ES2812753T3 - Detección de neoplasma colorectal - Google Patents

Abstract

Un kit que comprende un colector de muestras de heces para obtener una muestra de heces de un sujeto; reactivos para aislar un ácido nucleico de la muestra; un reactivo de bisulfito; y oligonucleótidos que se unen específicamente a una región genética que tiene las coordenadas del cromosoma 3 143119999-143120158.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de neoplasma colorectal

CAMPO DE INVENCION

[0001] Aquí se incluye tecnología relativa a la detección de neoplasia y en particular, pero no exclusivamente, a kits para la detección de lesiones premalignas y tumores malignos tales como cáncer colorrectal.

ANTECEDENTES

[0002] El cáncer colorrectal sigue siendo el segundo cáncer más común en hombres y mujeres estadounidenses combinados (Siegel R, et al,. CA Cáncer J Clin 2013; 63: 11-30). La biología subyacente de la progresión de la lesión precursora al cáncer se presta favorablemente a la detección (Vogelstein B, et al., Science 2013; 339: 1546-58). La evidencia apoya y las pautas avalan cualquiera de varias pruebas y estrategias (Levin B, et al., Gastroenterology 2008; 134: 1570-95; Rex DK, et al., Am J Gastroenterol 2009; 104: 739-50; Karl J, et al., Clin Gastroentero1Hepatol 2008; 6: 1122-8). Desde una perspectiva social, el cribado se considera rentable (Karl J, et al., Clin Gastroentero1Hepatol 2008; 6: 1122-8; Heitman SJ, et al., PLoS Med 2010; 7: e1000370; Parekh M, et al.., Aliment Pharmacol Ther 2008; 27: 697­ 712; Sharaf RN, et al., Am J Gastroenterol 2013; 108: 120-32).

[0003] Surge el cáncer colorrectal a partir de alteraciones genéticas y epigenéticas acumuladas, proporcionando una base para el análisis de las heces para los cambios específicos de tumor (Berger BM, et al, Pathology 2012; 44: 80­ 8). Estudios previos a gran escala de pruebas de ADN a base de heces de primera generación en el entorno de detección demostraron solo una sensibilidad justa para el cáncer colorrectal y baja sensibilidad para adenomas avanzados (Ahlquist DA, et al., Ann Intern Med 2008; 149: 441-50, W81; Imperiale TF, et al., N Engl J Med 2004; 351: 2704-14). Desde entonces se han incorporado importantes avances, incluido un tampón estabilizador (Boynton KA, et al., Clin Chem 2003; 49: 1058-65; Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15: 1115-9), más marcadores discriminantes (Ahlquist DA, et al., Gastroenterology 2012; 142: 248-56; Bardan E, et al., Israel journal of medical sciences 1997; 33: 777-80), plataformas con mayor sensibilidad analítica (Ahlquist DA, et al. al., Gastroenterology 2012; 142: 248-56; Aronchick CA, et al., Gastrointestinal endoscopy 2000; 52: 346-52), determinación de resultados utilizando un análisis de regresión logística en lugar de valores de marcadores individuales y automatización.

[0004] Aunque el cribado reduce la mortalidad del cáncer colorrectal (Mandel JS, et al, N Engl J Med 1993, 328: 1365­ 1371; Hardcastle JD, et al, Lancet 1996, 348: 1472-7; Kronborg O, et al., Scand J Gastroenterol. 2004, 39: 846-51; Winawer SJ, et al., J Natl Cancer Inst. 1993, 85: 1311-8; Singh H, et al., JAMA.2006, 295: 2366-73), las reducciones observadas han sido modestas (Singh H, et al., JAMA. 2006; 295, 2366-73; Heresbach D, et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 2006, 18: 427-33) y más de la mitad de los adultos en los Estados Unidos no se han hecho pruebas de detección (Meissner HI, Biomarcadores de Epidemiol de Cáncer Prev. 2006, 15: 389-94).

[0005] Un enfoque para la detección del cáncer emergente implica el ensayo de alteraciones del ADN específicos de tumores en muestras corporales de pacientes con cáncer, tales como heces, suero y orina (Osborn NK, Ahlquist DA Gastroenterology. 2005; 128: 192-206; Ahlquist DA, et al., Gastroenterology 2000; 119: 1219-27; Ahlquist dA, et al., Gastroenterology 2002; 122: Suppl A40; Chen WD, et al., J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1124-32; Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15: 1115-9; Zou HZ, Clin Cancer Res 2002; 8: 188-91; Hoque MO, J Clin Oncol 2005; 23: 6569-75; Belinsky SA, et al., Cancer Res 2006; 66: 3338-44; Itzkowitz SH, et al., Clin Gastroentero1Hepatol 2007; 5: 111-7' Kann L, et al., Clin Chem 2006; 52: 2299-302). Es importante seleccionar marcadores con alta precisión si se quiere lograr eficiencia y efectividad en una aplicación de detección de cáncer. Debido a la heterogeneidad molecular de la neoplasia colorrectal, las altas tasas de detección a menudo requieren un panel de marcadores.

[0006] Varios genes metilados se han detectado en las heces y las muestras de suero/plasma de pacientes con cáncer colorrectal (Ahlquist DA, Gastroenterology 2002; 122: Suppl A40; Chen WD, et al, J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1124­ 32; Zou HZ, et al., Clin Cancer Res 2002; 8: 188-91; Itzkowitz SH, et al., Clin Gastroentero1Hepatol 2007; 5: 111-7; Petko Z, et al., Clin Cancer Res 2005; 11: 1203-9; Muller HM, et al., Lancet 2004; 363: 1283-5; Leung WK, et al., Clin Chem 2004; 50: 2179-82; Ebert MP, et al., Gastroenterology 2006; 131: 1418-30; Grady WM, et al., Cancer Res 2001; 61: 900-2). Mientras que se han encontrado algunos genes metilados en la mayoría de los cánceres colorrectales, el rendimiento de los ensayos basados en fluidos corporales sigue siendo subóptimo (Ahlquist DA, et al., Gastroenterology 2002; 122: Suppl A40; Chen WD, et al., J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1124-32; Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15: 1115-9; Zou HZ, Clin Cancer Res 2002; 8: 188-91; Belinsky SA, et al., Cancer Res 2006; 66: 3338-44; Itzkowitz SH, et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2007; 5: 111-7; Kann L, et al., Clin Chem 2006; 52: 2299-302; Petko Z, et al., Clin Cancer Res 2005; 11: 1203-9; Muller HM, et al., Lancet 2004; 363: 1283-5; Leung WK, et al., Clin Chem 2004; 50: 2179-82; Ebert MP, et al., Gastroenterology 2006; 131: 1418-30; Grady WM, et al., Cancer Res 2001; 61: 900-2).

[0007] Se necesitan herramientas más precisas, fáciles de usar, y ampliamente distribuibles para mejorar la eficacia de detección, la aceptabilidad, y el acceso.

[0008] El documento WO 2012/088298 A2 describe métodos y kits para evaluar el riesgo de metástasis en un paciente con cáncer usando un clasificador para el fenotipo de metilador de isla CpG.

[0009] Naumov et al., Epigenetics 2013, vol,8, n° 9, páginas 921-934 describe el análisis a escala del genoma de la metilación del ADN en cáncer colorrectal utilizando matrices Infinium HumanMethylation450 BeadChip.

SUMARIO

[0010] El ADN metilado se ha estudiado como una clase potencial de biomarcadores en los tejidos de la mayoría de los tipos de tumores. En muchos casos, las metiltransferasas de ADN agregan un grupo metilo al ADN en los sitios de la isla de citosina-fosfato-guanina (CpG) como un control epigenético de la expresión génica. En un mecanismo biológicamente atractivo, se cree que los eventos de metilación adquiridos en regiones promotoras de genes supresores de tumores silencian la expresión, contribuyendo así a la oncogénesis. La metilación del ADN puede ser una herramienta de diagnóstico más estable química y biológicamente que la expresión de ARN o proteína (Laird (2010) Nat Rev Genet 11: 191-203). Además, en cánceres como el cáncer de colon esporádico, los marcadores de metilación ofrecen una excelente especificidad y son más ampliamente informativos y sensibles que las mutaciones de ADN individuales (Zou et al (2007) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: 2686-96).

[0011] El análisis de las islas CpG ha producido hallazgos importantes cuando se aplica a modelos animales y líneas celulares humanas. Por ejemplo, Zhang y sus colegas encontraron que los amplicones de diferentes partes de la misma isla de CpG pueden tener diferentes niveles de metilación (Zhang et al. (2009) PLoS Genet 5: e1000438). Además, los niveles de metilación se distribuyeron bimodalmente entre secuencias altamente metiladas y no metiladas, lo que respalda aún más el patrón binario de la actividad de la metiltransferasa de ADN (Zhang et al. (2009) PLoS Genet 5: e1000438). El análisis de los tejidos murinos in vivo y las líneas celulares in vitro demostraron que solo alrededor del 0,3% de los promotores de alta densidad de CpG (h Cp , definidos como que tenían >7% de secuencia de CpG dentro de una región de 300 pares de bases) estaban metilados, mientras que las áreas de baja densidad de CpG (LCP, definido como que tiene <5% de secuencia de CpG dentro de una región de 300 pares de bases) tendió a ser metilado con frecuencia en un patrón dinámico específico de tejido (Meissner et al. (2008) Nature 454: 766-70). Los PS incluyen promotores de genes ubicuos de limpieza y genes de desarrollo altamente regulados. Entre los sitios HCP metilados a >50% había varios marcadores establecidos como Wnt 2, NDRG2, SFRP2 y BMP3 (Meissner et al. (2008) Nature 454: 766-70).

[0012] Genes metilados se han detectado en la sangre y las heces de los pacientes con cáncer colorrectal y se han propuesto como marcadores de cribado de candidatos (Ahlquist DA, et al, Gastroenterology 2002; 122: Suppl. A40; Chen WD, et al, J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1124-32; Zou HZ, Clin Cancer Res 2002; 8: 188-91; Itzkowitz SH, et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2007; 5: 111-7; Kann L, et al., Clin Chem 2006; 52: 2299-302; Petko Z, et al., Clin Cancer Res 2005; 11: 1203-9; Muller HM, et al., Lancet 2004; 363: 1283-5; Leung WK, et al., Clin Chem 2004; 50: 2179-82; Ebert MP, et al., Gastroenterology 2006; 131: 1418-30; Grady WM, et al., Cancer Res 2001; 61: 900-2).

[0013] Zou y sus colegas, por ejemplo, genes evaluados frecuentemente metilados en la neoplasia colorrectal para identificar los las más discriminantes (Zou, et al, 2007 Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16 (12): 2686-2696). Se seleccionaron cuatro genes específicamente metilados en el cáncer colorrectal (proteína morfogenética ósea 3 (BMP3), EYA2, homeobox-4 (ALX4) y vimentina sin arista) de 41 genes candidatos y evaluados en 74 cánceres, 62 adenomas y 70 epitelios normales. El estado de metilación se analizó cualitativa y cuantitativamente y se confirmó mediante secuenciación genómica de bisulfito. El efecto de la metilación en la expresión génica se evaluó en cinco líneas celulares de cáncer de colon. Las mutaciones K-ras y BRAF se detectaron mediante secuenciación. La metilación de BMP3, EYA2, ALX4 o vimentina se detectó respectivamente en 66%, 66%, 68% y 72% de los cánceres; 74%, 48%, 89% y 84% de adenomas; y 7%, 5%, 11% y 11% de epitelios normales (P <0,01, cáncer o adenoma versus normal). Se concluyó que los genes BMP3, EYA2, ALX4 y vimentina están metilados en la mayoría de las neoplasias colorrectales, pero rara vez en los epitelios normales.

[0014] El cribado del cáncer está en necesidad de un panel de marcadores o un marcador para el cáncer colorrectal que es ampliamente informativo y exhibe una alta especificidad para el cáncer colorrectal en el nivel de tejido cuando es interrogado en muestras tomadas de un sujeto (por ejemplo, una muestra de heces; una muestra de tejido colorrectal).

[0015] Por consiguiente, en el presente documento se proporciona tecnología para marcadores de detección de cáncer colorrectal que proporcionan una alta relación señal/ruido y un bajo nivel de fondo cuando se detectan de muestras tomadas de un sujeto (por ejemplo, una muestra de heces; una muestra de tejido colorrectal; muestra de suero; sangre o producto sanguíneo).

[0016] En particular, la presente invención se refiere a un kit que comprende un colector de muestra de heces para la obtención de una muestra de heces de un sujeto; reactivos para aislar un ácido nucleico de la muestra; un reactivo de bisulfito; y oligonucleótidos que se unen específicamente a una región genética que tiene las coordenadas del cromosoma 3143119999-143120158.

[0017] En los experimentos realizados durante el curso del desarrollo de formas de realización de la presente descripción, los marcadores se identificaron en unos estudios de casos y de control mediante la comparación del estado de metilación de marcadores de ADN a partir de tejido colorrectal de sujetos con neoplasia colorrectal, adenoma, y/o pólipos de sésiles serrados (SSP) al estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de sujetos de control (p. ej., tejido normal como colon normal) (véanse, Ejemplos 1-2, Tablas 1-5).

[0018] Por ejemplo, los marcadores y/o paneles de marcadores (por ejemplo, una región cromosómica que tiene una anotación seleccionada de FLI1, OPLa H, DTX1, MATK, SFMBT2 región 2, KCNK12, región Vav3 1, SFMBT2 región 3, PPP2R5C, CHST2 región 2, PKIA, PDGFD, ELOVL2, CHST2 región 1, SFMBT2 región 1, QKI, VAV3 región 2 y SLC8A3) se identificaron en un estudio de casos y controles comparando el estado de metilación de los marcadores de ADN (p. ej., del tejido colorrectal de sujetos con neoplasia colorrectal y/o adenoma) al estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de sujetos de control (p. ej., tejido normal como el colon normal) (ver Ejemplo 1 y Tabla 1).

[0019] Los marcadores y/o paneles de marcadores (por ejemplo, una región cromosómica que tiene una anotación seleccionada de BMP3, NDRG4, PDGFG, CHST2 y SFMBT2) se identificaron en estudios de casos y controles comparando el estado de metilación de los marcadores de ADN del tejido colorrectal de sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer colorrectal al estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de sujetos de control (p. ej., tejido normal como colon normal) (véase el Ejemplo 1 y la Tabla 2).

[0020] Además, 185, 244, y 111 marcadores de metilación de ADN específicos para los cánceres colorrectales, adenomas grandes, y pólipos de sésiles serrados, respectivamente, se identificaron (véase el Ejemplo 2 y en las Tablas 3, 4 y 5). Junto con los casos de cáncer colorrectal, se secuenciaron casos de adenoma grande y pólipos de sésiles serrados, mucosa colónica normal y ADN normal de glóbulos blancos.

[0021] Los experimentos adicionales realizados durante el curso del desarrollo de formas de realización para la presente descripción demostraron NDRG4, BMP3, OPLAH, FLI1, PDGFD, CHST 7889, SFMBT2_895, SFMBT2_896, SFMBT2_897, CHST2_7890, Vav3, y DTX1 como marcadores eficaces para la detección de cáncer colorrectal dentro de muestras de heces (ver, Ejemplo 3 y Tablas 6 y 7).

[0022] Como se describe en el presente documento, la tecnología proporciona un número de marcadores y subconjuntos de ADN metilado de los mismos (por ejemplo, series de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más marcadores) con alta discriminación para la neoplasia colorrectal (p. ej., cáncer colorrectal, adenoma, SSP). Los experimentos aplicaron un filtro de selección a marcadores candidatos para identificar marcadores que proporcionan una alta relación señal/ruido y un bajo nivel de fondo para proporcionar una alta especificidad, por ejemplo, al analizar medios distantes (por ejemplo, heces, sangre, orina, tejido metastásico, etc.) para fines de detección o diagnóstico de cáncer colorrectal. Como tal, la tecnología proporciona marcadores específicos y combinaciones de marcadores para fines de detección o diagnóstico de cáncer colorrectal.

[0023] En algunas realizaciones, la tecnología está relacionada con la evaluación de la presencia y estado de metilación de uno o más de los marcadores identificados en la presente en una muestra biológica. Estos marcadores comprenden una o más regiones metiladas diferencialmente (DMR) como se discute en el presente documento, por ejemplo, como se proporciona en las Tablas 1-6. El estado de metilación se evalúa en realizaciones de la tecnología. Como tal, la tecnología proporcionada aquí no está restringida en el método por el cual se mide el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el estado de metilación se mide mediante un método de exploración del genoma. Por ejemplo, un método implica escaneo genómico de restricción de referencia (Kawai et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7421-7427) y otro ejemplo involucra PCR cebada arbitrariamente sensible a la metilación (Gonzalgo et al. (1997) Cancer Res 57: 594-599). En algunas realizaciones, los cambios en los patrones de metilación en sitios CpG específicos se controlan mediante digestión de ADN genómico con enzimas de restricción sensibles a la metilación, seguido de análisis Southern de las regiones de interés (método Southern de digestión). En algunas realizaciones, el análisis de los cambios en los patrones de metilación implica un proceso basado en PCR que implica la digestión del ADN genómico con enzimas de restricción sensibles a la metilación antes de la amplificación por PCR (Singer-Sam et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 687). Además, se han informado otras técnicas que utilizan el tratamiento con bisulfito de ADN como punto de partida para el análisis de metilación. Estos incluyen PCR específica de metilación (MSP) (Herman et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 9821-9826) y la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito (Sadri y Hornsby (1996) Nucl. Acids Res. 24: 5058-5059; y Xiong y Laird (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2532-2534). Se han desarrollado técnicas de PCR para la detección de mutaciones genéticas (Kuppuswamy et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 1143­ 1147) y la cuantificación de la expresión alélica específica (Szabo y Mann (1995) Genes Dev. 9: 3097-3108 y Singer-Sam et al. (1992) PCR Methods Appl. 1: 160-163). Dichas técnicas utilizan cebadores internos, que se unen a una plantilla generada por PCR y terminan inmediatamente en 5' del nucleótido único a analizar. Los métodos que usan un "ensayo cuantitativo de Ms-SNuPE" como se describe en la Patente de EE.UU. 7.037,650 se usan en algunas realizaciones.

[0024] Tras la evaluación de un estado de metilación, el estado de metilación se expresa a menudo como la fracción o porcentaje de hebras individuales de ADN que está metilado en un sitio en particular (por ejemplo, en un solo nucleótido, en una región o locus particular, en una secuencia de interés más larga, por ejemplo, hasta un ~100 pb, 200 pb, 500 pb, 1000 pb subsecuencia de ADN o más) con respecto a la población total de ADN en la muestra que comprende ese sitio particular. Tradicionalmente, la cantidad de ácido nucleico no metilado se determina por PCR usando calibradores. Luego, una cantidad conocida de ADN se trata con bisulfito y la secuencia específica de metilación resultante se determina usando una PCR en tiempo real u otra amplificación exponencial, por ejemplo, un ensayo QuARTS (por ejemplo, según lo dispuesto por la Patente de EE.UU. N° 8,361,720; y Solicitud de Patente de EE.UU. Nos 2012/0122088 y 2012/0122106).

[0025] Por ejemplo, en algunas realizaciones métodos comprenden la generación de una curva estándar para la diana no metilada mediante el uso de estándares externos. La curva estándar se construye a partir de al menos dos puntos y relaciona el valor de Ct en tiempo real para el ADN no metilado con estándares cuantitativos conocidos. Luego, se construye una segunda curva estándar para la diana metilada a partir de al menos dos puntos y estándares externos. Esta segunda curva estándar relaciona el Ct para ADN metilado con estándares cuantitativos conocidos. A continuación, los valores de Ct de la muestra de prueba se determinan para las poblaciones metiladas y no metiladas y los equivalentes genómicos de ADN se calculan a partir de las curvas estándar producidas por los dos primeros pasos. El porcentaje de metilación en el sitio de interés se calcula a partir de la cantidad de ADN metilados en relación con la cantidad total de ADN en la población, por ejemplo, (número de ADN metilados)/(número de ADN metilados número de ADN no metilados) X 100.

[0026] Según otro aspecto de la presente descripción, neoplasia de una muestra biológica se indica cuando una relación de metilación de uno o más marcadores de metilación de ADN relativo a un nivel de número de copias de ADN tratado con bisulfito de un gen de referencia es diferente, en donde el uno o más marcadores de metilación de ADN comprenden una base en una región metilada diferencialmente (DMR) como se proporciona aquí. La relación de metilación incluye la relación del nivel de metilación del marcador de metilación del Ad N y el nivel de una región en un gen de referencia determinado por los mismos medios utilizados para la determinación del nivel de metilación del biomarcador. Usualmente, la relación de metilación está representada por la relación del nivel de metilación del marcador de metilación de ADN y el nivel de una región en un gen de referencia determinado por los mismos medios utilizados para la determinación del nivel de metilación del marcador de metilación de ADN.

[0027] En algunas realizaciones, la relación de la metilación es la relación entre el nivel de metilación de un marcador de la metilación del ADN y el nivel de una región de un gen de referencia, ambos de los cuales se midió cuantitativamente usando polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR). Por ejemplo, el nivel de metilación de un marcador de metilación de ADN de una muestra de un sujeto puede medirse cuantitativamente usando un par de cebadores y una sonda de oligonucleótidos, donde un cebador, ambos cebadores, la sonda de oligonucleótidos o ambos cebadores y la sonda de oligonucleótidos son capaces de distinguir entre ácido nucleico metilado y no metilado, por ejemplo, después de que el ácido nucleico sea modificado por un agente modificador, por ejemplo, bisulfito que convierte la citosina no metilada en un ácido nucleico convertido.

[0028] La región de un gen de referencia puede ser cualquier región de un gen que tiene uno o más sitios o regiones que están desprovistos de sitios de metilación, por ejemplo, desprovistas de dinucleótidos CpG. Por ejemplo, la región de un gen de referencia puede ser una región que tiene dos sitios de unión de cebadores para la amplificación, tales como PCR que carecen de dinucleótidos CpG o una región que tiene al menos un sitio de unión de sonda oligonucleotídica específica para PCR en tiempo real que está desprovista de dinucleótidos CpG. La región de un gen de referencia puede ser una región del gen MYOD. La región de un gen de referencia puede ser una región del gen ACTB. La región de un gen de referencia puede ser una región que no está frecuentemente sujeta a alteraciones en el número de copias, como la amplificación o eliminación de genes.

[0029] En general, el nivel de una región de un gen de referencia se mide cuantitativamente usando PCR en tiempo real con cebadores y sondas específicos que se unen específicamente a sitios después de la conversión de bisulfito pero sin discriminar directa o indirectamente el estado de metilación de los sitios.

[0030] En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para detectar neoplasia en un sujeto. Tales métodos comprenden, por ejemplo, obtener una muestra que comprende ADN de un sujeto; tratar el ADN obtenido con un reactivo que modifica selectivamente los residuos de citosina no metilados en el ADN obtenido para producir residuos modificados pero que no modifica los residuos de citosina metilados; determinar el nivel de metilación de uno o más marcadores de metilación de ADN en el ADN que ha sufrido el tratamiento del paso b), en donde uno o más marcadores de metilación de ADN comprenden una base en una región metilada diferencialmente (DMR) como se proporciona aquí; comparar el nivel de metilación determinado de uno o más marcadores de metilación de ADN con referencias de nivel de metilación para uno o más marcadores de metilación de ADN para sujetos que no tienen neoplasia; e identificar al sujeto con neoplasia cuando el estado de metilación de o más de los marcadores de metilación del ADN es diferente al estado de metilación del marcador analizado en un sujeto que no tiene una neoplasia.

[0031] En algunas realizaciones, una determinación de la metilación elevada en uno o más de los marcadores de mutilación del ADN comprende una determinación de la mutilación alterada dentro de una región seleccionada del grupo que consiste de una isla CpG y una orilla isla CpG.

[0032] En algunas realizaciones, una determinación de la metilación elevada dentro de dicha isla CpG o CpG en tierra comprende metilación elevada dentro de una región de codificación o una región reguladora del marcador de la metilación del ADN.

[0033] En algunas realizaciones, la determinación del nivel de metilación de uno o más marcadores de metilación del ADN en el ADN que hayan sido sometidos al tratamiento del paso b) comprende la determinación de la puntuación de la metilación y/o la frecuencia de metilación del uno o más marcadores de metilación del ADN.

[0034] En algunas realizaciones, el tratamiento del paso b) se lleva a cabo a través de modificación con bisulfito del Ad N obtenido.

[0035] En algunas realizaciones, la determinación del nivel de metilación de uno o más marcadores de metilación del ADN en el ADN que hayan sido sometidas al tratamiento del paso b) se consigue mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en PCR de metilación específica, PCR cuantitativa de metilación específica, análisis de enzimas de restricción de ADN sensibles a la metilación, secuenciación cuantitativa de bisulfito y PCR de secuenciación genómica de bisulfito.

[0036] En algunas realizaciones, el neoplasma es un cáncer colorrectal, un gran adenoma colorrectal y/o un pólipo de sésiles serrado.

[0037] En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para detectar neoplasia en un sujeto. Dichas realizaciones comprenden, por ejemplo, determinar una relación de metilación de una muestra de un sujeto, en donde la relación de metilación es el nivel de metilación de una región tratada con bisulfito de uno o más marcadores de metilación de ADN en relación con un nivel de copia de ADN tratada con bisulfito número de un gen de referencia, en donde el uno o más marcadores de metilación del ADN comprenden una base en una región metilada diferencialmente (DMR) como se proporciona aquí, en donde el gen de referencia es MYOD o ACTB, identificando al sujeto con neoplasia cuando la relación de metilación de uno o más de los marcadores de metilación del ADN es diferente de la relación de metilación del marcador respectivo analizado en un sujeto que no tiene una neoplasia.

[0038] En algunas realizaciones, el nivel de metilación se determina mediante el uso de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR). En algunas realizaciones, el nivel de metilación se determina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, en donde al menos un cebador usado en la PCR es capaz de distinguir entre ácido nucleico no metilado y metilado. En algunas realizaciones, el nivel de metilación se determina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, en la que ambos cebadores utilizados en la PCR son capaces de distinguir entre ácido nucleico no metilado y metilado. En algunas realizaciones, el nivel de metilación se determina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, en la que una sonda utilizada en la PCR es capaz de distinguir entre ácido nucleico no metilado y metilado. En algunas realizaciones, el nivel de metilación se determina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, en la que los cebadores y una sonda utilizados en la PCR son capaces de distinguir entre el ácido nucleico metilado y no metilado. En algunas realizaciones, el nivel de la región en el gen de referencia se determina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. En algunas realizaciones, el nivel de la región en el gen de referencia se determina usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, en donde la región contiene un primer y segundo sitio de unión del cebador y un sitio de unión de la sonda y en donde el primer y segundo sitio de unión del cebador y el sitio de unión de la sonda carecen de dinucleótidos CpG. En algunas realizaciones, la región en el gen de referencia carece de dinucleótidos CpG.

[0039] También se proporcionan en este documento composiciones y kits para la práctica de los métodos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los reactivos (por ejemplo, cebadores, sondas) específicos para uno o más marcadores se proporcionan solos o en conjuntos (por ejemplo, conjuntos de pares de cebadores para amplificar una pluralidad de marcadores). También se pueden proporcionar reactivos adicionales para realizar un ensayo de detección (p. ej., enzimas, tampones, controles positivos y negativos para realizar QuARTS, PCR, secuenciación, bisulfito u otros ensayos). En algunas realizaciones, se proporcionan los kits que contienen uno o más reactivos necesarios, suficientes o útiles para realizar un método. También se proporcionan mezclas de reacciones que contienen los reactivos. Además se proporcionan conjuntos de reactivos de mezcla maestra que contienen una pluralidad de reactivos que pueden agregarse entre sí y/o a una muestra de prueba para completar una mezcla de reacción.

[0040] En algunas realizaciones, la tecnología descrita en el presente documento está asociada con una máquina programable diseñada para llevar a cabo una secuencia de operaciones aritméticas o lógicas como proporcionada por los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, algunas realizaciones de la tecnología están asociadas con (por ejemplo, implementadas en) software de computadora y/o hardware de computadora. En un aspecto, la tecnología se refiere a una computadora que comprende una forma de memoria, un elemento para realizar operaciones aritméticas y lógicas, y un elemento de procesamiento (por ejemplo, un microprocesador) para ejecutar una serie de instrucciones (por ejemplo, un método como se proporciona aquí) para leer, manipular y almacenar datos.

En algunas realizaciones, un microprocesador es parte de un sistema para determinar un estado de metilación (por ejemplo, de uno o más DMR, por ejemplo, como se proporciona en las Tablas 1-6); comparar estados de metilación (por ejemplo, de uno o más DMR, por ejemplo, como se proporciona en las Tablas 1-6); generar curvas estándar; determinar un valor de Ct; calcular una fracción, frecuencia o porcentaje de metilación (p. ej., de uno o más DMR, p. ej. como se proporciona en las Tablas 1-6); identificar una isla CpG; determinar una especificidad y/o sensibilidad de un ensayo o marcador; calcular una curva ROC y un AUC asociado; análisis de secuencia; todo como se describe en este documento o se conoce en la técnica.

[0041] En algunas realizaciones, un componente de software o hardware reciba los resultados de ensayos múltiples y determina un resultado de valor único que informar a un usuario que indica un riesgo de cáncer en base a los resultados de los múltiples ensayos (por ejemplo, la determinación del estado de metilación de DMR múltiple, por ejemplo, como se proporciona en las Tablas 1-6). Las realizaciones relacionadas calculan un factor de riesgo basado en una combinación matemática (p. ej., una combinación ponderada, una combinación lineal) de los resultados de múltiples ensayos, p. ej., determinando los estados de metilación de múltiples marcadores (como DMR múltiple, p. ej. como se proporciona en las Tablas 1-6). En algunas realizaciones, el estado de metilación de un DMR define una dimensión y puede tener valores en un espacio multidimensional y la coordenada definida por los estados de metilación de DMR múltiple es un resultado, por ejemplo, para informar a un usuario, por ejemplo, en relación con un riesgo de cáncer colorrectal.

[0042] Algunas realizaciones comprenden un medio de almacenamiento y componentes de memoria. Los componentes de la memoria (p. ej., memoria volátil y/o no volátil) encuentran uso en el almacenamiento de instrucciones (p. ej., una realización de un proceso como se proporciona aquí) y/o datos (p. ej., una pieza de trabajo como mediciones de metilación, secuencias y descripciones estadísticas asociadas con ella). Algunas realizaciones se refieren a sistemas que también comprenden una o más de una CPU, una tarjeta gráfica y una interfaz de usuario (por ejemplo, que comprende un dispositivo de salida como pantalla y un dispositivo de entrada como teclado).

[0043] Las máquinas programables asociadas con la tecnología comprenden tecnologías convencionales existentes y tecnologías en desarrollo o aún por desarrollar (por ejemplo, una computadora cuántica, una computadora química, una computadora de ADN, una computadora óptica, una computadora basada en espintrónica, etc.).

[0044] En algunas realizaciones, la tecnología comprende un cable (por ejemplo, cable metálico, de fibra óptica) o medio de transmisión inalámbrica para transmitir datos. Por ejemplo, algunas realizaciones se refieren a la transmisión de datos a través de una red (por ejemplo, una red de área local (LAN), una red de área amplia (WAN), una red adhoc, Internet, etc.). En algunas realizaciones, las máquinas programables están presentes en una red como pares y en algunas realizaciones las máquinas programables tienen una relación cliente/servidor.

[0045] En algunas realizaciones, los datos se almacenan en un medio de almacenamiento legible por ordenador tal como un disco duro, memoria flash, medios ópticos, un disquete, etc.

[0046] En algunas realizaciones, la tecnología proporcionada en el presente documento está asociado con una pluralidad de dispositivos programables que operan en concierto para realizar un método como se describe aquí. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una pluralidad de computadoras (por ejemplo, conectadas por una red) pueden trabajar en paralelo para recopilar y procesar datos, por ejemplo, en una implementación de computación en clúster o computación en cuadrícula o alguna otra arquitectura de computadora distribuida que se basa en computadoras completas (con CPU incorporadas, almacenamiento, fuentes de alimentación, interfaces de red, etc.) conectadas a una red (privada, pública o Internet) por una interfaz de red convencional, como Ethernet, fibra óptica o mediante una tecnología de red inalámbrica.

[0047] Por ejemplo, algunas realizaciones proporcionan un equipo que incluye un medio legible por ordenador. La realización incluye una memoria de acceso aleatorio (RAM) acoplada a un procesador. El procesador ejecuta las instrucciones del programa ejecutable por computadora almacenadas en la memoria. Dichos procesadores pueden incluir un microprocesador, un ASIC, una máquina de estado u otro procesador, y pueden ser cualquiera de varios procesadores de computadora, como los procesadores de Intel Corporation of Santa Clara, California and Motorola Corporation of Schaumburg, Illinois. Dichos procesadores incluyen, o pueden estar en comunicación con medios, por ejemplo, medios legibles por computadora, que almacenan instrucciones que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador realice los pasos descritos en este documento.

[0048] Las realizaciones de medios legibles por computadora incluyen, pero no se limitan a, un dispositivo electrónico, óptico, magnético u otro dispositivo de almacenamiento o transmisión capaz de proporcionar un procesador con instrucciones legibles por computadora. Otros ejemplos de medios adecuados incluyen, entre otros, un disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memoria, r Om , RAM, un ASIC, un procesador configurado, todos los medios ópticos, todas las cintas magnéticas u otros medios magnéticos o cualquier otro medio desde el cual un procesador de computadora pueda leer las instrucciones. Además, varias otras formas de medios legibles por computadora pueden transmitir o llevar instrucciones a una computadora, incluido un enrutador, una red pública o privada u otro dispositivo o canal de transmisión, tanto por cable como inalámbrico. Las instrucciones pueden incluir un código de cualquier lenguaje de programación adecuado, incluidos, por ejemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl y JavaScript.

[0049] Las computadoras están conectadas en algunas realizaciones a una red. Las computadoras también pueden incluir varios dispositivos externos o internos, como un ratón, un CD-ROM, DVD, un teclado, una pantalla u otros dispositivos de entrada o salida. Ejemplos de computadoras son computadoras personales, asistentes digitales, asistentes digitales personales, teléfonos celulares, teléfonos móviles, teléfonos inteligentes, buscapersonas, tabletas digitales, computadoras portátiles, dispositivos de internet y otros dispositivos basados en procesadores. En general, las computadoras relacionadas con los aspectos de la tecnología aquí provistos pueden ser cualquier tipo de plataforma basada en procesador que opere en cualquier sistema operativo, como Microsoft Windows, Linux, UNIX, Mac OS X, etc., capaz de soportar uno o más programas que comprenden la tecnología provista aquí. Algunas realizaciones comprenden una computadora personal que ejecuta otros programas de aplicación (por ejemplo, aplicaciones). Las aplicaciones pueden estar contenidas en la memoria y pueden incluir, por ejemplo, una aplicación de procesamiento de texto, una aplicación de hoja de cálculo, una aplicación de correo electrónico, una aplicación de mensajería instantánea, una aplicación de presentación, una aplicación de navegador de Internet, una aplicación de calendario/organizador y cualquier otra aplicación capaz de ser ejecutada por un dispositivo cliente.

[0050] Todos los tales componentes, equipos y sistemas descritos en el presente documento como asociados con la tecnología pueden ser lógicos o virtuales.

[0051] Por consiguiente, en este documento se proporciona tecnología relacionada con un método de detección de una neoplasia colorrectal en una muestra (por ejemplo, muestra de heces, muestra de tejido colorrectal; muestra de sangre; muestra de producto sanguíneo) obtenida de un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), comprendiendo el método analizar un estado de metilación de un marcador en una muestra obtenida de un sujeto; e identificar al sujeto que tiene una neoplasia colorrectal cuando el estado de metilación del marcador es diferente al estado de metilación del marcador analizado en un sujeto que no tiene una neoplasia colorrectal, en donde el marcador comprende una base en una región metilada diferencialmente (DMR) seleccionada de un grupo que consiste en un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6. La tecnología también abarca la determinación del estado o etapa de un cáncer colorrectal, por ejemplo, en algunas realizaciones, la neoplasia es precancerosa. Algunas realizaciones proporcionan métodos que comprenden analizar una pluralidad de marcadores, por ejemplo, que comprenden analizar de 2 a 11 marcadores.

[0052] La tecnología no está limitada en el estado de metilación evaluado. En algunas realizaciones, evaluar el estado de metilación del marcador en la muestra comprende determinar el estado de metilación de una base. En algunas realizaciones, analizar el estado de metilación del marcador en la muestra comprende determinar el grado de metilación en una pluralidad de bases. Además, en algunas realizaciones, el estado de metilación del marcador comprende un aumento de la metilación del marcador con respecto a un estado de metilación normal del marcador. En algunas realizaciones, el estado de metilación del marcador comprende una metilación disminuida del marcador con respecto a un estado de metilación normal del marcador. En algunas realizaciones, el estado de metilación del marcador comprende un patrón diferente de metilación del marcador con respecto a un estado de metilación normal del marcador.

[0053] Además, en algunas realizaciones, el marcador es una región de 100 bases o menos, el marcador es una región de 500 bases o menos, el marcador es una región de 1000 bases o menos, el marcador es una región de 5000 o menos bases, o, en algunas realizaciones, el marcador es una base. En algunas realizaciones, el marcador está en un promotor de alta densidad de CpG.

[0054] La tecnología no está limitada por el tipo de muestra. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra es una muestra de heces, una muestra de tejido, una muestra de tejido colorrectal, una muestra de sangre (por ejemplo, plasma, suero, sangre completa), una excreción o una muestra de orina.

[0055] Además, la tecnología no está limitada en el método utilizado para determinar el estado de metilación. En algunas realizaciones, el ensayo comprende usar reacción en cadena de polimerasa específica de metilación, secuenciación de ácido nucleico, espectrometría de masas, nucleasa específica de metilación, separación basada en masa o captura de dianas. En algunas realizaciones, el ensayo comprende el uso de un oligonucleótido específico de metilación. En algunas realizaciones, la tecnología usa masivamente secuenciación paralela (por ejemplo, secuenciación de próxima generación) para determinar el estado de metilación, por ejemplo, secuenciación por síntesis, secuenciación en tiempo real (por ejemplo, de una sola molécula), secuenciación de emulsión de cuenta, secuenciación de nanoporos, etc.

[0056] La tecnología proporciona reactivos para la detección de un DMR, por ejemplo, en algunas realizaciones se proporcionan un conjunto de oligonucleótidos que comprenden las secuencias proporcionadas por la SEQ ID NOs: 1­ 110. En algunas realizaciones, se proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia complementaria a una región cromosómica que tiene una base en una DMR, por ejemplo, un oligonucleótido sensible al estado de metilación de una DMR.

[0057] La tecnología proporciona diversos paneles de marcadores, por ejemplo, en algunas realizaciones, el marcador comprende una región cromosómica que tiene una anotación que es FLI1, OPLAH, DTX1, MATK, SFMBT2 región 2, KCNK12, Vav3 región 1, SFMBT2 región 3, PPP2R5C, CHST2 región 2, PKIA, PDGFD, ELOVL2, CHST2 región 1, SFMBT2 región 1, QKI, VAV3 región 2 y SLC8A3, y eso comprende el marcador (ver Tabla 1). En algunas realizaciones, el marcador comprende una región cromosómica que tiene una anotación que es BMP3, NDRG4, PDGFG, CHST2 y SFMBT2, y que comprende el marcador (ver, Tabla 2). En algunas realizaciones, el marcador comprende una o más de las regiones cromosómicas proporcionadas en la Tabla 3 (para cáncer colorrectal), Tabla 4 (para adenoma) y Tabla 5 (para SSP).

[0058] Además, las realizaciones proporcionan un método de análisis de una DMR a partir de las Tablas 1-6. Algunas realizaciones proporcionan determinar el estado de metilación de un marcador, en donde una región cromosómica que tiene una anotación es FLI1, OPLAH, DTX1, MATK, SFMBT2 región 2, KCNK12, VAV3 región 1, SFMBT2 región 3, PPP2R5C, CHST2 región 2, PKIA, PDGFD, ELOVL2, CHST2 región 1, SFMBT2 región 1, QKI, VAV3 región 2 y SLC8A3, y/o una región cromosómica que tiene una anotación que es BMP3, NDRG4, PDGFG, CHST2 y SFMBT2 comprende el marcador. Algunas realizaciones proporcionan determinar el estado de metilación de un marcador, en donde una región cromosómica como se proporciona en las Tablas 3, 4 y/o 5 comprende el marcador.

[0059] Realizaciones de kit se describen en el presente documento, por ejemplo, un kit que comprende un reactivo de bisulfito; y un ácido nucleico de control que comprende una secuencia de una DMR seleccionada de cualquiera de las regiones cromosómicas proporcionadas en las Tablas 1-6 y que tiene un estado de metilación asociado con un sujeto que no tiene cáncer. En algunas realizaciones, los kits comprenden un reactivo de bisulfito y un oligonucleótido como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits comprenden un reactivo de bisulfito; y un ácido nucleico de control que comprende una secuencia de una DMR seleccionada de cualquiera de las regiones cromosómicas proporcionadas en las Tablas 1-6 y que tiene un estado de metilación asociado con un sujeto que tiene cáncer colorrectal, adenoma y/o SSP. Algunas realizaciones del kit comprenden un colector de muestras para obtener una muestra de un sujeto (por ejemplo, una muestra de heces); reactivos para aislar un ácido nucleico de la muestra; un reactivo de bisulfito; y un oligonucleótido como se describe en el presente documento.

[0060] La tecnología está relacionada con formas de realización de composiciones (por ejemplo, mezclas de reacción). En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende un ácido nucleico que comprende un DMR y un reactivo de bisulfito. Algunas realizaciones proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y un oligonucleótido como se describe en el presente documento. Algunas realizaciones proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y una enzima de restricción sensible a la metilación. Algunas realizaciones proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y una polimerasa.

[0061] Realizaciones de método adicionales relacionadas se proporcionan para la detección de una neoplasia colorrectal en una muestra obtenida de un sujeto, por ejemplo, un método que comprende la determinación de un estado de metilación de un marcador en la muestra que comprende una base en un DMR seleccionado de cualquiera de las regiones cromosómicas proporcionadas en las Tablas 1-6; comparar el estado de metilación del marcador de la muestra del sujeto con un estado de metilación del marcador de una muestra de control normal de un sujeto que no tiene cáncer; y determinar un intervalo de confianza y/o un valor p de la diferencia en el estado de metilación de la muestra del sujeto y la muestra de control normal. En algunas realizaciones, el intervalo de confianza es 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% o 99,99% y el valor p es 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, o 0,0001. Algunas realizaciones de métodos proporcionan pasos de hacer reaccionar un ácido nucleico que comprende una DMR con un reactivo de bisulfito para producir un ácido nucleico reaccionado con bisulfito; secuenciar el ácido nucleico reaccionado con bisulfito para proporcionar una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico reaccionado con bisulfito; comparar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico reaccionado con bisulfito con una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que comprende la DMR de un sujeto que no tiene cáncer para identificar diferencias en las dos secuencias; e identificar al sujeto que tiene una neoplasia colorrectal cuando hay una diferencia presente.

[0062] La tecnología proporciona sistemas para la detección de una neoplasia colorrectal en una muestra obtenida de un sujeto. Las realizaciones ejemplares de sistemas incluyen, por ejemplo, un sistema para la detección de una neoplasia colorrectal en una muestra obtenida de un sujeto, el sistema comprende un componente de análisis configurado para determinar el estado de metilación de una muestra, un componente de software configurado para comparar el estado de metilación de la muestra con una muestra de control o un estado de metilación de muestra de referencia registrado en una base de datos, y un componente de alerta configurado para alertar a un usuario de un estado de metilación asociado con cáncer. Una alerta se determina en algunas realizaciones mediante un componente de software que recibe los resultados de múltiples ensayos (p. ej., determinando los estados de metilación de múltiples marcadores, p. ej., DMR, p. ej., como se proporciona en las Tablas 1-6) y calculando un valor o resultado para informe basado en los múltiples resultados. Algunas realizaciones proporcionan una base de datos de parámetros ponderados asociados con cada DMR proporcionada en este documento para su uso en el cálculo de un valor o resultado y/o una alerta para informar a un usuario (por ejemplo, un médico, enfermera, médico, etc.). En algunas realizaciones, se informan todos los resultados de múltiples ensayos y en algunas realizaciones se usan uno o más resultados para proporcionar una puntuación, valor o resultado basado en una combinación de uno o más resultados de múltiples ensayos que es indicativo de un riesgo de cáncer colorrectal en un sujeto.

[0063] En algunas realizaciones de sistemas, una muestra comprende un ácido nucleico que comprende una DMR. En algunas realizaciones el sistema comprende además un componente para aislar un ácido nucleico, un componente para recoger una muestra tal como un componente para recoger una muestra de heces. En algunas realizaciones, el sistema comprende secuencias de ácido nucleico que comprenden una DMR. En algunas realizaciones, la base de datos comprende secuencias de ácido nucleico de sujetos que no tienen cáncer. También se proporcionan ácidos nucleicos, por ejemplo, un conjunto de ácidos nucleicos, cada ácido nucleico tiene una secuencia que comprende una DMR. En algunas realizaciones, el conjunto de ácidos nucleicos en donde cada ácido nucleico tiene una secuencia de un sujeto que no tiene cáncer. Las realizaciones del sistema relacionadas comprenden un conjunto de ácidos nucleicos como se describe y una base de datos de secuencias de ácido nucleico asociadas con el conjunto de ácidos nucleicos. Algunas realizaciones comprenden además un reactivo de bisulfito. Y, algunas realizaciones comprenden además un secuenciador de ácido nucleico.

[0064] La tecnología está relacionada con formas de realización de composiciones (por ejemplo, mezclas de reacción). En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende un ácido nucleico que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) y un reactivo de bisulfito. Algunas realizaciones proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y un oligonucleótido como se describe en el presente documento. Algunas realizaciones proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y una enzima de restricción sensible a la metilación. Algunas realizaciones proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y una polimerasa.

[0065] En ciertas realizaciones, las preocupaciones actuales de divulgación métodos de cribado para un neoplasma colorrectal en una muestra obtenida de un sujeto que tiene la enfermedad inflamatoria intestinal, comprendiendo el método 1) ensayar una metilación estado de un marcador en una muestra obtenida de un sujeto; y 2) identificar al sujeto que tiene una neoplasia cuando el estado de metilación del marcador es diferente al estado de metilación del marcador analizado en un sujeto que no tiene una neoplasia, en donde el marcador comprende una base en una región metilada diferencialmente (DMR) como se proporciona en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la neoplasia es cáncer colorrectal y/o displasia plana.

[0066] Las realizaciones adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica pertinente basándose en las enseñanzas contenidas en este documento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0067] Se describe en el presente documento tecnología relacionada con la detección de neoplasia colorrectal y particularmente, pero no exclusivamente, con métodos, composiciones y usos relacionados para detectar cáncer colorrectal premaligno y maligno. Como la tecnología se describe en este documento, los encabezados de sección utilizados son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema de ninguna manera.

[0068] En esta descripción detallada de las diversas formas de realización, para fines de explicación, numerosos detalles específicos se exponen para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones descritas. Sin embargo, un experto en la materia apreciará que estas diversas realizaciones se pueden practicar con o sin estos detalles específicos. En otros casos, las estructuras y dispositivos se muestran en forma de diagrama de bloques. Además, un experto en la materia puede apreciar fácilmente que las secuencias específicas en las que se presentan y realizan los métodos son ilustrativas y se contempla que las secuencias pueden variarse.

[0069] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto ordinario en la técnica a la que las diversas realizaciones descritas en este documento pertenece. Cuando las definiciones de los términos en las referencias parecen diferir de las definiciones proporcionadas en las presentes enseñanzas, prevalecerá la definición proporcionada en las presentes enseñanzas.

Definiciones

[0070] Para facilitar la comprensión de la tecnología actual, un número de términos y frases se definen a continuación. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

[0071] A lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones, los siguientes términos tienen los significados asociados explícitamente en el presente documento, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La frase "en una realización" como se usa en el presente documento no se refiere necesariamente a la misma realización, aunque puede hacerlo. Además, la frase "en otra realización" como se usa en el presente documento no se refiere necesariamente a una realización diferente, aunque puede hacerlo.

[0072] Además, tal como se utiliza aquí, el término "o" es un "o" inclusive operador y es equivalente a la expresión "y/o" a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. El término "basado en" no es exclusivo y permite basarse en factores adicionales no descritos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, a lo largo de la especificación, el significado de “un”, “una”, “el” y “la” incluye referencias plurales. El significado de "en" incluye "en" y "sobre".

[0073] Como se usa en este documento, un "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere generalmente a cualquier ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, que puede ser modificado o no modificado de ADN o ARN. Los "ácidos nucleicos" incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios. Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" también incluye ADN como se describió anteriormente que contiene una o más bases modificadas. Por lo tanto, el ADN con un esqueleto modificado por estabilidad o por otras razones es un "ácido nucleico". El término "ácido nucleico" tal como se usa en el presente documento abarca formas de ácidos nucleicos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN características de virus y células, que incluyen, por ejemplo, células simples y complejas.

[0074] Los términos "oligonucleótido" o "polinucleótido" o "nucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a una molécula que tiene dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres, y usualmente más de diez. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función o uso final del oligonucleótido. El oligonucleótido puede generarse de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa o una combinación de los mismos. Los desoxirribonucleótidos típicos para el ADN son timina, adenina, citosina y guanina. Los ribonucleótidos típicos para ARN son uracilo, adenina, citosina y guanina.

[0075] Como se usa en este documento, los términos "locus" o "región" de un ácido nucleico se refieren a una subregión de un ácido nucleico, por ejemplo, un gen en un cromosoma, un solo nucleótido, una isla CpG, etc.

[0076] Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a nucleótidos (por ejemplo, 1 nucleótido) o polinucleótidos (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia 5-AGT-3' es complementaria a la secuencia 3-TCA-5'. La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O, puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácido nucleico afecta la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre las cadenas de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación y en los métodos de detección que dependen de la unión entre los ácidos nucleicos.

[0077] El término "gen" se refiere a un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) secuencia que comprende las secuencias de codificación necesarias para la producción de un ARN, o de un polipéptido o su precursor. Un polipéptido funcional puede codificarse por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia de codificación siempre que se retenga la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimática, unión de ligando, transducción de señal, etc.) del polipéptido. El término "porción" cuando se usa en referencia a un gen se refiere a fragmentos de ese gen. El tamaño de los fragmentos puede variar desde unos pocos nucleótidos hasta la secuencia génica completa menos un nucleótido. Por lo tanto, "un nucleótido que comprende al menos una porción de un gen" puede comprender fragmentos del gen o del gen completo.

[0078] El término "gen" también abarca las regiones codificantes de un gen estructural e incluye secuencias localizadas adyacentes a la región de codificación tanto en el 5' y 3', por ejemplo, para una distancia de aproximadamente 1 kb en cada extremo, tal que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa (por ejemplo, que comprende secuencias de codificación, reguladoras, estructurales y de otro tipo). Las secuencias que están ubicadas en 5' de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas o no traducidas. Las secuencias que se encuentran 3' o aguas abajo de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas o 3' no traducidas. El término "gen" abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen. En algunos organismos (p. ej., eucariotas), una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias". Los intrones son segmentos de un gen que se transcribe en ARN nuclear (ARNhn); Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se eliminan o "empalman" de la transcripción nuclear o primaria; por lo tanto, los intrones están ausentes en la transcripción del ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

[0079] Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen pueden incluir también secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones "flanqueantes" (estas secuencias flanqueantes están ubicadas 5' o 3' a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, la escisión postranscripcional y la poliadenilación.

[0080] El término "de tipo silvestre" cuando se hace en referencia a un gen se refiere a un gen que tiene las características de un gen aislado de una fuente de origen natural. El término "tipo salvaje" cuando se hace en referencia a un producto genético se refiere a un producto genético que tiene las características de un producto genético aislado de una fuente natural. El término "ocurrencia natural" tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por la mano de una persona en el laboratorio es natural. Un gen de tipo salvaje es a menudo ese gen o alelo que se observa con mayor frecuencia en una población y, por lo tanto, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "de tipo salvaje" del gen. En contraste, el término "modificado" o "mutante" cuando se hace en referencia a un gen o a un producto génico se refiere, respectivamente, a un gen o a un producto génico que muestra modificaciones en la secuencia y/o propiedades funcionales (por ejemplo, alterado características) en comparación con el gen de tipo salvaje o el producto génico. Se observa que los mutantes naturales pueden aislarse; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas en comparación con el gen de tipo salvaje o el producto génico.

[0081] El término "alelo" se refiere a una variación de un gen; las variaciones incluyen, pero no se limitan a variantes y mutantes, loci polimórficos y loci polimórficos de un solo nucleótido, cambios de marco y mutaciones de empalme. Un alelo puede ocurrir naturalmente en una población o puede surgir durante la vida de cualquier individuo en particular de la población.

[0082] Por lo tanto, los términos "variante" y "mutante" cuando se usa en referencia a una secuencia de nucleótidos se refieren a un ácido nucleico de secuencia que difiere en uno o más nucleótidos de otro, por lo general relacionados, secuencia de ácido nucleótido. Una "variación" es una diferencia entre dos secuencias de nucleótidos diferentes; típicamente, una secuencia es una secuencia de referencia.

[0083] La "amplificación" es un caso especial de replicación de ácido nucleico que implica especificidad de plantilla. Debe contrastarse con la replicación de plantilla no específica (por ejemplo, la replicación que depende de la plantilla pero no depende de una plantilla específica). La especificidad de plantilla se distingue aquí de la fidelidad de replicación (por ejemplo, síntesis de la secuencia de polinucleótidos adecuada) y (ribo- o desoxirribo)especificidad de nucleótidos. La especificidad de la plantilla se describe con frecuencia en términos de especificidad de "diana". Las secuencias diana son "dianas" en el sentido de que se busca que se separen de otros ácidos nucleicos. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta clasificación.

[0084] La amplificación de ácidos nucleicos generalmente se refiere a la producción de copias múltiples de un polinucleótido, o una porción del polinucleótido, típicamente comenzando desde una pequeña cantidad del polinucleótido (por ejemplo, una molécula de polinucleótido único, 10 a 100 copias de una molécula de polinucleótido, que puede o no ser exactamente la misma), donde los productos de amplificación o amplicones son generalmente detectables. La amplificación de polinucleótidos abarca una variedad de procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula de a Dn diana o plantilla durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR; véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5,494,810) son formas de amplificación. Los tipos adicionales de amplificación incluyen, entre otros, PCR específica de alelo (Patente de EE.UU. N° 5,639,611), PCR de ensamblaje (Patente de EE.UU. N° 5,965,408), amplificación dependiente de helicasa (Patente de EE.UU. N° 7,662,594), PCR de arranque en caliente (Patentes de EE.Uu . Nos 5,773,258 y 5,338,671), PCR específica de intersecuencia, PCR inversa (Triglia, et al. Al. (1988) Nucleic Acids Res., 16: 8186), PCR mediada por ligadura (Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25: 1854-1858 (1997); Patente de EE.UU. N° 5,508,169), PCR específica de metilación (Herman, et al., (1996) PNAS 93 (13) 9821-9826), minicebador PCR, ligadura múltiple dependiente de la amplificación de la sonda (Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30 (12): e57), PCR multiplex (Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16 (23) 11141-11156; Ballabio, et al., (1990) Human Genetics 84 (6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR de extensión y solapamiento (Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16 (15) 7351-7367), PCR en tiempo real (Higuchi, e t alet al., (1992) Biotechnology 10: 413-417; Higuchi, et al., (1993) Biotechnology 11: 1026-1030), PCR de transcripción inversa (Bustin, SA (2000) J. Molecular Endocrinology 25: 169-193), PCR en fase sólida, PCR entrelazada asimétrica térmica y PCR de contacto. (Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19 (14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16 (5) 812-814; Hecker, et al., (1996) Biotechniques 20 (3) 478-485). La amplificación de polinucleótidos también se puede lograr mediante PCR digital (Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 96; 9236-41, (1999); Publicación de Patente Internacional N° WO05023091A2; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 20070202525).

[0085] Como se usa en este documento, el término "ensayo de detección de ácido nucleico" se refiere a cualquier método para determinar la composición de nucleótidos de un ácido nucleico de interés. El ensayo de detección de ácido nucleico incluye, pero no se limita a, métodos de secuenciación de ADN, métodos de hibridación de sonda, ensayos de escisión específicos de estructura (por ejemplo, el ensayo INVADER, Hologic, Inc.) y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos 5,846,717, 5,985,557, 5,994.069, 6.001,567, 6.090,543 y 6,872,816; Lyamichev y col., Nat. Biotech., 17: 292 (1999), Hall et al., PNAS, EE. UU., 97: 8272 (2000) y US 2009/0253142); reacción en cadena de la polimerasa; métodos de hibridación ramificada (p. ej., Chiron, Patentes de EE.UU. Nos 5,849,481, 5,710,264, 5,124,246 y 5,624,802); replicación de círculo rodante (p. ej., Patentes de EE.UU. Nos6,210,884, 6,183,960 y 6,235,502); NASBA (e.g., la Patente de EE.UU. N° 5,409,818); tecnología de baliza molecular (p. ej., Patente de EE.UU. N° 6,150.097); tecnología de sonda de ciclismo (p. ej., Patentes de Estados Unidos Nos 5,403,711, 5.011,769 y 5,660,988); reacción en cadena de ligasa (por ejemplo, Barnay Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 88, 189-93 (1991)); Ensayo QuARTS (p. ej., Según lo provisto por la Patente de EE.UU. N° 8,361,720; y la Solicitud de Patente de EE.UU. y 2012/0122106); y métodos de hibridación en sándwich (p. ej., Patente de EE.u U. N° 5,288,609).

[0086] El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, tanto si se producen de forma natural como en un digesto de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico se induce (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una polimerasa de ADN y a una temperatura y pH adecuados). El cebador es preferiblemente monocatenario para la máxima eficiencia en la amplificación, pero alternativamente puede ser bicatenario. Si es de doble hebra, la imprimación se trata primero para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método.

[0087] El término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos), sea de origen natural como en un digesto de restricción purificado o producido sintéticamente, de forma recombinante, o mediante amplificación por PCR, que es capaz de hibridar con otro oligonucleótido de interesar. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares (por ejemplo, una "sonda de captura"). Se contempla que cualquier sonda utilizada en la presente invención puede, en algunas realizaciones, marcarse con cualquier "molécula informadora", de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, que incluye, pero no se limita a enzima (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), sistemas fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente divulgación se limite a ningún sistema o etiqueta de detección particular.

[0088] Como se usa en este documento, "metilación" se refiere a la metilación de citosina en las posiciones C5 o N4 de la citosina, la posición N6 de adenina, u otros tipos de metilación ácida nucleica. El ADN amplificado in vitro generalmente no está metilado porque los métodos típicos de amplificación de ADN in vitro no retienen el patrón de metilación de la plantilla de amplificación. Sin embargo, "ADN no metilado" o "ADN metilado" también pueden referirse a ADN amplificado cuya plantilla original estaba no metilada o metilada, respectivamente.

[0089] Por consiguiente, como se usa en el presente documento, un "nucleótido metilado" o una "base de nucleótido metilada" se refiere a la presencia de un resto metilo en una base de nucleótidos, donde el resto metilo no está presente en una base nucleotídica típica reconocida. Por ejemplo, la citosina no contiene un resto metilo en su anillo de pirimidina, pero la 5-metilcitosina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por lo tanto, la citosina no es un nucleótido metilado y la 5-metilcitosina es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, la timina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina; sin embargo, para los fines de este documento, la timina no se considera un nucleótido metilado cuando está presente en el a Dn , ya que la timina es una base típica de nucleótidos del ADN.

[0090] Tal como se utiliza aquí, una "molécula de ácido nucleico metilado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados.

[0091] Como se usa en este documento, un "estado de metilación", "perfil de metilación", y "estado de metilación" de una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia de la ausencia de una o más bases de nucleótidos metilados en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina metilada se considera metilada (por ejemplo, el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico está metilado). Una molécula de ácido nucleico que no contiene ningún nucleótido metilado se considera no metilada.

[0092] El estado de metilación de una secuencia de ácido nucleico particular (por ejemplo, un marcador de genes o región de ADN como se describe en el presente documento) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de las bases (por ejemplo, de una o más citosinas) dentro de la secuencia, o puede indicar información sobre la densidad de metilación regional dentro de la secuencia con o sin proporcionar información precisa de las ubicaciones dentro de la secuencia en que ocurre la metilación.

[0093] El estado de metilación de un locus de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de un nucleótido metilado en un locus particular, en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido en una molécula de ácido nucleico se metila cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido en la molécula de ácido nucleico es 5-metilcitosina. De manera similar, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido en una molécula de ácido nucleico no está metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido en la molécula de ácido nucleico es citosina (y no 5-metilcitosina).

[0094] El estado de metilación puede opcionalmente estar representado o indicado por un "valor de metilación" (por ejemplo, representando una frecuencia de metilación, la fracción, la relación, por ciento, etc.). Un valor de metilación puede ser generado, por ejemplo, mediante la cuantificación de la cantidad de ácido nucleico intacto presente después de la digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de la metilación o mediante la comparación de perfiles de amplificación después de la reacción con bisulfito o mediante la comparación de secuencias de ácidos nucleicos tratados con bisulfito y sin tratar. En consecuencia, un valor, por ejemplo, un valor de metilación, representa el estado de metilación y, por lo tanto, puede usarse como un indicador cuantitativo del estado de metilación en múltiples copias de un locus. Esto es de uso particular cuando es deseable comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un umbral o valor de referencia.

[0095] Como se usa en este documento, "frecuencia de metilación" o "porcentaje de metilación (%)" se refieren al número de casos en los que una molécula o locus está metilado en relación con el número de instancias en que la molécula o locus es no metilado.

[0096] Como tal, el estado de metilación describe el estado de metilación de un ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia genómica). Además, el estado de metilación se refiere a las características de un segmento de ácido nucleico en un locus genómico particular relevante para la metilación. Dichas características incluyen, pero no se limitan a, si alguno de los residuos de citosina (C) dentro de esta secuencia de ADN están metilados, la ubicación de los residuos C metilados, la frecuencia o el porcentaje de C metilado en cualquier región particular de un ácido nucleico y diferencias alélicas en la metilación debido, por ejemplo, a la diferencia en el origen de los alelos. Los términos "estado de metilación", "perfil de metilación" y "estado de metilación" también se refieren a la concentración relativa, concentración absoluta o patrón de C metilado o C no metilado en cualquier región particular de un ácido nucleico en una muestra biológica. Por ejemplo, si el (los) residuo(s) de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados, pueden denominarse "hipermetilados" o "metilación incrementada", mientras que si el (los) residuo(s) de citosina (C) está(n) dentro de una secuencia ADN no están metilados, pueden denominarse "hipometilados" o que tienen "metilación disminuida". Del mismo modo, si el (los) residuo(s) de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico se metilan en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, de una región diferente o de un individuo diferente, etc.), esa secuencia se considera hipermetilada o ha aumentado metilación en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, si los residuos de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, de una región diferente o de un individuo diferente, etc.), esa secuencia se considera hipometilada o ha disminuido metilación en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Además, el término "patrón de metilación" como se usa en el presente documento se refiere a los sitios colectivos de nucleótidos metilados y no metilados sobre una región de un ácido nucleico. Dos ácidos nucleicos pueden tener la misma frecuencia de metilación o un porcentaje de metilación similar o similar, pero tienen patrones de metilación diferentes cuando el número de nucleótidos metilados y no metilados es igual o similar en toda la región, pero las ubicaciones de los nucleótidos metilados y no metilados son diferentes. Se dice que las secuencias están "metiladas diferencialmente" o que tienen una "diferencia en la metilación" o que tienen un "estado de metilación diferente" cuando difieren en la extensión (por ejemplo, se ha aumentado o disminuido la metilación en relación con la otra), la frecuencia o el patrón de metilación. El término "metilación diferencial" se refiere a una diferencia en el nivel o patrón de metilación de ácido nucleico en una muestra positiva de cáncer en comparación con el nivel o patrón de metilación de ácido nucleico en una muestra de cáncer negativo. También puede referirse a la diferencia en niveles o patrones entre pacientes que tienen recurrencia de cáncer después de la cirugía versus pacientes que no tienen recurrencia. La metilación diferencial y los niveles o patrones específicos de metilación del ADN son biomarcadores pronósticos y predictivos, por ejemplo, una vez que se han definido las características predictivas o de corte correctas.

[0097] La frecuencia de estado de metilación puede ser usada para describir una población de individuos o de una muestra de un solo individuo. Por ejemplo, un locus de nucleótidos que tiene una frecuencia de estado de metilación del 50% se metila en el 50% de los casos y no se metila en el 50% de los casos. Dicha frecuencia puede usarse, por ejemplo, para describir el grado en que un locus de nucleótidos o una región de ácido nucleico se metila en una población de individuos o en una colección de ácidos nucleicos. Por lo tanto, cuando la metilación en una primera población o grupo de moléculas de ácido nucleico es diferente de la metilación en una segunda población o grupo de moléculas de ácido nucleico, la frecuencia del estado de metilación de la primera población o grupo será diferente de la frecuencia del estado de metilación de la segunda población o piscina. Tal frecuencia también se puede usar, por ejemplo, para describir el grado en que un locus de nucleótidos o una región de ácido nucleico se metila en un solo individuo. Por ejemplo, dicha frecuencia puede usarse para describir el grado en que un grupo de células de una muestra de tejido se metila o no se metila en un locus de nucleótidos o región de ácido nucleico.

[0098] Como se usa en el presente documento un "locus de nucleótidos" se refiere a la ubicación de un nucleótido en una molécula de ácido nucleico. Un locus de nucleótidos de un nucleótido metilado se refiere a la ubicación de un nucleótido metilado en una molécula de ácido nucleico.

[0099] Típicamente, la metilación de ADN humano se produce en una secuencia de dinucleótido incluyendo una guanina adyacente y citosina donde se encuentra la citosina 5' de la guanina (también denominadas secuencias de dinucleótidos CpG). La mayoría de las citosinas dentro de los dinucleótidos CpG están metiladas en el genoma humano, sin embargo, algunas permanecen sin metilar en regiones genómicas específicas ricas en dinucleótidos CpG, conocidas como islas CpG (véase, por ejemplo, Antequera et al. (1990) Cell 62: 503-514).

[0100] Como se usa en el presente documento, una "isla CpG" se refiere a una región rica en G:C de ADN genómico que contiene un mayor número de dinucleótidos CpG con respecto al ADN genómico total. Una isla CpG puede tener al menos 100, 200 o más pares de bases de longitud, donde el contenido G:C de la región es al menos 50% y la proporción de frecuencia CpG observada sobre la frecuencia esperada es 0,6; en algunos casos, una isla CpG puede tener al menos 500 pares de bases de longitud, donde el contenido G:C de la región es al menos 55%) y la proporción de frecuencia CpG observada sobre la frecuencia esperada es 0,65. La frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada se puede calcular de acuerdo con el método proporcionado en Gardiner-Garden et al (1987) J. Mol. Biol. 196: 261-281. Por ejemplo, la frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada se puede calcular de acuerdo con la fórmula R = (A X B)/(C X D), donde R es la relación de la frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada, A es el número de CpG dinucleótidos en una secuencia analizada, B es el número total de nucleótidos en la secuencia analizada, C es el número total de nucleótidos C en la secuencia analizada y D es el número total de nucleótidos G en la secuencia analizada. El estado de metilación se determina típicamente en islas CpG, por ejemplo, en regiones promotoras. Sin embargo, se apreciará que otras secuencias en el genoma humano son propensas a la metilación del ADN como CpA y CpT (véase Ramsahoye (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 5237-5242; Salmon y Kaye (1970) Biochim Biophys. Acta. 204: 340-351; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2827-2842; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4353-4367; Woodcock (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 888-894).

[0101] Como se usa en el presente documento, un reactivo que modifica un nucleótido de la molécula de ácido nucleico en función del estado de metilación de la molécula de ácido nucleico, o un reactivo específico de metilación, se refiere a un compuesto o composición u otro agente que puede cambiar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de una manera que refleja el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico. Los métodos para tratar una molécula de ácido nucleico con dicho reactivo pueden incluir poner en contacto la molécula de ácido nucleico con el reactivo, junto con pasos adicionales, si se desea, para lograr el cambio deseado de la secuencia de nucleótidos. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido metilado se modifica a un nucleótido diferente. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido no metilado se modifica a un nucleótido diferente. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada uno de un nucleótido seleccionado que no está metilado (por ejemplo, cada citosina no metilada) se modifica a un nucleótido diferente. El uso de dicho reactivo para cambiar la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido que es un nucleótido metilado (por ejemplo, cada citosina metilada) se modifica a un nucleótido diferente. Como se usa en este documento, el uso de un reactivo que modifica un nucleótido seleccionado se refiere a un reactivo que modifica un nucleótido de los cuatro nucleótidos que ocurren típicamente en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para ADN y C, G, U, y A para ARN), de modo que el reactivo modifique un nucleótido sin modificar los otros tres nucleótidos. En una realización ejemplar, dicho reactivo modifica un nucleótido seleccionado no metilado para producir un nucleótido diferente. En otra realización ejemplar, dicho reactivo puede desaminar nucleótidos de citosina no metilados. Un reactivo ejemplar es el bisulfito.

[0102] Como se usa en este documento, el término "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende en algunas realizaciones bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno, o combinaciones de los mismos para distinguir entre citidinas metiladas y no metiladas, por ejemplo, en secuencias de dinucleótidos CpG.

[0103] El término "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de un ácido nucleico.

[0104] El término "MS AP-PCR" (reacción en cadena de la polimerasa preparada arbitrariamente sensible a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un escaneo global del genoma usando cebadores ricos en CG para centrarse en las regiones más probables para contener dinucleótidos CpG, y descritos por Gonzalgo et al. (1997) Cancer Research 57: 594-599.

[0105] El término "MethyLight™" se refiere a la técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads et al. (1999) Cancer Res. 59: 2302-2306.

[0106] El término "HeavyMethyl™” se refiere a un ensayo en donde las sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en este documento como bloqueadores) que cubren las posiciones de CpG entre, o cubiertas por, los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

[0107] El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™” se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight ™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo de MethyLight™ se combina con la metilación específica de bloqueo sondas que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.

[0108] El término "Ms-SNuPE" (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531.

[0109] El término "MSP" (PCR específica de mutilación) se refiere al ensayo de mutilación reconocido en la técnica descrito por Herman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 9821-9826, y por la Patente de EE.UU. N° 5,786,146.

[0110] El término "COBRA" (Combined Bisulfite Restriction Analysis) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong & Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534.

[0111] El término "MCA" (Methylated CpG Island Amplification) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota et al. (1999) Cancer Res. 59: 2307-12, y en el documento WO 00/26401A1.

[0112] Como se usa en el presente documento, un "nucleótido seleccionado" se refiere a un nucleótido de los cuatro nucleótidos que se producen típicamente en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para ADN y C, G, U y A para ARN) y puede incluir derivados metilados de los nucleótidos que ocurren típicamente (por ejemplo, cuando C es el nucleótido seleccionado, tanto el C metilado como el no metilado se incluyen dentro del significado de un nucleótido seleccionado), mientras que un nucleótido seleccionado metilado se refiere específicamente a un nucleótido metilado que ocurre típicamente y un nucleótido seleccionado no metilado se refiere específicamente a un nucleótido no metilado que se produce típicamente.

[0113] Los términos "enzima de restricción específica de metilación" o "enzima de restricción sensible a metilación" se refieren a una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiente del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. En el caso de una enzima de restricción que corta específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o está hemimetilado, el corte no tendrá lugar o tendrá una eficacia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento está metilado. En el caso de una enzima de restricción que corta específicamente si el sitio de reconocimiento está metilado, el corte no tendrá lugar o tendrá una eficacia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento no está metilado. Se prefieren las enzimas de restricción específicas de metilación, cuya secuencia de reconocimiento contiene un dinucleótido CG (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento como CGCG o CCCGGG). Más preferidas para algunas realizaciones son las enzimas de restricción que no se cortan si la citosina en este dinucleótido se metila en el átomo de carbono C5.

[0114] Como se usa en el presente documento, un "nucleótido diferente" se refiere a un nucleótido que es químicamente diferente de un nucleótido seleccionado, típicamente tal que el nucleótido diferente tiene propiedades de emparejamiento de bases Watson-Crick que difieren del nucleótido seleccionado, con lo que el nucleótido que ocurre típicamente que es complementario al nucleótido seleccionado no es el mismo que el nucleótido que ocurre típicamente que es complementario a los diferentes nucleótidos. Por ejemplo, cuando C es el nucleótido seleccionado, U o T puede ser el nucleótido diferente, que se ejemplifica por la complementariedad de C a G y la complementariedad de U o T a A. Como se usa en el presente documento, un nucleótido que es complementario al nucleótido seleccionado o que es complementario a los diferentes nucleótidos se refiere a un nucleótido que se empareja en bases, en condiciones de alta rigurosidad, con el nucleótido seleccionado o un nucleótido diferente con mayor afinidad que el emparejamiento de bases del nucleótido complementario con tres de los cuatro nucleótidos que ocurren típicamente. Un ejemplo de complementariedad es el emparejamiento de bases de Watson-Crick en ADN (por ejemplo, AT y CG) y ARN (por ejemplo, AU y CG). Así, por ejemplo, los pares de bases G, en condiciones de alta rigurosidad, con mayor afinidad a C que los pares de bases G a G, A o T y, por lo tanto, cuando C es el nucleótido seleccionado, G es un nucleótido complementario al nucleótido seleccionado.

[0115] Como se usa en el presente documento, la "sensibilidad" de un marcador dado se refiere al porcentaje de muestras que informan un valor de metilación de ADN por encima de un valor umbral que distingue entre muestras neoplásicas y no neoplásicas. En algunas realizaciones, un positivo se define como una neoplasia confirmada por histología que informa un valor de metilación del ADN por encima de un valor umbral (por ejemplo, el rango asociado con la enfermedad), y un falso negativo se define como una neoplasia confirmada por histología que informa un valor de metilación de ADN por debajo del valor umbral (p. ej., el rango asociado con ninguna enfermedad). El valor de la sensibilidad, por lo tanto, refleja la probabilidad de que una medición de metilación del ADN para un marcador dado obtenido de una muestra enferma conocida esté dentro del rango de mediciones asociadas a la enfermedad. Como se define aquí, la relevancia clínica del valor de sensibilidad calculado representa una estimación de la probabilidad de que un marcador determinado detecte la presencia de una condición clínica cuando se aplica a un sujeto con esa condición.

[0116] Como se usa en este documento, la "especificidad" de un marcador dado se refiere al porcentaje de muestras no neoplásicas que informan un valor de metilación del ADN por debajo de un valor umbral que distingue entre muestras neoplásicas y no neoplásicas. En algunas realizaciones, un negativo se define como una muestra no neoplásica confirmada por histología que informa un valor de metilación del ADN por debajo del valor umbral (por ejemplo, el rango asociado con ninguna enfermedad) y un falso positivo se define como una muestra no neoplásica confirmada histológicamente que informa un valor de metilación del ADN por encima del valor umbral (por ejemplo, el rango asociado con la enfermedad). El valor de especificidad, por lo tanto, refleja la probabilidad de que una medición de metilación de ADN para un marcador dado obtenido de una muestra no neoplásica conocida esté en el rango de mediciones no asociadas a la enfermedad. Como se define aquí, la relevancia clínica del valor de especificidad calculado representa una estimación de la probabilidad de que un marcador determinado detecte la ausencia de una condición clínica cuando se aplica a un paciente sin esa condición.

[0117] El término "AUC" como se usa en el presente documento es una abreviatura para el "área bajo una curva". En particular, se refiere al área bajo una curva de características operativas del receptor (ROC). La curva ROC es un gráfico de la tasa positiva verdadera contra la tasa de falsos positivos para los diferentes puntos de corte posibles de una prueba de diagnóstico. Muestra la compensación entre sensibilidad y especificidad según el punto de corte seleccionado (cualquier aumento en la sensibilidad irá acompañado de una disminución en la especificidad). El área bajo una curva ROC (AUC) es una medida para la precisión de una prueba de diagnóstico (cuanto mayor sea el área, mejor; el óptimo es 1; una prueba aleatoria tendría una curva ROC en la diagonal con un área de 0,5; para referencia: JP Egan. (1975) Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, Nueva York).

[0118] Como se usa en el presente documento, el término "neoplasia" se refiere a "una masa anormal de tejido, cuyo crecimiento excede y está descoordinado con el de los tejidos normales" Véase, por ejemplo, Willis RA, "The Spread of Tumors in the Human Body", Londres, Butterworth & Co, 1952.

[0119] Como se usa en este documento, el término "adenoma" se refiere a un tumor benigno de origen glandular. Aunque estos crecimientos son benignos, con el tiempo pueden progresar hasta convertirse en malignos.

[0120] El término "pre-canceroso" o "pre-neoplásico" y sus equivalentes se refieren a cualquier trastorno proliferativo celular que esté experimentando transformación maligna.

[0121] Un "sitio" de una neoplasia, adenoma, cáncer, etc. es el tejido, órgano, tipo de célula, área anatómica, parte del cuerpo, etc. en el cuerpo de un sujeto donde se ubica la neoplasia, adenoma, cáncer, etc.

[0122] Como se usa en el presente documento, una aplicación de prueba de "diagnóstico" incluye la detección o identificación de un estado o condición de enfermedad de un sujeto, determinando la probabilidad de que un sujeto contraiga una enfermedad o condición dada, determinando la probabilidad de que un sujeto con una enfermedad o afección responderá a la terapia, determinando el pronóstico de un sujeto con una enfermedad o afección (o su probable progresión o regresión) y determinando el efecto de un tratamiento en un sujeto con una enfermedad o afección. Por ejemplo, se puede usar un diagnósti

contraiga una neoplasia o la probabilidad de que dicho sujeto responda favorablemente a un compuesto (por ejemplo, un medicamento, por ejemplo, un medicamento) u otro tratamiento.

[0123] El término "marcador", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia (por ejemplo, un ácido nucleico o una región de un ácido nucleico) que puede diagnosticar un cáncer al distinguir las células cancerosas de las células normales, por ejemplo, basándose en su estado de metilación.

[0124] El término "aislado" cuando se usa en relación con un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un ácido nucleico contaminante con el que normalmente se asocia en su fuente natural. El ácido nucleico aislado está presente en una forma o entorno diferente al que se encuentra en la naturaleza. Por el contrario, los ácidos nucleicos no aislados, como el ADN y el ARN, se encuentran en el estado en que existen en la naturaleza. Los ejemplos de ácidos nucleicos no aislados incluyen: una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) que se encuentra en el cromosoma de la célula huésped en proximidad de genes vecinos; las secuencias de ARN, como una secuencia específica de ARNm que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con numerosos otros ARNm que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína particular incluye, a modo de ejemplo, dicho ácido nucleico en las células que normalmente expresan la proteína, donde el ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales, o está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente que la encontrada en la naturaleza. El ácido nucleico u oligonucleótido aislado puede estar presente en forma monocatenaria o bicatenaria.Cuando se va a utilizar un ácido nucleico u oligonucleótido aislado para expresar una proteína, el oligonucleótido contendrá como mínimo la cadena sentido o codificante (es decir, el oligonucleótido puede ser monocatenario), pero puede contener hebras tanto sentido como antisentido (es decir, el oligonucleótido puede ser bicatenario). Un ácido nucleico aislado puede, después del aislamiento de su entorno natural o típico, ser combinado con otros ácidos nucleicos o moléculas. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede estar presente en una célula huésped en la que se ha colocado, por ejemplo, para expresión heteróloga.

[0125] El término "purificado" se refiere a moléculas, secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos que se eliminan de su entorno natural, se aíslan o se separan. Por lo tanto, una "secuencia de ácido nucleico aislada" puede ser una secuencia de ácido nucleico purificada. Las moléculas "sustancialmente purificadas" son al menos 60% libres, preferiblemente al menos 75% libres, y más preferiblemente al menos 90% libres de otros componentes con los que están naturalmente asociados. Como se usa en este documento, los términos "purificado" o "purificar" también se refieren a la eliminación de contaminantes de una muestra. La eliminación de proteínas contaminantes da como resultado un aumento en el porcentaje de polipéptido o ácido nucleico de interés en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos recombinantes se expresan en células huésped vegetales, bacterianas, de levadura o de mamífero y los polipéptidos se purifican mediante la eliminación de las proteínas de la célula huésped; el porcentaje de polipéptidos recombinantes se incrementa así en la muestra.

[0126] El término "composición que comprende" una secuencia de polinucleótidos dada o polipéptido se refiere ampliamente a cualquier composición que contiene la secuencia de polinucleótidos dada o polipéptido. La composición puede comprender una solución acuosa que contiene sales (por ejemplo, NaCl), detergentes (por ejemplo, SDS) y otros componentes (por ejemplo, solución de Denhardt, leche en polvo, ADN de esperma de salmón, etc.).

[0127] El término "muestra" se usa en su sentido más amplio. En cierto sentido, puede referirse a una célula o tejido animal. En otro sentido, está destinado a incluir una muestra o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas se pueden obtener de plantas o animales (incluidos los humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras ambientales incluyen material ambiental como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales.

[0128] Como se usa en el presente documento, una "muestra remota" como se usa en algunos contextos se refiere a una muestra recolectada indirectamente de un sitio que no es la fuente de células, tejidos u órganos de la muestra. Por ejemplo, cuando el material de muestra que se origina en el colon o el recto se evalúa en una muestra de heces (por ejemplo, no de una muestra tomada directamente de tejido colorrectal), la muestra es una muestra remota.

[0129] Como se usa en el presente documento, los términos "paciente" o "sujeto" se refieren a organismos sujetos a diversas pruebas proporcionadas por la tecnología. El término "sujeto" incluye animales, preferiblemente mamíferos, incluidos humanos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización aún más preferida, el sujeto es un humano.

[0130] Como se usa en el presente documento, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de entrega para entregar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, dichos sistemas de entrega incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o entrega de reactivos de reacción (por ejemplo, oligonucleótidos, enzimas, etc. en los contenedores apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo, etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (p. ej., cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes. Como se usa en el presente documento, el término "kit fragmentado" se refiere a sistemas de suministro que comprenden dos o más recipientes separados que contienen cada uno una porción del total de componentes del kit. Los contenedores pueden ser entregados al destinatario previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener una enzima para usar en un ensayo, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleótidos. El término "kit fragmentado" pretende abarcar kits que contienen reactivos específicos de analitos (ASR) regulados bajo la sección 520 (e) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, pero no se limitan a los mismos. De hecho, cualquier sistema de entrega que comprenda dos o más contenedores separados, cada uno de los cuales contiene una parte del total de componentes del kit, se incluye en el término "kit fragmentado". En contraste, un "kit combinado" se refiere a un sistema de suministro que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un único recipiente (por ejemplo, en una sola caja que contiene cada uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye kits fragmentados y combinados.

Realizaciones de la tecnología

[0131] En conjunto, los cánceres gastrointestinales representan más mortalidad por cáncer que cualquier otro sistema de órganos. El cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más mortal, en el país, con más de 600.000 muertes anuales. Si bien los cánceres colorrectales se examinan en los Estados Unidos, el cumplimiento es deficiente dado el costo, la incomodidad y la invasividad de la colonoscopia y el pésimo desempeño del menú actual de análisis de sangre fecal no invasiva. Para disminuir la carga de CCR en los individuos y la sociedad, se necesitan nuevas estrategias de prueba que sean efectivas y amigables para el paciente. Una prueba molecular precisa y no invasiva que utiliza biomarcadores ampliamente informativos puede proporcionar un enfoque racional. Un ensayo basado en heces es uno de esos ejemplos. Los cánceres y precánceres colorrectales arrojan células y ADN a la corriente digestiva y finalmente se excretan en las heces. Se han utilizado ensayos altamente sensibles para detectar marcadores genéticos y epigenéticos en heces de pacientes con cáncer de CCR y pólipos precancerosos. En un estudio multicéntrico reciente, estos marcadores se incorporaron a un ensayo de heces que exhibía una sensibilidad para el CCR esencialmente equivalente a la de la colonoscopia. Los nuevos marcadores serían de mayor valor si demostraran ser más sensibles, más específicos o más predictivos del sitio de la lesión que los marcadores existentes. Además, los marcadores idealmente detectarían las lesiones precancerosas críticas (pólipos adenomatosos y pólipos serrados) además del CCR cuando se aplican a una aplicación de detección.

[0132] Los mecanismos genómicos subyacentes al cáncer colorrectal implican genes y anomalías cromosómicas, incluyendo mutaciones de una sola base, aneuploidía, deleciones, translocaciones, alteraciones del número de copias, y cambios de expresión. Todos estos eventos se están estudiando intensamente utilizando nuevas tecnologías genómicas, incluida la secuenciación masiva paralela. Sin embargo, las alteraciones genéticas están demostrando ser muy heterogéneas y, en algunos aspectos, aleatorias, en lugar de recurrentes. El gen APC, por ejemplo, es el gen más mutado en las lesiones de CCR (~90%), pero los sitios de mutación se extienden a lo largo de 15 exones codificadores que requieren un análisis de todo el gen. Esto agrega complejidad al desarrollo de ensayos con los niveles de rendimiento requeridos.

[0133] La metilación epigenético de ADN en sitios de la isla de citosina-fosfato-guanina (CpG) por metiltransferasas de a Dn se ha estudiado como una clase potencial de biomarcadores en los tejidos de la mayoría de los tipos de tumores. En un mecanismo biológicamente atractivo, se cree que los eventos de metilación adquiridos en regiones promotoras de genes supresores de tumores silencian la expresión, contribuyendo a la oncogénesis. La metilación del ADN puede ser una herramienta de diagnóstico más estable química y biológicamente que la expresión de ARN o proteína. Además, los marcadores de metilación aberrantes son más ampliamente informativos y sensibles que las mutaciones de ADN individuales y ofrecen una excelente especificidad.

[0134] Las aplicaciones clínicas de marcadores altamente discriminantes podrían tener un gran impacto. Por ejemplo, el análisis de dichos marcadores en medios distantes, como heces o sangre, se utiliza en pruebas de detección o diagnósticos precisos para la detección de neoplasia colorrectal.

[0135] En experimentos realizados durante el desarrollo de realizaciones para la presente divulgación, se identificaron marcadores en un estudio de casos y controles comparando el estado de metilación de los marcadores de ADN del tejido colorrectal de sujetos con neoplasia colorrectal, adenoma y/o pólipos de sésiles serrados (SSP) al estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de sujetos de control (p. ej., tejido normal como colon normal) (véanse, Ejemplos 1-2, Tablas 1-5).

[0136] Por ejemplo, marcadores y/o paneles de marcadores (por ejemplo, una región cromosómica que tiene una anotación seleccionada de FLI1, Op lAh , DTX1, MATK, SFMBT2 región 2, KCNK12, VAV3 región 1, SFMBT2 región 3, PPP2R5C, CHST2 región 2, PKIA, PDGFD, ELOVL2, CHST2 región 1, SFMBT2 región 1, QKI, VAV3 región 2 y SLC8A3) se identificaron en un estudio de casos y controles comparando el estado de metilación de los marcadores de ADN (p. ej., del tejido colorrectal de sujetos con neoplasia colorrectal y/o adenoma al estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de los sujetos de control (por ejemplo, tejido normal como el de colon normal) (véase, ejemplo 1 y las Tablas 1A y 1B).

[0137] Los marcadores y/o paneles de marcadores (por ejemplo, una región cromosómica que tiene una anotación seleccionada de BMP3, NDRG4, PDGFG, CHST2 y SFMBT2) se identificaron en estudios de casos y controles al comparar el estado de metilación de los marcadores de ADN del tejido colorrectal de sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer colorrectal con el estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de sujetos de control (p. ej., tejido normal tal como colon normal) (ver, Ejemplo 1 y Tabla 2).

[0138] Además, 185, 244, y 111 de marcadores de metilación ADN específicos para los cánceres colorrectales, adenomas grandes, y pólipos de sésiles serrados, respectivamente, se identificaron (véase el Ejemplo 2 y en las Tablas 3, 4 y 5). Junto con los casos de cáncer colorrectal, se secuenciaron casos de adenoma grande y pólipos de sésiles serrados, mucosa colónica normal y ADN normal de glóbulos blancos.

[0139] Experimentos adicionales realizados durante el desarrollo de realizaciones para la presente divulgación demostraron que NDRG4, BMP3, OPLAH, FLI1, PDGFD, CHST_7889, SFMBT2_895, SFMBT2_896, SFMBT2_897, CHST2_7890, VAV3 y DTX1 como marcadores efectivos para detectar cáncer colorrectal con muestras de heces (ver, Ejemplo 3 y Tablas 6 y 7).

[0140] En consecuencia, se divulga en el presente documento una tecnología para marcadores de detección de cáncer colorrectal que proporcionan una alta relación señal/ruido y un bajo nivel de fondo cuando se detecta a partir de muestras tomadas de un sujeto (por ejemplo, muestra de heces; una muestra de tejido colorrectal). Los marcadores se identificaron en un estudio de casos y controles comparando el estado de metilación de los marcadores de ADN del tejido colorrectal de sujetos con neoplasia colorrectal y/o adenoma con el estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de los sujetos control (p. ej., tejido normal como el colon normal) (véanse los Ejemplos 1-3 y las Tablas 1-6).

[0141] Aunque la descripción en el presente documento se refiere a ciertas realizaciones ilustradas, debe entenderse que estas realizaciones se presentan a modo de ejemplo y no a modo de limitación.

[0142] En aspectos particulares, la presente tecnología se refiere a composiciones y métodos para identificar, determinar y/o clasificar un cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, los métodos comprenden determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación en una muestra biológica aislada de un sujeto (por ejemplo, una muestra de heces o una muestra de tejido colorrectal), en donde un cambio en el estado de metilación del marcador es indicativo de la presencia, clase o sitio de un cáncer colorrectal. Las realizaciones particulares se refieren a marcadores que comprenden una región metilada diferencialmente (DMR, por ejemplo, una DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) que se utilizan para el diagnóstico o la detección de trastornos proliferativos celulares neoplásicos (por ejemplo, cáncer colorrectal), incluida la detección temprana durante estadios pre-cancerosos de la enfermedad. Además, los marcadores se usan para la diferenciación de trastornos proliferativos celulares neoplásicos de benignos. En aspectos particulares, la presente tecnología proporciona un método en donde un trastorno proliferativo de células neoplásicas se distingue de un trastorno proliferativo de células benignas.

[0143] Los marcadores de la presente tecnología son particularmente eficaces para detectar o distinguir entre trastornos proliferativos colorrectales, proporcionando de este modo medios mejorados para la detección temprana, clasificación y tratamiento de cáncer colorrectal.

[0144] Además de las realizaciones en las que se analiza el análisis de metilación de al menos un marcador, una región de un marcador o una base de un marcador que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) proporcionado aquí, la tecnología también proporciona paneles de marcadores que comprenden al menos un marcador, región de un marcador o base de un marcador que comprende un DMR con utilidad para la detección de cánceres colorrectales. Además de las realizaciones en las que se analiza el análisis de metilación de al menos un marcador, una región de un marcador o una base de un marcador que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) que se proporciona en el presente documento, la tecnología también proporciona paneles de marcadores que comprenden cualquier tipo o clase de fabricantes (por ejemplo, marcador completo, región de un marcador, base de un marcador, etc.) que tienen utilidad para la detección de cánceres colorrectales (por ejemplo, un marcador de expresión, cantidad de a Dn , péptido, hemoglobina, etc.).

[0145] Algunas realizaciones de la tecnología se basan en el análisis del estado de metilación de CpG de al menos un marcador, región de un marcador o base de un marcador que comprende un DMR.

[0146] En algunas realizaciones, la presente tecnología proporciona el uso de una técnica de bisulfito, en combinación con uno o más ensayos de metilación para determinar el estado de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG dentro de al menos un marcador que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6). Los dinucleótidos CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (alternativamente conocidos como metilados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente). Sin embargo, los métodos de la presente divulgación son adecuados para el análisis de muestras biológicas de naturaleza heterogénea, por ejemplo, una baja concentración de células tumorales o materiales biológicos a partir de ellas, dentro de un fondo de una muestra remota (por ejemplo, sangre, efluente de órganos o heces). En consecuencia, al analizar el estado de metilación de una posición de CpG dentro de una muestra de este tipo, se puede usar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo, porcentaje, fracción, relación, proporción o grado) de metilación en una posición de CpG particular.

[0147] La determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG en marcadores que comprenden una DMR tiene utilidad tanto en el diagnóstico como en la caracterización de cánceres colorrectales.

Combinaciones de marcadores

[0148] En algunas realizaciones, la tecnología se relaciona con la evaluación del estado de metilación de combinaciones de marcadores que comprenden un DMR de las Tablas 1-6 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 27, 29, 30) o más marcadores que comprenden un DMR. En algunas realizaciones, evaluar el estado de metilación de más de un marcador aumenta la especificidad y/o sensibilidad de un cribado o diagnóstico para identificar una neoplasia colorrectal en un sujeto. Además de las realizaciones en las que se analiza el análisis de metilación de al menos un marcador, una región de un marcador o una base de un marcador que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) que se proporciona en el presente documento, también se analiza la tecnología proporciona paneles de marcadores que comprenden cualquier tipo o clase de fabricantes (por ejemplo, marcador completo, región de un marcador, base de un marcador, etc.) que tienen utilidad para la detección de cánceres colorrectales (por ejemplo, un marcador de expresión, cantidad de ADN, péptido, hemoglobina, etc.).

[0149] Se predicen varios cánceres mediante diversas combinaciones de marcadores, por ejemplo, como se identifica mediante técnicas estadísticas relacionadas con la especificidad y la sensibilidad de la predicción. La tecnología proporciona métodos para identificar combinaciones predictivas y combinaciones predictivas validadas para algunos tipos de cáncer.

Métodos para analizar el estado de metilación

[0150] Un método para analizar un ácido nucleico para la presencia de 5-metilcitosina se basa en el método de bisulfito descrito por Frommer, et al. para la detección de 5-metilcitosinas en el ADN (Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 1827-31) o variaciones de las mismas. El método de bisulfito para mapear las 5-metilcitosinas se basa en la observación de que la citosina, pero no la 5-metilcitosina, reacciona con el ion sulfito de hidrógeno (también conocido como bisulfito). En algunas realizaciones, la reacción se realiza de acuerdo con los siguientes pasos: primero, la citosina reacciona con sulfito de hidrógeno para formar una citosina sulfonada. A continuación, la desaminación espontánea del intermedio de reacción sulfonado da como resultado un uracilo sulfonado. Finalmente, el uracilo sulfonado se desulfona en condiciones alcalinas para formar uracilo. La detección es posible porque el uracilo forma pares de bases con adenina (comportándose así como timina), mientras que los pares de bases de 5-metilcitosina con guanina (comportándose así como citosina). Esto hace posible la discriminación de las citosinas metiladas de las citosinas no metiladas mediante, por ejemplo, la secuenciación genómica de bisulfito (Grigg G y Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189 -98) o PCR específica de metilación (MSP) como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 5,786,146.

[0151] Algunas tecnologías convencionales están relacionadas con métodos que comprenden encerrar el ADN para analizar en una matriz de agarosa, evitando así la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con el ADN monocatenario), y reemplazando los pasos de precipitación y purificación con una diálisis rápida (Olek A, et al. (1996) "A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis" Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). Por lo tanto, es posible analizar el estado de metilación de las células individuales, ilustrando la utilidad y la sensibilidad del método. Rein, T., y cols. proporcionan una visión general de los métodos convencionales para detectar 5-metilcitosina. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 2255.

[0152] La técnica de bisulfito típicamente implica amplificar fragmentos cortos y específicos de un ácido nucleico conocido después de un tratamiento con bisulfito, y luego analizar el producto por secuenciación (Olek y Walter (1997) Nat. Genet. 17: 275-6) o una reacción de extensión del cebador (Gonzalgo & Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-31; WO 95/00669; Patente de EE.UU. N° 6,251,594) para analizar posiciones individuales de citosina. Algunos métodos utilizan la digestión enzimática (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-4). La detección por hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek et al., WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso de la técnica de bisulfito para la detección de metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark (1994) Bioessays 16: 431­ 6; Zeschnigk et al. (1997) Hum Mol Genet. 6: 387-95; Feil et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 695; Martin et al. (1995) Gene 157: 261-4; WO 9746705; WO 9515373).

[0153] Se conocen varios procedimientos de ensayo de metilación en la técnica y se pueden usar junto con el tratamiento con bisulfito de acuerdo con la tecnología actual. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas CpG) dentro de una secuencia de ácido nucleico. Dichos ensayos implican, entre otras técnicas, la secuenciación de ácido nucleico tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis de transferencia Southern y uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

[0154] Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de patrones de metilación y distribuciones de 5-metilcitosina mediante el tratamiento con bisulfito (Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 1827-1831). Además, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito encuentra uso en la evaluación del estado de metilación, por ejemplo, según lo descrito por Sadri y Hornsby (1997) Nucl. Acidos Res. 24: 5058-5059 o como se incorpora en el método conocido como COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534).

[0155] El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativa útil para determinar los niveles de metilación del ADN en loci específico en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997). Brevemente, la digestión con enzimas de restricción se usa para revelar diferencias de secuencia dependientes de la metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante tratamiento con bisulfito estándar de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 1827-1831, 1992). La amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito se realiza utilizando cebadores específicos para las islas CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasa de restricción, electroforesis en gel y detección mediante sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de forma linealmente cuantitativa en un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de manera confiable al ADN obtenido de muestras de tejido embebido en parafina microdiseccionadas.

[0156] Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podría encontrar en un kit basado en COBRA™ típica) para análisis COBRA™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, d Mr , regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); enzima de restricción y tampón apropiado; oligonucleótido de hibridación génica; control de oligonucleótido de hibridación; kit de etiquetado de quinasa para sonda de oligonucleótidos; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de a Dn (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

[0157] Preferiblemente, ensayos como "MethyLight™” (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999), Ms-SNuPE™ (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension) (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 9821-9826, 1996; Patente de EE.UU. N° 5,786,146), y la amplificación de isla metílica CpG ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59: 2307-12, 1999) se usan solos o en combinación con uno o más de estos métodos.

[0158] La técnica de ensayo "HeavyMethyl™" es un método cuantitativo para evaluar diferencias de metilación basado en la amplificación específica para la mutilación de ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de mutilación ("bloqueadores") que cubren las posiciones de CpG entre, o cubiertas por, los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

[0159] El término ensayo de "HeavyMethyl™ MethyLight™” se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo de MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas a metilación que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también se puede usar en combinación con cebadores de amplificación específicos de metilación.

[0160] Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podría encontrar en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis HeavyMethyl™ puede incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG, etc.); oligonucleótidos de bloqueo; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.

[0161] La MSP (PCR específica a metilación) permite evaluar el estado de metilación de prácticamente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 93: 9821-9826, 1996; Patente de EE.UU. N° 5,786,146). Brevemente, el ADN es modificado por bisulfito de sodio, que convierte las citosinas no metiladas, pero no metiladas, en uracilo, y los productos se amplifican posteriormente con cebadores específicos para ADN metilado versus no metilado. MSP requiere solo pequeñas cantidades de ADN, es sensible a los alelos metilados al 0,1% de un locus de isla CpG dado, y puede realizarse en ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en MSP) para el análisis de MSP pueden incluir, entre otros: cebadores de PCR metilados y no metilados para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes), regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos, y sondas específicas.

[0162] El ensayo de MethyLight™ es un ensayo de metilación de alto rendimiento cuantitativo que utiliza PCR en tiempo real basado en la fluorescencia (por ejemplo, TaqMan®) que no requiere manipulaciones adicionales después del paso de PCR (Eads et al, Cancer Res.. 59: 2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción de bisulfito de sodio, en un conjunto mixto de diferencias de secuencia dependientes de la metilación de acuerdo con los procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo). La PCR basada en fluorescencia se realiza luego en una reacción "sesgada", por ejemplo, con cebadores de PCR que se superponen a los dinucleótidos CpG conocidos. La discriminación de secuencia ocurre tanto al nivel del proceso de amplificación como al nivel del proceso de detección de fluorescencia.

[0163] El ensayo MethyLight™ se usa como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en un ácido nucleico, por ejemplo, una muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia ocurre al nivel de hibridación de la sonda. En una versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un sitio de metilación putativo particular. Un control imparcial de la cantidad de ADN de entrada es proporcionado por una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica al sondear el conjunto de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (por ejemplo, una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren posibles sitios de metilación.

[0164] El proceso MethyLight™ se usa con cualquier sonda adecuada (por ejemplo, una sonda "TaqMan®", una sonda Lightcycler®, etc.) Por ejemplo, en algunas aplicaciones, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de los dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas TaqMan®, por ejemplo, con cebadores MSP y/o oligonucleótidos bloqueadores de HeavyMethyl y una sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene doble etiqueta con moléculas fluorescentes de "indicador" y "desactivador" y está diseñada para ser específica para una región de contenido de GC relativamente alta de modo que se derrita a una temperatura aproximadamente 10°C más alta en el ciclo de PCR que la delantera o cebadores inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el paso de recocido/extensión de p Cr . A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, eventualmente alcanzará la sonda TaqMan® recocida. La actividad de endonucleasa Taq polimerasa 5' a 3' desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no apagada utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

[0165] Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podría encontrar en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.

[0166] El ensayo QM™ (mutilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para los patrones de mutilación en muestras de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia se produce al nivel de hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación imparcial en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un sitio de metilación putativo particular. Un control imparcial de la cantidad de ADN de entrada es proporcionado por una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica sondeando el conjunto de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren los sitios de metilación potenciales.

[0167] El proceso QM™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo, sondas "TaqMan®", sondas Lightcycler®, en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y a la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene doble etiqueta con moléculas fluorescentes de "indicador" y "desactivador", y está diseñada para ser específica para una región de contenido de GC relativamente alta de modo que se derrita a una temperatura aproximadamente 10°C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores hacia adelante o hacia atrás. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el paso de recocido/extensión de PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, eventualmente alcanzará la sonda TaqMan® recocida. La actividad de endonucleasa Taq polimerasa 5' a 3' desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no apagada utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real. Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en QM™) para el análisis QM™ pueden incluir, entre otros: cebadores de p Cr para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.

[0168] La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basados en el tratamiento con bisulfito de ADN, seguido de extensión de cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997). Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo mientras se deja la 5-metilcitosina sin cambios. La amplificación de la secuencia diana deseada se realiza luego usando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se usa como plantilla para el análisis de metilación en el sitio de interés CpG. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (p. ej., secciones de patología microdiseccionadas) y se evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios CpG.

[0169] Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podría encontrar en un kit típico basado en Ms-SNuPE™) para análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE™ para loci específicos; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

[0170] La secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRB) comienza con el tratamiento de bisulfito de ácido nucleico para convertir todas las citosinas no metiladas en uracilo, seguido de digestión con enzimas de restricción (por ejemplo, por una enzima que reconoce un sitio que incluye una secuencia CG tales como MspI) y completa secuenciación de fragmentos después del acoplamiento a un ligando adaptador. La elección de la enzima de restricción enriquece los fragmentos de las regiones densas de CpG, reduciendo el número de secuencias redundantes que pueden mapearse en múltiples posiciones de genes durante el análisis. Como tal, RRBS reduce la complejidad de la muestra de ácido nucleico seleccionando un subconjunto (por ejemplo, mediante selección de tamaño usando electroforesis en gel preparativa) de fragmentos de restricción para la secuenciación. A diferencia de la secuenciación de bisulfito de genoma completo, cada fragmento producido por la digestión con enzimas de restricción contiene información de metilación del ADN para al menos un dinucleótido CpG. Como tal, RRBS enriquece la muestra para promotores, islas CpG y otras características genómicas con una alta frecuencia de sitios de corte de enzimas de restricción en estas regiones y, por lo tanto, proporciona un ensayo para evaluar el estado de metilación de uno o más loci genómicos.

[0171] Un protocolo típico para RRBS comprende los pasos de digerir una muestra de ácido nucleico con una enzima de restricción como MspI, rellenar voladizos y colas A, adaptadores de ligadura, conversión de bisulfito y PCR. Ver, por ejemplo, et al. (2005) Nat Methods 7: 133-6; Meissner y col. (2005) Nucleic Acids Res. 33: 5868-77.

[0172] En algunas realizaciones, se usa una diana en tiempo real específica a alelo cuantitativo y ensayo de amplificación de señal (QuARTS) para evaluar el estado de metilación. Se producen tres reacciones secuencialmente en cada ensayo QuARTS, incluida la amplificación (reacción 1) y la escisión de la sonda diana (reacción 2) en la reacción primaria; y escisión FRET y generación de señal fluorescente (reacción 3) en la reacción secundaria. Cuando el ácido nucleico diana se amplifica con cebadores específicos, una sonda de detección específica con una secuencia de colgajo se une libremente al amplicón. La presencia del oligonucleótido invasivo específico en el sitio de unión a la diana hace que la escisión libere la secuencia del colgajo cortando entre la sonda de detección y la secuencia del colgajo. La secuencia de la aleta es complementaria a una porción sin pinza de un casete FRET correspondiente. En consecuencia, la secuencia del colgajo funciona como un oligonucleótido invasivo en el casete FRET y produce una escisión entre el fluoróforo del casete FRET y un apagador, que produce una señal fluorescente. La reacción de escisión puede cortar múltiples sondas por diana y así liberar múltiples fluoróforos por colgajo, proporcionando una amplificación de señal exponencial. QuARTS puede detectar múltiples dianas en un solo pozo de reacción mediante el uso de casetes FRET con diferentes tintes. Ver, por ejemplo, en Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56: A199; Pat. N° 8,361,720 y la Patente de EE.UU. Sol. Ser. Nos 13/594,674, 12/946,745 y 12/946,752.

[0173] En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana se aísla de una muestra mediante, por ejemplo, una captura directa de genes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ácido nucleico diana se aísla de una muestra mediante, por ejemplo, la eliminación de agentes inhibidores del ensayo para producir una muestra clarificada (por ejemplo, con PVP, PVPP y/o el uso de un filtro giratorio), captura de un ácido nucleico diana (si está presente) de la muestra clarificada con un reactivo de captura para formar un complejo de captura, aislando el complejo de captura de la muestra clarificada, recuperando el ácido nucleico diana (si está presente) del complejo de captura en una solución de ácido nucleico, y, opcionalmente, repetir el aislamiento de diferentes dianas (véanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE.UU. Nos de Serie 14/145,082, 14/145,087, 14/145,070, 14/145,056, 13/470,251, 13/470,018, 13/469,999 y 13/469,989).

[0174] En algunas realizaciones, los fragmentos del ADN tratado se amplifican usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores (por ejemplo, véase la Tabla 2) y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN puede llevarse a cabo simultáneamente en uno y el mismo recipiente de reacción. Típicamente, la amplificación se lleva a cabo usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los amplicones son típicamente de 100 a 2000 pares de bases de longitud.

[0175] En otra realización del método, el estado de metilación de las posiciones de CpG dentro o cerca de un marcador que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) puede detectarse mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito en la Patente de EE.UU. N° 6,265,171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estado de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores MSP contienen al menos un cebador que se hibrida con un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores de MSP específicos para ADN no metilado contienen una "T" en la posición de la posición C en el CpG.

[0176] Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar un marcador detectable directa o indirectamente. En algunas realizaciones, los marcadores son marcadores fluorescentes, radionucleidos o fragmentos de moléculas desmontables que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas. Cuando dichas etiquetas son etiquetas de masa, algunas realizaciones proporcionan que los amplicones marcados tengan una sola carga neta positiva o negativa, lo que permite una mejor delectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse mediante, por ejemplo, espectrometría de masas por ionización/desorción asistida por matriz (MALDI) o utilizando espectrometría de masas por pulverización electrónica (ESI).

[0177] En algunas realizaciones, los métodos para aislar ADN comprenden el aislamiento de ácidos nucleicos como se describe en la Patente de EE.UU. Sol. Ser. N° 13/470,251 ("Isolation of Nucleic Acids").

Métodos

[0178] En algunas realizaciones de la tecnología, se describen métodos que comprenden los siguientes pasos:

1) poner en contacto un ácido nucleico (p. ej., ADN genómico, p. ej., aislado de fluidos corporales como una muestra de heces o tejido colorrectal) obtenido del sujeto con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador DMR (por ejemplo, un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6) y

2) detectar una neoplasia colorrectal o trastorno proliferativo (por ejemplo, cáncer colorrectal, adenoma grande, SSP) (por ejemplo, con una sensibilidad mayor o igual al 80% y una especificidad mayor o igual al 80%).

[0179] En algunas realizaciones, se describen métodos que comprenden los siguientes pasos:

1) poner en contacto un ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico, por ejemplo, aislado de fluidos corporales, como una muestra de heces o tejido colorrectal) obtenido del sujeto con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador seleccionado de una región cromosómica que tiene una anotación seleccionada del grupo que consiste en BMP3, NDRG4, FLI1, OPLAH, DTX1, MATK, SFMBT2 región 2, KCNK12, VAV3 región 1, SFMBT2 región 3, PPP2R5C, CHST2 región 2, PKIA, PDGFD, ELOVL2, CHST2 región 1, SFMBT2 región 1, QKI, VAV3 región 2 y SLC8A3, y

2) detectar el cáncer colorrectal (por ejemplo, con una sensibilidad mayor o igual al 80% y una especificidad mayor o igual al 80%).

[0180] Preferiblemente, la sensibilidad es de aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. En algunas realizaciones, la especificidad es de aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. En algunas realizaciones, la especificidad es de aproximadamente 90% a 100%, 91% a 99%, 93% a 97%, 94% a 96%, 95% a 99%, 96% a 99,5%, 97% a 99,9%, etc.)

[0181] El ADN genómico se puede aislar por cualquier medio, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. Brevemente, en donde el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular, la muestra biológica debe ser interrumpida y lisada por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN se puede eliminar de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera de la solución. Esto puede llevarse a cabo mediante una variedad de métodos que incluyen la salazón, la extracción orgánica o la unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores, incluidos el tiempo, los gastos y la cantidad requerida de ADN. Todos los tipos de muestra que comprenden materia neoplásica o materia preneoplásica son adecuados para usar en el presente método, por ejemplo, líneas celulares, portaobjetos histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, heces, efluentes del colon, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo., sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de las mismas.

[0182] La tecnología no está limitada en los métodos utilizados para preparar las muestras y proporcionar un ácido nucleico para la prueba. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se aísla un ADN de una muestra de heces o de sangre o de una muestra de plasma usando captura directa de genes, por ejemplo, como se detalla en las Solicitudes de Patente de EE.UU. Nos de Serie 14/145,082, 14/145,087, 14/145,070, 14/145,056, 13/470,251, 13/470,018, 13/469,999 y 13/469,989.

[0183] La muestra de ADN genómico se trata luego con al menos un reactivo, o una serie de reactivos, que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador que comprende una DMR (por ejemplo, una DMR como se proporciona en las Tablas 1-6).

[0184] En algunas realizaciones, el reactivo convierte bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' en uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. Sin embargo, en algunas realizaciones, el reactivo puede ser una enzima de restricción sensible a la metilación.

[0185] En algunas realizaciones, la muestra de ADN genómico se trata de tal manera que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. En algunas realizaciones, este tratamiento se lleva a cabo con bisulfato (sulfito de hidrógeno, disulfito) seguido de hidrólisis alcalina.

[0186] A continuación se analiza el ácido nucleico tratado para determinar el estado de metilación de las secuencias de genes diana (por lo menos un gen, secuencia genómica o nucleótido de un marcador que comprende un DMR, por ejemplo, al menos un DMR como proporcionado en las Tablas 1- 6). En algunas realizaciones, el método de análisis es QuARTS y/o MSP como se describe aquí.

[0187] Metilación aberrante, más específicamente la hipermetilación de un marcador que comprende un DMR (por ejemplo, un DMR como proporcionado en las Tablas 1-6) está asociada con un cáncer colorrectal.

[0188] La tecnología se relaciona con el análisis de cualquier muestra asociada con un cáncer colorrectal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra comprende un tejido y/o fluido biológico obtenido de un paciente. En algunas realizaciones, la muestra comprende una secreción. En algunas realizaciones, la muestra comprende sangre, suero, plasma, secreciones gástricas, tejido colorrectal, tejido tumoral colorrectal, una muestra de biopsia colorrectal, jugo pancreático, una muestra de biopsia gastrointestinal, células microdiseccionadas de una biopsia gastrointestinal, células gastrointestinales caídas en la luz gastrointestinal, y/o células gastrointestinales recuperadas de las heces. En algunas realizaciones, el sujeto es humano. Estas muestras pueden originarse en el tracto gastrointestinal superior, el tracto gastrointestinal inferior, o comprender células, tejidos y/o secreciones tanto del tracto gastrointestinal superior como del tracto gastrointestinal inferior. La muestra puede incluir células, secreciones o tejidos del hígado, conductos biliares, páncreas, estómago, colon, recto, esófago, intestino delgado, apéndice, duodeno, pólipos, vesícula biliar, ano y/o peritoneo. En algunas realizaciones, la muestra comprende líquido celular, ascitis, orina, heces, líquido pancreático, líquido obtenido durante la endoscopia, sangre, moco o saliva. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de heces.

[0189] Dichas muestras se pueden obtener por cualquier variedad de técnicas. Por ejemplo, las muestras de orina y heces son fácilmente obtenibles, mientras que las muestras de sangre, ascitis, suero, líquido colorrectal o pancreático se pueden obtener por vía parenteral utilizando una aguja y una jeringa, por ejemplo. Se pueden obtener muestras sin células o sustancialmente sin células sometiendo la muestra a varias técnicas que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación y filtración. Aunque generalmente se prefiere que no se usen técnicas invasivas para obtener la muestra, aún puede ser preferible obtener muestras tales como homogeneizados de tejidos, secciones de tejidos y muestras de biopsia.

[0190] La tecnología se puede utilizar para tratar a un paciente (por ejemplo, un paciente con cáncer colorrectal, con cáncer colorrectal en etapa temprana, o que puede desarrollar cáncer colorrectal), comprendiendo el método determinar el estado de metilación de una o más DMR como se proporciona en este documento y administrar un tratamiento al paciente basado en los resultados de determinar el estado de metilación. El tratamiento puede realizar una colonoscopia, administrar un compuesto farmacéutico, una vacuna, realizar una cirugía, tomar imágenes del paciente, realizar otra prueba. Preferiblemente, dicho uso es en un método de detección clínica, un método de evaluación del pronóstico, un método para monitorear los resultados de la terapia, un método para identificar a los pacientes con más probabilidades de responder a un tratamiento terapéutico particular, un método para obtener imágenes de un paciente o sujeto, y un método para la detección y desarrollo de drogas.

[0191] En algunas realizaciones, el pronóstico clínico del cáncer incluye determinar la agresividad del cáncer y la probabilidad de recurrencia tumoral para planificar la terapia más eficaz. Si se puede hacer un pronóstico más preciso o incluso se puede evaluar un riesgo potencial de desarrollar cáncer, se puede elegir una terapia adecuada y, en algunos casos, una terapia menos severa para el paciente. La evaluación (por ejemplo, determinar el estado de metilación) de los biomarcadores de cáncer es útil para separar a los sujetos con buen pronóstico y/o bajo riesgo de desarrollar cáncer que no necesitarán terapia o terapia limitada de aquellos con más probabilidades de desarrollar cáncer o sufrir una recurrencia de cáncer que podría beneficiarse de tratamientos o monitoreo más intensivos.

[0192] En algunas realizaciones de la materia actualmente descrita, se realizan múltiples determinaciones de los biomarcadores a lo largo del tiempo para facilitar el diagnóstico y/o pronóstico. Se utiliza un cambio temporal en el biomarcador para predecir un resultado clínico, controlar la progresión del cáncer gastrointestinal y/o controlar la eficacia de las terapias apropiadas dirigidas contra el cáncer. En tal realización, por ejemplo, se podría esperar ver un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores (p. ej., DMR) divulgados aquí (y potencialmente uno o más biomarcadores adicionales, si se monitorean) en una muestra biológica durante tiempo durante el curso de una terapia efectiva.

[0193] Los métodos y composiciones de la presente descripción pueden emplearse para el tratamiento o diagnóstico de la enfermedad en una etapa temprana, por ejemplo, antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad.

[0194] En algunas realizaciones, un análisis estadístico asocia un indicador pronóstico con una predisposición a un resultado adverso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un estado de metilación diferente del de una muestra de control normal obtenida de un paciente que no tiene cáncer puede indicar que un sujeto tiene más probabilidades de sufrir un cáncer que los sujetos con un nivel que es más similar al estado de metilación en la muestra de control, según lo determinado por un nivel de significación estadística. Además, un cambio en el estado de metilación desde un nivel basal (p. ej., "normal") puede reflejar el pronóstico del sujeto, y el grado de cambio en el estado de metilación puede estar relacionado con la gravedad de los eventos adversos. La significación estadística a menudo se determina comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor p. Véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza ejemplares del presente tema son 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9 % y 99,99%, mientras que los valores p ejemplares son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

[0195] En otras realizaciones, se puede establecer un grado umbral de cambio en el estado de metilación de un biomarcador de pronóstico o diagnóstico descrito en este documento (por ejemplo, una DMR), y el grado de cambio en el estado de metilación del marcador biológico en una muestra biológica simplemente se compara con el grado umbral de cambio en el estado de metilación. Un cambio de umbral preferido en el estado de metilación para los biomarcadores proporcionados aquí es aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, aproximadamente 100% y aproximadamente 150%. En otras realizaciones más, se puede establecer un "nomograma", mediante el cual el estado de metilación de un indicador de pronóstico o diagnóstico (biomarcador o combinación de biomarcadores) está directamente relacionado con una disposición asociada hacia un resultado dado. El experto en la técnica está familiarizado con el uso de tales nomogramas para relacionar dos valores numéricos con el entendimiento de que la incertidumbre en esta medición es la misma que la incertidumbre en la concentración del marcador porque se hace referencia a mediciones de muestras individuales, no a promedios de población.

[0196] En algunas realizaciones, una muestra de control se analiza simultáneamente con la muestra biológica, de modo que los resultados obtenidos de la muestra biológica se pueden comparar con los resultados obtenidos de la muestra de control. Además, se contempla que se pueden proporcionar curvas estándar, con las cuales se pueden comparar los resultados del ensayo para la muestra biológica. Dichas curvas estándar presentan estados de mutilación de un biomarcador en función de las unidades de ensayo, por ejemplo, intensidad de señal fluorescente, si se usa un marcador fluorescente. Usando muestras tomadas de múltiples donantes, se pueden proporcionar curvas estándar para controlar los estados de metilación de uno o más biomarcadores en el tejido normal, así como para los niveles "en riesgo" de uno o más biomarcadores en el tejido tomado de donantes con metaplasia o de donantes con cáncer gastrointestinal. En ciertas realizaciones del método, se identifica a un sujeto que tiene metaplasia al identificar un estado de metilación aberrante de uno o más DMR proporcionados aquí en una muestra biológica obtenida del sujeto. En otras realizaciones del método, la detección de un estado de metilación aberrante de uno o más de tales biomarcadores en una muestra biológica obtenida del sujeto da como resultado que el sujeto sea identificado como que tiene cáncer.

[0197] El análisis de marcadores puede llevarse a cabo por separado o simultáneamente con marcadores adicionales dentro de una muestra de ensayo. Por ejemplo, se pueden combinar varios marcadores en una sola prueba para el procesamiento eficiente de un múltiplo de muestras y para proporcionar potencialmente una mayor precisión diagnóstica y/o pronóstica. Además, un experto en la materia reconocería el valor de probar múltiples muestras (por ejemplo, en puntos de tiempo sucesivos) del mismo sujeto. Dichas pruebas de muestras en serie pueden permitir la identificación de cambios en los estados de metilación del marcador con el tiempo. Los cambios en el estado de metilación, así como la ausencia de cambios en el estado de metilación, pueden proporcionar información útil sobre el estado de la enfermedad que incluye, entre otros, la identificación del tiempo aproximado desde el inicio del evento, la presencia y la cantidad de tejido recuperable, la idoneidad de las terapias farmacológicas, la efectividad de varias terapias y la identificación del resultado del sujeto, incluido el riesgo de eventos futuros.

[0198] El análisis de biomarcadores puede llevarse a cabo en una variedad de formatos físicos. Por ejemplo, el uso de placas de microtitulación o automatización puede usarse para facilitar el procesamiento de grandes cantidades de muestras de prueba. Alternativamente, se pueden utilizar formatos de muestra única para facilitar el tratamiento inmediato y el diagnóstico de manera oportuna, por ejemplo, en transporte ambulatorio o en salas de emergencias.

[0199] En algunas realizaciones, al sujeto se le diagnostica un cáncer colorrectal si, en comparación con un estado de metilación de control, hay una diferencia apreciable en el estado de metilación de al menos un biomarcador en la muestra. Por el contrario, cuando no se identifica ningún cambio en el estado de metilación en la muestra biológica, se puede identificar al sujeto como no con cáncer colorrectal, sin riesgo de cáncer o con bajo riesgo de cáncer. A este respecto, los sujetos que tienen el cáncer o el riesgo del mismo pueden diferenciarse de los sujetos que tienen un cáncer o un riesgo bajo o sustancialmente nulo. Aquellos sujetos que corren el riesgo de desarrollar un cáncer colorrectal pueden someterse a un programa de detección más intensivo y/o regular, incluida la vigilancia endoscópica. Por otro lado, aquellos sujetos que tienen un riesgo bajo o prácticamente nulo pueden evitar ser sometidos a una endoscopia, hasta que un examen de detección futuro, por ejemplo, un examen de detección realizado de acuerdo con la tecnología actual, indique que apareció en esos sujetos un riesgo de cáncer colorrectal.

[0200] Como se mencionó anteriormente, dependiendo de la realización del método de la presente tecnología, detectar un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores puede ser una determinación cualitativa o puede ser una determinación cuantitativa. Como tal, el paso de diagnosticar que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer gastrointestinal indica que se realizan ciertas mediciones de umbral, por ejemplo, el estado de metilación de uno o más biomarcadores en la muestra biológica varía de un estado de metilación de control predeterminado. En algunas realizaciones del método, el estado de metilación de control es cualquier estado de metilación detectable del biomarcador. En otras realizaciones del método donde una muestra de control se prueba simultáneamente con la muestra biológica, el estado de metilación predeterminado es el estado de metilación en la muestra de control. En otras realizaciones del método, el estado de metilación predeterminado se basa y/o identifica mediante una curva estándar. En otras realizaciones del método, el estado de metilación predeterminado es un estado o rango de estado específico. Como tal, el estado de metilación predeterminado puede elegirse, dentro de límites aceptables que serán evidentes para los expertos en la técnica, en base en parte a la forma de realización del método siendo practicado y la especificidad deseada, etc.

[0201] La materia actualmente divulgada incluye además un sistema para diagnosticar un cáncer gastrointestinal en un sujeto. El sistema puede proporcionarse, por ejemplo, como un kit comercial que puede usarse para detectar un riesgo de cáncer gastrointestinal o diagnosticar un cáncer gastrointestinal en un sujeto del que se ha recogido una muestra biológica. Un sistema ejemplar proporcionado de acuerdo con la presente tecnología incluye evaluar el estado de metilación de un DMR como se proporciona en las Tablas 1-6.

EJEMPLOS

Ejemplo 1.

[0202] Este ejemplo describe estudios de tejido de control de casos independientes que identificaron marcadores de metilación altamente discriminantes para la neoplasia colorrectal. Los ejemplos utilizaron RRBS para la fase de descubrimiento y la PCR específica de metilación (MSP) y la diana en tiempo real específica a alelos cuantitativos y la amplificación de señal (QuART) para la fase de validación.

[0203] Se identificaron muestras de tejido de registros de cáncer existentes. La población accesible incluía a aquellos que se sometieron a colectomía abierta o laparoscópica, o biopsia de colon con una muestra archivada. Todos los tejidos fueron revisados por un patólogo gastrointestinal experto para confirmar la clasificación correcta. Los tejidos de casos de neoplasia colorrectal incluyeron cánceres colorrectales en estadios I-IV (congelados frescos), adenomas avanzados >1 cm de tamaño (congelados frescos) y pólipos de sésiles serrados del lado derecho (FFPE). Hubo dos grupos de control estudiados. El primer grupo de control incluyó 18 tejidos epiteliales de colon de pacientes confirmados como libres de neoplasia de colon. El segundo grupo incluyó 18 muestras de pelaje normal de pacientes sin cáncer. Los casos y ambos controles se combinaron por sexo y edad. Además, el CRC y las cohortes de adenoma avanzado se distribuyeron uniformemente entre las lesiones del lado derecho e izquierdo. En un laboratorio central, se microdiseccionaron tejidos de casos y controles y se extrajo el ADN usando una técnica de fenol-cloroformo, produciendo al menos 500 ng de ADN. La identificación de casos, el emparejamiento y la extracción de ADN fueron realizados por personal independiente para mantener el cegamiento del personal de laboratorio al estado del caso y el control.

[0204] El ADN genómico (300 ng) se fragmentó mediante digestión con 10 unidades de MspI, una enzima de restricción específica para la metilación que reconoce motivos que contienen CpG. Esto enriquece las muestras para el contenido de CpG y elimina áreas redundantes del genoma. Los fragmentos digeridos se repararon por el extremo y se colocaron en cola A con 5 unidades de fragmento Klenow (3'-5 'exo-), y se ligaron durante la noche a adaptadores TruSeq metilados (Illumina, San Diego CA) que contienen una de cuatro secuencias de códigos de barras (para unir cada uno fragmento a su ID de muestra). La selección del tamaño de los fragmentos de 160-340 pb (insertos de 40­ 220 pb) se realizó usando cuentas/tampón Agencourt AMPure XP SPRI (Beckman Coulter, Brea CA). Los límites de tampón fueron de 0,7X a 1,1X volúmenes de muestra de cuentas/tampón. El volumen de elución final fue de 22 pL (tampón EB - Qiagen, Germantown MD). Se usó qPCR para medir la eficiencia de la ligadura y la calidad del fragmento en una pequeña alícuota de muestra. Luego, las muestras se sometieron a conversión de bisulfito (dos veces) utilizando un protocolo EpiTect modificado (Qiagen). qPCR y PCR convencional (PfuTurbo Cx hotstart - Agilent, Santa Clara CA) seguido de la evaluación Bioanalyzer 2100 (Agilent) en alícuotas de muestra convertidas determinaron el número de ciclo de PCR óptimo antes de la amplificación de la biblioteca final. Condiciones para la PCR final: 50uL rxn: 5uL de 10X tampón, 1,25uL de 10mM cada dNTP's, 5uL primer cocktail (~5uM), 15uL plantilla (muestra), 1uL PfuTurbo Cx hotstart, 22,75 agua. 95C-5min; 98C-30seg; 16 ciclos de 98C-10seg, 65C-30seg, 72C-30seg; 72C-5min; 4C. Las muestras se combinaron (equimolar) en bibliotecas de 4 plex con base en el esquema de aleatorización y se probaron con el bioanalizador para la verificación del tamaño final, y con qPCR usando estándares phiX y cebadores específicos del adaptador.

[0205] Las muestras se cargaron en carriles de célula de flujo de acuerdo con una asignación aleatoria de carriles con carriles adicionales reservados para controles de ensayo internos. La secuenciación fue realizada por el núcleo de secuenciación de próxima generación en el Centro de Genoma Médico de la Clínica Mayo en Illumina HiSeq 2000. Las lecturas fueron unidireccionales durante 101 ciclos. Cada carril de célula de flujo generó 100-120 millones de lecturas, suficiente para una cobertura media de 30-50 veces la profundidad de secuencia (número de lectura por CpG) para secuencias alineadas. Se usó el software estándar de canalización Illumina para llamadas de base y generación de lectura de secuencia en formato fastq. Como anteriormente (véase, por ejemplo, Sun, et al., 2012 Bioinformatics 28 (16): 2180-1), se utilizó SAAP-RRBS, una tubería de análisis y anotación simplificada para la secuenciación de bisulfito de representación reducida, para la alineación de secuencias y la extracción de metilación.

[0206] Se realizaron dos estudios de validación basados en MSP en conjuntos de muestras expandidas para confirmar la precisión y la reproducibilidad de los candidatos observados diferencialmente metilados. El primero, un estudio de validación interna (MSP, por sus siglas en inglés), se realizó en muestras emparejadas y ciegas utilizando réplicas biológicas y técnicas de neoplasia colorrectal, colon normal y leucocitos normales. Este paso se realizó para garantizar que los sitios de metilación diferencial identificados por la filtración de datos RRBS, donde el % de metilación era la unidad de análisis, se reflejarían en MSP, donde la unidad de análisis es el número absoluto de copias genómicas de la secuencia diana corregido por la concentración de ADN de entrada para cada muestra. El segundo experimento de validación externa utilizó la tecnología QuART para evaluar a los principales candidatos en neoplasia colorrectal independiente, asignada al azar, cegada e independiente y muestras de colon normales.

[0207] Los cebadores para cada marcador se diseñaron para apuntar a las secuencias metiladas modificadas con bisulfito de cada gen diana (IDT, Coralville IA) y una región sin sitios de citosina-fosfato-guanina en el gen de ¡5-actina, como referencia del tratamiento con bisulfito. y entrada de ADN. El diseño se realizó mediante el software Methprimer (Universidad de California, San Francisco, CA) o mediante métodos semi-manuales. Los ensayos se probaron y optimizaron ejecutando qPCR con tintes SYBR Green (Life Technologies, Grand Island NY) en diluciones de controles de ADN genómico universalmente metilados y no metilados.

[0208] Las reacciones de MSP se realizaron en ADN extraído de tejido como se describió previamente (véase, por ejemplo, Kisiel, et al., 2012 Cancer 118 (10): 2623-2631). Brevemente, el ADN se trató con bisulfito usando el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, Orange, CA) y se eluyó en tampón. Se usó 1 ml de ADN tratado con bisulfito como plantilla para la cuantificación de la metilación con una PCR en tiempo real basada en fluorescencia, realizada con la mezcla maestra SYBR Green (Roche, Mannheim, Alemania). Las reacciones se realizaron en Roche 480 LightCyclers (Indianápolis, IN), donde se usó ADN metilado universal CpGenome tratado con bisulfito (Millipore, Billerica, MA) como control positivo, y diluido en serie para crear curvas estándar para todas las placas. Las secuencias de oligonucleótidos y las temperaturas de recocido están disponibles a pedido.

[0209] La comparación primaria de interés era la diferencia de metilación entre casos y controles de colon en cada CpG asignada. Las islas CpG se definen bioquímicamente por una relación CpG observada a esperada superior a 0,6 (31). Sin embargo, para este modelo, se crearon unidades de análisis de CpG "región metilada diferencialmente (DMR)" en función de la distancia entre las ubicaciones del sitio CpG para cada cromosoma. Como la distancia entre cualquier CpG dada excedió la ubicación anterior o siguiente en más de 100 bps, se creó un nuevo identificador de isla. Se excluyeron las islas con un solo CpG. El resultado secundario fue la misma comparación entre casos y controles de leucocitos. Los sitios de CpG individuales se consideraron para el análisis diferencial solo si la profundidad total de cobertura por grupo de enfermedad fue > 200 lecturas (lo que equivale aproximadamente a un promedio de 10 lecturas por sujeto) y la varianza del % de metilación fue mayor que cero (sitios de CpG no informativos con 0 varianza fueron excluidos). Los criterios para la profundidad de lectura se basaron en el poder estadístico deseado para detectar una diferencia del 10% en la tasa de metilación entre dos grupos en los cuales el tamaño de la muestra de los individuos para cada grupo era 18.

[0210] La significación estadística se determinó por regresión logística en el % de metilación por DMR (usando los recuentos reales) con los grupos definidos como neoplasia colorrectal, colon normal y leucocitos normales. Para tener en cuenta las diferentes profundidades de lectura entre sujetos individuales, se utilizó un modelo de regresión logística sobredispersado, donde el parámetro de dispersión se estimó utilizando la estadística Chi-cuadrado de Pearson de los residuos del modelo ajustado. Para evaluar la metilación específica del filamento, las regiones directa e inversa se analizaron por separado. Los DMR se clasificaron de acuerdo con su nivel de significación y se consideraron como una región marcadora viable si la tasa de metilación en los controles era <2,5% pero >10% en los casos. Cada DMR significativa se consideró como un marcador candidato.

[0211] Para el estudio de validación interna, el resultado primario fue el área bajo la curva de características operativas del receptor (AUC) para cada marcador. Esto se calculó utilizando la regresión logística (JMP versión 9.0.1, SAS Institute, Cary NC) para modelar la fuerza del número de copias medianas corregidas de cada marcador con neoplasia colorrectal en comparación con el colon normal y los leucocitos normales. Los marcadores con los valores más altos de AUC y la relación más amplia de número de copias de marcadores medianos entre casos y controles fueron seleccionados para el estudio de validación externa. El resultado primario para el experimento de validación externa fue el AUC para cada marcador trazado frente a la intensidad de la señal de cada marcador, medido por el registro de la relación de % de metilación mediano corregido en los casos en comparación con los controles. Con dieciocho casos, hay >80% de potencia para detectar un área bajo la curva de 0,85 o superior a partir de la hipótesis nula de 0,5 a un nivel de significancia de dos lados 0,05.

[0212] Descubrimiento del marcador RRBS Extractos de ADN coincidentes, cegados, asignados aleatoriamente de 18 cánceres colorrectales, 18 adenomas avanzados (>1 cm), 18 pólipos de sésiles serrados, 18 tejidos epiteliales de colon normales y 18 controles leucocitarios derivados de la capa leucocitaria normal fueron secuenciados por RRBS. La mediana de edad fue de 65 años (rango intercuartil 60-70), y el 51% eran mujeres. Se generaron 4-5 millones de CpG por muestra a partir de los datos de secuenciación. Después de seleccionar solo los sitios CpG donde se cumplieron los criterios de cobertura y varianza del grupo, se consideró un rango aproximado de 2-3 millones de sitios CpG para su posterior análisis. Las muestras de SSA, que se derivaron de bloques de tejido FFPE, tenían un número menor de CpG (200.000 - 1,2 millones) debido a la menor calidad inherente). Las DMR 1068 (CRC), 1200 (adenoma avanzado) y 268 (SSA) cumplieron los criterios de significación para la metilación diferencial. Estos se agruparon en 185, 244 y 109 regiones candidatas con suficientes firmas de metilación para el diseño del cebador MSP. La longitud de los DMR oscilaba entre 30 y más de 1000 bases. Las firmas de metilación contenían 6 a 69 CpG contiguas. El 84% de los DMR anotan en las regiones reguladoras 5' (promotoras) de genes, la mayoría de las cuales se asocian con islas CpG más grandes. En el caso de las DMR de CCR, aproximadamente el 15% tiene asociaciones previas con neoplasia colorrectal. 50% han sido reportados en otros tipos de cáncer. Del 25% restante, aproximadamente la mitad se segrega en vías relevantes para el cáncer (factores de transcripción, señalización, reguladores del ciclo celular, transportadores de membrana, etc.) Varios sitios anotados contienen múltiples DMR.

[0213] Validación interna Basándose en el número de CpG vecinas en cada firma de metilación del gen candidato, se diseñaron cebadores para los 50 candidatos principales de los 185 marcadores CRC. La clasificación se realizó por referencia a las métricas de regresión logística y la relación de número de copias caso/control. 35 de estas pasaron el control de calidad interno y 15 fueron rechazadas. Luego se usó MSP para analizar los 35 candidatos en muestras de ADN de cohortes parcialmente independientes, emparejadas, cegadas, que incluyen 36 lesiones de CCR, 36 adenomas avanzados y 36 muestras de epitelio colónico normal. Además, 31 muestras de ADN extraídas de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (18 con CRC, 2 con alto grado de displasia, y 13 controles normales.) ¡3-actina amplificado en todas las muestras. De los 35 ensayos de MSP, 18 marcadores candidatos tenían un AUC >0,88, relaciones de número de copias caso/control >50 y metilación de fondo <1% (ver Tabla 1A y 1B). Estos fueron seleccionados para su inclusión en una validación externa independiente.

Tabla 1A: Marcadores más discriminatorios en tejidos independientes por MSP, incluidas las coordenadas genómicas de DMR

[0214] También se realizaron análisis logísticos en las muestras de casos/controles de EII. De los 35 marcadores probados, se seleccionaron 3 marcadores (PDGFD, CHST27889, SFMBT2896) para compararlos con los marcadores de metilación ColoGuard (Exact Sciences) BMP3 y NDRG4 existentes en una validación externa basada en heces.

[0215] Validación externa El ADN emparejado, cegado, asignado aleatoriamente de 40 CRC, 24 adenomas avanzados y 40 muestras epiteliales de colon normales se analizaron mediante QuART para 18 candidatos principales. La mediana de edad de este subconjunto fue de 60 (rango intercuartil 52-67). El equilibrio de género fue de 50:50. Lo mismo para porcentajes de lesión distal:proximal en los casos. p-actina amplificada en todas las muestras. Los 18 marcadores demostraron un rendimiento en línea con los resultados de la validación interna. En el análisis CRC, 9 marcadores exhibieron un rendimiento superior en términos de características AUC y relaciones de metilación entre casos y controles. Como se muestra en la tabla a continuación (Tabla 1C), estos 9 mostraron una excelente asociación con el cáncer colorrectal.

Tabla 1C: Marcadores más discriminatorios que muestran asociación con CCR

[0216] Para el estudio de validación de heces de EII, se eligieron tres marcadores -(PDGFD, CHST27889, SFMBT2 896), y se corrieron en comparación con BMP3 y NDRG4.

[0217] Se descubrieron marcadores de ADN metilados y se pusieron a prueba para medir la detección de CRN asociado a IBD (IBDCRN: displasia de bajo grado [LGD], displasia de alto grado [h Gd ] y cáncer colorrectal [CRC]).

[0218] Los marcadores se identificaron y probaron en 3 pasos discretos: descubrimiento; validación biológica; y pilotaje clínico. Primero, un experimento de descubrimiento identificó marcadores por secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) en el ADN extraído de muestras de tejido congeladas archivadas de CRC esporádico y adenomas. En segundo lugar, los marcadores candidatos se validaron mediante un ensayo de PCR específico de metilación (MSP) en ADN extraído de tejidos de archivo de pacientes con EII-CRC y controles de EII sin CRN. En tercer lugar, las heces de archivo de casos independientes de IBD-CRN y controles de IBD se analizaron mediante una diana cuantitativa específica de alelos en tiempo real y amplificación de señal (QuARTS). Se excluyeron los pacientes sin biopsias de vigilancia o con trasplante previo de órganos sólidos. La regresión logística midió la sensibilidad y la especificidad. La influencia de la variable clínica se probó mediante la suma de rangos de Chicuadrado y Wilcoxon para datos categóricos y continuos, respectivamente.

[0219] 18 CRC esporádicos, 18 adenomas avanzados y 18 muestras de colon normales fueron secuenciadas por RRBS; los mejores 20 candidatos fueron probados por MSP en muestras independientes, incluyendo 18 IBD-CRC y 13 controles IBD. Se seleccionaron tres marcadores (PDGFD, CHST2, SFMBT2) para compararlos con BMP3 y NDRG4; todos fueron analizados por QuARTS en muestras de heces de 33 casos de IBD-c Rn (8 CRC, 8 HGD, 8 LGD > 1cm, 10 LGD <1cm) y 50 controles de IBD. Se excluyeron cuatro controles por insuficiencia de p-actina. La mediana de la duración de la enfermedad de la EII fue de 23 años (rango intercuartil [RIQ] 9-35) en los casos y 13 (8­ 20) años en controles (p = 0,0009). No se observaron otras diferencias significativas al comparar la edad, el sexo, la gravedad de la inflamación, la extensión de la EII o la colangitis esclerosante primaria comórbida. Los niveles de PDGFD, CHST2, SFMBT2 fueron moderadamente influenciados por la duración de la enfermedad (p = 0,04, 0,02, 0,04), pero BMP3 y NDRG4 no. Otras variables no fueron significativas. Se informan tasas de detección al 90% de especificidad (Tabla 2A, 2B y 2C).

[0220] Para muestras de CRC (n = 1) y HGD (n = 2) que fueron negativas, se revisaron los bloques H&E. Una muestra de DAG fue reclasificada como cambio reactivo. El a Dn se extrajo de los tejidos restantes de HGD y CRC y se analizó mediante QuARTS para cada marcador anterior. Estos fueron muy positivos.

[0221] Ensayos de QuARTS se repitieron en las correspondientes muestras de heces con un cambio mínimo en % de metilación; sin embargo, los números de copias sin procesar aumentaron para cada marcador, de modo que BMP3, NDRG4, PDGFG, CHST27889 pudieron detectar 8/8 CRC y 6/7 HGD (14/15 CRC HGD, sensibilidad del 93%) en un rango de especificidad de 89-93%.

Tabla 2A: Detección de neoplasias colorrectales asociadas a EII por ADN de heces metiladas con una especificidad del 90%

Tabla 2B: Detección de neoplasias colorrectales asociadas a EII por ADN de heces metiladas con una especificidad del 90%, incluidas las coordenadas genómicas de DMR

Ejemplo 2.

[0222] Este ejemplo describe la identificación de marcadores de ADN metilados para la detección de cáncer colorrectal y precáncer.

[0223] Aquí se divulga un conjunto de 185 marcadores de metilación del ADN para el cáncer colorrectal (Tablas 3A y 3B), 244 para adenomas grandes (> 1 cm) (Tablas 4A y 4B), y 111 para pólipos de sésiles serrados (SSP) (Tablas 5A y 5B): todos identificados a partir de los datos generados por el enriquecimiento de la isla CpG junto con la secuenciación masivamente paralela de un conjunto de muestras de tejido de control de casos. Los adenomas y los SSP son las lesiones precancerosas críticas para el CRC, y su detección en una aplicación de detección es importante. Los controles incluyeron epitelios colónicos normales y ADN derivado de glóbulos blancos normales. La técnica utilizó la secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS). Los análisis terciarios y cuaternarios son únicos e integrales al proceso de selección de marcadores. El paso terciario consiste en analizar los datos en términos de límites de cobertura, excluyendo todos los sitios no informativos, contrastando el % de metilación entre subgrupos de diagnóstico mediante regresión logística, creando "islas" CpG in silico basadas en agrupaciones definidas de sitios de metilación contiguos, y análisis de características operativas receptoras. El paso cuaternario filtra los datos de % de metilación (tanto CpG individuales como los grupos in silico) para seleccionar marcadores que maximicen las relaciones señal/ruido, minimicen la metilación de fondo, expliquen la heterogeneidad del tumor y enfaticen el rendimiento de ROC. Además, este enfoque analítico asegura la identificación de CpG de punto de acceso en una longitud de ADN definida para un desarrollo fácil y un diseño óptimo de ensayos de marcadores posteriores: PCR específica de metilación, secuenciación profunda de fragmentos pequeños, etc.

[0224] Las muestras de CRC, adenoma y control produjeron aproximadamente 2-3 millones de CpG de alta calidad, que después del análisis y el filtrado dieron como resultado aproximadamente 1068 (CRC) y 1200 (adenoma) sitios altamente discriminados. Estos se agruparon en 185 regiones localizadas de metilación diferencial para CRC y 244 para adenoma, algunas extendiéndose para 30-40 bases y otras más de una kilobase. De una revisión superficial de la literatura, menos del 15% de las DMR parecen tener una asociación previa de cáncer colorrectal. Sin embargo, casi el 50% tiene alguna asociación previa con el cáncer, pero no tiene un carácter específicamente epigenético. El resto tiene asociaciones de cáncer muy débiles o nulas, aunque muchas están involucradas en vías funcionales que pueden ser relevantes para la tumorigénesis. 30 DMR (CRC) y 42 (adenoma) no tenían anotaciones ni referencias en ninguna parte de la literatura. Estos fueron nombrados MAX seguido de ubicación cromosómica y coordenadas. Todos los DMR tenían AUC de 0,85 o más (algunos demostraron una discriminación perfecta de los casos de los controles con un AUC de 1,0). Además de alcanzar el umbral de AUC de 0,85, los marcadores de cáncer de colon y adenoma que se identificaron tuvieron que exhibir una densidad de metilación >50 veces mayor en el tumor que en la mucosa gástrica o colónica normal y <1,0 % de metilación en la mucosa colónica normal. Con base en la experiencia previa con el descubrimiento y validación de marcadores de cáncer de páncreas, estas características de marcadores en el tejido predicen una alta discriminación en medios distantes como las heces o la sangre.

[0225] Las muestras de SSP se derivaron de bloques FFPE y fueron de menor calidad. Para estos, solo la mitad tuvo un número adecuado de lecturas (>100.000). Como tal, las limitaciones de filtrado se redujeron ligeramente en comparación con las utilizadas con las muestras congeladas. Después de la clasificación, hubo 268 sitios discriminados que se agruparon en 111 regiones localizadas.

[0226] Algunos de los marcadores descritos se comparten entre grupos de casos por pares, y un número menor entre los tres. Otros son exclusivos de un grupo específico. La mayoría son parte de islas CpG definidas (p. ej., contenido de GC superior al 55% y una relación CpG observada a esperada del 65% o más), y cuando hay una anotación (asociación con un gen conocido), la ubicación es generalmente en la región promotora.

Tabla 3A - DMR de cáncer colorrectal

(Continuación)

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Tabla 3B: DMR de cáncer colorrectal clasificadas por área bajo la curva ROC

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Tabla 4A: DMR de adenoma grande

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Tabla 4B: DMR de adenoma grande clasificados por área bajo la curva ROC

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Tabla 5A - DMR de pólipos de sésiles serrados (SSP)

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Tabla 5B: DMR de pólipos de sésiles serrados (SSP) clasificados por área bajo la curva ROC

(Continuación)

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Ejemplo 3.

[0227] Este ejemplo demuestra NDRG4, BMP3, OPLAH, FLI1, PDGFD, CHST_7889, SFMBT2_895, SFMBT2_896, SFMBT2_897, CHST27890, VAV3 y DTX1 como marcadores efectivos para detectar el cáncer colorrectal en muestras de heces.

[0228] Las secuencias de cebador y sonda directa e inversa para NDRG4, BMP3, OPLAH, FLI1, PDGFD, CHST_7889, SFMBT2_895, SFMBT2_896, SFMBT2_897, CHST2_7890, VAV3 y DTX1 se proporcionan en la Tabla 6A. La Tabla 6B proporciona información sobre el marcador metilado, el cromosoma y las coordenadas genómicas de DMR proporcionadas en la Tabla 6A.

[0229] Las sondas de captura para cada marcador fueron diseñadas para tener una temperatura de fusión de 75-80°C y longitudes entre 25-35 bases (ver, Tabla 6C). Además, la región de hibridación de la sonda de captura se seleccionó para estar dentro de la huella de QuARTS postbisulfito. La Tabla 6C proporciona el marcador de metilación y las secuencias de sonda de captura respectivas.

Tabla 6B. Marcador metilado, cromosoma y coordenadas genómicas DMR.

Tabla 6C. Marcador de metilación y secuencias de sonda de captura respectivas.

[0230] Cada sonda de captura se sintetizó con una modificación 5'-NH2 para permitir el acoplamiento a partículas magnéticas que son -COOH modificado a través de la química de acoplamiento de carbodiimida estándar. Además, un oligonucleótido complementario a la sonda de captura se sintetizó para contener una etiqueta 5'-Cy3. Esta sonda complementaria se utilizó para confirmar el acoplamiento de la sonda de captura a partículas magnéticas.

[0231] Para probar la eficacia de captura de cada sonda, así como evaluar el rendimiento del marcador, se hicieron dos agrupaciones de heces de pacientes normales y con cáncer. El grupo de heces de cáncer provino de 6 pacientes (3 son CRC, 1 es un AA y 2 incógnitas). Del mismo modo, las heces normales provienen de 6 pacientes normales sin CRC. Las heces se prepararon mezclando el sobrenadante después de la centrifugación homogeneizada. El sobrenadante agrupado se dividió en alícuotas en muestras de captura única que contenían sobrenadantes de 14 ml.

[0232] Las sondas de captura fueron diseñadas para tener una temperatura de fusión de 75-80°C y longitudes entre 25-35 bases. Además, la región de hibridación de la sonda de captura se seleccionó para estar dentro de la huella QuARTS posterior al bisulfito.

[0233] Para realizar la captura, las bolas de captura (partículas magnéticas con sondas de captura unidas covalentemente) para dos marcadores más las bolas de captura de ACTB se agruparon para formar un grupo de bolas de captura triple.

[0234] La captura se realizó en triplicados de 14 ml de sobrenadantes de heces positivos y normales (la excepción fue VAV3 y DTX1 se realizaron por duplicado ya que el grupo se estaba agotando).

[0235] Después de completar la captura, el ADN de las heces se eluyó de las perlas de captura con 0,1 N NaOH a 42°C durante 20 minutos seguido de conversión de bisulfito a 56°C durante 1 hora usando bisulfito de amonio. Luego se desulfonó el ADN de las heces y se purificó usando perlas magnéticas recubiertas de sílice y se eluyó en 70 pl de Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 0,1 mM. Luego se ensayaron 10 uL de eluyente y se cuantificaron en ensayos QuARTS.

[0236] Para poder cuantificar las muestras, se usaron plásmidos pUC57 con insertos de ADN correspondientes a las huellas QuARTS. Los insertos de ADN se flanquearon con sitios EcoRI para permitir la linealización y cuantificación usando absorbancia a 260 nm.

[0237] Para permitir el cálculo inverso de las hebras en las muestras eluidas, se realizaron ensayos QuARTS en 10 pl de eluyentes y diluciones en serie de los plásmidos digeridos.

[0238] La Tabla 6D muestra los resultados obtenidos para cada uno de los marcadores probados. Estos resultados muestran que los marcadores de metilación tenían grandes diferencias de cadena entre el grupo de heces positivo y normal, lo que indica que estos marcadores son candidatos para la detección de CRC en las heces.

Tabla 6D.

Ejemplo 4.

[0239] Procedimiento ejemplar para la detección de un cáncer colorrectal en un sujeto humano.

[0240] Contactar con un ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómico, por ejemplo, aislado de fluidos corporales como una muestra de heces o tejido colorrectal) obtenido de un sujeto humano con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador DMR seleccionado de:

• FLI1, OPLAH, DTX1, MATK y SFMBT2 región 2; (como se indica en la Tabla 1);

• BMP3, NDRG4, PDGFG, CHST2 y SFMBT2 (como se indica en la Tabla 2);

• SFMBT2, LIFR, OPLAH, CRHR2, AGBL4, ZEB2, ZNF788, SFMBT2, ESR1, ANKRD33B, CHST2 y FNDC1 (como se indica en la Tabla 3); y

• NDRG4, BMP3, OPLAH, FLI1, PDGFD, CHST_7889, SFMBT2_895, SFMBT2_896, SFMBT2_897, CHST27890, VAV3 y DTX1 (como se indica en la Tabla 6).

[0241] Identificar al sujeto que tiene un cáncer colorrectal cuando el estado de metilación del marcador es diferente al estado de metilación del marcador analizado en un sujeto que no tiene una neoplasia.

Procedimiento ejemplar para la detección de un adenoma grande basado en colorrectal en un sujeto humano.

[0242] Contactar con un ácido nucleico (p. ej., ADN genómico, p. ej., aislado de fluidos corporales como una muestra de heces o tejido colorrectal) obtenido de un sujeto humano con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador DMR seleccionado entre:

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Un kit que comprende un colector de muestras de heces para obtener una muestra de heces de un sujeto; reactivos para aislar un ácido nucleico de la muestra; un reactivo de bisulfito; y oligonucleótidos que se unen específicamente a una región genética que tiene las coordenadas del cromosoma 3143119999-143120158.

2. El kit de la reivindicación 1, en donde los oligonucleótidos son un conjunto de cebadores que consisten en SEQ ID NOS: 69 y 71.