチル化配列と非メチル化配列との間で二峰性に分布し、さらにDNAメチルトランスフェラーゼ活性のバイナリースイッチ様パターンを支持していた(Zhang et al.(2009)PLoS Genet 5:e1000438)。インビボのマウス組織及びインビトロの細胞株の分析は、高CpG密度のプロモーター(HCP、300塩基対領域内で>7%のCpG配列を有すると定義される)の約0.3%のみがメチル化されたのに対して、低CpG密度の領域(LCP、300塩基対領域内で<5%のCpG配列を有すると定義される)は、動的組織特異的パターンにおいて高い頻度でメチル化される傾向があったことを実証した(Meissner et al.(2008)Nature 454:766-70)。HCPは、遍在性ハウスキーピング遺伝子及び高度に制御された発生遺伝子のためのプロモーターを含む。>50%においてメチル化されたHCP部位の中でも、いくつかの確立されたマーカー、例えば、Wnt2、NDRG2、SFRP2、及びBMP3などがあった(Meissner et al.(2008)Nature 454:766-70)。
DNAメチルトランスフェラーゼによるシトシン-リン酸-グアニン(CpG)アイランド部位におけるDNAのエピジェネティックメチル化は、ほとんどの腫瘍型の組織中におけるバイオマーカーの有力なクラスとして研究されている。生物学的に興味深い機序では、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域における後天的メチル化事象は、発現をサイレンシングし、発がんに寄与すると考えられている。DNAメチル化は、RNAまたはタンパク質発現よりも、より化学的かつ生物学的に安定した診断ツールである可能性がある。さらに、散発性結腸癌のような他のがんでは、異常なメチル化マーカーは、個別のDNA変異であるものよりも、より広範な情報を有し、かつ感度が高く、優れた特異性を提供する。
いくつかの方法が、新規メチル化マーカーを探索するのに利用可能である。CpGメチル化のマイクロアレイに基づく照合は、合理的で高スループットなアプローチであるが、この方針は、既知の目的の領域、主に確立された腫瘍抑制プロモーターに偏っている。DNAメチル化のゲノムワイド解析の代替方法は、この10年間で開発されている。3つの基本的なアプローチが存在する。第1には、特定のメチル化部位を認識する制限酵素によってDNAの消化を用い、続いていくつかの可能な分析技術を用いて、酵素認識部位またはプライマーに限定されたメチル化データを提供し、これらを使用して定量化ステップにおいてDNAを増幅する(メチル化特異的PCR、MSPなど)。第2アプローチは、メチル-シトシンまたは他のメチル化特異的結合ドメインを対象とする抗体を使用してゲノムDNAのメチル化画分を濃縮し、続いてマイクロアレイ分析またはシーケンシングを行って、断片を基準ゲノムにマッピングする。このアプローチは、断片内における全てのメチル化部位の単一ヌクレオチド分解能を提供しない。第3アプローチは、DNAの亜硫酸水素塩処理に始まって全ての非メチル化チロシンをウラシルに変換し、続いて制限酵素消化を行い、アダプターリガンドへの結合後に全ての断片の完全シーケンシングを行う。制限酵素の選択によって、CpG高密度領域の断片が濃縮され、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされる可能性のある冗長配列数が減少し得る。
RRBSは、中程度~高いリードカバレッジで全てのCpGアイランド及び大部分の腫瘍抑制プロモーターの80~90%に関する、単一ヌクレオチド分解能でのCpGメチル化状態データをもたらす。がん症例-対照研究では、これらのリードの分析は、可変メチル化領域(DMR)の同定をもたらす。膵臓癌検体に関するこれまでのRRBS分析では、何百ものDMRが発見され、その多くは発がんとは決して関連せず、その多くはアノテーションされなかった。独立した組織試料セットに対するさらなる検証試験は、性能の点で100%の感度及び特異性であったマーカーCpGを確認した。
本明細書で提供されるのは、乳癌スクリーニングに関する技術であり、特に、乳癌の存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途であるが、これらに限らない。
事実、実施例I、II及びIIIに記載されるように、本発明についての実施形態を同定する過程中に実施された実験は、非腫瘍性対照DNAと乳房由来のDNAのがんを区別するために可変メチル化領域(DMR)の新規セットを同定した。
そのような実験によって、乳癌組織と良性の乳房組織とを区別する375個の新規DNAメチル化マーカーが列挙かつ記載されている(表2及び表18、実施例I、II及びIIIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1(表16E、実施例IIを参照のこと)、ならびに
・ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B(表22、実施例IIIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、血液試料(例えば、血漿試料、全血試料、血清試料)中の乳癌を検出するための以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B(表27、実施例IIIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、トリプルネガティブ乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・ABLIM1、AJAP1_B、ASCL2、ATP6V1B1、BANK1、CALN1_A、CALN1_B、CLIC6、DSCR6、FOXP4、GAD2、GCGR、GP5、GRASP、HBM、HNF1B_B、KLF16、MAGI2、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8859253-8859329、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr6.157557371-157557657、MPZ、NKX2-6、PDX1、PLXNC1_A、PPARG、PRKCB、PTPRN2、RBFOX_A、SCRT2_A、SLC7A4、STAC2_B、STX16_A、STX16_B、TBX1、TRH_A、VSTM2B_A、ZBTB16、ZNF132、及びZSCAN23(表3、実施例Iを参照のこと)、
・CALN1_A、LOC100132891、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、DLX4、GP5、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、KCNK9、SCRT2_B、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)、
・ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4(表16A、実施例IIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、HER2+乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・ABLIM1、AFAP1L1、AKR1B1、ALOX5、AMN、ARL5C、BANK1、BCAT1、BEGAIN、BEST4、BHLHE23_B、BHLHE23_C、C17orf64、C1QL2、C7orf52、CALN1_B、CAV2、CD8A、CDH4_A、CDH4_B、CDH4_C、CDH4_D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_B、CLIP4、CR1、DLK1、DNAJC6、DNM3_A、EMX1_A、ESPN、FABP5、FAM150A、FLJ42875、GLP1R、GNG4、GYPC_A、HAND2、HES5、HNF1B_A、HNF1B_B、HOXA1_A、HOXA1_B、HOXA7_A、HOXA7_B、HOXA7_C、HOXD9、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、IGSF9B_A、IL15RA、INSM1、ITPKA_B、ITPRIPL1、KCNE3、KCNK17_B、LIME1、LOC100132891、LOC283999、LY6H、MAST1、MAX.chr1.158083198-158083476、MAX.chr1.228074764-228074977、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr10.130085265-130085312、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr14.101176106-101176260、MAX.chr15.96889069-96889128、MAX.chr17.8230197-8230314、MAX.chr19.46379903-46380197、MAX.chr2.97193163-97193287、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr21.44782441-44782498、MAX.chr22.23908718-23908782、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.180101084-180101094、MAX.chr5.42952185-42952280、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr6.27064703-27064783、MAX.chr7.152622607-152622638、MAX.chr8.145104132-145104218、MAX.chr9.136474504-136474527、MCF2L2、MSX2P1、NACAD、NID2_B、NID2_C、ODC1、OSR2_B、PAQR6、PCDH8、PIF1、PPARA、PPP2R5C、PRDM13_A、PRHOXNB、PRKCB、RBFOX3_A、RBFOX3_B、RFX8、SNCA、STAC2_A、STAC2_B、STX16_B SYT5、TIMP2、TMEFF2、TNFRSF10D、TRH_B、TRIM67、TRIM71_C、USP44_A、USP44_B、UTF1、UTS2R、VSTM2B_A、VSTM2B_B、ZFP64、及びZNF132(表4、実施例Iを参照のこと)、
・BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、CHST2_A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、C17orf64、CHST2_B、DLX4、DNM3_A、EMX1_A、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、LAYN、PLXNC1_A、RIC3、SCRT2_B、ALOX5、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、AJAP1_B、DSCR6、及びMAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)、
・ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、C10orf125(表16B、実施例IIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、ルミナルA乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・ARL5C、BHLHE23_C、BMP6、C10orf125、C17orf64、C19orf66、CAMKV、CD1D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_A、CRHBP、DLX6、DNM3_A、DNM3_B、DNM3_C、ESYT3、ETS1_A、ETS1_B、FAM126A、FAM189A1、FAM20A、FAM59B、FBN1、FLRT2、FMN2、FOXP4、GAS7、GYPC_A、GYPC_B、HAND2、HES5、HMGA2、HNF1B_B、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、KCNH8、KCNK17_A、KCNQ2、KLHDC7B、LOC100132891、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990591-59990895、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr20.1783841-1784054、MAX.chr21.47063802-47063851、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.172234248-172234494、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr6.130686865-130686985、MAX.chr8.687688-687736、MAX.chr8.688863-688924、MAX.chr9.114010-114207、MPZ、NID2_A、NKX2-6、ODC1、OSR2_A、POU4F1、PRDM13_B、PRKCB、RASGRF2、RIPPLY2、SLC30A10、ST8SIA4、SYN2、TRIM71_A、TRIM71_B、TRIM71_C、UBTF、ULBP1、USP44_B、及びVSTM2B_A(表5、実施例Iを参照のこと)、
・BHLHE23_C、CD1D、CHST2_A、FAM126A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、SLC30A10、TRIM67、ATP6V1B1、BANK1、C10orf125、C17orf64、CHST2_B、DNM3_A、EMX1_A、GP5、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990671-59990859、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、OTX1、PLXNC1_A、HNF1B_B、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、DSCR6、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)、
・ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125(表16C、実施例IIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、ルミナルB乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・ACCN1、AJAP1_A、AJAP1_B、BEST4、CALN1_B、CBLN1_B、CDH4_E、DLX4、FOXP4、IGSF9B_B、ITPRIPL1、KCNA1、KLF16、LMX1B_A、MAST1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr8.124173128-124173268、MPZ、PPARA、PRMT1、RBFOX3_B、RYR2_A、SALL3、SCRT2_A、SPHK2、STX16_B SYNJ2、TMEM176A、TSHZ3、及びVIPR2(表6、実施例Iを参照のこと)、
・CALN1_A、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、DLX4、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、BHLHE23_D、HNF1B_B、TRH_A、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、AJAP1_B、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)、
・ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D(表16D、実施例IIを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、BRCA1乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・C10orf93、C20orf195_A、C20orf195_B、CALN1_B、CBLN1_A、CBLN1_B、CCDC61、CCND2_A、CCND2_B、CCND2_C、EMX1_B、FAM150B、GRASP、HBM、ITPRIPL1、KCNK17_A、KIAA1949、LOC100131176、MAST1、MAX.chr1.8277285-8277316、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr18.5629721-5629791、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679767-42679917、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr6.157556793-157556856、MAX.chr8.124173030-124173395、MN1、MPZ、NR2F6、PDXK_A、PDXK_B、PTPRM、RYR2_B、SERPINB9_A、SERPINB9_B、SLC8A3、STX16_B TEPP、TOX、VIPR2、VSTM2B_A、ZNF486、ZNF626、及びZNF671(表7、実施例Iを参照のこと)、
・BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、BRCA2乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・ANTXR2、B3GNT5、BHLHE23_C、BMP4、CHRNA7、EPHA4、FAM171A1、FAM20A、FMNL2、FSCN1、GSTP1、HBM、IGFBP5、IL17REL、ITGA9、ITPRIPL1、KIRREL2、LRRC34、MAX.chr1.239549742-239549886、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr2.238864674-238864735、MAX.chr5.81148300-81148332、MAX.chr7.151145632-151145743、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr8.143533298-143533558、MERTK、MPZ、NID2_C、NTRK3、OLIG3_A、OLIG3_B、OSR2_C、PROM1、RGS17、SBNO2、STX16_B TBKBP1、TLX1NB、VIPR2、VN1R2、VSNL1、及びZFP64(表8、実施例Iを参照のこと)、
・MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、浸潤性乳癌組織と良性の乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・CDH4_E、FLJ42875、GAD2、GRASP、ITPRIPL1、KCNA1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MPZ、NKX2-6、PRKCB、RBFOX3_B、SALL3、及びVSTM2B_A(表2、実施例Iを参照のこと)。
これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別できる以下のマーカー及び/またはマーカーのパネルが同定された:
・SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、ITPRIPL1、ITPRIPL1、DLX4、CALN1_A、及びIGF2BP3_B(表15、実施例Iを参照のこと)、
・SCRT2_B、ITPRIPL1、及びMAX.chr8.124173030-12417339(91%の特異性で100%の感度)(表15、実施例Iを参照のこと)、
・DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、及びITPRIPL1(表17、実施例IIを参照のこと)。
本明細書に記載されるように、技術は、多数のメチル化DNAマーカー及びそのサブセット(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個のマーカーセット)を提供し、乳癌全体及び様々な乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を高度に区別する。実験は、選択フィルターを候補マーカーに適用し、高いシグナル対ノイズ比及び低いバックグラウンドレベルを提供するマーカーを同定し、乳癌スクリーニングまたは診断のために高い特異性を提供した。
いくつかの実施形態では、技術は、生体試料(例えば、乳房組織、血漿試料)中における本明細書で同定されるマーカーのうち1個以上の存在及びメチル化状態を評価することに関する。これらのマーカーは、本明細書に記載されるような、例えば、表2及び表18に提供されるような1箇所以上の可変メチル化領域(DMR)を含む。メチル化状態は、技術の実施形態で評価される。そのようなものとして、本明細書で提供される技術は、遺伝子のメチル化状態が測定される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、メチル化状態は、ゲノムスキャニング法によって測定される。例えば、1つの方法は、制限ランドマークゲノムスキャニング(Kawai et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:7421-7427)を含み、別の例は、メチル化感受性任意プライムPCR(Gonzalgo et al.(1997)Cancer Res.57:594-599)を含む。いくつかの実施形態では、特定のCpG部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性制限酵素によるゲノムDNAの消化に続いて目的領域のサザン分析(消化-サザン法)によってモニターされる。いくつかの実施形態では、メチル化パターンの変化を分析することは、PCR増幅前にメチル化感受性制限酵素またはメチル化依存性制限酵素によるゲノムDNAの消化を含むPCRに基づくプロセスを含む(Singer-Sam et al.(1990)Nucl.Acids Res.18:687)。加えて、メチル化分析の出発点としてDNAの亜硫酸水素塩処理を利用する他の技術が報告されている。これらとしては、メチル化特異的PCR(MSP)(Herman et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826)ならびに亜硫酸水素塩変換DNAから増幅されたPCR産物の制限酵素消化(Sadri and Hornsby(1996)Nucl.Acids Res.24:5058-5059、及びXiong and Laird(1997)Nucl.Acids Res.25:2532-2534)が挙げられる。PCR技術は、遺伝子変異の検出(Kuppuswamy et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143-1147)ならびにアレル特異的発現の定量化(Szabo and Mann(1995)Genes Dev.9:3097-3108、及びSinger-Sam et al.(1992)PCR Methods Appl.1:160-163)について開発されている。そのような技術は内部プライマーを使用し、PCR生成鋳型にアニーリングして、アッセイされる単一ヌクレオチドの5’で直ちに終結する。米国特許第7,037,650号に記載されるような「定量的Ms-SNuPEアッセイ」を使用する方法が、いくつかの実施形態で使用される。
メチル化状態を評価する場合、メチル化状態は、特定の部位を含む試料中のDNA母集団と比較して、その特定の部位において(例えば、単一ヌクレオチドにおいて、特定の領域または遺伝子座において、目的のより長い配列において、例えば、DNAの最大約100bp、200bp、500bp、1000bp配列またはそれらを超えて)メチル化される個々のDNA鎖の割合またはパーセンテージとして多くの場合に表される。従来より、非メチル化核酸の量は、較正物質を使用するPCRによって決定される。次いで、既知のDNA量が亜硫酸水素塩処理され、得られたメチル化特異的配列は、リアルタイムPCRまたは他の指数関数的増幅、例えば、QuARTSアッセイ(例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第8,361,720号、ならびに米国特許出願公開第2012/0122088号及び同第2012/0122106号によって提供されるような)のいずれかを使用して決定される。
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、外部標準物質を使用することによって非メチル化標的の検量線を生成することを含む。検量線は、少なくとも2点から構成され、既知の定量的標準物質に対する非メチル化DNAについてのリアルタイムCt値に関する。次いで、メチル化標的についての第2検量線は、少なくとも2点及び外部標準物質から構成される。この第2検量線は、既知の定量的標準物質に対するメチル化DNAについてのCt値に関する。次に、試験試料Ct値が、メチル化集団及び非メチル化集団について決定され、DNAのゲノム当量が、最初の2ステップによって生成された検量線から算出される。目的部位におけるメチル化のパーセンテージは、集団中におけるDNAの総量と比較したメチル化DNA量、例えば、(メチル化DNA数)/(メチル化DNA数+非メチル化DNA数)×100から算出される。
また本明細書で提供されるのは、方法を実施するための組成物及びキットである。例えば、いくつかの実施形態では、1個以上のマーカーに特異的な試薬(例えば、プライマー、プローブ)は、単独で、またはセット(例えば、複数のマーカーを増幅するためのプライマー対のセット)で提供される。検出アッセイを実施するための追加の試薬(例えば、QuARTS、PCR、シーケンシング、亜硫酸水素塩、または他のアッセイを実施するための酵素、緩衝液、陽性及び陰性対照)もまた提供されてよい。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)を含有する。いくつかの実施形態では、方法を実施するのに必要な、十分な、または有用な1つ以上の試薬を含有するキットが提供される。さらに提供されるのは、試薬を含有する反応混合物である。さらに提供されるのは、互いに、及び/または試験試料に添加され、反応混合物を完成させる場合がある複数の試薬を含有するマスターミックス試薬セットである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載される方法によって提供されるような一連の算術演算または論理演算を実施するように設計されたプログラム可能な機械と関連する。例えば、技術のいくつかの実施形態は、コンピュータソフトウェア及び/またはコンピュータハードウェアと関連する(例えば、これらで実行される)。一態様では、技術は、メモリの形態、算術演算及び論理演算を実施するための要素、ならびにデータを読み取り、操作し、保存するための一連の指示(例えば、本明細書で提供されるような方法)を実行するための処理要素(例えば、マイクロプロセッサ)を含むコンピュータに関する。いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサは、メチル化状態(例えば、1箇所以上のDMR、例えば、表2及び表18に提供されるようなDMR1~375の)を決定する、メチル化状態(例えば、1箇所以上のDMR、例えば、表2及び表18に提供されるようなDMR1~375の)を比較する、検量線を生成する、Ct値を決定する、メチル化の(例えば、1箇所以上のDMR、例えば、表2及び表18に提供されるようなDMR1~375の)割合、頻度、またはパーセンテージを算出する、CpGアイランドを同定する、アッセイまたはマーカーの特異性及び/または感度を決定する、ROC曲線及び関連AUCを算出する、配列分析、本明細書に記載されるような、または当該技術分野において既知の全てを目的としたシステムの部分である。
いくつかの実施形態では、マイクロプロセッサまたはコンピュータは、がんの部位を予測するためのアルゴリズムにおいてメチル化状態データを使用する。
いくつかの実施形態では、ソフトウェアまたはハードウェアコンポーネントは、複数のアッセイ結果を受けて、単一値の結果を決定し、複数のアッセイ(例えば、表2及び表18に提供されるような、例えば、複数のDMRのメチル化状態を決定する)の結果に基づいてがんリスクを示すユーザに報告する。関連実施形態は、例えば、複数のマーカー(例えば、表2及び表18に提供されるような、複数のDMRなど)のメチル化状態を決定する、複数のアッセイ結果の数学的組合せ(例えば、重み付け組合せ、線形組合せ)に基づいてリスク因子を算出する。いくつかの実施形態では、DMRのメチル化状態は次元を規定し、多次元空間における値を有する可能性があり、複数のDMRのメチル化状態によって規定される座標は、例えば、ユーザに報告するための、例えば、がんリスクに関連する結果である。
いくつかの実施形態は、記憶媒体及びメモリコンポーネントを含む。メモリコンポーネント(例えば、揮発性及び/または不揮発性メモリ)は、指示(例えば、本明細書で提供されるようなプロセスの実施形態)及び/またはデータ(例えば、メチル化測定値、配列、及びそれらと関連する統計的記述などのワークピース)の保存に用途を見出す。いくつかの実施形態はまた、CPU、グラフィックスカード、及びユーザインターフェース(例えば、ディスプレイなどの出力デバイス及びキーボードなどの入力デバイスを含む)のうち1つ以上を含むシステムにも関する。
技術と関連するプログラム可能な機械は、従来の現存する技術及び開発中またはまだ開発されていない技術(例えば、量子コンピュータ、化学コンピュータ、DNAコンピュータ、光コンピュータ、スピントロニクスに基づくコンピュータなど)を含む。
いくつかの実施形態では、技術は、データを送信するための有線(例えば、金属ケーブル、光ファイバー)または無線伝送媒体を含む。例えば、いくつかの実施形態は、ネットワーク(例えば、ローカルエリアネットワーク(LAN)、ワイドエリアネットワーク(WAN)、アドホックネットワーク、インターネットなど)経由のデータ伝送に関する。いくつかの実施形態では、プログラム可能な機械はピアのようなネットワーク上に存在し、いくつかの実施形態では、プログラム可能な機械はクライアント/サーバ関係を有する。
いくつかの実施形態では、データは、コンピュータ可読記憶媒体、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリ、光媒体、フロッピーディスクなどに保存される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される技術は、協働して動作し、本明細書に記載されるような方法を実施する複数のプログラム可能なデバイスと関連する。例えば、いくつかの実施形態では、複数のコンピュータ(例えば、ネットワークによって接続される)が、例えば、イーサネット、光ファイバーなどの従来のネットワークインターフェースによって、または無線ネットワーク技術によってネットワーク(プライベート、パブリック、またはインターネット)に接続される完全コンピュータ(オンボードCPU、記憶装置、電源、ネットワークインターフェースなどを備える)に依存するクラスタコンピューティングまたはグリッドコンピューティングまたはある他の分散コンピュータアーキテクチャの実装において、並行で動作し、データを収集して処理する場合がある。
例えば、いくつかの実施形態は、コンピュータ可読媒体を含むコンピュータを提供する。実施形態は、プロセッサに連結されるランダムアクセスメモリ(RAM)を含む。プロセッサは、メモリに保存されているコンピュータ実行可能プログラム指示を実行する。そのようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、ASIC、状態機械、または他のプロセッサを含む場合があり、多数のコンピュータプロセッサ、例えば、Santa Clara,CaliforniaのIntel Corporation及びSchaumburg,IllinoisのMotorola Corporation製のプロセッサなどのいずれかであり得る。そのようなプロセッサは、媒体、例えば、コンピュータ可読媒体を含むか、または媒体と連通する場合があり、この媒体は、プロセッサによって実行される場合、プロセッサに本明細書に記載されるステップを実行させる指示を保存する。
コンピュータ可読媒体の実施形態としては、コンピュータ可読指示を含むプロセッサを提供できる電子、光、磁気、または他の記憶デバイスまたは伝送デバイスが挙げられるが、これらに限定されない。好適な媒体の他の例としては、コンピュータプロセッサが指示を読み取ることができるフロッピーディスク、CD-ROM、DVD、磁気ディスク、メモリチップ、ROM、RAM、ASIC、設定プロセッサ、全ての光媒体、全ての磁気テープもしくは他の磁気媒体、またはいずれかの他の媒体を含むが、これらに限定されない。また、コンピュータ可読媒体の様々な他の形態は、コンピュータに指示を伝送する、または運ぶ場合があり、有線及び無線の両方のルーター、プライベートもしくはパブリックネットワーク、または他の伝送デバイスもしくはチャネルを含む。指示は、例えば、C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、及びJavaScriptを含む、任意の好適なコンピュータプログラミング言語からのコードを含む場合がある。
コンピュータは、いくつかの実施形態ではネットワークに接続されている。コンピュータはまた、多数の外部または内部デバイス、例えば、マウス、CD-ROM、DVD、キーボード、ディスプレイ、または他の入力もしくは出力デバイスなども含む場合がある。コンピュータの例は、パーソナルコンピュータ、デジタルアシスタント、パーソナルデジタルアシスタント、携帯電話(cellular phone)、携帯電話(mobile phone)、スマートフォン、ポケットベル、デジタルタブレット、ラップトップコンピュータ、インターネットアプライアンス、及び他のプロセッサに基づくデバイスである。概して、本明細書で提供される技術の態様に関連するコンピュータは、本明細書で提供される技術を含む1つ以上のプログラムをサポートできる任意のオペレーティングシステム、例えば、Microsoft Windows、Linux、UNIX、Mac OS Xなどで動作する、いずれかの種類のプロセッサに基づくプラットフォームであってよい。いくつかの実施形態は、他のアプリケーションプログラム(例えば、アプリケーション)を実行するパーソナルコンピュータを含む。アプリケーションはメモリに格納され得、これらとしては、例えば、ワードプロセッシングアプリケーション、表計算アプリケーション、電子メールアプリケーション、インスタントメッセンジャーアプリケーション、プレゼンテーションアプリケーション、インターネットブラウザアプリケーション、カレンダー/オーガナイザーアプリケーション、及びクライアントデバイスによって実行可能な任意の他のアプリケーションが挙げられ得る。
技術と関連するような本明細書に記載されるそのようなコンポーネント、コンピュータ、及びシステムの全ては、論理的または仮想であってよい。
したがって、本明細書で提供されるのは、対象から得られた試料中における乳癌及び/または様々な乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)についてスクリーニングする方法に関する技術であり、本方法は、対象から得られた試料(例えば、乳房組織)(例えば、血漿試料)中におけるマーカーのメチル化状態をアッセイし、マーカーのメチル化状態が乳癌を有しない対象でアッセイされたマーカーのメチル化状態と異なる場合に乳癌及び/または特定の乳癌型を有すると対象を同定し、マーカーは、表2及び表18に提供されるような可変メチル化領域(DMR)1~375からなる群から選択されるDMR中に塩基を含むことを含む。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象が乳癌を有することを示す:ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1(表16E、実施例IIを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象が乳癌を有することを示す:ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B(表22、実施例IIIを参照のこと)。
対象から得られた試料が血液試料(例えば、血漿、血清、全血)であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象が乳癌を有することを示す:CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B(表27、実施例IIIを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がトリプルネガティブ乳癌を有することを示す:ABLIM1、AJAP1_B、ASCL2、ATP6V1B1、BANK1、CALN1_A、CALN1_B、CLIC6、DSCR6、FOXP4、GAD2、GCGR、GP5、GRASP、HBM、HNF1B_B、KLF16、MAGI2、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8859253-8859329、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr6.157557371-157557657、MPZ、NKX2-6、PDX1、PLXNC1_A、PPARG、PRKCB、PTPRN2、RBFOX_A、SCRT2_A、SLC7A4、STAC2_B、STX16_A、STX16_B、TBX1、TRH_A、VSTM2B_A、ZBTB16、ZNF132、及びZSCAN23(表3、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がトリプルネガティブ乳癌を有することを示す:CALN1_A、LOC100132891、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、DLX4、GP5、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、KCNK9、SCRT2_B、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がトリプルネガティブ乳癌を有することを示す:ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4(表16A、実施例IIを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がHER2+乳癌を有することを示す:ABLIM1、AFAP1L1、AKR1B1、ALOX5、AMN、ARL5C、BANK1、BCAT1、BEGAIN、BEST4、BHLHE23_B、BHLHE23_C、C17orf64、C1QL2、C7orf52、CALN1_B、CAV2、CD8A、CDH4_A、CDH4_B、CDH4_C、CDH4_D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_B、CLIP4、CR1、DLK1、DNAJC6、DNM3_A、EMX1_A、ESPN、FABP5、FAM150A、FLJ42875、GLP1R、GNG4、GYPC_A、HAND2、HES5、HNF1B_A、HNF1B_B、HOXA1_A、HOXA1_B、HOXA7_A、HOXA7_B、HOXA7_C、HOXD9、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、IGSF9B_A、IL15RA、INSM1、ITPKA_B、ITPRIPL1、KCNE3、KCNK17_B、LIME1、LOC100132891、LOC283999、LY6H、MAST1、MAX.chr1.158083198-158083476、MAX.chr1.228074764-228074977、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr10.130085265-130085312、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr14.101176106-101176260、MAX.chr15.96889069-96889128、MAX.chr17.8230197-8230314、MAX.chr19.46379903-46380197、MAX.chr2.97193163-97193287、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr21.44782441-44782498、MAX.chr22.23908718-23908782、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.180101084-180101094、MAX.chr5.42952185-42952280、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr6.27064703-27064783、MAX.chr7.152622607-152622638、MAX.chr8.145104132-145104218、MAX.chr9.136474504-136474527、MCF2L2、MSX2P1、NACAD、NID2_B、NID2_C、ODC1、OSR2_B、PAQR6、PCDH8、PIF1、PPARA、PPP2R5C、PRDM13_A、PRHOXNB、PRKCB、RBFOX3_A、RBFOX3_B、RFX8、SNCA、STAC2_A、STAC2_B、STX16_B SYT5、TIMP2、TMEFF2、TNFRSF10D、TRH_B、TRIM67、TRIM71_C、USP44_A、USP44_B、UTF1、UTS2R、VSTM2B_A、VSTM2B_B、ZFP64、及びZNF132(表4、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がHER2+乳癌を有することを示す:BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、CHST2_A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、C17orf64、CHST2_B、DLX4、DNM3_A、EMX1_A、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、LAYN、PLXNC1_A、RIC3、SCRT2_B、ALOX5、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、AJAP1_B、DSCR6、及びMAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がHER2+乳癌を有することを示す:ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、C10orf125(表16B、実施例IIを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がルミナルA乳癌を有することを示す:ARL5C、BHLHE23_C、BMP6、C10orf125、C17orf64、C19orf66、CAMKV、CD1D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_A、CRHBP、DLX6、DNM3_A、DNM3_B、DNM3_C、ESYT3、ETS1_A、ETS1_B、FAM126A、FAM189A1、FAM20A、FAM59B、FBN1、FLRT2、FMN2、FOXP4、GAS7、GYPC_A、GYPC_B、HAND2、HES5、HMGA2、HNF1B_B、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、KCNH8、KCNK17_A、KCNQ2、KLHDC7B、LOC100132891、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990591-59990895、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr20.1783841-1784054、MAX.chr21.47063802-47063851、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.172234248-172234494、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr6.130686865-130686985、MAX.chr8.687688-687736、MAX.chr8.688863-688924、MAX.chr9.114010-114207、MPZ、NID2_A、NKX2-6、ODC1、OSR2_A、POU4F1、PRDM13_B、PRKCB、RASGRF2、RIPPLY2、SLC30A10、ST8SIA4、SYN2、TRIM71_A、TRIM71_B、TRIM71_C、UBTF、ULBP1、USP44_B、及びVSTM2B_A(表5、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がルミナルA乳癌を有することを示す:BHLHE23_C、CD1D、CHST2_A、FAM126A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、SLC30A10、TRIM67、ATP6V1B1、BANK1、C10orf125、C17orf64、CHST2_B、DNM3_A、EMX1_A、GP5、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990671-59990859、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、OTX1、PLXNC1_A、HNF1B_B、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、DSCR6、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がルミナルA乳癌を有することを示す:ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125(表16C、実施例IIを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がルミナルB乳癌を有することを示す:ACCN1、AJAP1_A、AJAP1_B、BEST4、CALN1_B、CBLN1_B、CDH4_E、DLX4、FOXP4、IGSF9B_B、ITPRIPL1、KCNA1、KLF16、LMX1B_A、MAST1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr8.124173128-124173268、MPZ、PPARA、PRMT1、RBFOX3_B、RYR2_A、SALL3、SCRT2_A、SPHK2、STX16_B SYNJ2、TMEM176A、TSHZ3、及びVIPR2(表6、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がルミナルB乳癌を有することを示す:CALN1_A、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、DLX4、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、BHLHE23_D、HNF1B_B、TRH_A、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、AJAP1_B、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がルミナルB乳癌を有することを示す:ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D(表16D、実施例IIを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がBRCA1乳癌を有することを示す:C10orf93、C20orf195_A、C20orf195_B、CALN1_B、CBLN1_A、CBLN1_B、CCDC61、CCND2_A、CCND2_B、CCND2_C、EMX1_B、FAM150B、GRASP、HBM、ITPRIPL1、KCNK17_A、KIAA1949、LOC100131176、MAST1、MAX.chr1.8277285-8277316、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr18.5629721-5629791、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679767-42679917、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr6.157556793-157556856、MAX.chr8.124173030-124173395、MN1、MPZ、NR2F6、PDXK_A、PDXK_B、PTPRM、RYR2_B、SERPINB9_A、SERPINB9_B、SLC8A3、STX16_B TEPP、TOX、VIPR2、VSTM2B_A、ZNF486、ZNF626、及びZNF671(表7、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がBRCA1乳癌を有することを示す:BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がBRCA2乳癌を有することを示す:ANTXR2、B3GNT5、BHLHE23_C、BMP4、CHRNA7、EPHA4、FAM171A1、FAM20A、FMNL2、FSCN1、GSTP1、HBM、IGFBP5、IL17REL、ITGA9、ITPRIPL1、KIRREL2、LRRC34、MAX.chr1.239549742-239549886、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr2.238864674-238864735、MAX.chr5.81148300-81148332、MAX.chr7.151145632-151145743、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr8.143533298-143533558、MERTK、MPZ、NID2_C、NTRK3、OLIG3_A、OLIG3_B、OSR2_C、PROM1、RGS17、SBNO2、STX16_B TBKBP1、TLX1NB、VIPR2、VN1R2、VSNL1、及びZFP64(表8、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象がBRCA2乳癌を有することを示す:MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、対象が浸潤性乳癌を有することを示す:CDH4_E、FLJ42875、GAD2、GRASP、ITPRIPL1、KCNA1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MPZ、NKX2-6、PRKCB、RBFOX3_B、SALL3、及びVSTM2B_A(表9、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別する:SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、ITPRIPL1、ITPRIPL1、DLX4、CALN1_A、及びIGF2BP3_B(表15、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別する:SCRT2_B、ITPRIPL1、及びMAX.chr8.124173030-12417339(91%の特異性で100%の感度)(表15、実施例Iを参照のこと)。
対象から得られた試料が乳房組織であり、以下のマーカーのうち1個以上のメチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされた1個以上のマーカーのメチル化状態と異なる場合のいくつかの実施形態では、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別する:DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、及びITPRIPL1(表17、実施例IIを参照のこと)。
技術は、乳癌及び/または様々な乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を同定し、区別することに関する。いくつかの実施形態は、複数のマーカーをアッセイすることを含む方法、例えば、2個~11個~100個または120個または375個のマーカーをアッセイすることを含む方法を提供する。
技術は、評価されるメチル化状態に限定されない。いくつかの実施形態では、試料中におけるマーカーのメチル化状態を評価することは、1塩基のメチル化状態を決定することを含む。いくつかの実施形態では、試料中におけるマーカーのメチル化状態をアッセイすることは、複数の塩基でメチル化の程度を決定することを含む。さらに、いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較してマーカーのメチル化増加を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較してマーカーのメチル化低下を含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態と比較してマーカーのメチル化の異なるパターンを含む。
さらに、いくつかの実施形態では、マーカーは、100以下の塩基の領域である、マーカーは、500以下の塩基の領域である、マーカーは、1000以下の塩基の領域である、マーカーは、5000以下の塩基の領域である、またはいくつかの実施形態では、マーカーは1塩基である。いくつかの実施形態では、マーカーは、高CpG密度プロモーター中に存在する。
技術は、試料の種類によって限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料(例えば、乳房組織試料)、血液試料(例えば、血漿、血清、全血)、排泄物、または尿試料である。
さらに、技術は、メチル化状態を決定するために使用される方法に限定されない。いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、または標的捕捉を使用することを含む。いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、技術は、超並列シーケンシング(例えば、次世代シーケンシング)、例えば、合成によるシーケンシング(sequencing-by-synthesis)、リアルタイム(例えば、単一分子)シーケンシング、ビーズエマルジョンシーケンシング、ナノポアシーケンシングなどを使用して、メチル化状態を決定する。
技術は、DMRを検出するための試薬を提供し、例えば、いくつかの実施形態では、配列番号:1~422によって提供される配列(表10、表19及び表20を参照のこと)を含むオリゴヌクレオチドのセットが提供される。いくつかの実施形態では、DMR中に塩基を有する染色体領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、DMRのメチル化状態に対する感度が高いオリゴヌクレオチドが提供される。
技術は、乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1(表16E、実施例IIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B(表22、実施例IIIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B(表27、実施例IIIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、トリプルネガティブ乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ABLIM1、AJAP1_B、ASCL2、ATP6V1B1、BANK1、CALN1_A、CALN1_B、CLIC6、DSCR6、FOXP4、GAD2、GCGR、GP5、GRASP、HBM、HNF1B_B、KLF16、MAGI2、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8859253-8859329、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr6.157557371-157557657、MPZ、NKX2-6、PDX1、PLXNC1_A、PPARG、PRKCB、PTPRN2、RBFOX_A、SCRT2_A、SLC7A4、STAC2_B、STX16_A、STX16_B、TBX1、TRH_A、VSTM2B_A、ZBTB16、ZNF132、及びZSCAN23(表3、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、トリプルネガティブ乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、CALN1_A、LOC100132891、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、DLX4、GP5、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、KCNK9、SCRT2_B、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、トリプルネガティブ乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4(表16A、実施例IIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、HER2+乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ABLIM1、AFAP1L1、AKR1B1、ALOX5、AMN、ARL5C、BANK1、BCAT1、BEGAIN、BEST4、BHLHE23_B、BHLHE23_C、C17orf64、C1QL2、C7orf52、CALN1_B、CAV2、CD8A、CDH4_A、CDH4_B、CDH4_C、CDH4_D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_B、CLIP4、CR1、DLK1、DNAJC6、DNM3_A、EMX1_A、ESPN、FABP5、FAM150A、FLJ42875、GLP1R、GNG4、GYPC_A、HAND2、HES5、HNF1B_A、HNF1B_B、HOXA1_A、HOXA1_B、HOXA7_A、HOXA7_B、HOXA7_C、HOXD9、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、IGSF9B_A、IL15RA、INSM1、ITPKA_B、ITPRIPL1、KCNE3、KCNK17_B、LIME1、LOC100132891、LOC283999、LY6H、MAST1、MAX.chr1.158083198-158083476、MAX.chr1.228074764-228074977、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr10.130085265-130085312、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr14.101176106-101176260、MAX.chr15.96889069-96889128、MAX.chr17.8230197-8230314、MAX.chr19.46379903-46380197、MAX.chr2.97193163-97193287、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr21.44782441-44782498、MAX.chr22.23908718-23908782、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.180101084-180101094、MAX.chr5.42952185-42952280、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr6.27064703-27064783、MAX.chr7.152622607-152622638、MAX.chr8.145104132-145104218、MAX.chr9.136474504-136474527、MCF2L2、MSX2P1、NACAD、NID2_B、NID2_C、ODC1、OSR2_B、PAQR6、PCDH8、PIF1、PPARA、PPP2R5C、PRDM13_A、PRHOXNB、PRKCB、RBFOX3_A、RBFOX3_B、RFX8、SNCA、STAC2_A、STAC2_B、STX16_B SYT5、TIMP2、TMEFF2、TNFRSF10D、TRH_B、TRIM67、TRIM71_C、USP44_A、USP44_B、UTF1、UTS2R、VSTM2B_A、VSTM2B_B、ZFP64、及びZNF132(表4、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、HER2+乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、CHST2_A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、C17orf64、CHST2_B、DLX4、DNM3_A、EMX1_A、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、LAYN、PLXNC1_A、RIC3、SCRT2_B、ALOX5、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、AJAP1_B、DSCR6、及びMAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、HER2+乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、C10orf125(表16B、実施例IIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、ルミナルA乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ARL5C、BHLHE23_C、BMP6、C10orf125、C17orf64、C19orf66、CAMKV、CD1D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_A、CRHBP、DLX6、DNM3_A、DNM3_B、DNM3_C、ESYT3、ETS1_A、ETS1_B、FAM126A、FAM189A1、FAM20A、FAM59B、FBN1、FLRT2、FMN2、FOXP4、GAS7、GYPC_A、GYPC_B、HAND2、HES5、HMGA2、HNF1B_B、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、KCNH8、KCNK17_A、KCNQ2、KLHDC7B、LOC100132891、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990591-59990895、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr20.1783841-1784054、MAX.chr21.47063802-47063851、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.172234248-172234494、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr6.130686865-130686985、MAX.chr8.687688-687736、MAX.chr8.688863-688924、MAX.chr9.114010-114207、MPZ、NID2_A、NKX2-6、ODC1、OSR2_A、POU4F1、PRDM13_B、PRKCB、RASGRF2、RIPPLY2、SLC30A10、ST8SIA4、SYN2、TRIM71_A、TRIM71_B、TRIM71_C、UBTF、ULBP1、USP44_B、及びVSTM2B_A(表5、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、ルミナルA乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、BHLHE23_C、CD1D、CHST2_A、FAM126A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、SLC30A10、TRIM67、ATP6V1B1、BANK1、C10orf125、C17orf64、CHST2_B、DNM3_A、EMX1_A、GP5、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990671-59990859、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、OTX1、PLXNC1_A、HNF1B_B、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、DSCR6、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、ルミナルA乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125(表16C、実施例IIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、ルミナルB乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ACCN1、AJAP1_A、AJAP1_B、BEST4、CALN1_B、CBLN1_B、CDH4_E、DLX4、FOXP4、IGSF9B_B、ITPRIPL1、KCNA1、KLF16、LMX1B_A、MAST1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr8.124173128-124173268、MPZ、PPARA、PRMT1、RBFOX3_B、RYR2_A、SALL3、SCRT2_A、SPHK2、STX16_B SYNJ2、TMEM176A、TSHZ3、及びVIPR2(表6、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、ルミナルB乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、CALN1_A、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、DLX4、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、BHLHE23_D、HNF1B_B、TRH_A、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、AJAP1_B、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、ルミナルB乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D(表16D、実施例IIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、BRCA1乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、C10orf93、C20orf195_A、C20orf195_B、CALN1_B、CBLN1_A、CBLN1_B、CCDC61、CCND2_A、CCND2_B、CCND2_C、EMX1_B、FAM150B、GRASP、HBM、ITPRIPL1、KCNK17_A、KIAA1949、LOC100131176、MAST1、MAX.chr1.8277285-8277316、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr18.5629721-5629791、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679767-42679917、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr6.157556793-157556856、MAX.chr8.124173030-124173395、MN1、MPZ、NR2F6、PDXK_A、PDXK_B、PTPRM、RYR2_B、SERPINB9_A、SERPINB9_B、SLC8A3、STX16_B TEPP、TOX、VIPR2、VSTM2B_A、ZNF486、ZNF626、及びZNF671(表7、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、BRCA1乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、BRCA2乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ANTXR2、B3GNT5、BHLHE23_C、BMP4、CHRNA7、EPHA4、FAM171A1、FAM20A、FMNL2、FSCN1、GSTP1、HBM、IGFBP5、IL17REL、ITGA9、ITPRIPL1、KIRREL2、LRRC34、MAX.chr1.239549742-239549886、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr2.238864674-238864735、MAX.chr5.81148300-81148332、MAX.chr7.151145632-151145743、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr8.143533298-143533558、MERTK、MPZ、NID2_C、NTRK3、OLIG3_A、OLIG3_B、OSR2_C、PROM1、RGS17、SBNO2、STX16_B TBKBP1、TLX1NB、VIPR2、VN1R2、VSNL1、及びZFP64(表8、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、BRCA2乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、浸潤性乳癌を同定するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、CDH4_E、FLJ42875、GAD2、GRASP、ITPRIPL1、KCNA1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MPZ、NKX2-6、PRKCB、RBFOX3_B、SALL3、及びVSTM2B_A(表9、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、ITPRIPL1、ITPRIPL1、DLX4、CALN1_A、及びIGF2BP3_B(表15、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、SCRT2_B、ITPRIPL1、及びMAX.chr8.124173030-12417339(91%の特異性で100%の感度)(表15、実施例Iを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
技術は、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別するために使用される様々なマーカーのパネルを提供し、例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、及びITPRIPL1(表17、実施例IIを参照のこと)であるアノテーションを有する染色体領域を含む。
キットの実施形態が提供され、例えば、キットは、メチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)、ならびにDMR1~375(表2及び表18からの)からなる群から選択されるDMRの配列を含み、かつ乳癌を有しない対象と関連するメチル化状態を有する対照核酸を含む。いくつかの実施形態では、キットは、亜硫酸水素塩試薬及び本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)、ならびにDMR1~375(表2及び表18からの)からなる群から選択されるDMRの配列を含み、かつ乳癌を有する対象と関連するメチル化状態を有する対照核酸を含む。いくつかのキットの実施形態は、対象から試料(例えば、糞便試料、乳房組織試料、血漿試料、血清試料、全血試料)を得るための試料コレクター、メチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)、ならびに本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドを含む。
技術は、組成物(例えば、反応混合物)の実施形態に関する。いくつかの実施形態では、DMRを含む核酸ならびにメチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態は、DMRを含む核酸及び本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、DMRを含む核酸及びメチル化感受性制限酵素を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態は、DMRを含む核酸及びポリメラーゼを含む組成物を提供する。
追加の関連方法の実施形態は、対象から得られた試料(例えば、乳房組織試料、血漿試料、糞便試料)中における乳癌及び/または様々な乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)についてスクリーニングするために提供され、例えば、本方法は、DMR1~375(表2及び表18からの)のうち1箇所以上であるDMR中に塩基を含む試料中においてマーカーのメチル化状態を決定すること、対象試料のマーカーのメチル化状態を、乳癌(例えば、乳癌及び/または乳癌型:トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を有しない対象からの、正常対照試料のマーカーのメチル化状態と比較すること、ならびに対象試料及び正常対照試料のメチル化状態における差の信頼区間及び/またはp値を決定することを含む。いくつかの実施形態では、信頼区間は、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%または99.99%であり、p値は、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、または0.0001である。方法のいくつかの実施形態は、DMRを含む核酸を、メチル化特異的手法で核酸を修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)と反応させて、例えば、メチル化特異的手法で修飾された核酸を生成するステップ、メチル化特異的手法で修飾された核酸をシーケンシングし、メチル化特異的手法で修飾された核酸のヌクレオチド配列を提供するステップ、メチル化特異的手法で修飾された核酸のヌクレオチド配列を、乳癌及び/または乳癌型を有しない対象からのDMRを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、2つの配列間の差を同定するステップ、ならびに差が存在する場合、対象が乳癌(例えば、乳癌及び/または乳癌型:トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を有すると同定するステップを提供する。
対象から得られた試料中の乳癌についてスクリーニングするためのシステムが、技術によって提供される。システムの例示的な実施形態は、例えば、対象から得られた試料(例えば、乳房組織試料、血漿試料、糞便試料)中における乳癌及び/または乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)についてスクリーニングするためのシステムを含み、本システムは、試料のメチル化状態を決定するように構成されている分析コンポーネント、試料のメチル化状態を、データベースに記録されている対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、及び乳癌関連メチル化状態をユーザに警告するように構成されている警告コンポーネントを含む。警告は、いくつかの実施形態では、複数のアッセイ(例えば、複数のマーカー、例えば、表2及び表18に提供されるような、例えば、DMRのメチル化状態を決定する)からの結果を受けて、値または結果を算出し、複数の結果に基づいて報告するソフトウェアコンポーネントによって決定される。いくつかの実施形態は、値もしくは結果の算出及び/またはユーザ(例えば、医師、看護師、臨床医など)に報告する警告に使用するための、本明細書で提供される各DMRと関連する重み付けパラメータのデータベースを提供する。いくつかの実施形態では、複数のアッセイからの結果全てが報告され、いくつかの実施形態では、1つ以上の結果が、対象中のがんリスクを示す複数のアッセイに由来する1つ以上の結果を複合したものに基づいてスコア、値、または結果を提供するために使用される。
システムのいくつかの実施形態では、試料は、DMRを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、システムは、核酸を単離するためのコンポーネント、試料を収集するためのコンポーネント、例えば、糞便試料を収集するためのコンポーネントなどをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、DMRを含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、乳癌及び/または特定の乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を有しない対象からの核酸配列を含む。さらに提供されるのは、核酸、例えば、核酸のセットであり、各核酸がDMRを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸のセットは、各核酸が乳癌及び/または特定の乳癌型を有しない対象からの配列を有する。関連システムの実施形態は、記載されるような核酸のセット及び核酸のセットと関連する核酸配列のデータベースを含む。いくつかの実施形態は、メチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)をさらに含む。また、いくつかの実施形態は、核酸シーケンサーをさらに含む。
ある特定の実施形態では、ヒト患者からの試料(例えば、乳房組織試料、血漿試料、全血試料、血清試料、糞便試料)を特徴付ける方法が、提供される。例えば、いくつかの実施形態では、そのような実施形態は、DNAをヒト患者の試料から得ること、表2及び表18からの可変メチル化領域(DMR)1~375からなる群から選択されるDMR中に塩基を含むDNAメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすること、ならびに1個以上のDNAメチル化マーカーのアッセイされたメチル化状態を、乳癌及び/または特定の乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を有しないヒト患者に関する1個以上のDNAメチル化マーカーのメチル化レベル基準と比較することを含む。
そのような方法は、ヒト患者に由来する特定の種類の試料に限定されない。いくつかの実施形態では、試料は、乳房組織試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料、乳房組織試料、血液試料(例えば、血漿試料、全血試料、血清試料)、または尿試料である。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、複数のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、2~11個のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、12~120個のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、2~375個のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、試料中における1個以上のDNAメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすることを含み、1塩基のメチル化状態を決定することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、試料中における1個以上のDNAメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすることを含み、複数の塩基でメチル化の程度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、フォワード鎖のメチル化状態をアッセイすること、またはリバース鎖のメチル化状態をアッセイすることを含む。
いくつかの実施形態では、DNAメチル化マーカーは、100以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、DNAメチル化マーカーは、500以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、DNAメチル化マーカーは、1000以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、DNAメチル化マーカーは、5000以下の塩基の領域である。いくつかの実施形態では、DNAメチル化マーカーは、1塩基である。いくつかの実施形態では、DNAメチル化マーカーは、高CpG密度プロモーター中に存在する。
いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、または標的捕捉を使用することを含む。
いくつかの実施形態では、アッセイすることは、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、メチル化特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号:1~422(表10、表19及び表20)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1(表16E、実施例IIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B(表22、実施例IIIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B(表27、実施例IIIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ABLIM1、AJAP1_B、ASCL2、ATP6V1B1、BANK1、CALN1_A、CALN1_B、CLIC6、DSCR6、FOXP4、GAD2、GCGR、GP5、GRASP、HBM、HNF1B_B、KLF16、MAGI2、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8859253-8859329、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr6.157557371-157557657、MPZ、NKX2-6、PDX1、PLXNC1_A、PPARG、PRKCB、PTPRN2、RBFOX_A、SCRT2_A、SLC7A4、STAC2_B、STX16_A、STX16_B、TBX1、TRH_A、VSTM2B_A、ZBTB16、ZNF132、及びZSCAN23(表3、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、CALN1_A、LOC100132891、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、DLX4、GP5、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、KCNK9、SCRT2_B、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4(表16A、実施例IIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ABLIM1、AFAP1L1、AKR1B1、ALOX5、AMN、ARL5C、BANK1、BCAT1、BEGAIN、BEST4、BHLHE23_B、BHLHE23_C、C17orf64、C1QL2、C7orf52、CALN1_B、CAV2、CD8A、CDH4_A、CDH4_B、CDH4_C、CDH4_D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_B、CLIP4、CR1、DLK1、DNAJC6、DNM3_A、EMX1_A、ESPN、FABP5、FAM150A、FLJ42875、GLP1R、GNG4、GYPC_A、HAND2、HES5、HNF1B_A、HNF1B_B、HOXA1_A、HOXA1_B、HOXA7_A、HOXA7_B、HOXA7_C、HOXD9、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、IGSF9B_A、IL15RA、INSM1、ITPKA_B、ITPRIPL1、KCNE3、KCNK17_B、LIME1、LOC100132891、LOC283999、LY6H、MAST1、MAX.chr1.158083198-158083476、MAX.chr1.228074764-228074977、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr10.130085265-130085312、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr14.101176106-101176260、MAX.chr15.96889069-96889128、MAX.chr17.8230197-8230314、MAX.chr19.46379903-46380197、MAX.chr2.97193163-97193287、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr21.44782441-44782498、MAX.chr22.23908718-23908782、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.180101084-180101094、MAX.chr5.42952185-42952280、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr6.27064703-27064783、MAX.chr7.152622607-152622638、MAX.chr8.145104132-145104218、MAX.chr9.136474504-136474527、MCF2L2、MSX2P1、NACAD、NID2_B、NID2_C、ODC1、OSR2_B、PAQR6、PCDH8、PIF1、PPARA、PPP2R5C、PRDM13_A、PRHOXNB、PRKCB、RBFOX3_A、RBFOX3_B、RFX8、SNCA、STAC2_A、STAC2_B、STX16_B SYT5、TIMP2、TMEFF2、TNFRSF10D、TRH_B、TRIM67、TRIM71_C、USP44_A、USP44_B、UTF1、UTS2R、VSTM2B_A、VSTM2B_B、ZFP64、及びZNF132(表4、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、CHST2_A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、C17orf64、CHST2_B、DLX4、DNM3_A、EMX1_A、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、LAYN、PLXNC1_A、RIC3、SCRT2_B、ALOX5、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、AJAP1_B、DSCR6、及びMAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、C10orf125(表16B、実施例IIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ARL5C、BHLHE23_C、BMP6、C10orf125、C17orf64、C19orf66、CAMKV、CD1D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_A、CRHBP、DLX6、DNM3_A、DNM3_B、DNM3_C、ESYT3、ETS1_A、ETS1_B、FAM126A、FAM189A1、FAM20A、FAM59B、FBN1、FLRT2、FMN2、FOXP4、GAS7、GYPC_A、GYPC_B、HAND2、HES5、HMGA2、HNF1B_B、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、KCNH8、KCNK17_A、KCNQ2、KLHDC7B、LOC100132891、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990591-59990895、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr20.1783841-1784054、MAX.chr21.47063802-47063851、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.172234248-172234494、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr6.130686865-130686985、MAX.chr8.687688-687736、MAX.chr8.688863-688924、MAX.chr9.114010-114207、MPZ、NID2_A、NKX2-6、ODC1、OSR2_A、POU4F1、PRDM13_B、PRKCB、RASGRF2、RIPPLY2、SLC30A10、ST8SIA4、SYN2、TRIM71_A、TRIM71_B、TRIM71_C、UBTF、ULBP1、USP44_B、及びVSTM2B_A(表5、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、BHLHE23_C、CD1D、CHST2_A、FAM126A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、SLC30A10、TRIM67、ATP6V1B1、BANK1、C10orf125、C17orf64、CHST2_B、DNM3_A、EMX1_A、GP5、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990671-59990859、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、OTX1、PLXNC1_A、HNF1B_B、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、DSCR6、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125(表16C、実施例IIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ACCN1、AJAP1_A、AJAP1_B、BEST4、CALN1_B、CBLN1_B、CDH4_E、DLX4、FOXP4、IGSF9B_B、ITPRIPL1、KCNA1、KLF16、LMX1B_A、MAST1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr8.124173128-124173268、MPZ、PPARA、PRMT1、RBFOX3_B、RYR2_A、SALL3、SCRT2_A、SPHK2、STX16_B SYNJ2、TMEM176A、TSHZ3、及びVIPR2(表6、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、CALN1_A、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、DLX4、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、BHLHE23_D、HNF1B_B、TRH_A、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、AJAP1_B、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D(表16D、実施例IIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、C10orf93、C20orf195_A、C20orf195_B、CALN1_B、CBLN1_A、CBLN1_B、CCDC61、CCND2_A、CCND2_B、CCND2_C、EMX1_B、FAM150B、GRASP、HBM、ITPRIPL1、KCNK17_A、KIAA1949、LOC100131176、MAST1、MAX.chr1.8277285-8277316、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr18.5629721-5629791、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679767-42679917、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr6.157556793-157556856、MAX.chr8.124173030-124173395、MN1、MPZ、NR2F6、PDXK_A、PDXK_B、PTPRM、RYR2_B、SERPINB9_A、SERPINB9_B、SLC8A3、STX16_B TEPP、TOX、VIPR2、VSTM2B_A、ZNF486、ZNF626、及びZNF671(表7、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6(表11、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ANTXR2、B3GNT5、BHLHE23_C、BMP4、CHRNA7、EPHA4、FAM171A1、FAM20A、FMNL2、FSCN1、GSTP1、HBM、IGFBP5、IL17REL、ITGA9、ITPRIPL1、KIRREL2、LRRC34、MAX.chr1.239549742-239549886、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr2.238864674-238864735、MAX.chr5.81148300-81148332、MAX.chr7.151145632-151145743、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr8.143533298-143533558、MERTK、MPZ、NID2_C、NTRK3、OLIG3_A、OLIG3_B、OSR2_C、PROM1、RGS17、SBNO2、STX16_B TBKBP1、TLX1NB、VIPR2、VN1R2、VSNL1、及びZFP64(表8、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968(表11、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、CDH4_E、FLJ42875、GAD2、GRASP、ITPRIPL1、KCNA1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MPZ、NKX2-6、PRKCB、RBFOX3_B、SALL3、及びVSTM2B_A(表9、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、ITPRIPL1、ITPRIPL1、DLX4、CALN1_A、及びIGF2BP3_B(表15、実施例Iを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、及びITPRIPL1(表17、実施例IIを参照のこと)からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、DNAメチル化マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、そのような方法は、2個のDNAメチル化マーカーのメチル化状態を決定することを含む。いくつかの実施形態では、そのような方法は、表2及び/または表18の行に提供されるDNAメチル化マーカー対のメチル化状態を決定することを含む。
ある特定の実施形態では、技術は、ヒト患者から得られた試料(例えば、乳房組織試料、血漿試料、全血試料、血清試料、糞便試料)を特徴付ける方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、表2及び表18からのDMR1~375からなる群から選択されるDMR中に塩基を含む試料中においてDNAメチル化マーカーのメチル化状態を決定すること、患者試料のDNAメチル化マーカーのメチル化状態を、乳癌及び/または特定の乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を有しないヒト対象からの、正常対照試料のDNAメチル化マーカーのメチル化状態と比較すること、ならびにヒト患者及び正常対照試料のメチル化状態における差の信頼区間及び/またはp値を決定することを含む。いくつかの実施形態では、信頼区間は、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%または99.99%であり、p値は、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、または0.0001である。
ある特定の実施形態では、技術は、ヒト対象から得られた試料(例えば、乳房組織試料、血漿試料、全血試料、血清試料、糞便試料)を特徴付ける方法を提供し、本方法は、DMRを含む核酸を、メチル化特異的手法でDNAを修飾できる試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)と反応させて、メチル化特異的手法で修飾された核酸を生成すること、メチル化特異的手法で修飾された核酸をシーケンシングし、メチル化特異的手法で修飾された核酸のヌクレオチド配列を提供すること、メチル化特異的手法で修飾された核酸のヌクレオチド配列を、乳癌を有しない対象からのDMRを含む核酸のヌクレオチド配列と比較して、2つの配列間の差を同定することを含む。
ある特定の実施形態では、技術は、ヒト対象から得られた試料(例えば、乳房組織試料、血漿試料、糞便試料)を特徴付けるためのシステムを提供し、本システムは、試料のメチル化状態を決定するように構成されている分析コンポーネント、試料のメチル化状態を、データベースに記録されている対照試料または参照試料のメチル化状態と比較するように構成されているソフトウェアコンポーネント、及びメチル化状態の組合せに基づいて単一値を決定し、乳癌関連メチル化状態をユーザに警告するように構成されている警告コンポーネントを含む。いくつかの実施形態では、試料は、DMRを含む核酸を含む。
いくつかの実施形態では、そのようなシステムは、核酸を単離するためのコンポーネントをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのようなシステムは、試料を収集するためのコンポーネントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料、乳房組織試料、血液試料(例えば、血漿試料、全血試料、血清試料)、または尿試料である。
いくつかの実施形態では、データベースは、DMRを含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、乳癌を有しない対象からの核酸配列を含む。
さらなる実施形態は、本明細書に含有される教示に基づいて、関連分野の当業者には明らかとなる。
定義
本技術の理解を促進するために、多数の用語及び語句が以下に定義される。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載される。
本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、以下の用語は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、本明細書に明示的に関連する意味を持つ。「一実施形態では」という語句は、本明細書で使用される場合、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。さらに、「別の実施形態では」という語句は、本明細書で使用される場合、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。したがって、以下に記載されるように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせられてよい。
加えて、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、包括的な「または」の操作詞であり、「及び/または」という用語と同義である。「に基づく」という用語は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、排他的なものではなく、記載されていない追加の因子に基づくことを可能にする。加えて、本明細書全体を通して、「a」、「an」、及び「the」の意味は、複数の指示対象を含む。「中に」の意味は、「中に」及び「上に」を含む。
「から本質的になる」という移行句は、本出願の特許請求の範囲に使用される場合、In re Herz,537 F.2d 549,551-52,190 USPQ 461,463(CCPA 1976)で述べられているように、特許請求の範囲を、特定の物質またはステップ及び特許請求された発明の「基本的かつ新規の特徴(複数可)に実質的に影響を及ぼすことのないそれら」に限定する。例えば、列挙された要素「から本質的になる」組成物は、混入物が存在するが、純粋な組成物、すなわち、列挙された成分「からなる」組成物と比較した場合に列挙された組成物の機能を変化させないようなレベルで、列挙されていない混入物を含有する場合がある。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、一般にいずれかのリボ核酸またはデオキシリボ核酸を指し、これは非修飾または修飾DNAまたはRNAであってよい。「核酸」としては、一本鎖及び二本鎖核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、1つ以上の修飾塩基を含有する、上に記載されるようなDNAも含む。したがって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するDNAは、「核酸」である。「核酸」という用語は、それが本明細書で使用される場合、核酸のそのような化学的、酵素的、または代謝的修飾形態に加えて、ウイルス及び細胞、例えば、単純型及び複合型細胞を含むものに特徴的なDNAの化学的形態を包含する。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、2つ以上、好ましくは3つを超える、及び通常10を超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを有する分子を指す。正確なサイズは、多くの因子に依存することになり、それによりオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、逆転写、またはそれらの組合せを含む任意の手法で生成されてよい。DNAの典型的なデオキシリボヌクレオチドは、チミン、アデニン、シトシン、及びグアニンである。RNAの典型的なリボヌクレオチドは、ウラシル、アデニン、シトシン、及びグアニンである。
本明細書で使用される場合、核酸の「遺伝子座」または「領域」という用語は、核酸の小領域、例えば、染色体上の遺伝子、単一ヌクレオチド、CpGアイランドなどを指す。
「相補的な」及び「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連付けられるヌクレオチド(例えば、1つのヌクレオチド)またはポリヌクレオチド(例えば、ヌクレオチドの配列)を指す。例えば、配列5’-A-G-T-3’は、配列3’-T-C-A-5’に相補的である。相補性は「部分的」である可能性があり、その場合、核酸塩基のいくつかのみが塩基対合規則に従って一致する。あるいは、核酸間で「完全な」または「全体的な」相補性が存在してよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度をもたらす。これは、増幅反応において、及び核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
「遺伝子」という用語は、RNAの、またはポリペプチドもしくはその前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNAまたはRNA)配列を指す。機能的ポリペプチドは、ポリペプチドの所望の活性または機能特性(例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など)が保持される限り、全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。「部分」という用語は、遺伝子に関して使用される場合、その遺伝子の断片を指す。断片は、いくつかのヌクレオチドから、遺伝子全体の配列から1つのヌクレオチドを除いたサイズの範囲であってよい。したがって、「遺伝子の少なくとも一部分を含むヌクレオチド」は、遺伝子の断片または遺伝子全体を含んでよい。
「遺伝子」という用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、5’末端及び3’末端の両方でコード領域に隣接して、例えば、いずれかの末端上で約1kbの距離に位置する配列(例えば、コード配列、制御配列、構造配列及び他の配列を含む)を含み、それゆえ遺伝子が全長mRNAの長さに対応する。コード領域の5’側に位置し、かつmRNA上に存在する配列は、5’非翻訳(non-translated)または非翻訳(untranslated)配列と称される。コード領域の3’側または下流に位置し、かつmRNA上に存在する配列は、3’非翻訳(non-translated)または3’非翻訳(untranslated)配列と称される。「遺伝子」という用語は、cDNA及び遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。いくつかの生物(例えば、真核生物)では、遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される、非コード配列によって分断されるコード領域を含有する。イントロンは、核RNA(hnRNA)に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有してよい。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライシング除去」され、それゆえ、イントロンはメッセンジャーRNA(mRNA)転写物中には存在しない。mRNAは、新生ポリペプチド中でアミノ酸の配列または順序を指定するように翻訳中に機能する。
イントロンの含有に加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、RNA転写物上に存在する配列の5’末端及び3’末端の両方に位置する配列を含んでよい。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される(これらのフランキング配列は、mRNA転写物上に存在する非翻訳配列の5’側または3’側に位置する)。5’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するか、またはそれに影響を与える、プロモーター及びエンハンサーなどの調節配列を含有してよい。3’フランキング領域は、転写終結、転写後切断、及びポリアデニル化を指示する配列を含有してよい。
「野生型」という用語は、遺伝子を参照する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。「野生型」という用語は、遺伝子産物を参照する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。「天然に存在する」という用語は、物体に使用される場合、物体が天然に見られ得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離され得、かつ実験室で人の手によって意図的に修飾されていない生物(ウイルスを含む)中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が、天然に存在する。野生型遺伝子は、多くの場合に集団中において最も高い頻度で観察されるその遺伝子またはアレルであり、それゆえ、遺伝子の「正常」または「野生型」形態を任意に指定される。対照的に、「修飾された」または「変異体」という用語は、遺伝子または遺伝子産物を参照する場合、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列及び/または機能特性に修飾(例えば、変化した特徴)を示す遺伝子または遺伝子産物をそれぞれ指す。天然に存在する変異体が単離可能であり、これらは、それらが野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実によって同定されることに留意する。
「アレル」という用語は、遺伝子の多様性を指し、多様性としては、バリアント及び変異体、多型遺伝子座、ならびに一塩基多型遺伝子座、フレームシフト、ならびにスプライス変異が挙げられるが、これらに限定されない。アレルは、集団中に天然に存在する場合があるか、または集団における任意の特定の個体に関する寿命の間に生じる場合がある。
したがって、「バリアント」及び「変異体」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、別の、通常関連するヌクレオチド酸配列とは1つ以上のヌクレオチドで異なる核酸配列を指す。「多様性」は、2つの異なるヌクレオチド配列間の差であり、通常は1つの配列が参照配列である。
「増幅」は、鋳型特異性に関与する核酸複製の特殊な事例である。それは、非特異的鋳型複製(例えば、鋳型依存的であるが、特定の鋳型には依存しない複製)とは対照的である。鋳型特異性は、本明細書では、複製の忠実度(例えば、適切なポリヌクレオチド配列の合成)及びヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド)特異性とは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関して頻繁に記載される。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることが求められるという意味での「標的」である。増幅技術は、主にこの選別のために設計されている。
核酸との関連における「増幅すること」または「増幅」という用語は、通常は少量のポリヌクレオチド(例えば、単一ポリヌクレオチド分子)から開始するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部分に関する複数コピーの生成を指し、増幅産物またはアンプリコンは、一般に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学プロセス及び酵素プロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリガーゼ連鎖反応(LCR、例えば、米国特許第5,494,810号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)中における、標的または鋳型DNA分子の1つまたは少数コピーからの複数のDNAコピーの生成が、増幅の形態である。増幅の追加の種類としては、アレル特異的PCR(例えば、米国特許第5,639,611号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、アセンブリPCR(例えば、米国特許第5,965,408号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、ヘリカーゼ依存性増幅(例えば、米国特許第7,662,594号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、ホットスタートPCR(例えば、米国特許第5,773,258号及び同第5,338,671号を参照し、各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、配列間特異的PCR、逆PCR(例えば、Triglia, et al.(1988)Nucleic Acids Res.,16:8186を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、ライゲーション媒介PCR(例えば、Guilfoyle,R.et al.,Nucleic Acids Research, 25:1854-1858(1997)、米国特許第5,508,169号を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、メチル化特異的PCR(例えば、Herman,et al.,(1996)PNAS 93(13)9821-9826を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、ミニプライマーPCR、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅(例えば、Schouten,et al.,(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、マルチプレックスPCR(例えば、Chamberlain,et al.,(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156、Ballabio,et al.,(1990)Human Genetics 84(6)571-573、Hayden,et al.,(2008)BMC Genetics 9:80を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、ネストPCR、オーバーラップエクステンションPCR(例えば、Higuchi,et al.,(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、リアルタイムPCR(例えば、Higuchi,et al.,(1992)Biotechnology 10:413-417、Higuchi,et al.,(1993)Biotechnology 11:1026-1030を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、逆転写PCR(例えば、Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、固相PCR、熱非対称インターレースPCR、ならびにタッチダウンPCR(例えば、Don,et al.,Nucleic Acids Research(1991)19(14)4008、Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814、Hecker,et al.,(1996)Biotechniques 20(3)478-485を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる)が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド増幅はまた、デジタルPCRを使用して達成され得る(例えば、Kalinina,et al.,Nucleic Acids Research.25;1999-2004,(1997)、Vogelstein and Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96;9236-41,(1999)、国際特許公開第WO05023091A2号、米国特許出願公開第20070202525号を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)という用語は、クローニングまたは精製することなく、ゲノムまたは他のDNAまたはRNAの混合物中における標的配列のセグメント濃度を増加させる方法を記載しているK.B.Mullisの米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、及び同第4,965,188号の方法を指す。標的配列を増幅させるためのこのプロセスは、大過剰の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含有するDNA混合物に導入し、続いてDNAポリメラーゼの存在下で正確な順序の熱サイクルを行うことからなる。2つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれらの個々の鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内のそれらの相補的配列にアニーリングする。アニーリング後、プライマーを、新しい相補鎖の対を形成するようにポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長のステップが何回も反復され(すなわち、変性、アニーリング及び伸長が1回の「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が存在し得る)、高濃度の、所望の標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列に関する増幅セグメントの長さは、互いのプライマーに対する相対位置によって決定され、それゆえ、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスの反復態様のため、本方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)と称される。標的配列の所望の増幅セグメントが、混合物中で優勢配列(濃度に関して)となるため、それらは「PCRで増幅された」と言われ、それらは「PCR産物」または「アンプリコン」である。当業者は、「PCR」という用語が、例えば、リアルタイムPCR、ネストPCR、逆転写PCR(RT-PCR)、単一プライマー及び任意プライムPCRなどを使用する、元より記載されている方法の多くの別形態を包含すると理解することになる。
鋳型特異性は、大半の増幅技術において酵素の選択によって達成される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、核酸の不均一混合物中において核酸の特異的配列のみを処理することになる酵素である。例えば、Q-ベータレプリカーゼの場合、MDV-1 RNAは、レプリカーゼの特異的鋳型である(Kacian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:3038[1972])。他の核酸は、この増幅酵素によって複製されないことになる。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素は、それ自体のプロモーターに対してストリンジェントな特異性を有する(Chamberlin et al,Nature,228:227 [1970])。T4 DNAリガーゼの場合、酵素は、ライゲーション結合においてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの基質と鋳型との間にミスマッチがある場合、2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを結合させることはない(Wu and Wallace(1989)Genomics 4:560)。最後に、耐熱性鋳型依存性DNAポリメラーゼ(例えば、Taq及びPfu DNAポリメラーゼ)は、高温で機能するそれらの能力によって、プライマーが結合することにより定義される配列に高い特異性を示すことが見出され、それゆえ高温によって、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションには有利であるが、非標的配列とはハイブリダイズしない熱力学的条件がもたらされる(H.A.Erlich(ed.),PCR Technology,Stockton Press[1989])。
本明細書で使用される場合、「核酸検出アッセイ」という用語は、目的の核酸のヌクレオチド組成を決定する任意の方法を指す。核酸検出アッセイとしては、DNAシーケンシング法、プローブハイブリダイゼーション法、構造特異的切断アッセイ(例えば、INVADERアッセイ(Hologic,Inc.)、例えば、米国特許第5,846,717号、同第5,985,557号、同第5,994,069号、同第6,001,567号、同第6,090,543号、及び同第6,872,816号、Lyamichev et al.,Nat.Biotech.,17:292(1999)、Hall et al.,PNAS,USA,97:8272(2000)、ならびに米国特許第9,096,893号に記載され、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる)、酵素ミスマッチ切断法(例えば、Variagenics、米国特許第6,110,684号、同第5,958,692号、同第5,851,770号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、上に記載されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、分枝ハイブリダイゼーション法(例えば、Chiron、米国特許第5,849,481号、同第5,710,264号、同第5,124,246号、及び同第5,624,802号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、ローリングサークル複製(例えば、米国特許第6,210,884号、同第6,183,960号及び同第6,235,502号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、NASBA(例えば、米国特許第5,409,818号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、分子ビーコン技術(例えば、米国特許第6,150,097号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、Eセンサー技術(Motorola、米国特許第6,248,229号、同第6,221,583号、同第6,013,170号、及び同第6,063,573号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、サイクリングプローブ技術(例えば、米国特許第5,403,711号、同第5,011,769号、及び同第5,660,988号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、Dade Behringシグナル増幅法(例えば、米国特許第6,121,001号、同第6,110,677号、同第5,914,230号、同第5,882,867号、及び同第5,792,614号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、リガーゼ連鎖反応(例えば、Baranay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))、ならびにサンドイッチハイブリダイゼーション法(例えば、米国特許第5,288,609号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)が挙げられるが、これらに限定されない。
「増幅可能な核酸」という用語は、任意の増幅方法によって増幅される可能性がある核酸を指す。「増幅可能な核酸」が、通常「試料鋳型」を含むことになると考慮される。
「試料鋳型」という用語は、「標的」(以下に定義される)の存在について分析される試料に由来する核酸を指す。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、試料中に存在してよい、またはしなくともよい試料鋳型以外の核酸に関して使用される。バックグラウンド鋳型は、ほとんどの場合に偶発的である。それはキャリーオーバーの結果である可能性があるか、またはそれは、試料から離れて精製されることが求められる核酸混入物の存在による可能性がある。例えば、検出されるもの以外の生物からの核酸が、試験試料中のバックグラウンドとして存在する可能性がある。
「プライマー」という用語は、制限消化物からの、例えば、核酸断片として自然に生じるか、または合成して生成されるかのいずれのオリゴヌクレオチドも指し、これは核酸鋳型鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下(例えば、ヌクレオチド及び誘発剤、例えば、DNAポリメラーゼなどの存在下において、かつ好適な温度及びpHで)に置かれる場合、合成の開始点として機能できる。プライマーは、最大の増幅効率のために好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、最初にその鎖を分離するために処理されてから、伸長産物の調製に使用される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマー供給源、及び方法の使用を含む、多くの因子に依存することになる。
「プローブ」という用語は、精製した制限消化物と同様に自然に生じるか、または合成して、組換えて、もしくはPCR増幅によって生成されるかのいずれのオリゴヌクレオチド(例えば、ヌクレオチドの配列)も指し、これは目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる。プローブは、一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離に有用である(例えば、「捕捉プローブ」)。本発明で使用されるいずれのプローブも、いくつかの実施形態では、任意の「レポーター分子」で標識されてよく、その結果、任意の検出システム、例えば、酵素(例えば、ELISAに加えて、酵素に基づく組織化学アッセイ)、蛍光、放射、及び発光システムを含むが、これらに限定されないシステムで検出可能であると考慮される。本発明が、いずれかの特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
「標的」という用語は、本明細書で使用される場合、他の核酸から、例えば、プローブ結合、増幅、単離、捕捉などによって選別されることが求められる核酸を指す。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される場合、「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーによって結合された核酸の領域を指す一方で、標的DNAが増幅されないアッセイに使用される場合、例えば、侵入切断アッセイのいくつかの実施形態では、標的は、プローブ及び侵入オリゴヌクレオチド(例えば、INVADERオリゴヌクレオチド)が結合して侵入切断構造を形成する部位を含み、それゆえ標的核酸の存在が検出され得る。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。
本明細書で使用される場合、「メチル化」は、シトシンのC5位もしくはN4位のシトシンメチル化、アデニンのN6位、または他の種類の核酸メチル化を指す。インビトロ増幅DNAは、典型的なインビトロDNA増幅方法が増幅鋳型のメチル化パターンを保持しないため、通常メチル化されない。しかしながら、「非メチル化DNA」または「メチル化DNA」はまた、それぞれ元の鋳型がメチル化されていなかった、またはメチル化されていた増幅DNAも指し得る。
したがって、本明細書で使用される場合、「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド塩基上のメチル部分の存在を指し、メチル部分は、認識される典型的なヌクレオチド塩基中には存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル部分を含有しないが、5-メチルシトシンは、そのピリミジン環の5位にメチル部分を含有する。したがって、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、5-メチルシトシンは、メチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の5位にメチル部分を含有するが、本明細書での目的のためには、チミンはDNAの典型的なヌクレオチド塩基であるため、DNA中に存在する場合にチミンはメチル化ヌクレオチドであるとは見なされない。
本明細書で使用される場合、「メチル化核酸分子」は、1つ以上のメチル化ヌクレオチドを含有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、核酸分子の「メチル化状態(state)」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状態(status)」は、核酸分子中における1つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の存在または欠如を指す。例えば、メチル化シトシンを含有する核酸分子は、メチル化されていると見なされる(例えば、核酸分子のメチル化状態は、メチル化されている)。メチル化ヌクレオチドを一切含有しない核酸分子は、メチル化されていないと見なされる。
特定の核酸配列(例えば、本明細書に記載されるような遺伝子マーカーまたはDNA領域)のメチル化状態は、配列中の全塩基のメチル化状態を示し得る、もしくは配列内における塩基のサブセットの(例えば、1つ以上のシトシンの)メチル化状態を示し得る、またはメチル化が生じる配列内の正確な位置情報を提供しながら、もしくは提供せずに、配列内の局所的メチル化密度に関する情報を示し得る。
核酸分子中におけるヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸分子中における特定の遺伝子座のメチル化ヌクレオチドの存在または欠如を指す。例えば、核酸分子中の7番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の7番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが、5-メチルシトシンである場合にメチル化されている。同様に、核酸分子中の7番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子中の7番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが、シトシンである(かつ5-メチルシトシンではない)場合にはメチル化されていない。
メチル化状態は、場合により「メチル化値」(例えば、メチル化頻度、割合、比、パーセントなどを表す)によって表され得る、または示され得る。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素を用いた制限消化後に存在する無傷の核酸量を定量することによって、または亜硫酸水素塩反応後の増幅プロファイルを比較することによって、または亜硫酸水素塩処理及び未処理核酸の配列を比較することによって生成され得る。したがって、値、例えば、メチル化値はメチル化状態を表し、したがって、遺伝子座の複数のコピーにわたってメチル化状態の定量的指標として使用され得る。これは、試料中の配列のメチル化状態を閾値または参照値と比較することが望ましい場合の、特定の用途のものである。
本明細書で使用される場合、「メチル化頻度」または「メチル化パーセント(%)」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない事例の数と比較して、分子または遺伝子座がメチル化されている事例の数を指す。
そのようなものとして、メチル化状態は、核酸(例えば、ゲノム配列)のメチル化状態について記載する。さらに、メチル化状態は、メチル化に関連する特定のゲノム遺伝子座における核酸セグメントの特徴を指す。そのような特徴としては、このDNA配列内のシトシン(C)残基のいずれかがメチル化されるかどうか、メチル化C残基(複数可)の位置、核酸のいずれかの特定領域全体にわたるメチル化Cの頻度またはパーセンテージ、及び例えば、アレル起源の差に起因するメチル化のアレル差が挙げられるが、これらに限定されない。「メチル化状態(state)」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化状態(status)」という用語はまた、生体試料中における核酸のいずれかの特定領域全体にわたるメチル化Cまたは非メチル化Cの相対濃度、絶対濃度、またはパターンを指す。例えば、核酸配列内のシトシン(C)残基(複数可)がメチル化されている場合、それは「高メチル化」または「メチル化の増加」を有すると称される場合があるのに対して、DNA配列内のシトシン(C)残基(複数可)がメチル化されていない場合、それは「低メチル化」または「メチル化の低下」を有すると称される場合がある。同様に、核酸配列内のシトシン(C)残基(複数可)が、別の核酸配列(例えば、異なる領域の、または異なる個体などの)と比較した場合にメチル化されている場合、その配列は、他方の核酸配列と比較して高メチル化またはメチル化の増加を有すると見なされる。あるいは、DNA配列内のシトシン(C)残基(複数可)が、別の核酸配列(例えば、異なる領域の、または異なる個体などの)と比較した場合にメチル化されていない場合、その配列は、他方の核酸配列と比較して低メチル化またはメチル化の低下を有すると見なされる。さらに、「メチル化パターン」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸の領域にわたるメチル化及び非メチル化ヌクレオチドの集合部位を指す。2つの核酸は、同じまたは類似したメチル化頻度またはメチル化パーセントを有する場合があるが、メチル化及び非メチル化ヌクレオチドの数が、領域全体にわたって同じまたは類似しているが、メチル化及び非メチル化ヌクレオチドの位置が異なる場合、異なるメチル化パターンを有する場合がある。配列は、それらがメチル化の程度(例えば、一方が他方と比較してメチル化の増加または低下を有する)、頻度、またはパターンが異なる場合、「可変メチル化」と、または「メチル化の差」を有すると、または「異なるメチル化状態」を有すると言われる。「可変メチル化」という用語は、がん陰性試料中における核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較した場合、がん陽性試料中における核酸メチル化のレベルまたはパターンの差を指す。それはまた、手術後にがんが再発した患者と再発していない患者との間のレベルまたはパターンの差を指す場合もある。可変メチル化及びDNAメチル化の特定レベルまたはパターンは、例えば、正確なカットオフまたは予測特性が定義されると、予後及び予測バイオマーカーとなる。
メチル化状態頻度は、個体集団または単一の個体に由来する試料について記載するために使用され得る。例えば、50%のメチル化状態頻度を有するヌクレオチド遺伝子座は、50%の事例においてメチル化されていて、50%の事例においてメチル化されていない。そのような頻度は、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が、個体集団または核酸集合体中でメチル化される程度について記載するために使用され得る。したがって、核酸分子の第1集団またはプール中のメチル化が、核酸分子の第2集団またはプール中のメチル化とは異なる場合、第1集団またはプールのメチル化状態頻度は、第2集団またはプールのメチル化状態頻度とは異なることになる。そのような頻度はまた、例えば、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域が、単一個体中でメチル化される程度について記載するために使用され得る。例えば、そのような頻度は、組織試料からの細胞群が、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域でメチル化されている、またはメチル化されていない程度について記載するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド遺伝子座」は、核酸分子中のヌクレオチドの位置を指す。メチル化ヌクレオチドのヌクレオチド遺伝子座は、核酸分子中のメチル化ヌクレオチドの位置を指す。
典型的に、ヒトDNAのメチル化は、シトシンがグアニンの5’側に位置している、隣接するグアニン及びシトシンを含むジヌクレオチド配列(CpGジヌクレオチド配列とも称される)上で生じる。CpGジヌクレオチド内のシトシンの多くは、ヒトゲノム中でメチル化されるが、いくつかは、CpGアイランドとして知られている、特定のCpGジヌクレオチドリッチゲノム領域中でメチル化されないままである(例えば、Antequera et al.(1990)Cell 62:503-514を参照のこと)。
本明細書で使用される場合、「CpGアイランド」は、全ゲノムDNAと比較してCpGジヌクレオチドの増加した数を含有するゲノムDNAのG:Cリッチ領域を指す。CpGアイランドは、少なくとも100、200、またはそれを超える塩基対長であり得、その場合に領域のG:C含量は少なくとも50%であり、予測頻度に対する観測CpG頻度の比は0.6であり、いくつかの場合では、CpGアイランドは、少なくとも500塩基対長であり得、その場合に領域のG:C含量は少なくとも55%であり、予測頻度に対する観測CpG頻度の比は0.65である。予測頻度に対する観測CpG頻度は、Gardiner-Garden et al(1987)J.Mol.Biol.196:261-281で提供される方法によって算出され得る。例えば、予測頻度に対する観測CpG頻度は、式R=(A×B)/(C×D)によって算出され得、式中、Rは、予測頻度に対する観測CpG頻度の比であり、Aは、分析された配列中のCpGジヌクレオチド数であり、Bは、分析された配列中のヌクレオチドの総数であり、Cは、分析された配列中のCヌクレオチドの総数であり、Dは、分析された配列中のGヌクレオチドの総数である。メチル化状態は通常、CpGアイランド中で、例えば、プロモーター領域で決定される。しかし、ヒトゲノム中の他の配列が、CpA及びCpTなどのDNAメチル化の傾向があると理解されることになる(Ramsahoye(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:5237-5242、Salmon and Kaye(1970)Biochim.Biophys.Acta.204:340-351、Grafstrom(1985)Nucleic Acids Res.13:2827-2842、Nyce(1986)Nucleic Acids Res.14:4353-4367、Woodcock(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.145:888-894を参照のこと)。
本明細書で使用される場合、「メチル化特異的試薬」は、核酸分子のメチル化状態に応じて核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬を指す、またはメチル化特異的試薬は、核酸分子のメチル化状態を反映する手法で核酸分子のヌクレオチド配列を変化させ得る化合物もしくは組成物もしくは他の薬剤を指す。核酸分子をそのような試薬で処理する方法は、核酸分子を試薬と接触させ、所望であれば、追加ステップと組み合わせて、ヌクレオチド配列の所望の変化を達成することを含み得る。そのような方法は、非メチル化ヌクレオチド(例えば、各非メチル化シトシン)が、異なるヌクレオチドに修飾される手法で適用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、そのような試薬は、デオキシウラシル残基を生成するために非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化し得る。そのような試薬の例としては、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
メチル化特異的試薬による核酸ヌクレオチド配列の変化はまた、各メチル化ヌクレオチドが異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらし得る。
「メチル化アッセイ」という用語は、核酸の配列内における1つ以上のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するための任意のアッセイを指す。
「MS AP-PCR」(メチル化感受性任意プライムポリメラーゼ連鎖反応)という用語は、CGリッチプライマーを使用してゲノムの全体走査を可能にし、CpGジヌクレオチドを含有する可能性が最も高い領域に集中する、当該技術分野において認識されている技術を指し、Gonzalgo et al.(1997)Cancer Research 57:594-599に記載されている。
「MethyLight(商標)」という用語は、Eads et al.(1999)Cancer Res.59:2302-2306によって記載されている、当該技術分野において認識されている蛍光に基づくリアルタイムPCR技術を指す。
「HeavyMethyl(商標)」という用語はアッセイを指し、増幅プライマー間のCpG位置を網羅する、または増幅プライマーによって網羅されるメチル化特異的ブロッキングプローブ(本明細書ではブロッカーとも称される)が、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
「HeavyMethyl(商標)MethyLight(商標)」アッセイという用語は、HeavyMethyl(商標)MethyLight(商標)アッセイを指し、これはMethyLight(商標)アッセイの多様性であり、MethyLight(商標)アッセイが、増幅プライマー間のCpG位置を網羅するメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。
「Ms-SNuPE」(メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長)という用語は、Gonzalgo&Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529-2531によって記載されている当該技術分野において認識されているアッセイを指す。
「MSP」(メチル化特異的PCR)という用語は、Herman et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826によって、及び米国特許第5,786,146号によって記載されている当該技術分野において認識されているメチル化アッセイを指す。
「COBRA」(複合亜硫酸水素塩制限分析)という用語は、Xiong&Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532-2534によって記載されている当該技術分野において認識されているメチル化アッセイを指す。
「MCA」(メチル化CpGアイランド増幅)という用語は、Toyota et al.(1999)Cancer Res.59:2307-12によって、及びWO00/26401A1に記載されているメチル化アッセイを指す。
本明細書で使用される場合、「選択されたヌクレオチド」は、核酸分子中に通常存在する4つのヌクレオチド(DNAではC、G、T、及びAならびにRNAではC、G、U、及びA)のうち1つのヌクレオチドを指し、通常存在するヌクレオチドのメチル化誘導体を含み得る(例えば、Cが選択されたヌクレオチドである場合、メチル化C及び非メチル化Cの両方が選択されたヌクレオチドの意味に含まれる)のに対して、選択されたメチル化ヌクレオチドは、具体的には通常存在するメチル化ヌクレオチドを指し、選択された非メチル化ヌクレオチドは、具体的には通常存在する非メチル化ヌクレオチドを指す。
「メチル化特異的制限酵素」という用語は、その認識部位のメチル化状態に依存する核酸を選択的に消化する制限酵素を指す。認識部位がメチル化されていない、またはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素(メチル化感受性酵素)の場合、認識部位が、一方または両方の鎖上でメチル化される場合に切断は行われないことになる(または著しく低下した効率で行われることになる)。認識部位がメチル化されている場合に限り、特異的に切断する制限酵素(メチル化依存性酵素)の場合、認識部位がメチル化されない場合に切断は行われないことになる(または著しく低下した効率で行われることになる)。メチル化特異的制限酵素が好ましく、その認識配列は、CGジヌクレオチドを含有する(例えば、CGCGまたはCCCGGGなどの認識配列)。いくつかの実施形態にさらに好ましいのは、このジヌクレオチド中のシトシンが炭素原子C5でメチル化される場合には切断しない制限酵素である。
本明細書で使用される場合、「異なるヌクレオチド」は、選択されたヌクレオチドとは化学的に異なるヌクレオチドを指し、結果として通常は、異なるヌクレオチドが、選択されたヌクレオチドとは異なるワトソン・クリック塩基対合特性を有し、それによって、選択されたヌクレオチドに相補的な通常存在するヌクレオチドは、異なるヌクレオチドに相補的な通常存在するヌクレオチドと同じではない。例えば、Cが選択されたヌクレオチドである場合、UまたはTは異なるヌクレオチドであり得、これはCのGに対する相補性及びUまたはTのAに対する相補性によって例示される。本明細書で使用される場合、選択されたヌクレオチドに相補的な、または異なるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で、4つの通常存在するヌクレオチドのうち3つとの相補的ヌクレオチドの塩基対合よりも、高い親和性で選択されたヌクレオチドまたは異なるヌクレオチドと塩基対合するヌクレオチドを指す。相補性の一例は、DNA(例えば、A-T及びC-G)ならびにRNA(例えば、A-U及びC-G)のワトソン・クリック塩基対合である。したがって、例えば、Gは、高ストリンジェンシー条件下で、GがG、A、またはTと塩基対合するよりも、より高い親和性でCと塩基対合するため、Cが選択されたヌクレオチドである場合、Gは、選択されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、所与のマーカー(または共に使用されるマーカーのセット)の「感度」は、腫瘍性試料と非腫瘍性試料とを区別する閾値を超えるDNAメチル化値を報告する試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陽性は、閾値(例えば、疾患と関連する範囲)を超えるDNAメチル化値を報告する組織学的に確認された新生物として定義され、偽陰性は、閾値(例えば、疾患と関連しない範囲)未満のDNAメチル化値を報告する組織学的に確認された新生物として定義される。したがって、感度の値は、既知の患部試料から得られた所与のマーカーのDNAメチル化測定値が、疾患関連測定値の範囲内にあることになる確率を反映する。本明細書で定義されるように、算出された感度値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有する対象に適用される場合、その臨床状態の存在を検出することになる確率の推定を表す。
本明細書で使用される場合、所与のマーカー(または共に使用されるマーカーのセット)の「特異性」は、腫瘍性試料と非腫瘍性試料とを区別する閾値未満のDNAメチル化値を報告する非腫瘍性試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陰性は、閾値(例えば、疾患と関連しない範囲)未満のDNAメチル化値を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料として定義され、偽陽性は、閾値(例えば、疾患と関連する範囲)を超えるDNAメチル化値を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料として定義される。したがって、特異性の値は、既知の非腫瘍性試料から得られた所与のマーカーのDNAメチル化測定値が、非疾患関連測定値の範囲内にあることになる確率を反映する。本明細書で定義されるように、算出された特異性値の臨床的関連性は、所与のマーカーが臨床状態を有しない患者に適用される場合、その臨床状態の欠如を検出することになる確率の推定を表す。
「AUC」という用語は、本明細書で使用される場合、「曲線下面積」の略語である。特に、AUCは、受信者動作特性(ROC)曲線下面積を指す。ROC曲線は、診断試験の異なる可能なカットポイントの、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。ROC曲線は、選択されたカットポイントに依存する感度と特異性との間のトレードオフを示す(いずれの感度の上昇も、特異性の低下を伴うことになる)。ROC曲線下面積(AUC)は、診断試験の精度の指標である(より大きい領域であるほどより良好であり、最高は1、ランダム試験は0.5の面積を有する対角線上に位置するROC曲線を有することになる、参照:J.P.Egan.(1975)Signal Detection Theory and ROC Analysis,Academic Press,New York)。
「新生物」という用語は、本明細書で使用される場合、組織のあらゆる新規の異常成長を指す。したがって、新生物は、前悪性新生物または悪性新生物であり得る。
「新生物特異的マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、新生物の存在を示すために使用され得る任意の生体材料または要素を指す。生体材料の例としては、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分(例えば、細胞膜及びミトコンドリア)、ならびに全細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、マーカーは、特定の核酸領域(例えば、遺伝子、遺伝子内領域、特定の遺伝子座など)である。マーカーである核酸の領域は、例えば、「マーカー遺伝子」、「マーカー領域」、「マーカー配列」、「マーカー遺伝子座」などと称されてよい。
本明細書で使用される場合、「腺腫」という用語は、腺起源の良性腫瘍を指す。これらの増殖は良性であるが、経時的にそれらは進行して悪性となる可能性がある。
「前がん性」または「前腫瘍性」という用語及びそれらの同義語は、悪性形質転換を受けているいずれかの細胞増殖性障害を指す。
新生物、腺腫、がんなどの「部位」は、新生物、腺腫、がんなどが位置している対象の身体中における組織、器官、細胞型、解剖学的領域、身体部位などである。
本明細書で使用される場合、「診断」試験の適用は、対象の疾患状態(state)または状態(condition)の検出または同定を含み、対象が所与の疾患または状態に罹患することになる可能性を決定すること、疾患または状態を有する対象が療法に応答することになる可能性を決定すること、疾患または状態を有する対象の予後(またはその進行もしくは退行の可能性)を決定すること、及び疾患または状態を有する対象に対する処置の効果を決定することを含む。例えば、診断は、新生物に罹患する対象の存在もしくは可能性またはそのような対象が化合物(例えば、医薬、例えば、薬物)もしくは他の処置に有利に応答することになる可能性を検出するために使用され得る。
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」と同様に、核酸に関して使用される場合、その天然源中において通常関連する少なくとも1つの混入核酸から同定かつ分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然に見られるものとは異なる形態または状況で存在する。対照的に、DNA及びRNAなどの単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見られる。単離されていない核酸の例としては、隣接する遺伝子に近接している宿主細胞染色体上で見られる所与のDNA配列(例えば、遺伝子)、RNA配列、例えば、複数のタンパク質をコードする多数の他のmRNAを含む混合物として細胞中に見られる、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列などが挙げられる。しかしながら、特定のタンパク質をコードする単離された核酸としては、例として、タンパク質を通常発現する細胞中のそのような核酸が挙げられ、核酸は、天然細胞のそれとは異なる染色体位置に存在するか、またはさもなければ、天然に見られるものとは異なる核酸配列に隣接している。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在してよい。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドが、タンパク質を発現するために利用される場合、オリゴヌクレオチドは、最低でもセンス鎖またはコード鎖を含有する(すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であってよい)ことになるが、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含有してもよい(すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってよい)。単離された核酸は、その天然の、または典型的な環境からの単離後、他の核酸または分子と組み合わされてよい。例えば、単離された核酸は、例えば、異種発現のためにそれが置かれている宿主細胞中に存在する場合がある。
「精製された」という用語は、分子などの天然環境から除去された、単離された、または分離された分子、すなわち、核酸またはアミノ酸配列のいずれかを指す。したがって、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列であってよい。「実質的に精製された」分子は、それらが天然に関連している他の成分を少なくとも60%含まない、好ましくは少なくとも75%含まない、より好ましくは少なくとも90%含まない。本明細書で使用される場合、「精製された」または「精製する」という用語はまた、試料からの混入物の除去も指す。混入しているタンパク質の除去によって、試料中における目的のポリペプチドまたは核酸のパーセントが高くなる。別の例では、組換えポリペプチドが植物、細菌、酵母、または哺乳動物宿主細胞中で発現され、ポリペプチドが、宿主細胞タンパク質の除去によって精製され、それによって組換えポリペプチドのパーセントが試料中で上昇する。
所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド「を含む組成物」という用語は、所与のポリヌクレオチド配列またはポリペプチドを含有するいずれかの組成物を広く指す。組成物は、塩(例えば、NaCl)、界面活性剤(例えば、SDS)、及び他の成分(例えば、デンハルト液、粉乳、サケ精子DNAなど)を含有する水溶液を含んでよい。
「試料」という用語は、その最も広義に使用される。ある意味では、それは動物細胞または組織を指し得る。別の意味では、それは、いずれかの供給源から得られた検体または培養物に加えて、生体試料及び環境試料を指す。生体試料は、植物または動物(ヒトを含む)から得られてよく、流体、固体、組織、及び気体を包含する。環境試料は、環境物質、例えば、表面物質、土壌、水、及び工業用試料などを含む。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「遠隔試料」は、いくつかの文脈で使用される場合、細胞、組織、または器官の試料供給源ではない部位から間接的に収集される試料を指す。例えば、膵臓に由来する試料物質が、糞便試料(例えば、乳房から直接採取された試料に由来しない)中で評価される場合、試料は遠隔試料である。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、技術によって提供される様々な試験を受ける生物を指す。「対象」という用語は、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、対象は霊長類である。より一層好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに診断方法に関して、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血動物であり、好ましい温血脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び動物対象の両方を含む。したがって、獣医学的な治療的使用が本明細書で提供される。そのようなものとして、本技術によって、哺乳動物、例えば、ヒトに加えてアムールトラなどの絶滅の危機に瀕しているために重要なそれらの哺乳動物、ヒトによる消費のために農場で飼育されている動物などの経済的に重要なそれらの哺乳動物、及び/またはペットとして、もしくは動物園で飼育されている動物などのヒトにとって社会的に重要な動物などの診断が可能になる。そのような動物の例としては、ネコ及びイヌなどの肉食動物、ブタ(pig)、雄ブタ、及びイノシシを含むブタ(swine)、反芻動物及び/または有蹄動物、例えば、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなど、鰭脚類、ならびにウマが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、さらに提供されるのは、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ(競走馬を含む)などを含むが、これらに限定されない家畜の診断及び処置である。本明細書で開示される主題は、対象の肺癌を診断するためのシステムをさらに含む。システムは、例えば、生体試料が収集されている対象中の肺癌リスクについてスクリーニングする、または肺癌を診断するために使用され得る市販のキットとして提供され得る。本技術に従って提供される例示的なシステムは、本明細書に記載されるマーカーのメチル化状態を評価することを含む。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイとの関連において、そのような送達システムは、ある位置から別の位置への反応試薬(例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など)及び/または支持材料(例えば、緩衝液、アッセイを実施するための書面による説明書など)の保管、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬及び/または支持材料を含有する1つ以上の封入容器(例えば、箱)を含む。本明細書で使用される場合、「細分化キット」という用語は、2つ以上の別個の容器に各々がキットの全構成要素の一部を含有する、その容器を含む送達システムを指す。容器は、一緒にまたは別々に目的のレシピエントに送達されてよい。例えば、第1容器は、アッセイで使用するための酵素を含有してよく、一方で第2容器は、オリゴヌクレオチドを含有する。「細分化キット」という用語は、連邦食品医薬品化粧品法の第520条(e)項の下で規制される分析物特異的試薬(ASR)を含有するキットを包含することを意図するが、それらに限定されない。事実、2つ以上の別個の容器に各々がキットの全構成要素の一部を含有する、その容器を含む任意の送達システムが、「細分化キット」という用語に含まれる。対照的に、「複合キット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一容器中に(例えば、所望の構成要素の各々を収容する単一の箱中に)含有する送達システムを指す。「キット」という用語は、細分化及び複合キットの両方を含む。
本明細書で使用される場合、「乳癌」という用語は、一般に乳房組織の制御不能な増殖を指し、より具体的には、対象の一方または両方の乳房における異常細胞の異常に速い増殖を特徴とする状態を指す。異常細胞は、多くの場合に悪性または「腫瘍性細胞」と称され、これらは固形腫瘍を形成し得る形質転換細胞である。「腫瘍」という用語は、悪性または良性のいずれであっても、過度または異常な細胞分裂に起因する細胞の異常な塊または集団(すなわち、2個以上の細胞)、ならびに前がん性及びがん性細胞を指す。悪性腫瘍は、制御不能な細胞増殖に加えて、腫瘍が周囲組織に浸潤し得る、かつ転移し得る点で良性の増殖または腫瘍とは区別される。
本明細書で使用される場合、「HER2+乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、急速な細胞増殖を促進するHER2タンパク質(HER2(ヒト上皮成長因子受容体2に由来)またはHER2/neu)のレベル上昇を発現する。
本明細書で使用される場合、「ルミナルA乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、エストロゲン受容体(ER)陽性及びプロゲステロン受容体(PR)陽性であるが、HER2に対しては陰性である。
本明細書で使用される場合、「ルミナルB乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、ER陽性、HER2陽性で、PRに対しては陰性である。
本明細書で使用される場合、「トリプルネガティブ乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、ER、HER2、及びPRに対して陰性である。
本明細書で使用される場合、「HER2+乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、ER及びPRに対して陰性であるが、HER2に対しては陽性である。
本明細書で使用される場合、「BRCA1乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、BRCA1遺伝子の変異で特徴付けられる、及び/または野生型BRCA1の発現を減少させる。
本明細書で使用される場合、「BRCA2乳癌」という用語は乳癌を指し、がん細胞の少なくとも一部分が、BRCA2遺伝子の変異で特徴付けられる、及び/または野生型BRCA2の発現を減少させる。
本明細書で使用される場合、「非浸潤性乳管癌」(DCIS)という用語は、異常細胞が乳房の乳管内側に見られる非浸潤性がんを指す。「低悪性度」DCISは、核異型度1であるか、または低い分裂速度を有するDCISを指す。「高悪性度」DCISは、核異型度3であるか、または高い分裂速度を有するDCISを指す。「浸潤性」DCISは、非乳管組織まで転移している乳管癌を指す。
本明細書で使用される場合、「情報」という用語は、事実またはデータの任意の集合を指す。インターネットを含むが、これに限定されないコンピュータシステム(複数可)を使用して保存または処理される情報に関して、用語は、任意の形式(例えば、アナログ、デジタル、光など)で保存される任意のデータを指す。本明細書で使用される場合、「対象に関連する情報」という用語は、対象(例えば、ヒト、植物、または動物)に関する事実またはデータを指す。「ゲノム情報」という用語は、核酸配列、遺伝子、パーセンテージメチル化、アレル頻度、RNA発現レベル、タンパク質発現、遺伝型に関連する表現型などを含むが、これらに限定されない、ゲノムに関する情報を指す。「アレル頻度情報」は、アレル識別情報、対象(例えば、ヒト対象)のアレルと特徴の存在間における統計的相関、個体または集団中におけるアレルの存在または欠如、1つ以上の特定の特徴を有する個体中に存在しているアレルのパーセンテージ尤度などを含むが、これらに限定されない、アレル頻度に関する事実またはデータを指す。
様々な実施形態に関するこの詳細説明では、説明のために、多数の特定の詳細が、開示される実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、当業者は、これらの様々な実施形態が、これらの具体的な詳細の有無にかかわらず実施されてよいと理解することになる。他の場合では、構造及びデバイスは、ブロック図形式で示される。さらに、当業者は、方法が提示かつ実施される特定の順序は例示的なものであると容易に理解することができ、順序は変更され得るが、依然として本明細書に開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内のままであることが考慮される。
本明細書で提供されるのは、乳癌スクリーニングに関する技術であり、特に、乳癌及び/または特定の乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)の存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途であるが、これらに限らない。本技術が本明細書に記載されるように、使用される節の見出しは、系統立てる目的のためだけのものであり、いかなる方法でも主題を限定すると解釈されるべきではない。
事実、実施例I、II及びIIIに記載されるように、本発明についての実施形態を同定する過程中に実施された実験は、非腫瘍性対照DNAと乳房由来のDNAのがんを区別するために375個の可変メチル化領域(DMR)の新規セットを同定した。これらの375個の新規DNAメチル化マーカーから、さらなる実験によって、異なる乳癌型と正常な乳房組織とを区別できるマーカーが同定された。例えば、DMRの別個のセットが同定され、これらは、1)トリプルネガティブ乳癌組織と正常な乳房組織とを、2)HER2+乳癌組織と正常な乳房組織とを、3)ルミナルA乳癌組織と正常な乳房組織とを、4)ルミナルB乳癌組織と正常な乳房組織とを、5)BRCA1乳癌組織と正常な乳房組織とを、6)BRCA2乳癌組織と正常な乳房組織とを、及び7)浸潤性乳癌組織と正常な乳房組織とを区別できる。加えて、DMRが同定され、これらは、非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別できる。加えて、DMRが同定され、これらは、乳癌を有する対象の血漿と乳癌を有しない対象の血漿とを区別できる。
本明細書における開示は、ある特定の例示された実施形態を指すが、これらの実施形態は例として提示されていて、限定のためではないと理解されるべきである。
特定の態様では、本技術は、乳癌などのがんを同定する、決定する、及び/または分類するための組成物及び方法を提供する。方法は、対象から単離された生体試料(例えば、糞便試料、乳房組織試料、血漿試料)中における少なくとも1個のメチル化マーカーのメチル化状態を決定することを含み、マーカーのメチル化状態の変化は、乳癌の存在、分類、または部位を示している。特定の実施形態は、乳癌及び様々な乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)の診断(例えば、スクリーニング)に使用される可変メチル化領域(DMR、例えば、DMR1~375、表2及び表18を参照のこと)を含むマーカーに関する。
本明細書で提供され、かつ表2及び表18に列挙されるDMR(例えば、DMR、例えば、DMR1~375)を含む少なくとも1個のマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のメチル化分析が分析される実施形態に加えて、技術は、がん、特に乳癌の検出に有用なDMRを含む少なくとも1個のマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基を含むマーカーのパネルも提供する。
技術のいくつかの実施形態は、DMRを含む少なくとも1個のマーカー、マーカーの領域、またはマーカーの塩基のCpGメチル化状態に関する分析に基づいている。
いくつかの実施形態では、本技術は、1つ以上のメチル化アッセイと組み合わせたメチル化特異的手法でDNAを修飾する試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)の使用を可能にし、DMR(例えば、DMR1~375、表2及び表18を参照のこと)を含む少なくとも1個のマーカー内におけるCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定する。ゲノムCpGジヌクレオチドはメチル化され得る、またはメチル化され得ない(あるいは、それぞれ上下メチル化として知られている)。しかしながら、本発明の方法は、遠隔試料(例えば、血液、器官排出液、または糞便)のバックグラウンド内における、不均一な性質、例えば、低濃度の腫瘍細胞の生体試料、またはそれらからの生体物質に関する分析に好適である。したがって、そのような試料内におけるCpG位置のメチル化状態を分析する場合、特定のCpG位置におけるメチル化のレベル(例えば、パーセント、割合、比、比率、または程度)を決定するための定量アッセイを使用してよい。
本技術によれば、DMRを含むマーカー中におけるCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態の決定は、乳癌などのがんの診断及び特徴付けの両方に有用である。
マーカーの組合せ
いくつかの実施形態では、技術は、表2及び表18からのDMR(例えば、DMR番号1~375)を含むマーカーの組合せのメチル化状態を評価することに関する。いくつかの実施形態では、2個以上のマーカーのメチル化状態を評価することによって、対象の新生物(例えば、乳癌)を同定するためのスクリーニングまたは診断の特異性及び/または感度が向上する。
様々ながんは、例えば、予測の特異性及び感度に関連する統計的技法によって同定されるように、マーカーの様々な組合せによって予測される。本技術は、いくつかのがんに関する予測組合せ及び検証された予測組合せを同定する方法を提供する。
メチル化状態をアッセイする方法
ある特定の実施形態では、5-メチルシトシンの存在について核酸を分析する方法は、メチル化特異的手法でDNAを修飾する試薬を用いたDNAの処理を含む。そのような試薬の例としては、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
5-メチルシトシンの存在について核酸を分析する、頻繁に使用される方法は、DNA中の5ーメチルシトシン(Frommer et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-31、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に明示的に組み込まれる)またはそれらの多様性の検出について、Frommer,et al.によって記載されている亜硫酸水素塩法に基づいている。5-メチルシトシンをマッピングする亜硫酸水素塩法は、シトシンが、5-メチルシトシンではなく、亜硫酸水素塩(hydrogen sulfite)イオン(亜硫酸水素塩(bisulfite)としても知られる)と反応する観測に基づいている。反応は通常、以下のステップにより実施される:最初に、シトシンが亜硫酸水素塩と反応し、スルホン化シトシンを形成する。次に、スルホン化反応中間体の自発的脱アミノ化が、スルホン化ウラシルをもたらす。最後に、スルホン化ウラシルは、アルカリ条件下で脱スルホン化され、ウラシルを形成する。ウラシルがアデニンと塩基対合する(したがって、チミンのように挙動する)のに対して、5-メチルシトシンはグアニンと塩基対合する(したがって、シトシンのように挙動する)ため、検出が可能である。これにより、例えば、可能な亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング(Grigg G,&Clark S,Bioessays(1994)16:431-36、Grigg G,DNA Seq.(1996)6:189-98)、例えば、米国特許第5,786,146号に開示されるようなメチル化特異的PCR(MSP)、または配列特異的プローブ切断を含むアッセイ、例えば、QuARTSフラップエンドヌクレアーゼアッセイ(例えば、Zou et al.(2010)“Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology”Clin Chem 56:A199、ならびに米国特許第8,361,720号、同第8,715,937号、同第8,916,344号、及び同第9,212,392号を参照のこと)を使用することによって、メチル化シトシンと非メチル化シトシンとの区別を行う。
いくつかの従来の技術は、分析されるDNAをアガロースマトリックス中に入れ、それによってDNAの拡散及び復元を防止し(亜硫酸水素塩は、一本鎖DNAのみと反応する)、迅速な透析で沈殿及び精製ステップに取って代わることを含む方法に関する(Olek A,et al.(1996)“A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis”Nucleic Acids Res.24:5064-6)。したがって、メチル化状態の個々の細胞を分析し、方法の有用性及び感度を示すことが可能である。5-メチルシトシンを検出する従来の方法の概要は、Rein,T.,et al.(1998)Nucleic Acids Res.26:2255によって提供される。
亜硫酸水素塩技術は通常、亜硫酸水素塩処理後に既知核酸の短い特定の断片を増幅し、次いでシーケンシング(Olek&Walter(1997)Nat.Genet.17:275-6)またはプライマー伸長反応(Gonzalgo&Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529-31、WO95/00669、米国特許第6,251,594号)のいずれかによって産物をアッセイし、個々のシトシン位置を分析することを含む。いくつかの方法は、酵素消化を使用する(Xiong&Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532-4)。ハイブリダイゼーションによる検出はまた、当該技術分野において記載されている(Olek et al.,WO99/28498)。さらに、個々の遺伝子に関してメチル化検出のための亜硫酸水素塩技術の使用が記載されている(Grigg&Clark(1994)Bioessays 16:431-6,、Zeschnigk et al.(1997)Hum Mol Genet.6:387-95、Feil et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:695、Martin et al.(1995)Gene 157:261-4、WO9746705、WO9515373)。
様々なメチル化アッセイ手順が、本技術による亜硫酸水素塩処理と併用して使用され得る。これらのアッセイは、核酸配列内における1つまたは複数のCpGジヌクレオチド(例えば、CpGアイランド)のメチル化状態の決定を可能にする。そのようなアッセイは、他の技術の中でも、亜硫酸水素塩処理核酸のシーケンシング、PCR(配列特異的増幅について)、サザンブロット分析、及びメチル化特異的制限酵素、例えば、メチル化感受性またはメチル化依存性酵素の使用を含む。
例えば、ゲノムシーケンシングは、亜硫酸水素塩処理を使用することによって、メチル化パターン及び5-メチルシトシン分布の分析のために簡略化されている(Frommer et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-1831)。さらに、亜硫酸水素塩変換DNAから増幅されたPCR産物の制限酵素消化は、例えば、Sadri&Hornsby(1997)Nucl.Acids Res.24:5058-5059によって記載されるような、またはCOBRA(複合亜硫酸水素塩制限分析)(Xiong&Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532-2534)として知られる方法で具現化されるような、メチル化状態の評価に用途を見出す。
COBRA(商標)分析は、少量のゲノムDNA中における特定の遺伝子座でのDNAメチル化レベルを決定するのに有用な定量メチル化アッセイである(Xiong&Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997)。簡潔に述べると、制限酵素消化は、亜硫酸水素ナトリウム処理DNAのPCR産物中におけるメチル化依存性配列差を明らかにするために使用される。メチル化依存性配列差は、Frommer et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827-1831,1992)によって記載される手順に従って、標準的な亜硫酸水素塩処理により最初にゲノムDNA中に導入される。次いで、亜硫酸水素塩変換DNAのPCR増幅は、目的のCpGアイランドに特異的なプライマーを使用して実施され、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的標識ハイブリダイゼーションプローブを使用した検出を行う。元のDNA試料中におけるメチル化レベルは、DNAメチル化レベルの広範囲にわたる直線的な定量手法で、消化された及び消化されていないPCR産物の相対量によって表される。加えて、この技術は、顕微解剖パラフィン包埋組織試料から得られたDNAに確実に適用され得る。
COBRA(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なCOBRA(商標)に基づくキットで見られる場合があるような)としては、特定の遺伝子座(例えば、特定の遺伝子、マーカー、DMR、遺伝子の領域、マーカーの領域、亜硫酸水素塩処理DNA配列、CpGアイランドなど)に対するPCRプライマー、制限酵素及び適切な緩衝液、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、対照ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブのためのキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドを挙げてよいが、これらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、DNA変性緩衝液、スルホン化緩衝液、DNA回収試薬またはキット(例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム)、脱スルホン化緩衝液、及びDNA回収成分を挙げてもよい。
アッセイ、例えば、「MethyLight(商標)」(蛍光に基づくリアルタイムPCR技術)(Eads et al.,Cancer Res.59:2302-2306,1999)、Ms-SNuPE(商標)(メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長)反応(Gonzalgo&Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)、メチル化特異的PCR(「MSP」、Herman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996、米国特許第5,786,146号)、及びメチル化CpGアイランド増幅(「MCA」、Toyota et al.,Cancer Res.59:2307-12,1999)などが、単独でまたはこれらの方法のうち1つ以上と組み合わせて使用される。
「HeavyMethyl(商標)」アッセイ技術は、亜硫酸水素塩処理DNAのメチル化特異的増幅に基づいてメチル化の差を評価する定量法である。増幅プライマー間のCpG位置を網羅する、または増幅プライマーによって網羅されるメチル化特異的ブロッキングプローブ(「ブロッカー」)は、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
「HeavyMethyl(商標)MethyLight(商標)」アッセイという用語は、HeavyMethyl(商標)MethyLight(商標)アッセイを指し、これはMethyLight(商標)アッセイの多様性であり、MethyLight(商標)アッセイが、増幅プライマー間のCpG位置を網羅するメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。HeavyMethyl(商標)アッセイはまた、メチル化特異的増幅プライマーと組み合わせて使用されてもよい。
HeavyMethyl(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMethyLight(商標)に基づくキットで見られる場合があるような)としては、特定の遺伝子座(例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、亜硫酸水素塩処理DNA配列、CpGアイランド、または亜硫酸水素塩処理DNA配列もしくはCpGアイランドなど)に対するPCRプライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチド、最適化PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびにTaqポリメラーゼを挙げてよいが、これらに限定されない。
MSP(メチル化特異的PCR)は、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、CpGアイランド内におけるCpG部位の実質的にいずれかの基のメチル化状態を評価することを可能にする(Herman et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996、米国特許第5,786,146号)。簡潔に述べると、DNAは亜硫酸水素ナトリウムによって修飾され、これはメチル化シトシンではなく、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、続いて産物が、非メチル化DNAと対比してメチル化DNAに特異的なプライマーで増幅される。MSPで必要となるのは少量のDNAのみであり、所与のCpGアイランド遺伝子座の0.1%のメチル化アレルに対する感度が高く、パラフィン包埋試料から抽出されたDNA上で実施され得る。MSP分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMSPに基づくキットで見られる場合があるような)としては、特定の遺伝子座(例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、亜硫酸水素塩処理DNA配列、CpGアイランドなど)に対するメチル化及び非メチル化PCRプライマー、最適化PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびに特異的プローブを挙げてよいが、これらに限定されない。
MethyLight(商標)アッセイは、PCRステップ後にさらに操作する必要のない、蛍光に基づくリアルタイムPCR(例えば、TaqMan(登録商標))を利用する高スループット定量メチル化アッセイである(Eads et al.,Cancer Res.59:2302-2306,1999)。簡潔に述べると、MethyLight(商標)プロセスは、標準的な手順によって亜硫酸水素ナトリウム反応で、メチル化依存性配列差を持つ混合プールに変換されるゲノムDNAの混合試料から始める(亜硫酸水素塩プロセスは、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する)。次いで、蛍光に基づくPCRは、例えば、既知のCpGジヌクレオチドに重なるPCRプライマーを用いて「偏った」反応で実施される。配列の区別は、増幅プロセスのレベル及び蛍光検出プロセスのレベルの両方で行われる。
MethyLight(商標)アッセイは、核酸、例えば、ゲノムDNA試料中におけるメチル化パターンの定量試験として使用され、配列の区別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで行われる。定量版では、PCR反応によって、特定の推定メチル化部位に重なる蛍光プローブの存在下でメチル化特異的増幅が可能になる。DNA投入量について偏りのない対照は、プライマーもプローブも任意のCpGジヌクレオチドに重なることのない反応によってもたらされる。あるいは、ゲノムメチル化の定性試験は、既知のメチル化部位を網羅しない対照オリゴヌクレオチド(例えば、HeavyMethyl(商標)及びMSP技術の蛍光に基づくバージョン)または有力なメチル化部位を網羅するオリゴヌクレオチドのいずれかを用いて、偏ったPCRプールをプロービングすることによって達成される。
MethyLight(商標)プロセスは、任意の好適なプローブ(例えば「TaqMan(登録商標)」プローブ、Lightcycler(登録商標)プローブなど)と共に使用される。例えば、いくつかの用途では、二本鎖ゲノムDNAは亜硫酸水素ナトリウムで処理され、TaqMan(登録商標)プローブを使用した、例えば、MSPプライマー及び/またはHeavyMethylブロッカーオリゴヌクレオチドならびにTaqMan(登録商標)プローブを用いたPCR反応の2セットのうち1つに供される。TaqMan(登録商標)プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャー」分子で二重標識され、プローブがフォワードまたはリバースプライマーよりも約10℃高い温度でPCRサイクル中に融解するように、相対的に高いGC含有領域に特異的となるように設計されている。このことは、TaqMan(登録商標)プローブがPCRアニーリング/伸長ステップ中、十分にハイブリダイズし続けることを可能にする。Taqポリメラーゼが、PCR中に新規鎖を酵素的に合成する場合、最終的にアニーリングしたTaqMan(登録商標)プローブに達することになる。次いで、Taqポリメラーゼ5’から3’のエンドヌクレアーゼ活性が、リアルタイム蛍光検出システムを使用して検出時にクエンチされていないシグナルを定量的に検出するために、TaqMan(登録商標)プローブを消化して蛍光レポーター分子を放出することによってプローブを置換することになる。
MethyLight(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMethyLight(商標)に基づくキットで見られる場合があるような)としては、特定の遺伝子座(例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、亜硫酸水素塩処理DNA配列、CpGアイランドなど)に対するPCRプライマー、TaqMan(登録商標)またはLightcycler(登録商標)プローブ、最適化PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびにTaqポリメラーゼを挙げてよいが、これらに限定されない。
QM(商標)(定量メチル化)アッセイは、ゲノムDNA試料中におけるメチル化パターンの代替定量試験であり、配列の区別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで行われる。定量版では、PCR反応によって、特定の推定メチル化部位に重なる蛍光プローブの存在下で偏りのない増幅が可能になる。DNA投入量について偏りのない対照は、プライマーもプローブも任意のCpGジヌクレオチドに重なることのない反応によってもたらされる。あるいは、ゲノムメチル化の定性試験は、既知のメチル化部位を網羅しない対照オリゴヌクレオチド(HeavyMethyl(商標)及びMSP技術の蛍光に基づくバージョン)または有力なメチル化部位を網羅するオリゴヌクレオチドのいずれかを用いて、偏ったPCRプールをプロービングすることによって達成される。
QM(商標)プロセスは、増幅プロセス中において任意の好適なプローブ、例えば、「TaqMan(登録商標)」プローブ、Lightcycler(登録商標)プローブと共に使用され得る。例えば、二本鎖ゲノムDNAは亜硫酸水素ナトリウムで処理され、偏りのないプライマー及びTaqMan(登録商標)プローブに供される。TaqMan(登録商標)プローブは、蛍光「レポーター」及び「クエンチャー」分子で二重標識され、プローブがフォワードまたはリバースプライマーよりも約10℃高い温度でPCRサイクル中に融解するように、相対的に高いGC含有領域に特異的となるように設計されている。このことは、TaqMan(登録商標)プローブがPCRアニーリング/伸長ステップ中、十分にハイブリダイズし続けることを可能にする。Taqポリメラーゼが、PCR中に新規鎖を酵素的に合成する場合、最終的にアニーリングしたTaqMan(登録商標)プローブに達することになる。次いで、Taqポリメラーゼ5’から3’のエンドヌクレアーゼ活性が、リアルタイム蛍光検出システムを使用して検出時にクエンチされていないシグナルを定量的に検出するために、TaqMan(登録商標)プローブを消化して蛍光レポーター分子を放出することによってプローブを置換することになる。QM(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なQM(商標)に基づくキットで見られる場合があるような)としては、特定の遺伝子座(例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、亜硫酸水素塩処理DNA配列、CpGアイランドなど)に対するPCRプライマー、TaqMan(登録商標)またはLightcycler(登録商標)プローブ、最適化PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびにTaqポリメラーゼを挙げてよいが、これらに限定されない。
Ms-SNuPE(商標)技術は、DNAの亜硫酸水素塩処理、続く単一ヌクレオチドプライマー伸長に基づき、特定のCpG部位においてメチル化の差を評価する定量法である(Gonzalgo&Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)。簡潔に述べると、5-メチルシトシンを変化させないまま、ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて非メチル化シトシンをウラシルに変換する。次いで、所望の標的配列の増幅は、亜硫酸水素塩変換DNAに特異的なPCRプライマーを使用して実施され、得られた産物は単離されて、目的のCpG部位におけるメチル化分析用の鋳型として使用される。少量のDNAが分析され得(例えば、顕微解剖病理切片)、それによってCpG部位においてメチル化状態を決定するための制限酵素の利用が回避される。
Ms-SNuPE(商標)分析のための典型的な試薬(例えば、典型的なMs-SNuPE(商標)に基づくキットで見られる場合があるような)としては、特定の遺伝子座(例えば、特定の遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、亜硫酸水素塩処理DNA配列、CpGアイランドなど)に対するPCRプライマー、最適化PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、特定の遺伝子座に対するMs-SNuPE(商標)プライマー、反応緩衝液(Ms-SNuPE反応に対する)、ならびに標識ヌクレオチドを挙げてよいが、これらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、DNA変性緩衝液、スルホン化緩衝液、DNA回収試薬またはキット(例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム)、脱スルホン化緩衝液、及びDNA回収成分を挙げてもよい。
減少表現亜硫酸水素塩シーケンシング(RRBS)は、核酸の亜硫酸水素塩処理から始めて、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換し、続いて制限酵素消化(例えば、MsplなどのCG配列を含む部位を認識する酵素による)及びアダプターリガンドへの結合後に断片の完全シーケンシングを行う。制限酵素の選択によって、CpG高密度領域の断片が濃縮され、分析中に複数の遺伝子位置にマッピングされる可能性のある冗長配列数が減少する。そのようなものとして、RRBSは、シーケンシングのための制限断片サブセットを選択することによって(例えば、調製用ゲル電気泳動を使用したサイズ選択によって)、核酸試料の複雑性を減少させる。全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシングとは対照的に、制限酵素消化によって生成される全ての断片は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのDNAメチル化情報を含有する。そのようなものとして、RRBSは、プロモーター、CpGアイランド、及びこれらの領域中において頻度の高い制限酵素切断部位を有する他のゲノム形状の試料を濃縮し、それゆえ1つ以上のゲノム遺伝子座のメチル化状態を評価するためのアッセイを提供する。
RRBSの典型的なプロトコールは、MspIなどの制限酵素を用いて核酸試料を消化するステップ、オーバーハング及びAテーリングを挿入するステップ、アダプターを結合させるステップ、亜硫酸水素塩変換ステップ、ならびにPCRステップを含む。例えば、et al.(2005)“Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution”Nat Methods 7:133-6、Meissner et al.(2005)“Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis”Nucleic Acids Res.33:5868-77を参照のこと。
いくつかの実施形態では、定量アレル特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅(QuARTS)アッセイは、メチル化状態を評価するために使用される。各QuARTSアッセイ中では3つの反応が連続して生じ、一次反応には増幅(反応1)及び標的プローブ切断(反応2)、ならびに二次反応にはFRET切断及び蛍光シグナル生成(反応3)を含む。標的核酸が特定のプライマーで増幅される場合、フラップ配列を有する特定の検出プローブが、アンプリコンに緩く結合する。標的結合部位における特定の侵入オリゴヌクレオチドの存在は、5’ヌクレアーゼ、例えば、FEN-1エンドヌクレアーゼにより、検出プローブとフラップ配列との間を切断することによってフラップ配列を放出させる。フラップ配列は、対応するFRETカセットの非ヘアピン部分に相補的である。したがって、フラップ配列は、FRETカセット上で侵入オリゴヌクレオチドとして機能し、FRETカセットフルオロフォアとクエンチャーとの間に切断をもたらし、蛍光シグナルを生成する。切断反応は、標的ごとに複数のプローブを切断し得、それゆえフラップごとに複数のフルオロフォアを放出し、指数関数的シグナル増幅を提供する。QuARTSは、異なる色素を有するFRETカセットを使用することによって、単一反応ウェル中で複数の標的を検出し得る。例えば、Zou et al.(2010)“Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology”Clin Chem 56:A199)、ならびに米国特許第8,361,720号、同第8,715,937号、同第8,916,344号、及び同第9,212,392号中を参照し、その各々があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
「亜硫酸水素塩試薬」という用語は、亜硫酸水素塩(bisulfite)、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩(hydrogen sulfite)、またはそれらの組合せを含む試薬を指し、本明細書で開示されるように、メチル化CpGジヌクレオチド配列と非メチル化CpGジヌクレオチド配列とを区別するのに有用である。処理の方法は、当該技術分野において既知である(例えば、PCT/EP2004/011715及びWO2013/116375、その各々全体が参照によって組み込まれる)。いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩処理は、変性溶媒、例えばこれらに限定されないが、n-アルキレングリコールもしくはジエチレングリコールジメチルエーテル(DME)などの存在下で、またはジオキサンもしくはジオキサン誘導体の存在下で実施される。いくつかの実施形態では、変性溶媒は、1%~35%(v/v)の濃度で使用される。いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩反応は、スカベンジャー、例えばこれらに限定されないが、クロマン誘導体、例えば、6-ヒドロキシ-2,5,7,8,-テトラメチルクロマン2-カルボン酸またはトリヒドロキシ安息香酸及びそれらの誘導体、例えば、没食子酸などの存在下で実施される(PCT/EP2004/011715を参照し、その全体が参照によって組み込まれる)。ある特定の好ましい実施形態では、亜硫酸水素塩反応は、例えば、WO2013/116375に記載されるような、亜硫酸水素アンモニウムでの処理を含む。
いくつかの実施形態では、処理されたDNAの断片は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドのセット(例えば、表10、表19及び表20を参照のこと)ならびに増幅酵素を使用して増幅される。いくつかのDNAセグメントの増幅は、1つの同じ反応容器中で同時に実施され得る。典型的には、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して実施される。アンプリコンは、典型的には100~2000塩基対長である。
方法の別の実施形態では、DMR(例えば、DMR1~375、表2及び表18)を含むマーカー内の、または近傍のCpG位置のメチル化状態は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出されてよい。この技術(MSP)は、Hermanの米国特許第6,265,171号に記載されている。亜硫酸水素塩処理DNAの増幅を目的としたメチル化状態特異的プライマーの使用は、メチル化核酸と非メチル化核酸との間の区別を可能にする。MSPプライマー対は、亜硫酸水素塩処理CpGジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを含有する。したがって、プライマーの配列は、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。非メチル化DNAに特異的なMSPプライマーは、CpG中においてC位の位置に「T」を含有する。
増幅によって得られた断片は、直接的にまたは間接的に検出可能な標識を保持し得る。いくつかの実施形態では、標識は、質量分析計で検出され得る典型的な質量を有する蛍光標識、放射性核種、または着脱可能な分子断片である。標識が質量標識である場合、いくつかの実施形態は、標識アンプリコンが単一の正または負の正味電荷を有し、質量分析計中で良好な検出能を可能にすることをもたらす。検出は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI)によって、または電子スプレー質量分析(ESI)を使用して実施かつ可視化されてよい。
これらのアッセイ技術に好適なDNAを単離する方法は、当該技術分野において既知である。特に、いくつかの実施形態は、米国特許出願第13/470,251号(“Isolation of Nucleic Acids”)に記載されるような核酸の単離を含み、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマーカーは、糞便試料上で実施されるQUARTSアッセイに用途を見出す。いくつかの実施形態では、DNA試料を生成する方法ならびに、特に、高度に精製された低含量核酸を少量(例えば、100マイクロリットル未満、60マイクロリットル未満)含み、DNA試料を試験するために使用されるアッセイ(例えば、PCR、INVADER、QuARTSアッセイなど)を阻害する物質を実質的に及び/または効果的に含まないDNA試料を生成する方法が、提供される。そのようなDNA試料は、患者から採取した試料中に存在する遺伝子、遺伝子バリアント(例えば、アレル)、または遺伝子修飾(例えば、メチル化)の存在を定性的に検出するか、またはその活性、発現、もしくは量を定量的に測定する診断アッセイに用途を見出す。例えば、一部のがんは、特定の変異体アレルまたは特定のメチル化状態の存在と相関し、それゆえ、そのような変異体アレルまたはメチル化状態を検出及び/または定量化することは、がんの診断及び処置において予測値を有する。
多くの有益な遺伝子マーカーは、試料中に極めて少量で存在し、そのようなマーカーを生成する事象の多くは稀なものである。結果として、PCRなどの感度の高い検出方法であっても、アッセイの検出閾値を満たす、またはそれに取って代わるように低含量の標的を十分に提供するには、多量のDNAを必要とする。さらに、少量であっても阻害物質の存在は、そのような少量の標的を検出することを目的とするこれらのアッセイの正確さ及び精度を損なう。したがって、本明細書で提供されるのは、そのようなDNA試料を生成するための、体積及び濃度の必要な管理を提供する方法である。
いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、または唾液を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。そのような試料は、当該技術分野において既知の、例えば、当業者には明らかとなるような多数の手段によって得られ得る。無細胞または実質的に無細胞の試料は、当業者に既知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが遠心分離及び濾過を含む技術に試料を供することによって得られ得る。非侵襲的技術が試料を得るために使用されることが一般には好ましいが、試料、例えば、組織ホモジネート、組織切片、及び生検材料などを得ることが依然として好ましい場合もある。技術は、試料を調製するために、かつ試験用の核酸を提供するために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、DNAは、直接的遺伝子捕捉、例えば、米国特許第8,808,990号及び同第9,169,511号に、ならびにWO2012/155072に詳述されるようなものを使用して、または関連方法によって糞便試料から、または血液から、または血漿試料から単離される。
マーカーの分析は、1つの試験試料内で追加マーカーとは別個にまたは同時に実施され得る。例えば、いくつかのマーカーは、複数の試料を効率的に処理するために、かつ診断及び/または予後のより高い精度を提供するという可能性のために1つの試験で組み合わされ得る。加えて、当業者は、同じ対象からの複数の試料を(例えば、連続した時点で)試験する価値を認識することになる。一連の試料に関するそのような試験は、マーカーのメチル化状態における経時的な変化の同定を可能にし得る。メチル化状態の変化に加えて、メチル化状態の変化の欠如は、疾患状態、例えば、事象開始からのおよその時間を同定すること、回復可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な療法の有効性、ならびに未来事象のリスクを含む、対象の転帰の同定が挙げられるが、これらに限定されない状態についての有用な情報を提供し得る。
バイオマーカーの分析は、様々な物理的形式で実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用は、多数の試験試料の処理を容易にするために使用され得る。あるいは、単一の試料形式は、時宜を得た手法で、例えば、外来輸送または緊急救命室の状況で即時の処置及び診断を容易にするために開発され得た。
技術の実施形態は、キットの形態で提供されることが考慮される。キットは、本明細書に記載される組成物、デバイス、装置など、及びキットの使用に関する説明書の実施形態を含む。そのような説明書は、試料から分析物を調製する適切な方法、例えば、試料を収集し、試料から核酸を調製する方法について記載する。キットの個々の構成要素は、適切な容器及びパッケージング(例えば、バイアル、箱、ブリスターパック、アンプル、瓶、ボトル、チューブなど)にパッケージングされ、構成要素は、簡便な保存、輸送、及び/またはキットのユーザによる使用のために適切な容器(例えば、箱(複数可))中に一緒にパッケージングされる。液体構成要素(例えば、緩衝液)は、ユーザによって再構成される凍結乾燥形態で提供される場合があると理解される。キットは、キットの性能を評価する、検証する、及び/または保証するために対照または参照を含んでよい。例えば、試料中に存在する核酸の量をアッセイするためのキットは、既知濃度の同じまたは別の核酸を比較のために含む対照及び、いくつかの実施形態では、対照核酸に特異的な検出試薬(例えば、プライマー)を含んでよい。キットは、臨床設定での使用に、及びいくつかの実施形態では、ユーザの自宅での使用に適している。キットの構成要素は、いくつかの実施形態では、試料から核酸溶液を調製するためのシステムの機能を提供する。いくつかの実施形態では、システムのある特定の構成要素は、ユーザによって提供される。
方法
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、DMR(例えば、表2及び表18に提供されるような、例えば、DMR1~375)を含む少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、KLHDC7B_B、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TBX1_B、TRH_A、及びTRIM67_Bからなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_Bからなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ABLIM1、AJAP1_B、ASCL2、ATP6V1B1、BANK1、CALN1_A、CALN1_B、CLIC6、DSCR6、FOXP4、GAD2、GCGR、GP5、GRASP、HBM、HNF1B_B、KLF16、MAGI2、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8859253-8859329、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr6.157557371-157557657、MPZ、NKX2-6、PDX1、PLXNC1_A、PPARG、PRKCB、PTPRN2、RBFOX_A、SCRT2_A、SLC7A4、STAC2_B、STX16_A、STX16_B、TBX1、TRH_A、VSTM2B_A、ZBTB16、ZNF132、及びZSCAN23からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)トリプルネガティブ乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、CALN1_A、LOC100132891、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、DLX4、GP5、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、KCNK9、SCRT2_B、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、及びDSCR6からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)トリプルネガティブ乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)トリプルネガティブ乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ABLIM1、AFAP1L1、AKR1B1、ALOX5、AMN、ARL5C、BANK1、BCAT1、BEGAIN、BEST4、BHLHE23_B、BHLHE23_C、C17orf64、C1QL2、C7orf52、CALN1_B、CAV2、CD8A、CDH4_A、CDH4_B、CDH4_C、CDH4_D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_B、CLIP4、CR1、DLK1、DNAJC6、DNM3_A、EMX1_A、ESPN、FABP5、FAM150A、FLJ42875、GLP1R、GNG4、GYPC_A、HAND2、HES5、HNF1B_A、HNF1B_B、HOXA1_A、HOXA1_B、HOXA7_A、HOXA7_B、HOXA7_C、HOXD9、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、IGSF9B_A、IL15RA、INSM1、ITPKA_B、ITPRIPL1、KCNE3、KCNK17_B、LIME1、LOC100132891、LOC283999、LY6H、MAST1、MAX.chr1.158083198-158083476、MAX.chr1.228074764-228074977、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr10.130085265-130085312、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr14.101176106-101176260、MAX.chr15.96889069-96889128、MAX.chr17.8230197-8230314、MAX.chr19.46379903-46380197、MAX.chr2.97193163-97193287、MAX.chr2.97193478-97193562、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr21.44782441-44782498、MAX.chr22.23908718-23908782、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.180101084-180101094、MAX.chr5.42952185-42952280、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr6.27064703-27064783、MAX.chr7.152622607-152622638、MAX.chr8.145104132-145104218、MAX.chr9.136474504-136474527、MCF2L2、MSX2P1、NACAD、NID2_B、NID2_C、ODC1、OSR2_B、PAQR6、PCDH8、PIF1、PPARA、PPP2R5C、PRDM13_A、PRHOXNB、PRKCB、RBFOX3_A、RBFOX3_B、RFX8、SNCA、STAC2_A、STAC2_B、STX16_B SYT5、TIMP2、TMEFF2、TNFRSF10D、TRH_B、TRIM67、TRIM71_C、USP44_A、USP44_B、UTF1、UTS2R、VSTM2B_A、VSTM2B_B、ZFP64、及びZNF132からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)HER2+乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、CHST2_A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、TRIM67、ATP6V1B1、C17orf64、CHST2_B、DLX4、DNM3_A、EMX1_A、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、LAYN、PLXNC1_A、RIC3、SCRT2_B、ALOX5、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、AJAP1_B、DSCR6、及びMAX.chr11.68622869-68622968からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)HER2+乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、C10orf125からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)HER2+乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ARL5C、BHLHE23_C、BMP6、C10orf125、C17orf64、C19orf66、CAMKV、CD1D、CDH4_E、CDH4_F、CHST2_A、CRHBP、DLX6、DNM3_A、DNM3_B、DNM3_C、ESYT3、ETS1_A、ETS1_B、FAM126A、FAM189A1、FAM20A、FAM59B、FBN1、FLRT2、FMN2、FOXP4、GAS7、GYPC_A、GYPC_B、HAND2、HES5、HMGA2、HNF1B_B、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、KCNH8、KCNK17_A、KCNQ2、KLHDC7B、LOC100132891、MAX.chr1.46913931-46913950、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990591-59990895、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr20.1783841-1784054、MAX.chr21.47063802-47063851、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.172234248-172234494、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr6.130686865-130686985、MAX.chr8.687688-687736、MAX.chr8.688863-688924、MAX.chr9.114010-114207、MPZ、NID2_A、NKX2-6、ODC1、OSR2_A、POU4F1、PRDM13_B、PRKCB、RASGRF2、RIPPLY2、SLC30A10、ST8SIA4、SYN2、TRIM71_A、TRIM71_B、TRIM71_C、UBTF、ULBP1、USP44_B、及びVSTM2B_Aからなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)ルミナルA乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、BHLHE23_C、CD1D、CHST2_A、FAM126A、FMN2、HOXA1_A、HOXA7_A、KCNH8、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、SLC30A10、TRIM67、ATP6V1B1、BANK1、C10orf125、C17orf64、CHST2_B、DNM3_A、EMX1_A、GP5、IGF2BP3_A、IGF2BP3_B、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、ODC1、PLXNC1_A、PRKCB、ST8SIA4、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr12.59990671-59990859、BHLHE23_D、COL23A1、KCNK9、OTX1、PLXNC1_A、HNF1B_B、MAST1、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、RBFOX_A、MAX.chr12.4273906-4274012、GAS7、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、GYPC_B、DLX6、FBN1、OSR2_A、BEST4、DSCR6、MAX.chr11.68622869-68622968からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)ルミナルA乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)ルミナルA乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ACCN1、AJAP1_A、AJAP1_B、BEST4、CALN1_B、CBLN1_B、CDH4_E、DLX4、FOXP4、IGSF9B_B、ITPRIPL1、KCNA1、KLF16、LMX1B_A、MAST1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr17.73073682-73073814、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679578-42679917、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr8.124173128-124173268、MPZ、PPARA、PRMT1、RBFOX3_B、RYR2_A、SALL3、SCRT2_A、SPHK2、STX16_B SYNJ2、TMEM176A、TSHZ3、及びVIPR2からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)ルミナルB乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、CALN1_A、LOC100132891、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、DLX4、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、ITPRIPL1、KLF16、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr19.46379903-46380197、BHLHE23_D、HNF1B_B、TRH_A、ASCL2、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、AJAP1_B、及びDSCR6からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)ルミナルB乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_Dからなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)ルミナルB乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、C10orf93、C20orf195_A、C20orf195_B、CALN1_B、CBLN1_A、CBLN1_B、CCDC61、CCND2_A、CCND2_B、CCND2_C、EMX1_B、FAM150B、GRASP、HBM、ITPRIPL1、KCNK17_A、KIAA1949、LOC100131176、MAST1、MAX.chr1.8277285-8277316、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr18.5629721-5629791、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr22.42679767-42679917、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MAX.chr6.157556793-157556856、MAX.chr8.124173030-124173395、MN1、MPZ、NR2F6、PDXK_A、PDXK_B、PTPRM、RYR2_B、SERPINB9_A、SERPINB9_B、SLC8A3、STX16_B TEPP、TOX、VIPR2、VSTM2B_A、ZNF486、ZNF626、及びZNF671からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)BRCA1乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)BRCA1乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、ANTXR2、B3GNT5、BHLHE23_C、BMP4、CHRNA7、EPHA4、FAM171A1、FAM20A、FMNL2、FSCN1、GSTP1、HBM、IGFBP5、IL17REL、ITGA9、ITPRIPL1、KIRREL2、LRRC34、MAX.chr1.239549742-239549886、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr11.14926602-14926729、MAX.chr11.14926860-14927148、MAX.chr15.96889013-96889128、MAX.chr2.238864674-238864735、MAX.chr5.81148300-81148332、MAX.chr7.151145632-151145743、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr8.143533298-143533558、MERTK、MPZ、NID2_C、NTRK3、OLIG3_A、OLIG3_B、OSR2_C、PROM1、RGS17、SBNO2、STX16_B TBKBP1、TLX1NB、VIPR2、VN1R2、VSNL1、及びZFP64からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)BRCA2乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。 本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)BRCA2乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、CDH4_E、FLJ42875、GAD2、GRASP、ITPRIPL1、KCNA1、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr18.76734362-76734370、MAX.chr18.76734423-76734476、MAX.chr19.30719261-30719354、MAX.chr4.8859602-8859669、MAX.chr4.8860002-8860038、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.178957564-178957598、MAX.chr5.77268672-77268725、MPZ、NKX2-6、PRKCB、RBFOX3_B、SALL3、及びVSTM2B_Aからなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)浸潤性乳癌を検出する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、ITPRIPL1、ITPRIPL1、DLX4、CALN1_A、及びIGF2BP3_Bからなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、SCRT2_B、ITPRIPL1、及びMAX.chr8.124173030-12417339からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別する(例えば、100%以上の感度及び91%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)対象から得られた核酸(例えば、血液もしくは血漿などの体液または乳房組織から単離される、例えば、ゲノムDNA)を、DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、及びITPRIPL1からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1個のマーカー内で、メチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップ、ならびに
2)非浸潤性乳管癌高悪性度(DCIS-HG)乳癌組織と非浸潤性乳管癌低悪性度(DCIS-LG)乳房組織とを区別する(例えば、80%以上の感度及び80%以上の特異性で得られた)ステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)メチル化特異的手法でDNAを修飾する試薬(例えば、ここで試薬は、亜硫酸水素塩試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素である)を用いて生体試料中のゲノムDNAを処理することによって、ヒト個体の生体試料中における1つ以上の遺伝子のメチル化レベルを測定するステップであって、1つ以上の遺伝子が、以下の群のうち1つから選択されるステップ:
(i)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1、
(ii)ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B、ならびに
(iii)CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B、
2)選択された1つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、処理されたゲノムDNAを増幅するステップ、ならびに
3)ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、及び標的捕捉によって、1つ以上の遺伝子のメチル化レベルを決定するステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)試料からのDNA中における少なくとも1つのメチル化マーカー遺伝子量を測定するステップであって、1つ以上の遺伝子が、以下の群のうち1つから選択されるステップ:
(i)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1、
(ii)ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B、ならびに
(iii)CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B、
2)DNA中における少なくとも1個の参照マーカー量を測定するステップ、ならびに
3)DNA中で測定された少なくとも1つのメチル化マーカー遺伝子量の値を、DNA中で測定された参照マーカー遺伝子量のパーセンテージとして算出するステップであって、値が試料中で測定された少なくとも1つのメチル化マーカーDNA量を示すステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)メチル化特異的手法でDNAを修飾できる亜硫酸水素塩試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)を用いて生体試料中のゲノムDNAを処理することによって、ヒト個体の生体試料中における1つ以上の遺伝子に関するCpG部位のメチル化レベルを測定するステップ、
2)選択された1つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、修飾されたゲノムDNAを増幅するステップ、ならびに
3)メチル化特異的PCR、定量メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって、CpG部位のメチル化レベルを決定するステップであって、
1つ以上の遺伝子が、以下の群のうち1つから選択されるステップ:
(i)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、及びABLIM1、
(ii)ABLIM1_B、AJAP1_C、ALOX5_B、ASCL2_B、BANK1_B、BHLHE23_E、C10orf125_B、C17orf64_B、CALN1_1520、CALN_1B、CD1D_1058、CDH4_7890、CHST2_8128、CHST2_8384、CHST2_9316、CHST2_9470、CLIC6_B、CXCL12_B、DLX4_B、DNM3_D、EMX1_A、ESPN_B、FAM59B_7764、FOXP4_B、GP5、HOXA1_C、IGF2BP3_C、IPTRIPL1_1138、IPTRIPL1_1200、KCNK9_B、KCNK17_C、LAYN_B、LIME1_B、LMX1B_D、LOC100132891_B、MAST1_B、MAX.chr12.427.br、MAX.chr20.4422、MPZ_5742、MPZ_5554、MSX2P1_B、ODC1_B、OSR2_A、OTX1_B、PLXNC1_B、PRKCB_7570、SCRT2_C、SLC30A10、SPHK2_B、ST8SIA4_B、STX16_C、TRH_A、及びTRIM67_B、ならびに
(iii)CD1D、ITPRIPL1、FAM59B、C10orf125、TRIM67、SPHK2、CALN1_B、CHST2_B、MPZ、CXCL12_B、ODC1_B、OSR2_A、TRH_A、及びC17orf64_B。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)メチル化特異的手法でDNAを修飾する試薬(例えば、ここで試薬は、亜硫酸水素塩試薬、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化依存性制限酵素である)を用いて生体試料中のゲノムDNAを処理することによって、ヒト個体の生体試料中における1つ以上の遺伝子のメチル化レベルを測定するステップであって、1つ以上の遺伝子が、以下の群のうち1つから選択されるステップ:
(i)BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6、
(ii)MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、及びMAX.chr11.68622869-68622968、
(iii)ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4、
(iv)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、及びC10orf125、
(v)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125、
(vi)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ならびに
(vii)DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、ITPRIPL1、
2)選択された1つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、処理されたゲノムDNAを増幅するステップ、ならびに
3)ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、及び標的捕捉によって、1つ以上の遺伝子のメチル化レベルを決定するステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)試料からのDNA中における少なくとも1つのメチル化マーカー遺伝子量を測定するステップであって、1つ以上の遺伝子が、以下の群のうち1つから選択されるステップ:
(i)BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6、
(ii)MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、及びMAX.chr11.68622869-68622968、
(iii)ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4、
(iv)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、及びC10orf125、
(v)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125、
(vi)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ならびに
(vii)DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、ITPRIPL1、
2)DNA中における少なくとも1個の参照マーカー量を測定するステップ、ならびに
3)DNA中で測定された少なくとも1つのメチル化マーカー遺伝子量の値を、DNA中で測定された参照マーカー遺伝子量のパーセンテージとして算出するステップであって、値が試料中で測定された少なくとも1つのメチル化マーカーDNA量を示すステップ。
本技術のいくつかの実施形態では、以下のステップを含む方法が提供される:
1)メチル化特異的手法でDNAを修飾できる亜硫酸水素塩試薬(例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、及び亜硫酸水素塩試薬)を用いて生体試料中のゲノムDNAを処理することによって、ヒト個体の生体試料中における1つ以上の遺伝子に関するCpG部位のメチル化レベルを測定するステップ、
2)選択された1つ以上の遺伝子に対するプライマーのセットを使用して、修飾されたゲノムDNAを増幅するステップ、ならびに
3)メチル化特異的PCR、定量メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって、CpG部位のメチル化レベルを決定するステップであって、
1つ以上の遺伝子が、以下の群のうち1つから選択されるステップ:
(i)BHLHE23_C、CALN1_A、CD1D、HOXA7_A、LOC100132891、MAX.chr1.8277479-8277527、MAX.chr15.96889013-96889128、NACAD、ATP6V1B1、BANK1、C17orf64、DLX4、EMX1_A、FOXP4、GP5、ITPRIPL1、LMX1B_A、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、MAX.chr8.124173030-124173395、MPZ、PRKCB、STX16_B UBTF、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、ZSCAN12、BHLHE23_D、CXCL12、KCNK9、OTX1、RIC3、SCRT2_B、MAX.chr17.73073682-73073814、CDH4_E、HNF1B_B、TRH_A、MAX.chr20.1784209-1784461、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr5.77268672-77268725、BEST4、及びDSCR6、
(ii)MAX.chr15.96889013-96889128、ATP6V1B1、C17orf64、ITPRIPL1、MAX.chr11.14926602-14927148、MAX.chr5.42994866-42994936、LOC100132891、ITPRIPL1、ABLIM1、MAX.chr19.46379903-46380197、COL23A1、LAYN、OTX1、TRH_A、MAX.chr5.145725410-145725459、及びMAX.chr11.68622869-68622968、
(iii)ATP6V1B1、MAX.chr11.14926602-14927148、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、TRIM67、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、MAX.chr5.42994866-42994936、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_D、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、及びDLX4、
(iv)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、GP5、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、C17orf64、EMX1_A、CHST2_B、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ZSCAN12、GRASP、及びC10orf125、
(v)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、ST8SIA4、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_D、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、ODC1、CHST2_A、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、CHST2_B、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、ABLIM1、SLC30A10、C10orf125、
(vi)ATP6V1B1、LMX1B_A、BANK1、OTX1、MAX.chr11.14926602-14927148、UBTF、PRKCB、TRH_A、MPZ、DNM3_A、TRIM67、PLXNC1_A、MAX.chr12.4273906-4274012、CALN1_A、ITPRIPL1、MAX.chr12.4273906-4274012、GYPC_B、MAX.chr5.42994866-42994936、OSR2_A、SCRT2_B、MAX.chr5.145725410-145725459、MAX.chr11.68622869-68622968、MAX.chr8.124173030-124173395、MAX.chr20.1784209-1784461、LOC100132891、BHLHE23_C、ALOX5、MAX.chr19.46379903-46380197、CHST2_B、MAX.chr5.77268672-77268725、EMX1_A、DSCR6、ITPRIPL1、IGF2BP3_B、CDH4_E、DLX4、ABLIM1、BHLHE23_D、ならびに
(vii)DSCR6、SCRT2_B、MPZ、MAX.chr8.124173030-124173395、OSR2_A、MAX.chr11.68622869-68622968、ITPRIPL1、MAX.chr5.145725410-145725459、BHLHE23_C、ITPRIPL1。
好ましくは、そのような方法の感度は、約70%~約100%、または約80%~約90%、または約80%~約85%である。好ましくは、特異性は、約70%~約100%、または約80%~約90%、または約80%~約85%である。
ゲノムDNAは、市販キットの使用を含む、いずれかの手段によって単離されてよい。簡潔に述べると、目的のDNAが細胞膜によって被包されている場合、生体試料は酵素的、化学的または機械的手段によって破壊かつ溶解されなければならない。次いで、DNA溶液から、例えば、プロテイナーゼKを用いた消化によって、タンパク質及び他の混入物が除去されてよい。次いで、ゲノムDNAが溶液から回収される。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのDNAの結合を含む、様々な方法によって実施されてよい。方法の選択は、時間、費用、及び所要のDNA量を含む、いくつかの要因に影響されることになる。腫瘍性物質または前腫瘍性物質を含む全ての臨床試料タイプが本方法での使用に好適であり、例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、乳房組織、結腸排出物、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞、及びそれらの組合せである。
技術は、試料を調製するために、かつ試験用の核酸を提供するために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、DNAは、直接的遺伝子捕捉、例えば、米国特許出願第61/485386号に詳述されるようなものを使用して、または関連方法によって糞便試料から、または血液から、または血漿試料から単離される。
次いで、ゲノムDNA試料は、DMR(例えば、表2及び表18に提供されるような、例えば、DMR1~375)を含む少なくとも1個のマーカー内でメチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドとを区別する、少なくとも1つの試薬、または一連の試薬で処理される。
いくつかの実施形態では、試薬は、5’位でメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換する。しかしながら、いくつかの実施形態では、試薬は、メチル化感受性制限酵素であってよい。
いくつかの実施形態では、ゲノムDNA試料は、5’位でメチル化されていないシトシン塩基が、ウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる別の塩基に変換されるような手法で処理される。いくつかの実施形態では、この処理は、亜硫酸水素塩(bisulfite)(亜硫酸水素塩(hydrogen sulfite)、二亜硫酸塩)、続いてアルカリ加水分解で実施される。
次いで、処理された核酸が分析されて、標的遺伝子配列(DMR、例えば、表2及び表18に提供されるような、例えば、DMR1~375から選択される少なくとも1箇所のDMRを含むマーカーからの少なくとも1つの遺伝子、ゲノム配列、またはヌクレオチド)のメチル化状態を決定する。分析の方法は、本明細書に列挙されるもの、例えば、本明細書に記載されるようなQuARTS及びMSPを含む、当該技術分野において既知のものから選択されてよい。
異常なメチル化、より具体的には、DMR(例えば、表2及び表18に提供されるような、例えば、DMR1~375)を含むマーカーの高メチル化は、乳癌と関連する。
技術は、乳癌と関連するいずれかの試料の分析に関する。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、患者から得られた組織及び/または生体液を含む。いくつかの実施形態では、試料は分泌物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、胃分泌物、膵液、胃腸生検試料、乳房生検からの顕微解剖細胞、及び/または糞便から回収した細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は乳房組織を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。試料としては、乳房、肝臓、胆管、膵臓、胃、結腸、直腸、食道、小腸、虫垂、十二指腸、ポリープ、胆嚢、肛門、及び/または腹膜からの細胞、分泌物、または組織を挙げてよい。いくつかの実施形態では、試料は、細胞液、腹水、尿、糞便、膵液、内視鏡検査中に得られた液体、血液、粘液、または唾液を含む。いくつかの実施形態では、試料は糞便試料である。いくつかの実施形態では、試料は、乳房組織試料である。
そのような試料は、当該技術分野において既知の、例えば、当業者には明らかとなるような多数の手段によって得られ得る。例えば、尿及び糞便試料は、容易に達成可能であるが、血液、腹水、血清、または膵液試料は、例えば、ニードル及びシリンジを使用することによって非経口的に得られ得る。無細胞または実質的に無細胞の試料は、当業者に既知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが遠心分離及び濾過を含む技術に試料を供することによって得られ得る。非侵襲的技術が試料を得るために使用されることが一般には好ましいが、試料、例えば、組織ホモジネート、組織切片、及び生検材料などを得ることが依然として好ましい場合もある。
いくつかの実施形態では、技術は、患者(例えば、乳癌を有する、早期乳癌を有する、または乳癌を発症する可能性がある患者)(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌のうち1つ以上を有する患者)を処置する方法に関し、本方法は、本明細書で提供されるような1箇所以上のDMRのメチル化状態を決定すること、及びメチル化状態を決定する結果に基づいて患者に処置を投与することを含む。処置は、医薬化合物の投与、ワクチンの投与、外科手術の実施、患者の撮像、別の試験の実施であってよい。好ましくは、用途は、臨床スクリーニングの方法、予後評価の方法、療法の結果をモニターする方法、特定の治療的処置に応答する可能性が最も高い患者を同定する方法、患者または対象を撮像する方法、ならびに薬物のスクリーニング及び開発方法にある。
本技術のいくつかの実施形態では、対象中の乳癌を診断する方法が提供される。「診断すること」及び「診断」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が所与の疾患もしくは状態に罹患しているか否か、または将来的に所与の疾患もしくは状態を発症する可能性があるか否かを、当業者が推定し、さらに決定し得る方法を指す。当業者は、多くの場合に1つ以上の診断指標、例えば、バイオマーカー(例えば、本明細書で開示されるようなDMR)などに基づいて診断を行い、そのメチル化状態は、状態の存在、重症度、または欠如を示している。
診断と共に、臨床的ながん予後は、がんの攻撃性及び腫瘍再発の可能性を決定し、最も効果的な療法を計画することに関する。より正確な予後予測が行われ得るか、あるいはがんを発症する潜在的リスクが評価され得る場合、適切な療法、及びいくつかの場合では、患者にとってそれほど過酷ではない療法が選択され得る。がんバイオマーカーの評価(例えば、メチル化状態を決定すること)は、良好な予後を有し、及び/またはがんを発症するリスクが低く、療法を全く必要としないか、または限定的な療法を必要とすることになる対象と、がんを発症する、またはがんを再発する可能性が高く、より集中的な処置から恩恵を受ける可能性がある対象とを分けるのに有用である。
そのようなものとして、「診断を行うこと」または「診断すること」は、本明細書で使用される場合、がんを発症するリスクを決定すること、または予後を決定することをさらに含み、それは、本明細書に開示される診断バイオマーカー(例えば、DMR)の指標に基づいて、臨床転帰(医学的処置の有無にかかわらず)を予測すること、適切な処置(もしくは処置が効果的であるかどうか)を選択すること、または現在の処置をモニターし、場合により処置を変更することを可能にし得る。さらに、本明細書で開示される主題のいくつかの実施形態では、経時的なバイオマーカーの複数の決定は、診断及び/または予後予測を容易にするために行われ得る。バイオマーカーの時間変化は、臨床転帰を予測するため、乳癌の進行をモニターするため、及び/またはがんを対象とする適切な療法の有効性をモニターするために使用され得る。そのような実施形態では、例えば、効果的な療法の過程において経時的に、生体試料中における本明細書に開示される1個以上のバイオマーカー(例えば、DMR)(及びモニターされる場合、場合により1個以上の追加のバイオマーカー(複数可))のメチル化状態の変化が確認されることを期待する場合がある。
本明細書で開示される主題は、いくつかの実施形態では、対象中のがんの予防または処置を開始または継続するかどうかを決定する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ある期間にわたって対象から一連の生体試料を提供すること、一連の生体試料を分析し、生体試料の各々において本明細書で開示される少なくとも1個のバイオマーカーのメチル化状態を決定すること、及び生体試料の各々においてバイオマーカーのうち1個以上のメチル化状態におけるいずれかの測定可能な変化を比較することを含む。ある期間にわたるバイオマーカーにおけるメチル化状態のいずれの変化も、がんを発症するリスクを予測するため、臨床転帰を予測するため、がんの予防または療法を開始または継続するかどうか、及び現在の療法ががんを効果的に処置しているかどうかを決定するために使用され得る。例えば、第1時点は、処置の開始前に選択され得、第2時点は、処置開始後のある時点で選択され得る。メチル化状態は、異なる時点で採取された試料の各々で測定され得、定性的及び/または定量的な差に留意する。異なる試料からのバイオマーカーレベルのメチル化状態における変化は、対象における乳癌リスク、予後、処置の有効性の決定、及び/またはがんの進行と相関し得る。
好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、初期段階で、例えば、疾患の症状が現れる前の疾患の処置または診断のためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、臨床病期における疾患の処置または診断のためのものである。
既に述べたように、いくつかの実施形態では、1個以上の診断または予後バイオマーカーの複数の決定が行われ得、マーカーの時間変化は、診断または予後を決定するために使用され得る。例えば、診断マーカーは、初回に、及び2回目に再度決定され得る。そのような実施形態では、初回から2回目でのマーカーの増加は、特定のがん型もしくは重症度、または所与の予後を診断し得る。同様に、初回から2回目でのマーカーの減少は、特定のがん型もしくは重症度、または所与の予後を示し得る。さらに、1個以上のマーカーに関する変化の程度は、がんの重症度及び将来の有害事象に関連し得る。当業者は、ある特定の実施形態では、同じバイオマーカーの比較測定が複数の時点で行われ得るが、また所与のバイオマーカーをある時点で、及び第2バイオマーカーを第2時点で測定することもでき、これらのマーカーの比較によって診断情報が提供され得ると理解することになる。
本明細書で使用される場合、「予後を決定すること」という語句は、当業者が対象における状態の経過または転帰を予測し得る方法を指す。「予後」という用語は、100%の精度で状態の経過または転帰を予測する能力、あるいは所与の経過または転帰が、バイオマーカー(例えば、DMR)のメチル化状態に基づいて生じる可能性が予想通りに高い、または低いことを予測する能力を指すわけではない。その代わりに、当業者は、「予後」という用語が、ある特定の経過または転帰が生じることになる確率、すなわち、経過または転帰が、状態を示さないそれらの個体と比較した場合に所与の状態を示す対象で生じる可能性が高いという確率の上昇を指すと理解することになる。例えば、状態を示さない(例えば、1箇所以上のDMRの正常なメチル化状態を有する)個体では、所与の結果(例えば、乳癌に罹患すること)の可能性が非常に低い場合がある。
いくつかの実施形態では、統計分析は、予後指標を有害転帰に対する素因と関連付ける。例えば、いくつかの実施形態では、がんを有しない患者から得られた正常対照試料中のものとは異なるメチル化状態は、統計的有意性のレベルによって決定されるように、対象が、対照試料中のメチル化状態により類似したレベルを有する対象よりも、がんに罹患する可能性が高いことを示し得る。加えて、ベースライン(例えば、「正常な」)レベルからのメチル化状態の変化は、対象の予後を反映し得、メチル化状態における変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、多くの場合に2つ以上の集団を比較して、信頼区間及び/またはp値を決定することによって決定される。例えば、Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本主題の例示的な信頼区間は、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%及び99.99%である一方で、例示的なp値は、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、及び0.0001である。
他の実施形態では、本明細書で開示される予後または診断バイオマーカー(例えば、DMR)のメチル化状態における変化の閾値程度が確立され得、生体試料中におけるバイオマーカーのメチル化状態の変化程度は、メチル化状態における変化の閾値程度と単純に比較される。本明細書で提供されるバイオマーカーのメチル化状態において好ましい閾値の変化は、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約50%、約75%、約100%、及び約150%である。さらに他の実施形態では、「ノモグラム」が確立され得、それによって予後または診断指標(バイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せ)のメチル化状態が、所与の転帰に対して関連する性質に直接関連する。当業者は、そのようなノモグラムの使用に精通し、集団平均ではなく個々の試料測定値が参照されるため、この測定値の不確実性がマーカー濃度の不確実性と同じであることを理解した上で、2つの数値を関連付ける。
いくつかの実施形態では、対照試料は生体試料と同時に分析され、その結果、生体試料から得られた結果は対照試料から得られた結果と比較され得る。さらに、検量線が提供され得、これと生体試料のアッセイ結果が比較されてよいことが考慮される。そのような検量線は、アッセイ単位に応じたバイオマーカーのメチル化状態、例えば、蛍光標識が使用される場合、蛍光シグナル強度を提示する。複数のドナーから採取した試料を使用すると、検量線は、正常組織中における1個以上のバイオマーカーの対照メチル化状態に加えて、化生を有するドナーから、または乳癌を有するドナーから採取した組織中における1個以上のバイオマーカーの「リスクがある」レベルを規定し得る。本方法のある特定の実施形態では、対象は、対象から得られた生体試料中に、本明細書で提供される1箇所以上のDMRの異常なメチル化状態を同定する時に化生を有すると同定される。本方法の他の実施形態では、対象から得られた生体試料中におけるそのようなバイオマーカーのうち1個以上の異常なメチル化状態を検出することは、対象ががんを有すると同定されることをもたらす。
マーカーの分析は、1つの試験試料内で追加マーカーとは別個にまたは同時に実施され得る。例えば、いくつかのマーカーは、複数の試料を効率的に処理するために、かつ診断及び/または予後のより高い精度を提供するという可能性のために1つの試験で組み合わされ得る。加えて、当業者は、同じ対象からの複数の試料を(例えば、連続した時点で)試験する価値を認識することになる。一連の試料に関するそのような試験は、マーカーのメチル化状態における経時的な変化の同定を可能にし得る。メチル化状態の変化に加えて、メチル化状態の変化の欠如は、疾患状態、例えば、事象開始からのおよその時間を同定すること、回復可能な組織の存在及び量、薬物療法の妥当性、様々な療法の有効性、ならびに未来事象のリスクを含む、対象の転帰の同定が挙げられるが、これらに限定されない状態についての有用な情報を提供し得る。
バイオマーカーの分析は、様々な物理的形式で実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用は、多数の試験試料の処理を容易にするために使用され得る。あるいは、単一の試料形式は、時宜を得た手法で、例えば、外来輸送または緊急救命室の状況で即時の処置及び診断を容易にするために開発され得た。
いくつかの実施形態では、対象は、対照メチル化状態と比較した場合、試料中における少なくとも1個のバイオマーカーのメチル化状態に測定可能な差が存在する場合に乳癌を有すると診断される。逆に、メチル化状態に全く変化がないと生体試料中で同定される場合、対象は、乳癌を有していない、がんのリスクがない、またはがんのリスクが低いと同定され得る。これに関して、がんまたはそのリスクを有する対象は、わずかか、実質的に全くがんまたはそのリスクを有しない対象と区別され得る。乳癌を発症するリスクを有するそれらの対象は、内視鏡サーベイランスを含む、より集中的及び/または定期的なスクリーニングスケジュールに置かれ得る。他方では、リスクが低いか、実質的にリスクを全く有しないそれらの対象は、将来のスクリーニング、例えば、本技術に従って実施されるスクリーニングのような時に、乳癌のリスクがそれらの対象で現れたことが示されるまで、乳癌の追加試験(例えば、侵襲的手順)に供されるのを回避する場合がある。
上述される通り、本技術の方法の実施形態に応じて、1個以上のバイオマーカーのメチル化状態における変化を検出することは、定性的決定であり得るか、またはそれは定量的決定であり得る。そのようなものとして、乳癌を有するような、または乳癌を発症するリスクがある対象を診断するステップは、ある特定の閾値測定が行われること、例えば、生体試料中における1個以上のバイオマーカーのメチル化状態が、所定の対照メチル化状態とは異なることを示す。本方法のいくつかの実施形態では、対照メチル化状態は、バイオマーカーに関するいずれかの検出可能なメチル化状態である。対照試料が生体試料と同時に試験される方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、対照試料中におけるメチル化状態である。本方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、検量線に基づく、及び/または検量線によって同定される。本方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、特異的状態または状態の範囲である。そのようなものとして、所定のメチル化状態は、当業者には明らかとなる許容される限度内で、実施される方法の実施形態及び所望の特異性などに一部基づいて選択され得る。
さらに診断方法に関して、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は温血動物であり、好ましい温血脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び動物対象の両方を含む。したがって、獣医学的な治療的使用が本明細書で提供される。そのようなものとして、本技術によって、哺乳動物、例えば、ヒトに加えてアムールトラなどの絶滅の危機に瀕しているために重要なそれらの哺乳動物、ヒトによる消費のために農場で飼育されている動物などの経済的に重要なそれらの哺乳動物、及び/またはペットとして、もしくは動物園で飼育されている動物などのヒトにとって社会的に重要な動物などの診断が可能になる。そのような動物の例としては、ネコ及びイヌなどの肉食動物、ブタ(pig)、雄ブタ、及びイノシシを含むブタ(swine)、反芻動物及び/または有蹄動物、例えば、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなど、ならびにウマが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、さらに提供されるのは、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ(競走馬を含む)などを含むが、これらに限定されない家畜の診断及び処置である。
本明細書で開示される主題は、対象中の乳癌及び/または特定の乳癌型(例えば、トリプルネガティブ乳癌、HER2+乳癌、ルミナルA乳癌、ルミナルB乳癌、BRCA1乳癌、BRCA2乳癌)を診断するためのシステムをさらに含む。システムは、例えば、生体試料が収集されている対象中の乳癌リスクについてスクリーニングする、または乳癌を診断するために使用され得る市販のキットとして提供され得る。本技術に従って提供される例示的なシステムは、表2及び表18に提供されるようなDMRのメチル化状態を評価することを含む。
実施例I.
本実施例は、乳癌特異的マーカーの発見及び組織の検証について記載する。
表1は、乳癌特異的マーカーの発見に使用した乳癌の各サブタイプに関する組織試料の数を示す。
RRBSによるメチル化マーカーの発見のために、凍結組織試料を、72件の浸潤性乳癌症例(18件のルミナルA、18件のルミナルB、18件の基底細胞様/トリプルネガティブ、及び18件のHER2+)、15件のBRCA生殖細胞系列変異患者の浸潤性乳癌(6件のBRCA1、9件のBRCA2)、ならびに45件の対照物(18件の正常な乳房(乳房縮小術または予防的乳房切除、9件の生殖細胞系BRCA保因者の組織学的に正常な乳房(予防的乳房切除)、及び18件の正常なバフィーコート))から得た。腫瘍及び乳房組織切片を専門のGI病理学者によって再調査し、診断を確認して異常な細胞充実性を推定した。次いで、切片を顕微解剖した。ゲノムDNAを、QiaAmp Mini kit(Qiagen,Valencia CA)を使用して精製した。DNA(300ng)を、10単位のMspIを用いた消化によって断片化した。消化した断片を5単位のクレノウ断片(3’-5’エキソ-)で末端修復かつAテーリングし、バーコード配列を含有する(各断片を、その試料IDと関連付けるために)メチル化TruSeqアダプター(Illumina,San Diego CA)に一晩ライゲートさせた。反応物を、AMPure XP SPRIビーズ/緩衝液(Beckman Coulter,Brea CA)を使用して精製した。
次いで、改良したEpiTectプロトコール(Qiagen)を使用して、組織試料に亜硫酸水素塩変換を施した(2回)。qPCR(LightCycler480-Roche,Mannheim Germany)を使用して、最適な濃縮Ctを決定した。以下の条件を、最終濃縮PCRに使用した:各50μLの反応物は、5uLの10×緩衝液、1.25uLの各10mMのデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、5uLのプライマーカクテル(約5uM)、15uLの鋳型(試料)、1uLのPfuTurbo Cxホットスタート(Agilent,Santa Clara CA)及び22.75の水を含有し、温度及び時間は、それぞれ95℃-5分、98℃-30秒、16サイクルの98℃-10秒、65℃-30秒、72℃-30秒、72℃-5分及び4℃保持であった。試料をSPRIビーズで精製し、次いでバイオアナライザ2100(Agilent)上で試験して、濃縮のDNAサイズ分布を評価した。160~520bp断片(40~400bpのインサート)のサイズ選択を、AMPure XP SPRIビーズ/緩衝液(Beckman Coulter,Brea CA)を使用して実施した。緩衝液カットオフは、0.7×~1.1×試料体積であった。試料をランダム化スキームに基づいて4プレックスライブラリーに組み合わせ(等モル)、最終的なサイズ及び濃度の検証についてバイオアナライザを用いて、ならびにqPCR(KAPA Library Quantification Kit-KAPA Biosystems,Cape Town South Africa)を用いて試験した。
組織試料を、ランダム化したレーンの割り当てによってシングルリードフローセル上に載せ、シーケンシングを、Mayo Clinic Medical Genome FacilityでNext Generation Sequencing Coreによって、Illumina HiSeq 2000プラットフォーム上で実施した。リードは、101サイクルについて一方向であった。標準的なIlluminaパイプラインを、一次解析のために実行した。SAAP-RRBS(減少表現亜硫酸水素塩シーケンシングのための流線解析及びアノテーションパイプライン)を、品質スコアリング、配列アラインメント、アノテーション、及びメチル化抽出に使用した。
乳癌組織は多数の区別DMRをもたらし、その多くは、以前には同定されていなかった。乳癌組織試料のメチル化を正常な乳房組織と比較すると、327箇所のメチル化領域で、乳癌組織を正常な乳房組織と区別したと同定した(表2を参照のこと)(表2に示した領域のゲノム座標は、Human Feb.2009(GRCh37/hg19)Assemblyに基づく)。表3は、トリプルネガティブ乳癌組織を正常な乳房組織と区別した48箇所のメチル化領域を示す。表4は、HER2+乳癌組織を正常な乳房組織と区別した122箇所のメチル化領域を示す。表5は、ルミナルA乳癌組織を正常な乳房組織と区別した75箇所のメチル化領域を示す。表6は、ルミナルB乳癌組織を正常な乳房組織と区別した39箇所のメチル化領域を示す。表7は、BRCA1乳癌組織を正常な乳房組織と区別した49箇所のメチル化領域を示す。表8は、BRCA2乳癌組織を正常な乳房組織と区別した45箇所のメチル化領域を示す。表9は、浸潤性乳癌組織を正常な乳房組織と区別した21箇所のメチル化領域を示す。
次に、SYBR Greenメチル化特異的PCR(qMSP)を発見試料上で実施し、表2に示した候補DMRの精度及び再現性を確認した。加えて、16個のマーカーサブセットを、凍結した低悪性度及び高悪性度DCIS試料上で実行し、適用性を試験した(22件の高悪性度/CIS/P3 DCIS(非浸潤性乳管癌)、11件の低悪性度/P1 DCIS)。
qMSPプライマーを、Methprimerソフトウェア(Li LC and Dahiya R.Bioinformatics.2002 Nov;18(11):1427-31)を使用してマーカー領域の各々のために設計した。それらをIDT(Integrated DNA Technologies)によって合成した。アッセイを、亜硫酸水素塩変換した広くメチル化されているDNAの希釈物で、変換した非メチル化DNAならびに変換及び未変換白血球DNA陰性対照(10ng/ea)と共に試験し、最適化した(Roche LightCycler480を使用する)。進めていたアッセイは、線形回帰曲線及び最低基準(1.6ゲノムコピー)を下回る5倍未満の陰性対照値を実証する必要があった。アッセイまたは制御に失敗したより有望なDMRのいくつかを再設計した。127の全設計(表10は、127の全設計についてフォワード及びリバースプライマー配列情報を示す)のうち、80の高性能MSPアッセイがQC基準を満たしたため、試料に適用した。MSPプライマー配列は、その各々が2~8のCpGを含み、これらを、試料中のメチル化を評価する簡単な手段を提供するように設計し、そのようなものとして、最も区別されたCpGを標的とするような増幅効率に偏重し、これは長い最適化時間を必要とすることになった。
DNAを発見RRBS節に記載した通りに精製し、picogreen吸光度(Tecan/Invitrogen)を使用して定量化した。次いで、2ugの試料DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、Zymo EZ-96 Methylation kit(Zymo Research)を使用して精製した。溶出した物質を、384ウェルブロックを使用してRoche 480LightCyclers上で増幅させた。各プレートは、2個のマーカー(ならびに標準物質及び対照物)を収容することができ、プレートは合計で40であった。80のMSPアッセイが、異なる最適な増幅プロファイル(Tm=60℃、65℃、または70℃)を有し、それに応じてグループ分けした。20μLの反応物を、LightCycler480 SYBR Iマスターミックス(Roche)及び0.5uモルのプライマーを使用して50サイクルで実行し、一般にFit Point18%の絶対定量法によって分析した。全てのパラメータ(ノイズ帯域、閾値など)を自動マクロで事前に指定し、ユーザの主観性を回避した。ゲノムコピー数で表した生データを、DNA(β-アクチン)投入量を基準として正規化した。結果を、JMPを使用してロジスティックに分析し、AUC値として示した。12の比較を実行した:各乳癌サブタイプ対正常な乳房、及び各サブタイプ対バフィーコート。加えて、メチル化倍率変化率(mFCR)を、各比較について平均値及び中央値のメチル化率の両方を使用して算出した(FCR=がん(メチル化コピー/β-アクチンコピー)/正常(メチル化コピー/β-アクチンコピー))。これらの性能測定基準の両方とも、臨床的な血液に基づく試験においてマーカーの可能性を評価するために重要である。
試験した>90%のマーカーが、AUC及びFCRカテゴリーの両方で優れた性能をもたらし、多数のAUCが0.90を超え、がん対正常組織FCRは>10、及びがん対バフィーコートFCRは>50であった。
表11は、正常な乳房組織と比較して、基底細胞/トリプルネガティブ乳房組織、HER2+乳房組織、ルミナルA乳房組織、ルミナルB乳房組織、BRCA1乳房組織、及びBRCA2乳房組織を区別する、同定した80箇所のメチル化領域に関する曲線下面積を示す。
表12は、正常なバフィーコートと比較して、基底細胞/トリプルネガティブ乳房組織、HER2+乳房組織、ルミナルA乳房組織、ルミナルB乳房組織、BRCA1乳房組織、及びBRCA2乳房組織を区別する、同定した80箇所のメチル化領域に関する曲線下面積を示す。
表13は、正常な乳房組織と比較して、基底細胞/トリプルネガティブ乳房組織、HER2+乳房組織、ルミナルA乳房組織、ルミナルB乳房組織、BRCA1乳房組織、及びBRCA2乳房組織を区別する、同定した80箇所のメチル化領域に関するメチル化倍率変化を示す。
表14は、正常なバフィーコートと比較して、基底細胞/トリプルネガティブ乳房組織、HER2+乳房組織、ルミナルA乳房組織、ルミナルB乳房組織、BRCA1乳房組織、及びBRCA2乳房組織を区別する、同定した80箇所のメチル化領域に関するメチル化倍率変化を示す。
DCIS高悪性度対低悪性度の比較では、試験した16個のマーカーのAUCは、0.57~0.92の範囲であった。2個のマーカーのいくつかの組合せは、91%の特異性で95%の感度を達成した(1つのみ偽陽性)(表15)。3個のマーカーの組合せ(SCRT2_B、ITPRIPL1、MAX.chr8.124173030-124173395)は、91%の特異性で100%の感度であった。
実施例II.
本実施例は、乳癌特異的マーカーの組織の検証について記載する。
独立した組織試料(新鮮凍結)を、Mayo Clinic Rochesterのがん登録制度から選択し、専門の病理学者によって再調査して正確な分類を確認し、顕微解剖を指導した。症例は、29件のトリプルネガティブ/基底細胞様、34件のHER2型、36件のルミナルA、及び25件のルミナルB浸潤性乳癌を含んだ。5件のBRCA1及び6件のBRCA2癌、21件のDCIS w/HGD及び12件のDCIS w/LGDも含んだ。対照物は、27件の年齢適合正常乳房組織及び健康な女性に由来する18件のバフィーコート試料を含んだ。
55個のメチル化DNAマーカー(MDM)を、発見試料で試験した80個のMDMの一覧(実施例I及び表11~15を参照のこと)から選択した。
ゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,Valencia CA)を使用して調製し、EZ-96 DNA Methylation kit(Zymo Research,Irvine CA)を使用して亜硫酸水素塩変換した。増幅プライマーを、Methprimerソフトウェア(University of California,San Francisco CA)を使用してマーカー配列から設計し、商業的に合成した(IDT,Coralville IA)。アッセイを、SYBR Green qPCR(Roche)によって、亜硫酸水素塩変換(メチル化及び非メチル化ゲノムDNA)ならびに未変換対照物で厳密に試験して最適化した。陰性対照物と交差反応したアッセイは、再設計または廃棄のいずれかを行った。融解曲線分析を利用して、特異的増幅が行われていたことを保証した。
qMSPを、LightCycler480機器を使用し、25μLの総反応体積中、2μLの変換DNAで実施した。標準物質を、段階希釈し広くメチル化したDNA(Zymo Research)から得た。生マーカーコピーを、CpG横断的β-アクチン、すなわち、全ゲノムDNAのマーカーに対して標準化した。
結果を、JMP10(SAS,Cary NC)を使用してロジスティックに分析した。症例を、正常な乳房対照及び正常なバフィーコート試料と別個に比較した。メチル化率及び絶対差を、MDMの各々について算出した。
独立した試料におけるMDM性能は優れていて、多くのAUC及びメチル化倍率変化率(FC)は、それぞれ0.90超及び50超であった。結果を、表16A(トリプルネガティブ)、表16B(HER2+)、表16C(ルミナルA)、表16D(ルミナルD)、及び表16E(全体)に提供する。本明細書では、MDMをAUC(症例全体とバフィーコート試料とを比較する)によって順位付けした。これは、大多数の無細胞DNA(cfDNA)が白血球に由来するため、血漿中での可能な用途のために重要な測定基準である。白血球DNAからの上皮由来がんを高度に区別しないいずれのMDMも、組織中でのその性能にかかわらず、血液検査形式で失敗することになる。55個のMDMのうち41個は、0.9を超えるがん対バフィーコートAUCを有し、3個は完全な区別を達成した(AUC=1)。表16A、表16B、表16C、表16D、及び表16Eはまた、AUC、FC、p値、及びこれらのMDMの優秀さを評価かつ実証する時の他の重要な測定基準として%がんメチル化も列挙する。
表17は、DCIS HGDをDCIS LGDと区別するための上位10個のMDMを強調する。
実施例III.
本実施例は、乳癌を検出するための乳房組織マーカー及び血漿マーカーの同定について記載する。
乳癌を検出するための候補メチル化マーカーを、乳癌及び正常な乳房組織試料のRRBSによって同定した。最初に58個のマーカーを同定し、標的濃縮ロングプローブ定量的増幅シグナルアッセイを設計して整理した(例えば、一般技術に関してWO2017/075061及び米国特許出願第15,841,006号を参照のこと)(表18は、乳癌組織を正常な乳房組織と区別するメチル化領域を示す)(表19及び表20は、表18に示したマーカーのプライマー及びプローブ配列を示す)。設計スクリーニング及び再設計後、56個のマーカー(表21を参照のこと)を選択し、アッセイを行って3回反復して、組織上で試験した。アッセイを、FAMとHEXレポート間で等しく分割し、Quasar670を報告する参照アッセイのB3GALT6と共に3回反復した。
6人のBRCA保因者を含む38の標準的な乳癌試料ならびにルミナルA及びB、HER2+、BRCA1+、BRCA2+、トリプルネガティブならびにDCIS多様性を含む113の乳癌組織試料の収集物を、56個のメチル化マーカーの存在について試験した。56個のマーカーは、95%の特異性で約15%~92%の感度範囲を示した。表22は、95%の特異性で25%以上の感度を実証するマーカーを示す。5個のマーカーパネル(SPHK2、c17orf64_B、DLX4_B、MPZ_5742、ITPRIPL1_1138)は、100%の特異性で96%の感度を示した。得られたROC曲線は、0.995のAUCを有した。
組織試験の結果に基づいて、28個のマーカーセットを選択し、乳癌患者及び正常対照から収集した血漿試料のセットで試験した。28個のマーカーを、試験した多数のマーカーによって14個の2つのプールに分割した。2つのプールにおけるマーカーを、以下の表23及び表24に示す。
プール7マーカーの試験を、85の乳癌試料(33のステージI、33のステージII、18のステージIII、及び1のステージIV)ならびに100の健康な正常対照で構成されるEDTA血漿試料の収集物で行った。プール8マーカーの試験を、85の乳癌試料(34のステージI、32のステージII、18のステージIII及び1のステージIV)ならびに100の健康な正常対照で構成されるEDTA血漿試料の類似した収集物で行った。プール7及びプール8試験の結果に基づいて、14のアッセイの収集物をさらなる試験のために選択した(表25に示した)。
プール9マーカーの試験を、42の乳癌試料(1のステージI、16のステージII、14のステージIII、及び11のステージIV)ならびに84の健康な正常対照で構成されるLBgard(Biomatrica,San Diego,CA)血漿試料の収集物で行った。表26は、プール9マーカーの同定したメチル化領域を示す。表27は、プール9マーカーの示した感度及び90%の特異性を示す。表28及び表29は、プール9マーカーのプライマー情報、及びプローブ情報を示す。4個のマーカー(FAM59B、ITPRIPL1、TRH_A、及びC17orf64_B)の収集物は、90%の特異性で74%の感度を示した。得られたROC曲線は、0.884のAUCを示した。
上記明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、あらゆる目的のためにそれら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。記載される本技術の組成物、方法、及び用途の様々な修正及び変化形態は、記載されるような本技術の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかとなる。本技術は、特定の例示的実施形態に関連して記載されてきたが、請求されるような本発明が、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。事実、薬理学、生化学、医科学、または関連分野における当業者には明らかである、本発明を実施するための記載された方法に関する様々な修正が、以下の特許請求の範囲内であることを意図する。