ES2956257T3

ES2956257T3 - Detección de carcinoma hepatocelular

Info

Publication number: ES2956257T3
Application number: ES17847642T
Authority: ES
Inventors: William R Taylor; David A Ahlquist; Douglas W Mahoney; John B Kisiel; Tracy C Yab; Hatim T Allawi; Maria Giakoumopoulos; Graham P Lidgard
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Exact Sciences Corp
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Exact Sciences Corp
Priority date: 2016-09-02
Filing date: 2017-09-01
Publication date: 2023-12-18
Anticipated expiration: 2037-09-01
Also published as: EP4293128A2; EP3507298A4; KR102648965B1; US20200115761A1; AU2017318700A1; CN109790198B; CN116064795A; KR20190045188A; AU2022291502A1; JP2019528704A; CN109790198A; AU2017318700A2; EP3507298A1; EP4293128A3; US20180066320A1; WO2018045322A1; JP2023058645A; JP7293109B2; CA3034903A1; EP3507298B1

Abstract

En el presente documento se proporciona tecnología para la detección del carcinoma hepatocelular y en particular, pero no exclusivamente, métodos, composiciones y usos relacionados para detectar la presencia de carcinoma hepatocelular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de carcinoma hepatocelular

Campo de la invención

En la presente descripción se proporciona tecnología para la detección de carcinoma hepatocelular y particularmente, pero no exclusivamente, a métodos, composiciones, y usos relacionados para detectar la presencia de carcinoma hepatocelular.

Antecedentes

El carcinoma hepatocelular (HCC, por sus siglas en inglés) es una neoplasia maligna primaria del hígado y se produce predominantemente en pacientes con enfermedad hepática crónica subyacente y cirrosis. Se cree que la(s) célula(s) de origen son las células madre hepáticas (véase, Alison MR. Stem Cell Rev. 2005. 1(3):253-60). Los tumores progresan con expansión local, diseminación intrahepática, y metástasis a distancia.

El HCC es ahora la tercera causa principal de muertes por cáncer en todo el mundo, con más de 500.000 personas afectadas. La incidencia de HCC es la más alta en Asia y África, donde la alta prevalencia endémica de hepatitis B y hepatitis C se predispone marcadamente al desarrollo de una enfermedad hepática crónica y posterior desarrollo de HCC.

La presentación de HCC ha evolucionado significativamente durante las últimas décadas. Mientras que en el pasado, el HCC generalmente se presentaba en una etapa avanzada con dolor en el cuadrante superior derecho, pérdida de peso, y signos de enfermedad hepática descompensada, ahora se reconoce cada vez más en una etapa mucho más temprana como consecuencia de la detección rutinaria de pacientes con cirrosis conocida, usando estudios de imágenes en sección transversal y mediciones de alfafetoproteína sérica (AFP, por sus siglas en inglés).

El documento US-2011/256538 A1 se relaciona con un método para detectar la presencia o ausencia de un cáncer en un individuo, determinando el nivel de metilación de la cadena codificante de una región reguladora seleccionada del gen supresor de tumores de la poliposis coli adenomatosa (APC, por sus siglas en inglés). La hipermetilación se ha descrito en el gen HOXA1 en colangiocarcinoma (US 2016/090634 A1) y adenocarcinoma (Tsau y col., Molecular Cancer, Biomed Central, vol. 6, núm. 1,29 de octubre de 2007, páginas 70).

Se espera que la amenaza de HCC continúe creciendo en los próximos años (véase, Llovet JM, y col., Liver Transl. 10 de feb. de 2004 (2 Supl. 1):S115-20). Por tanto, existe una gran necesidad de detección temprana del HCC para mejorar la tasa de supervivencia de estos pacientes.

Resumen

El carcinoma hepatocelular (HCC) es el segundo cáncer más mortal en todo el mundo. La supervivencia mejora con la detección en etapas tempranas, y se necesitan herramientas de detección no invasivas precisas. Es imperativa una innovación que ofrecerá herramientas de detección precisas, asequibles, y seguras para la detección presintomática de la etapa temprana del HCC.

La presente invención aborda esta necesidad. De hecho, la presente invención proporciona marcadores de ADN metilados novedosos que discriminan el HCC de los controles normales (controles con y sin cirrosis).

El ADN metilado se ha estudiado como una posible clase de biomarcadores en los tejidos de la mayoría de los tipos de tumores. En muchos casos, las ADN metiltransferasas agregan un grupo metilo al ADN en los sitios de islas de citosina-fosfato-guanina (CpG) como control epigenético de la expresión génica. En un mecanismo biológicamente atractivo, se cree que los eventos de metilación adquiridos en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores silencian la expresión, contribuyendo así a la oncogénesis. La metilación del ADN puede ser una herramienta de diagnóstico química y biológicamente más estable que el ARN o la expresión de proteínas (Laird (2010) Nat Rev Genet 11: 191-203). Además, en otros cánceres como el cáncer de colon esporádico, los marcadores de metilación ofrecen una excelente especificidad y son más ampliamente informativos y sensibles que las mutaciones de ADN individuales (véase, Zou y col. (2007) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: 2686-96).

El análisis de las islas de CpG ha arrojado resultados importantes cuando se aplica a modelos animales y a líneas celulares humanas. Por ejemplo, Zhang y sus colegas descubrieron que los amplicones de diferentes partes de la misma isla de CpG pueden tener diferentes niveles de metilación (Zhang y col. (2009) PLoS Genet 5: e1000438). Además, los niveles de metilación se distribuyeron bimodalmente entre secuencias altamente metiladas y no metiladas, respaldando aún más el patrón binario similar a un interruptor de la actividad de la ADN metiltransferasa (Zhang y col. (2009) PLoS Genet 5: e1000438). El análisis de tejidos murinos in vivo y de líneas celulares in vitro demostró que solo alrededor del 0,3 % de los promotores de alta densidad de CpG (HCP, definidos como que tienen >7 % de secuencia de CpG dentro de una región de 300 pares de bases) estaban metilados, mientras que las áreas de baja densidad de CpG (LCP, definido como que tiene <5 % de secuencia de CpG dentro de una región de 300 pares de bases) tendía a metilarse frecuentemente en un patrón dinámico específico de tejido (Meissner y col. (2008) Nature 454: 766-70). Los HCP incluyen promotores de genes constitutivos ubicuos y genes de desarrollo altamente regulados. Entre los sitios de HCP metilados en >50 % se encontraban varios marcadores establecidos, como Wnt 2, NDRG2, SFRP2, y BMP3 (Meissner y col. (2008) Nature 454: 766-70).

Los experimentos conducidos durante el curso del desarrollo de realizaciones de desarrollo para la presente invención compararon el estado de metilación de marcadores de ADN del plasma de sujetos que tienen HCC al estado de metilación de los mismos marcadores de ADN de los sujetos de control (p. ej., sujetos que tienen cirrosis o normal). Tales experimentos identificaron y validaron candidatos marcadores de ADN metilados que discriminan el HCC a partir de tales grupos de control.

Por consiguiente, en la presente descripción se describe una tecnología para la detección de HCC (p. ej., la vigilancia) y particularmente, pero no exclusivamente, métodos, composiciones, y usos relacionados para detectar la presencia de HCC.

Se identificaron marcadores y/o paneles de marcadores capaces de detectar el HCC (véanse, los Ejemplos I, II y III) (ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, EFNB2, HOXA1, LRRC4, SPINT2, TSPYL5, CCNJ 3707, CCNJ 3124, PFKP, SCRN1, y ECE1).

Por lo tanto la invención describe un método para caracterizar una muestra biológica que comprende: medir un nivel de metilación de un sitio CpG para el gen HOXA1 y uno o más genes seleccionados de EMX1, DAB2IP, TSPYL5, ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DBNL, EFNB2, LRRC4, SPINT2, CCNJ 3707, CCNJ 3124, PFKP, SCRN1, y ECE1 en una muestra biológica de un individuo humano a través del tratamiento del ADN genómico en la muestra biológica con bisulfito; amplificar el ADN genómico tratado con bisulfito usando un conjunto de iniciadores para los genes; y determinar el nivel de metilación del sitio CpG mediante PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa, análisis de enzimas de restricción de ADN sensible a la metilación, pirosecuenciación con bisulfito cuantitativa, o PCR de secuenciación genómica de bisulfito, y comparar el nivel de metilación con un nivel de metilación de un conjunto correspondiente de genes en muestras de control sin HCC; y determinar que el individuo tiene HCC cuando el nivel de metilación medido en los genes es mayor que el nivel de metilación medido en las respectivas muestras de control.

Como se describe en la presente descripción, la tecnología proporciona un número de marcadores de ADN metilado y subconjuntos de los mismos (p. ej., conjuntos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 marcadores) con alta discriminación para detectar la presencia de HCC en sujetos. Los experimentos aplicaron un filtro de selección a los marcadores candidatos para identificar los marcadores que proporcionan una proporción señal/ruido alto y un nivel de fondo bajo para proporcionar una alta especificidad, p. ej., cuando se analizan medios (p. ej., plasma) con fines de detección o diagnóstico de cáncer (p. ej., detección o diagnóstico de HCC).

En algunos aspectos de la descripción, la tecnología se relaciona con evaluar la presencia y el estado de metilación de uno o más de los marcadores identificados en la presente descripción en una muestra biológica (p. ej., una muestra de plasma). Estos marcadores comprenden una o más regiones metiladas diferencialmente (DMR, por sus siglas en inglés) según se analiza en la presente descripción, p. ej., como se proporciona en las Tablas 1 y 4. El estado de metilación se evalúa en realizaciones de la tecnología. Como tal, la tecnología proporcionada en la presente descripción no está restringida en el método por el cual se mide el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, en algunos aspectos el estado de metilación se mide mediante un método de exploración del genoma. Por ejemplo, un método implica la exploración genómica de puntos de referencia de restricción (véase, Kawai y col. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7421-7427) y otro ejemplo implica la PCR cebada arbitrariamente sensible a la metilación (véase, Gonzalgo y col. (1997) Cancer Res. 57: 594-599). En algunos aspectos, los cambios en los patrones de metilación en sitios de CpG específicos se controlan mediante la digestión del ADN genómico con enzimas de restricción sensibles a la metilación seguido de un análisis de Southern de las regiones de interés (método de digestión-Southern). En algunas realizaciones de la invención, analizar los cambios en los patrones de metilación implica un proceso basado en la PCR que implica la digestión del ADN genómico con enzimas de restricción sensibles a la metilación antes de la amplificación por ^pC^r(véase, Singer-Sam y col. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 687). Además, se han notificado otras técnicas que utilizan el tratamiento con bisulfito del ADN como punto de partida para el análisis de metilación. Estos incluyen la PCR específica de metilación (MSP, por sus siglas en inglés) (véase, Herman y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826) y digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito (véase. Sadri y Hornsby (1996) Nucl. Acids Res.

24: 5058-5059; y Xiong y Laird (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2532-2534). Se han desarrollado técnicas de PCR para la detección de mutaciones genéticas (véase, Kuppuswamy y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-1147) y cuantificación de la expresión alélica específica (Szabo y Mann (1995) Genes Dev. 9: 3097-3108; y Singer-Sam y col. (1992) PCR Methods Appl. 1: 160-163). Estas técnicas utilizan cebadores internos, que se hibridan con una plantilla generada por PCR y terminan inmediatamente en 5' del único nucleótido que se va a ensayar. Métodos usando un “ ensayo de Ms-SNuPE cuantitativo” como se describe en la patente US-7.037.650 se usan en algunas realizaciones.

Al evaluar un estado de metilación, el estado de metilación a menudo se expresa como la fracción o el porcentaje de hebras individuales de ADN que están metiladas en un sitio particular (por ejemplo, en un solo nucleótido, en una región o locus particular, en una secuencia más larga de interés, por ejemplo, hasta una subsecuencia de ~100 pb, 200 pb, 500 pb, 1000 pb de un ADN o más) en relación con la población total de ADN en la muestra que comprende ese sitio en particular. Tradicionalmente, la cantidad de ácido nucleico no metilado se determina mediante PCR utilizando calibradores. Posteriormente, se trata una cantidad conocida de ADN con bisulfito y la secuencia específica de metilación resultante se determina utilizando una PCR en tiempo real u otra amplificación exponencial, p. ej., un ensayo QuARTS (p. ej., como se proporciona en la patente US- 8.361.720, 8.715.937, y 8.916.344);

Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos comprenden generar una curva patrón para la diana no metilada mediante el uso de patrones externos. La curva patrón se construye a partir de al menos dos puntos y relaciona el valor de Ct en tiempo real del ADN no metilado con patrones cuantitativos conocidos. Posteriormente, se construye una segunda curva patrón para la diana metilada a partir de al menos dos puntos y patrones externos. Esta segunda curva patrón relaciona el Ct para el ADN metilado con patrones cuantitativos conocidos. A continuación, se determinan los valores de Ct de la muestra de prueba para las poblaciones metiladas y no metiladas y se calculan los equivalentes genómicos de ADN a partir de las curvas patrón producidas mediante las dos primeras etapas. El porcentaje de metilación en el sitio de interés se calcula a partir de la cantidad de ADN metilado en relación con la cantidad total de ADN en la población, por ejemplo, (número de ADN metilados) / (número de ADN metilados número de ADN no metilados) * 100.

También se proporcionan en la descripción composiciones y kits para practicar los métodos. Por ejemplo, en algunos aspectos, los reactivos (p. ej., cebadores, sondas) específicos para uno o más marcadores se proporcionan solos o en conjuntos (p. ej., conjuntos de pares de cebadores para amplificar una pluralidad de marcadores). También se pueden proporcionar reactivos adicionales para realizar un ensayo de detección (p. ej., enzimas, tampones, controles positivos y negativos para realizar QuARTS, PCR, secuenciación, bisulfito u otros ensayos). En algunos aspectos, se proporcionan kits que contienen uno o más reactivos necesarios, suficientes o útiles para realizar un método. También se proporcionan mezclas de reacción que contienen los reactivos. Además, se proporcionan conjuntos de reactivos de mezcla maestra que contienen una pluralidad de reactivos que se pueden agregar entre sí y/o a una muestra de prueba para completar una mezcla de reacción.

En algunos aspectos, la tecnología descrita en la presente descripción está asociada con una máquina programable diseñada para realizar una secuencia de operaciones aritméticas o lógicas según lo previsto por los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, algunos aspectos de la tecnología están asociados con (por ejemplo, implementados en) software y/o hardware de ordenador. En un aspecto, la tecnología se relaciona con un ordenador que comprende una forma de memoria, un elemento para realizar operaciones aritméticas y lógicas y un elemento de procesamiento (p. ej., un microprocesador) para ejecutar una serie de instrucciones (p. ej., un método como se proporciona en la presente descripción) para leer, manipular y almacenar datos. En algunos aspectos, un microprocesador es parte de un sistema para determinar un estado de metilación (p. ej., de una o más DMR, p. ej., d Mr 1-400 como se proporciona en las Tablas 1 y 4); comparar estados de metilación (p. ej., de una o más DMR, p. ej., DMR 1-400 como se proporciona en las Tablas 1 y 4); generar curvas patrón; determinar un valor de Ct; calcular una fracción, frecuencia, o porcentaje de metilación (p. ej., de una o más DMR, p. ej., DMR 1-400 como se proporciona en las Tablas 1 y 4); identificar una isla de CpG; determinar una especificidad y/o sensibilidad de un ensayo o marcador; calcular una curva ROC y una ABC asociada; análisis de secuencias; todo como se describe en la presente descripción o se conoce en la técnica.

En algunos aspectos, un microprocesador o un ordenador usa datos del estado de metilación en un algoritmo para predecir el sitio de un cáncer.

En algunos aspectos, un componente de software o hardware recibe los resultados de múltiples ensayos y determina un resultado de valor único para informar a un usuario que indica un riesgo de cáncer basado en los resultados de múltiples ensayos (p. ej., determinar el estado de metilación de múltiples DMR, p. ej., como se indica en las Tablas 1 y 4); Los aspectos relacionados calculan un factor de riesgo basado en una combinación matemática (p. ej., una combinación ponderada, una combinación lineal) de los resultados de múltiples ensayos, p. ej., determinando los estados de metilación de múltiples marcadores (como DMR múltiple, p. ej., como se proporciona en las Tablas 1 y 4); En algunos aspectos, el estado de metilación de una DMR define una dimensión y puede tener valores en un espacio multidimensional y la coordenada definida por los estados de metilación de múltiples DMR es un resultado, p. ej., para informar a un usuario.

Algunos aspectos comprenden un medio de almacenamiento y componentes de memoria. Los componentes de memoria (p. ej., memoria volátil y/o no volátil) encuentran uso en almacenar instrucciones (p. ej., un aspecto de un proceso como se proporciona en la presente descripción) y/o datos (p. ej., una pieza de trabajo tal como mediciones de metilación, secuencias, y descripciones estadísticas asociadas con las mismas). Algunos aspectos se relacionan con sistemas que también comprenden una o más de una CPU, una tarjeta gráfica y una interfaz de usuario (p. ej., que comprenden un dispositivo de salida, como una pantalla, y un dispositivo de entrada, como un teclado).

Las máquinas programables asociadas con la tecnología comprenden tecnologías convencionales existentes y tecnologías en desarrollo o aún por desarrollar (por ejemplo, una computadora cuántica, una computadora química, una computadora de ADN, una computadora óptica, una computadora basada en espintrónica, etc.).

En algunos aspectos, la tecnología comprende un medio de transmisión alámbrico (por ejemplo, cable metálico, fibra óptica) o inalámbrico para transmitir datos. Por ejemplo, algunos aspectos se relacionan con la transmisión de datos a través de una red (por ejemplo, una red de área local (LAN), una red de área amplia (WAN), una red ad-hoc, Internet, etc.). En algunos aspectos, las máquinas programares están presentes en dicha red como iguales y en algunos aspectos las máquinas programares tienen una relación cliente/servidor.

En algunos aspectos, los datos se almacenan en un medio de almacenamiento legible por ordenador, como un disco duro, una memoria flash, un medio óptico, un disquete, etc.

En algunos aspectos, la tecnología proporcionada en la presente descripción está asociada con una pluralidad de ^{dispositivos programa} r ^{es que funcionan en conjunto para realizar un método como se describe en la presente}descripción. Por ejemplo, en algunos aspectos, una pluralidad de ordenadores (por ejemplo, conectados por una red) pueden trabajar en paralelo para recolectar y procesar datos, por ejemplo, en una implementación de computación en clúster o computación en malla o alguna otra arquitectura de computación distribuida que se basa en ordenadores (con CPU integradas, almacenamiento, fuentes de alimentación, interfaces de red, etc.) conectados a una red (privada, pública o Internet) mediante una interfaz de red convencional, como Ethernet, fibra óptica o tecnología de red inalámbrica.

Por ejemplo, algunos aspectos proporcionan un ordenador que incluye un medio legible por ordenador. El aspecto incluye una memoria de acceso aleatorio (RAM) acoplada a un procesador. El procesador ejecuta instrucciones de programa ejecutables por ordenador almacenadas en la memoria. Dichos procesadores pueden incluir un microprocesador, un ASIC, una máquina de estado u otro procesador, y pueden ser cualquiera de varios procesadores informáticos, como los procesadores de Intel Corporation de Santa Clara, California y Motorola Corporation de Schaumburg, Illinois. Dichos procesadores incluyen, o pueden estar en comunicación con, medios, por ejemplo, medios legibles por ordenador, que almacenan instrucciones que, cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador realice los pasos descritos en la presente descripción.

Los aspectos de los medios legibles por ordenador incluyen, pero no se limitan a, un dispositivo de almacenamiento o transmisión electrónico, óptico, magnético o de otro tipo capaz de proporcionar a un procesador instrucciones legibles por ordenador. Otros ejemplos de medios adecuados incluyen, entre otros, un disquete, un CD-ROM, un DVD, un disco magnético, un chip de memoria, una ROM, una RAM, un ASIC, un procesador configurado, todos los medios ópticos, todas las cintas magnéticas u otros medios magnéticos, o cualquier otro medio desde el cual un procesador de ordenador pueda leer instrucciones. Además, varias formas diferentes de medios legibles por ordenador pueden transmitir o llevar instrucciones a un ordenador, incluidos un enrutador, una red privada o pública u otro dispositivo o canal de transmisión, tanto por cable como inalámbrico. Las instrucciones pueden incluir código en cualquier lenguaje de programación informático adecuado, incluidos, por ejemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, y JavaScript.

En algunos aspectos, los ordenadores están conectados a una red. Los ordenadores también pueden incluir varios dispositivos externos o internos, como un ratón, un CD-ROM, un DVD, un teclado, una pantalla u otros dispositivos de entrada o salida. Algunos ejemplos de ordenadores son los ordenadores personales, los asistentes digitales, los asistentes digitales personales, los teléfonos celulares, los teléfonos móviles, los teléfonos inteligentes, los buscapersonas, las tabletas digitales, los ordenadores portátiles, los dispositivos de Internet y otros dispositivos basados en procesadores. En general, los ordenadores relacionados con aspectos de la tecnología proporcionada en la presente descripción pueden ser cualquier tipo de plataforma basada en procesador que opere en cualquier sistema operativo, como Microsoft Windows, Linux, UNIX, Mac OS X, etc., capaz de soportar uno o más programas que comprenden la tecnología proporcionada en la presente descripción. Algunos aspectos comprenden un ordenador personal que ejecuta otros programas de aplicación (por ejemplo, aplicaciones). Las aplicaciones pueden estar contenidas en la memoria y pueden incluir, por ejemplo, una aplicación de procesamiento de texto, una aplicación de hoja de cálculo, una aplicación de correo electrónico, una aplicación de mensajería instantánea, una aplicación de presentación, una aplicación de navegador de Internet, una aplicación de calendario/organizador y cualquier otra aplicación capaz de ser ejecutada por un dispositivo cliente.

Todos los componentes, ordenadores y sistemas descritos en la presente descripción como asociados con la tecnología pueden ser lógicos o virtuales.

En la presente descripción se proporciona tecnología relacionada con un método de detección de HCC en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el método ensayar un estado de metilación de un marcador en una muestra obtenida de un sujeto; e identificar al sujeto que tiene HCC cuando el estado de metilación del marcador es diferente de un estado de metilación del marcador ensayado en un sujeto que no tiene HCC (p. ej., un sujeto que no tiene HCC) (p. ej., un sujeto que no tiene HCC, pero tiene cirrosis hepática), en donde el marcador comprende una o más bases en una región diferencialmente metilada (DMR) seleccionada de ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, EFNB2, HOXA1, LRRC4, SPINT2, TSPYL5, CCNJ_3707, CCNJ_3124, PFKP, SCRN1, y ECE1 como se proporciona en las Tablas 1 y 4.

La tecnología no está limitada en el estado de metilación evaluado. En algunas realizaciones, evaluar el estado de metilación del marcador en la muestra comprende determinar el estado de metilación de una base. En algunas realizaciones, analizar el estado de metilación del marcador en la muestra comprende determinar el grado de metilación en una pluralidad de bases. Además, en algunas realizaciones, el estado de metilación del marcador comprende una metilación aumentada del marcador con respecto a un estado de metilación normal del marcador. En algunas realizaciones, el estado de metilación del marcador comprende una metilación disminuida del marcador con respecto a un estado de mutilación normal del marcador. En algunas realizaciones, el estado de mutilación del marcador comprende un patrón diferente de metilación del marcador con respecto a un estado de metilación normal del marcador.

Además, en algunas realizaciones el marcador es una región de 100 o menos bases, el marcador es una región de 500 o menos bases, el marcador es una región de 1000 o menos bases, el marcador es una región de 5000 o menos bases, o, en algunas realizaciones, el marcador es una base. En algunas realizaciones, el marcador está en un promotor de alta densidad de CpG.

La tecnología no está limitada por el tipo de muestra. Por ejemplo, en algunos aspectos de la descripción, la muestra es una muestra de sangre (p. ej., plasma, suero, sangre completa), una muestra de heces, una muestra de tejido (p. ej., tejido del estómago, tejido pancreático, tejido del conducto biliar/hepático, jugo pancreático, y tejido colorrectal), una excreción, o una muestra de orina.

Además, la tecnología no está limitada en el método utilizado para determinar el estado de metilación. En algunos aspectos, el análisis comprende usar la reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación, la secuenciación de ácido nucleico, la espectrometría de masas, la nucleasa específica de metilación, la separación basada en masas o la captura de dianas. En algunos aspectos, el ensayo comprende el uso de un oligonucleótido específico de metilación. En algunos aspectos, la tecnología usa secuenciación masivamente paralela (p. ej., secuenciación de próxima generación) para determinar el estado de metilación, p. ej., secuenciación por síntesis, secuenciación en tiempo real (p. ej., de una sola molécula), secuenciación de emulsión de glóbulos, secuenciación de nanoporos, etc.

La tecnología proporciona reactivos para detectar una DMR, p. ej., en algunos aspectos se proporciona un conjunto de oligonucleótidos que comprenden las secuencias proporcionadas por las Id. de sec. n.°: 1-94 (Tablas 2 y 5) En algunos aspectos, se proporciona un oligonucleótido que comprende una secuencia complementaria a una región cromosómica que tiene una base en una DMR, por ejemplo, un oligonucleótido sensible al estado de metilación de una DMR.

La tecnología proporciona varios paneles de marcadores, p. ej., en algunos aspectos el marcador comprende una región cromosómica que tiene una anotación que se proporciona en las Tablas 1 o 3, y que comprende el marcador. Además, los aspectos proporcionan un método para analizar una DMR de las Tablas 1 y/o 4 que una o más de las DMR núms. 1-400.

En la descripción se proporcionan aspectos del kit, p. ej., un kit que comprende un reactivo de bisulfito; y un ácido nucleico de control que comprende una secuencia de una DMR seleccionada de un grupo que consiste en DMR 1-400 (de las Tablas 1 y 4) y que tiene un estado de metilación asociado con un sujeto que no tiene HCC (p. ej., un sujeto que no tiene HCC y no tiene cirrosis hepática) (p. ej., un sujeto que no tiene HCC pero tiene cirrosis hepática). Se proporcionan aspectos del kit, p. ej., un kit que comprende un reactivo de bisulfito; y un ácido nucleico de control que comprende una secuencia de una DMR seleccionada de un grupo que consiste en las DMR 1-400 (de las Tablas 1 y 4) y que tiene un estado de metilación asociado con un sujeto que no tiene HCC.

Algunos aspectos del kit comprenden un recolector de muestras para obtener una muestra de un sujeto (por ejemplo, una muestra de heces); reactivos para aislar un ácido nucleico de la muestra; un reactivo de bisulfito; y un oligonucleótido como se describe en la presente descripción.

La descripción se relaciona con aspectos de las composiciones (p. ej., mezclas de reacción). En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y un reactivo de bisulfito. Algunos aspectos proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y un oligonucleótido como se describe en la presente descripción. Algunos aspectos proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y una enzima de restricción sensible a la metilación. Algunos aspectos proporcionan una composición que comprende un ácido nucleico que comprende una DMR y una polimerasa.

Se proporcionan realizaciones de métodos relacionados adicionales para detectar HCC en una muestra obtenida de un sujeto (p. ej., una muestra de plasma), p. ej., un método que comprende determinar un estado de metilación de un marcador en la muestra que comprende una base en una DMR que es una o más de las DMR 1-400 (de las Tablas 1 y 4); comparar el estado de metilación del marcador de la muestra del sujeto con un estado de metilación del marcador de una muestra de control normal de un sujeto que no tiene HCC; y determinar un intervalo de confianza y/o un valor p de la diferencia en el estado de metilación de la muestra del sujeto y la muestra de control normal.

En algunas realizaciones, el intervalo de confianza es del 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % y el valor de p es 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, o 0,0001. Algunas realizaciones de métodos proporcionan etapas para hacer reaccionar un ácido nucleico que comprende una DMR con un reactivo de bisulfito para producir un ácido nucleico que ha reaccionado con bisulfito; secuenciar el ácido nucleico que ha reaccionado con bisulfito para proporcionar una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico que ha reaccionado con bisulfito; comparar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico que ha reaccionado con bisulfito con una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que comprende la DMR de un sujeto que no tiene cáncer para identificar diferencias en las dos secuencias; e identificar que el sujeto tiene una neoplasia cuando está presente una diferencia.

La tecnología proporciona sistemas para la detección de HCC en una muestra obtenida de un sujeto. Algunas realizaciones ilustrativas de sistemas incluyen, p. ej., un sistema para detectar HCC en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo el sistema un componente de análisis configurado para determinar el estado de metilación de una muestra, un componente de software configurado para comparar el estado de metilación de la muestra con una muestra de control o un estado de metilación de muestra de referencia registrado en una base de datos, y un componente de alerta configurado para alertar a un usuario de un estado de metilación asociado con el HCC (p. ej., un estado de metilación sin HCC; un estado de metilación con HCC). En algunos aspectos se determina una alerta mediante un componente de software que recibe los resultados de múltiples ensayos (p. ej., determinando los estados de metilación de múltiples marcadores, p. ej., DMR, p. ej., como se proporciona en las Tablas 1 y 4) y calculando un valor o resultado para informar basado en los múltiples resultados. Algunos aspectos proporcionan una base de datos de parámetros ponderados asociados con cada DMR proporcionada en la presente memoria para su uso en el cálculo de un valor o resultado y/o una alerta para informar a un usuario (p. ej., como un médico, un profesional de enfermería, un profesional sanitario, etc.) En algunos aspectos se notifican todos los resultados de múltiples ensayos y, en algunos aspectos, se usan uno o más resultados para proporcionar una puntuación, un valor, o un resultado basado en una combinación de uno o más resultados de múltiples ensayos que es indicativo de un riesgo de HCC en un sujeto.

En algunos aspectos de sistemas, una muestra comprende un ácido nucleico que comprende una DMR. En algunos aspectos el sistema comprende además un componente para aislar un ácido nucleico, un componente para recolectar una muestra, como un componente para recolectar una muestra de plasma. En algunos aspectos, el sistema comprende secuencias de ácido nucleico que comprenden una DMR. En algunos aspectos la base de datos comprende secuencias de ácido nucleico de sujetos que no tienen HCC. También se proporcionan ácidos nucleicos, por ejemplo, un conjunto de ácidos nucleicos, teniendo cada ácido nucleico una secuencia que comprende una DMR. En algunos aspectos el conjunto de ácidos nucleicos en donde cada ácido nucleico tiene una secuencia de un sujeto que no tiene HCC. Los aspectos de sistemas relacionados comprenden un conjunto de ácidos nucleicos como se describe y una base de datos de secuencias de ácidos nucleicos asociadas con el conjunto de ácidos nucleicos. Algunos aspectos comprenden además un reactivo de bisulfito. Y, algunos aspectos comprenden además un secuenciador de ácido nucleico.

En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para detectar HCC en una muestra obtenida de un sujeto (p. ej., una muestra de plasma), que comprenden a) obtener una muestra que comprende ADN de un sujeto; b) tratar el ADN obtenido con un reactivo que modifica selectivamente residuos de citosina no metilados en el ADN obtenido para producir residuos modificados, pero que no modifica los residuos de citosina metilado; c) determinar el nivel de metilación de uno o más marcadores de metilación del ADN en el ADN que se ha sometido al tratamiento de la etapa b), en donde el uno o más marcadores de metilación del ADN comprenden una base en una región diferencialmente metilada (DMR) como se proporciona por DMR 1-400 (de las Tablas 1 y 4), d) comparar el nivel de metilación determinado del uno o más marcadores de metilación del ADN con referencias a nivel de metilación para el uno o más marcadores de metilación del ADN para sujetos que no tienen HCC; y e) identificar que el sujeto tiene HCC cuando están presentes diferencia.

En algunas realizaciones, una determinación de la metilación elevada en uno o más de los marcadores de metilación del ADN comprende una determinación de la metilación alterada dentro de una región seleccionada del grupo que consiste en una isla de CpG y una orilla de isla de CpG.

En algunas realizaciones, una determinación de la metilación elevada dentro de la isla de CpG o la orilla CpG comprende una metilación elevada dentro de una región codificante o una región reguladora del marcador de metilación del ADN.

En algunas realizaciones, determinar el nivel de metilación de uno o más marcadores de metilación del ADN en el ADN que se ha sometido al tratamiento de la etapa b) comprende determinar la puntuación de metilación y/o la frecuencia de metilación del uno o más marcadores de metilación del ADN. En algunas realizaciones, el tratamiento de la etapa b) se logra mediante la modificación con bisulfito del ADN obtenido.

En algunas realizaciones, determinar el nivel de metilación de uno o más marcadores de metilación del ADN en el ADN que se ha sometido al tratamiento de la etapa b) se logra mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en PCR específica de metilación, PCR cuantitativa específica de metilación, análisis de enzimas de restricción de ADN sensible a la metilación, pirosecuenciación con bisulfito cuantitativa, y PCR de secuenciación genómica de bisulfito.

Algunas realizaciones adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica relevante basándose en las enseñanzas contenidas en la presente descripción.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Una representación de las cuatro fases involucradas en la identificación de 311 regiones diferencialmente metiladas (DMR) para discriminar muestras de ADN de HCC del ADN derivado de controles normales (p. ej., individuos sin HCC con o sin cirrosis hepática).

Figura 2: Una combinación complementaria de 3 marcadores (EMX1, LRRC4 y BDH1) identificó 20/21 HCC y 32/33 controles en plasma; 1 HCC tuvo niveles bajos de BDH1 y 1 control tuvo LRRC4 elevado. Este panel fue sensible al 95 % (IC del 95 %, 74 % -100 %) para HCC a una especificidad del 97 % (IC al 95 %, 82 %-100 %) y alcanzó un ABC de 0,98 (véase, la Figura 2).

3A-I: Área bajo la información de la curva característica operativa del receptor para ACP1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, HOXA1, LRRC4, SPINT2, y TSPYL5.

Figura 4A-CC: Representaciones de cajas (escala logarítmica) de 27 marcadores de cáncer gástrico (29 con análisis de punto de ajuste añadidos) a partir de datos biológicos de validación del tejido. Las muestras se disponen con hígado normal en la parte izquierda, seguido de HCC c/s cirrosis, HCC c/cirrosis, y controles de cirrosis (inflamatoria). El eje vertical es metilación fraccional (normalizada a hebras de p-actina).

Figura 5: El rendimiento de 27 marcadores de cáncer de HCC en 75 muestras de tejido de HCC y 29 controles (16 cirrosis, 13 hígado normal) en un formato de matriz con un 95 % de especificidad normal. Los marcadores se enumeran verticalmente y las muestras horizontalmente. Las muestras se disponen con hígado normal (NI) en el extremo izquierdo, seguido de HCC c/s cirrosis (HN), HCC c/cirrosis (HC), y controles de cirrosis (In). Los aciertos positivos están en gris claro y las fallas en gris oscuro. Este gráfico permite evaluar los marcadores de forma complementaria. Nota: 2 marcadores, TBX15 y EGR2, se analizaron una segunda vez usando un método de puntos de ajuste en los datos de qMSP y se incluyen en esta descripción.

La Figura 6 proporciona las secuencias de oligonucleótidos para los casetes de FRET, que se usan en la detección de firmas de ADN metiladas mediante los ensayos QuART (amplificación de señal en tiempo real específico de alelo cuantitativo y amplificación de señal). Cada secuencia de FRET incluye un fluoróforo y un inactivador que pueden multiplexarse juntos en 3 ensayos separados.

Figura 7A-D: A) Árbol binario de rPart con cortes para la combinación de 3 marcadores superiores (EMX1, BDH1, LRRC4). El árbol se construye mediante el siguiente proceso: primero se encuentra la variable única que mejor divide los datos en dos grupos. Los datos se separan y luego este proceso se aplica separadamente a cada subgrupo, y así sucesivamente hasta que los subgrupos alcancen un tamaño mínimo o hasta que no se pueda realizar ninguna mejora. Los números de muestra de control que cumplen o no cumplen con los corte se representan en la posición del numerador y las muestras de casos en la posición del denominador. Aquí, la combinación identificó 20 de 21 HCC y 32 de 33 controles en plasma. B) Árbol binario de rPart con cortes para la combinación de 3 marcadores superiores (EMX1, DAB2IP, TSPYL5). C) Árbol binario de rPart con cortes para la combinación de 3 marcadores superiores (EMX1, HOXA1, ACPI). D) Árbol binario de rPart con cortes para la combinación de 3 marcadores superiores (EMX1, EFNB2, SPINT2).

Figura 8: Gráfico de barras que demuestra la sensibilidad de HCC en el plasma por la etapa A-C al 100 % de especificidad usando el marcador de metilación EMX1. Las muestras clasificadas como U no se definieron para la etapa.

Figura 9: Gráfico que representa la importancia relativa de cada uno de los marcadores de metilación considerados en este análisis (ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, EFNB2, HOXA1, LRRC4, SPINT2, TSPYL5, CCNJ 3707, CCNJ 3124, PFKP, SCRN1, y ECE1). La estimación validada cruzada de sensibilidad y especificidad para todo el panel de marcadores fue del 75 % y el 96 %, respectivamente.

Descripción detallada

Ya que en la presente descripción se describe la tecnología, los encabezados de las secciones se utilizan con fines organizativos y no deben interpretarse de modo alguno como una limitación de la materia descrita.

En esta descripción detallada de las diversas realizaciones, con fines explicativos, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones descritas. Un experto en la técnica apreciará, sin embargo, que estas diversas realizaciones pueden practicarse con o sin estos detalles específicos. En otros casos, las estructuras y los dispositivos se muestran en forma de diagrama de bloques. Además, un experto en la materia puede apreciar fácilmente que las secuencias específicas en las que se presentan y realizan los métodos son ilustrativas y se contempla que las secuencias se pueden variar y permanecer dentro del espíritu y alcance de las diversas realizaciones descritas en la presente descripción.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Cuando las definiciones de los términos en las referencias incorporadas parezcan diferir de las definiciones proporcionadas en las presentes enseñanzas, prevalecerá la definición proporcionada en las presentes enseñanzas.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente tecnología, a continuación se definen una serie de términos y expresiones. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, los siguientes términos tienen los significados asociados explícitamente en la presente descripción, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La expresión “ en una realización” , tal como se usa en la presente descripción, no se refiere necesariamente a la misma realización, aunque podría hacerlo. Además, la expresión “ en otra realización” , tal como se usa en la presente descripción, no se refiere necesariamente a una realización diferente, aunque podría hacerlo. Por tanto, como se describe a continuación, varias realizaciones de la invención pueden combinarse fácilmente, sin apartarse del alcance o espíritu de la invención.

Además, como se usa en la presente descripción, el término “ o” es un operador “ o” inclusivo y es equivalente al término “ y/o” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La expresión “ basado en” no es exclusiva y permite que esté basado en factores adicionales no descritos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, a lo largo de la memoria descriptiva, el significado de “ un” , “ una” y “ el” incluyen referencias en plural. El significado de “ en” incluye “ en” y “ sobre” .

Como se usa en la presente descripción, un “ ácido nucleico” o “ molécula de ácido nucleico” generalmente se refiere a cualquier ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, que puede ser ADN o ARN no modificado o modificado. Los “ ácidos nucleicos” incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios. Como se usa en la presente descripción, la expresión “ ácido nucleico” también incluye ADN como se describe anteriormente que contiene una o más bases modificadas. Por lo tanto, el ADN con una cadena principal modificada por motivos de estabilidad o por otras razones es un “ ácido nucleico” . La expresión “ ácido nucleico” , tal como se utiliza en la presente descripción, abarca tales formas de ácidos nucleicos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN características de virus y células, incluidas, por ejemplo, células simples y complejas.

Los términos “ oligonucleótido” o “ polinucleótido” o “ nucleótido” o “ ácido nucleico” se refieren a una molécula que tiene dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres y normalmente más de diez. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función final o el uso del oligonucleótido. El oligonucleótido puede generarse de cualquier manera, incluida la síntesis química, la replicación del ADN, la transcripción inversa o una combinación de las mismas. Los desoxirribonucleótidos típicos del ADN son la timina, la adenina, la citosina y la guanina. Los ribonucleótidos típicos del ARN son uracilo, adenina, citosina y guanina.

Como se usa en la presente descripción, los términos “ locus” o “ región” de un ácido nucleico se refieren a una subregión de un ácido nucleico, por ejemplo, un gen en un cromosoma, un solo nucleótido, una isla de CpG, etc.

Los términos “ complementario” y “ complementariedad” se refieren a nucleótidos (p. ej., 1 nucleótido) o polinucleótidos (p. ej., una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia 5-A-G-T-3' es complementaria a la secuencia 3-T-C-A-5'. La complementariedad puede ser “ parcial” , en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan según las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad “ completa” o “ total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos afecta a la eficacia y a la fuerza de hibridación entre las cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación y en los métodos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

El término “ gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un ARN, o de un polipéptido o su precursor. Un polipéptido funcional puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante siempre que se conserven la actividad deseada o las propiedades funcionales (p. ej., actividad enzimática, unión de ligandos, transducción de señales, etc.) del polipéptido. El término “ porción” cuando se usa en referencia a un gen se refiere a fragmentos de ese gen. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde unos pocos nucleótidos hasta la secuencia completa del gen menos un nucleótido. Por lo tanto, “ un nucleótido que comprende al menos una parte de un gen” puede comprender fragmentos del gen o el gen completo.

El término “ gen” también abarca las regiones codificantes de un gen estructural e incluye secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante en los extremos 5' y 3', p. ej., a una distancia de aproximadamente 1 kb en cada extremo, de modo que el gen corresponde a la longitud completa del ARNm de longitud completa (p. ej., que comprende secuencias codificantes, reguladoras, estructurales y otras). Las secuencias que están ubicadas en 5' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que están ubicadas en 3' o cadena abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas o 3' sin traducir. El término “ gen” abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen. En algunos organismos (p. ej., eucariotas), una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas “ intrones” o “ regiones intermedias” o “ secuencias intermedias” . Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (ARNnh); los intrones pueden contener elementos reguladores como potenciadores. Los intrones se eliminan o “ cortan” del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones “ flanqueantes” (estas secuencias flanqueantes están ubicadas en 5' o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, la escisión postranscripcional y la poliadenilación.

El término “ alelo” se refiere a una variación de un gen; las variaciones incluyen, pero sin limitación, variantes y mutantes, locus polimórficos y locus polimórficos de un solo nucleótido, desplazamiento del marco de lectura y mutaciones de corte y empalme. Un alelo puede ocurrir naturalmente en una población o puede surgir durante la vida de cualquier individuo particular de la población.

Por tanto, los términos “variante” y “ mutante” , cuando se usan en referencia a una secuencia de nucleótidos se refieren a una secuencia de ácido nucleico que difiere en uno o más nucleótidos de otra secuencia de ácido de nucleótido, generalmente relacionada. Una “variación” es una diferencia entre dos secuencias de nucleótidos diferentes; típicamente, una secuencia es una secuencia de referencia.

La “ amplificación” es un caso especial de replicación de ácidos nucleicos que implica especificidad de la cadena molde. Debe contrastarse con la replicación de cadena molde no específica (por ejemplo, la replicación que depende de la cadena molde pero no depende de una cadena molde específica). La especificidad de la cadena molde se distingue aquí de la fidelidad de la replicación (por ejemplo, la síntesis de la secuencia de polinucleótidos adecuada) y la especificidad de los nucleótidos (ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos). La especificidad de la cadena molde se describe frecuentemente en términos de especificidad del “ objetivo” . Las secuencias diana son “ dianas” en el sentido de que se busca separarlas de otros ácidos nucleicos. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta clasificación.

La amplificación de ácidos nucleicos generalmente se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o una porción del polinucleótido, típicamente a partir de una pequeña cantidad del polinucleótido (por ejemplo, una sola molécula de polinucleótido, de 10 a 100 copias de una molécula de polinucleótido, que pueden o no ser exactamente iguales), donde los productos de amplificación o amplicones son generalmente detectables. La amplificación de polinucleótidos abarca diversos procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula o cadena molde de ADN diana durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR); véase, p. ej., la atente US-5.494.810) son formas de amplificación. Los tipos adicionales de amplificación incluyen, pero sin limitación, PCR específica de alelo (véase, p. ej., la patente US-5.639.611), PCR de ensamblaje (véase, p. ej., la patente US-5.965.408), amplificación dependiente de helicasa (véase, p. ej., la patente US-7.662.594), PCR de inicio en caliente (véanse, p. ej., las patentes US-5.773.258 y 5.338.671), PCR intersecuencial específica, PCR inversa (véase, p. ej., Triglia y col. (1988) Nucleic Acids Research, 16:8186), PCR mediada por ligamiento (véase, p. ej., Guilfoyle, R. y col., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); patente US-5.508.169), PCR específica de metilación (véase, p. ej., Herman y col., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826), PCR de minicebador, amplificación de sonda dependiente de ligadura multiplex (véase, p. ej., Schouten y col., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57), PCR multiplex (véase, p. ej., Chamberlain y col., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio y col., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden y col., (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR de superposición-extensión (véase, p. ej., Higuchi y col., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367), PCR en tiempo real (véase, p. ej., Higuchi y col., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi y col., (1993) Biotechnology 11:1026-1030), ^{P c R}de transcripción inversa (véase, p. ej., Bustin, SA (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193), PCR en fase sólida, PCR termoasimétrica entrelazada y PCR Touchdown (véase, p. ej., Don, y col., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, y col., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485). La amplificación de polinucleótidos puede lograrse también usando PCR digital (véase, p. ej., Kalinina y col., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999); publicación de patente internacional n.° WO05023091A2; publicación de solicitud de patente US-20070202525).

La expresión “ reacción en cadena de polimerasa” (“ PCR” ) se refiere al método de K.B. Mullis, patentes de US-4.683.195, 4.683.202, y 4.965.188, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso de amplificación de la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores de oligonucleótidos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus cadenas respectivas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se hibridan posteriormente con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Después de la hibridación, se extienden los cebadores con una polimerasa a fin de formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación del cebador y extensión con la polimerasa pueden repetirse muchas veces, es decir, la desnaturalización, la hibridación y la extensión constituyen un “ ciclo” ; puede haber numerosos “ ciclos” ) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Debido al aspecto repetitivo del proceso, el método se denomina “ reacción en cadena de la polimerasa” (“ PCR” ). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están “ amplificados por PCR” y son “ productos de PCR” o “ amplicones” .

La especificidad de la cadena molde se logra en la mayoría de las técnicas de amplificación mediante la elección de la enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, en las condiciones en que se usan, procesarán solo secuencias específicas de ácido nucleico en una mezcla heterogénea de ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso del replicaso Q-beta, el ARN de MDV-1 es la plantilla específica para el replicaso (Kacian y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:3038 [1972]). Esta enzima de amplificación no replicará otros ácidos nucleicos. Similarmente, en el caso de la polimerasa de ARN T7, esta enzima de amplificación tiene una especificidad estricta para sus propios promotores (Chamberlin y col, Nature, 228:227 [1970]). En el caso de la ligasa de ADN T4, la enzima no ligará los dos oligonucleótidos o polinucleótidos, cuando haya un desajuste entre el sustrato del oligonucleótido o polinucleótido y el molde en la unión de ligadura (Wu y Wallace (1989) Genomics 4:560). Finalmente, debido a su capacidad para funcionar a altas temperaturas, se observa que las ADN polimerasas termoestables dependientes de la cadena molde son capaces de mostrar una alta especificidad por las secuencias unidas y por tanto, definidas por los cebadores; la alta temperatura da como resultado condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación del cebador con las secuencias diana y no la hibridación con secuencias no diana (H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989]).

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ ensayo de detección de ácido nucleico” se refiere a cualquier método para determinar la composición de nucleótidos de un ácido nucleico de interés. Los ensayos de detección de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, métodos de secuenciación de ADN, métodos de hibridación de sondas, ensayos de escisión específica de estructura (p. ej., el ensayo INVADER, Hologic, Inc.) y se describen, p. ej., en las patentes US-5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, 6.001.567, 6.090.543, y 6.872.816; Lyamichev y col, Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall y col, PNAS, EE. UU., 97:8272 (2000), y el documento US-2009/0253142); métodos de escisión de desajustes enzimáticos (p. ej., Variagenics, patentes US-6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reacción en cadena de la polimerasa; métodos de hibridación ramificados (p. ej., Chiron, patentes US- 5.849.481, 5.710.264, 5.124.246, y 5.624.802); replicación en círculo rodante (p. ej., patentes US- 6.210.884, 6.183.960 y 6.235.502); NASBA (p. ej., patente US- 5.409.818); tecnología de baliza molecular (p. ej., patente US- 6.150.097); tecnología de sensor electrónico (Motorola, patentes US-6.248.229, 6.221.583, 6.013.170, y 6.063.573); tecnología de sonda cíclica (p. ej., patentes US-5.403.711, 5.011.769, y 5.660.988); métodos de amplificación de señales de Dade Behring (p. ej., patentes US-6.121.001, 6.110.677, 5.914.230, 5.882.867, y 5.792.614); reacción en cadena de la ligasa (p. ej., Barnay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); y métodos de hibridación en sándwich (p. ej., patente ^{U s -}5.288.609).

La expresión “ ácido nucleico amplificable” se refiere a un ácido nucleico que puede amplificarse mediante cualquier método de amplificación. Se contempla que el “ ácido nucleico amplificable” comprenderá normalmente la “ cadena molde de muestra” .

La expresión “ cadena molde de muestra” se refiere a un ácido nucleico que procede de una muestra que se analiza en busca de la presencia de la “ diana” (definida más adelante). Por el contrario, “ cadena molde de fondo” se utiliza en referencia a un ácido nucleico distinto de la cadena molde de muestra que puede o no estar presente en una muestra. La cadena molde de fondo normalmente pasa desapercibida. Puede ser el resultado del arrastre o puede deberse a la presencia de contaminantes de ácido nucleico que se busca purificar fuera de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de organismos distintos de los que se van a detectar pueden estar presentes como fondo en una muestra de prueba.

El término “ cebador” se refiere a un oligonucleótido, ya sea de forma natural como en un digerido de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico (p. ej., en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una polimerasa de ADN ya una temperatura y un pH adecuados). El cebador es preferiblemente monocatenario para máxima eficiencia en la amplificación, pero como alternativa puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata en primer lugar para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método.

El término “ sonda” se refiere a un oligonucleótido (p. ej., una secuencia de nucleótidos), ya sea de forma natural como en una digestión de restricción purificada o producida de forma sintética, recombinante o mediante amplificación por PCR, que es capaz de hibridarse con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares (p. ej., una “ sonda de captura” ). Se contempla que cualquier sonda utilizada en la presente invención pueda, en algunas realizaciones, marcarse con cualquier “ molécula indicadora” , de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, incluidos, entre otros, enzimas (p. ej., ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), sistemas fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a ningún sistema de detección o etiqueta en particular.

Como se usa en la presente descripción, “ mutilación” se refiere a la mutilación de citosina en las posiciones C5 o N4 de la citosina, la posición N6 de la adenina u otros tipos de metilación de ácidos nucleicos. El ADN amplificado in vitro generalmente no está metilado porque los métodos típicos de amplificación de ADN in vitro no conservan el patrón de metilación de la cadena molde de amplificación. Sin embargo, “ADN metilado” o “ADN no metilado” también pueden referirse a ADN amplificado cuya cadena molde original está metilada o no metilada, respectivamente.

Por consiguiente, como se usa en la presente descripción, un “ nucleótido metilado” o una “ base de nucleótido metilada” se refiere a la presencia de un resto de metilo en una base de nucleótido, en donde el resto de metilo no está presente en una base de nucleótido típica reconocida. Por ejemplo, la citosina no contiene un resto de metilo en su anillo de pirimidina, pero la 5-metilcitosina contiene un resto de metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por lo tanto, la citosina no es un nucleótido metilado y la 5-metilcitosina es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, la timina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina; sin embargo, para los fines de la presente descripción, la timina no se considera un nucleótido metilado cuando está presente en el ADN, ya que la timina es una base nucleotídica típica del ADN.

Como se usa en la presente descripción, una “ molécula de ácido nucleico metilado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados.

Como se usa en la presente descripción, un “ estado de metilación” , “ perfil de metilación” y “ estatus de metilación” de una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de una o más bases de nucleótido metiladas en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina metilada se considera metilada (p. ej., el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico está metilado). Una molécula de ácido nucleico que no contiene nucleótidos metilados se considera no metilada.

El estado de metilación de una secuencia de ácido nucleico en particular (p. ej., un marcador genético o región de ADN como se describe en la presente descripción) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de bases (p. ej., de una o más citosinas) dentro de la secuencia, o puede indicar información sobre la densidad de metilación regional dentro de la secuencia proporcionando o sin proporcionar información precisa de las ubicaciones dentro de la secuencia en la que se produce la metilación.

El estado de metilación de un locus de nucleótido en una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de un nucleótido metilado en un locus particular en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido de una molécula de ácido nucleico está metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido de la molécula de ácido nucleico es 5-metilcitosina. De manera similar, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido de una molécula de ácido nucleico no está metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido de la molécula de ácido nucleico es citosina (y no 5-metilcitosina).

El estado de metilación se puede representar o indicar opcionalmente mediante un “valor de metilación” (p. ej., que representa una frecuencia, fracción, proporción, porcentaje, etc.). Se puede generar un valor de metilación, por ejemplo, cuantificando la cantidad de ácido nucleico intacto presente después de la digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de la metilación o comparando los perfiles de amplificación después de la reacción con bisulfito o comparando las secuencias de ácidos nucleicos tratados con bisulfito y no tratados. Por consiguiente, un valor, por ejemplo, un valor de metilación, representa el estado de metilación y, por lo tanto, puede usarse como un indicador cuantitativo del estado de metilación en múltiples copias de un locus. Esto es particularmente útil cuando se desea comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un umbral o valor de referencia.

Como se usa en la presente descripción, “ frecuencia de metilación” o “ porcentaje de metilación (%)” se refiere al número de casos en los que una molécula o locus está metilado en relación con el número de casos en que la molécula o el locus no está metilado.

Como tal, el estado de metilación describe el estado de metilación de un ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia genómica). Además, el estado de metilación se refiere a las características de un segmento de ácido nucleico en un locus genómico particular relevante para la metilación. Dichas características incluyen, entre otras, si alguno de los restos de citosina (C) dentro de esta secuencia de ADN está metilado, la ubicación de los restos de C metilados, la frecuencia o el porcentaje de C metilado en cualquier región particular de un ácido nucleico y diferencias alélicas en la metilación debidas, por ejemplo, a diferencias en el origen de los alelos. Los términos “ estado de metilación” , “ perfil de metilación” y “ estado de metilación” también se refieren a la concentración relativa, concentración absoluta o patrón de C metilado o C no metilado en cualquier región particular de un ácido nucleico en una muestra biológica. Por ejemplo, si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados, se puede decir que están “ hipermetilados” o que tienen “ metilación aumentada” , mientras que si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metiladas, se puede denominar “ hipometilada” o que tiene “ metilación disminuida” . Asimismo, si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (p. ej., de una región diferente o de un individuo diferente, etc.), esa secuencia se considera hipermetilada o con metilación aumentada en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Como alternativa, si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (p. ej., de una región diferente o de un individuo diferente, etc.), esa secuencia se considera hipometilada o con metilación disminuida en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Además, la expresión “ patrón de metilación” , como se usa en la presente descripción, se refiere a los sitios colectivos de nucleótidos metilados y no metilados sobre una región de un ácido nucleico. Dos ácidos nucleicos pueden tener la misma o similar frecuencia de metilación o porcentaje de metilación pero tener diferentes patrones de metilación cuando el número de nucleótidos metilados y no metilados es el mismo o similar en toda la región pero las ubicaciones de los nucleótidos metilados y no metilados son diferentes. Se dice que las secuencias están “ metiladas diferencialmente” o que tienen una “ diferencia en la metilación” o que tienen un “ estado de metilación diferente” cuando difieren en el grado (p. ej., una tiene una metilación aumentada o disminuida en relación con la otra), la frecuencia o el patrón de metilación. La expresión “ metilación diferencial” se refiere a una diferencia en el nivel o patrón de metilación de ácidos nucleicos en una muestra positiva para cáncer en comparación con el nivel o patrón de metilación de ácidos nucleicos en una muestra negativa para cáncer. También puede referirse a la diferencia en niveles o patrones entre pacientes que tienen recurrencia del cáncer después de la cirugía frente a pacientes que no tienen recurrencia. La metilación diferencial y los niveles o patrones específicos de metilación del ADN son biomarcadores pronósticos y predictivos, por ejemplo, una vez que se han definido las características predictivas o de corte correctas.

La frecuencia del estado de metilación se puede utilizar para describir una población de individuos o una muestra de un solo individuo. Por ejemplo, un locus de nucleótido que tiene una frecuencia de estado de metilación del 50 % está metilado en el 50 % de los casos y no metilado en el 50 % de los casos. Dicha frecuencia se puede utilizar, por ejemplo, para describir el grado en que un locus de nucleótido o región de ácido nucleico está metilado en una población de individuos o una colección de ácidos nucleicos. Por lo tanto, cuando la metilación en una primera población o conjunto de moléculas de ácido nucleico es diferente de la metilación en una segunda población o conjunto de moléculas de ácido nucleico, la frecuencia del estado de metilación de la primera población o conjunto será diferente de la frecuencia del estado de metilación del segundo. población o piscina. Dicha frecuencia también puede utilizarse, por ejemplo, para describir el grado en que un locus de nucleótido o región de ácido nucleico está metilado en un solo individuo. Por ejemplo, dicha frecuencia se puede utilizar para describir el grado en que un grupo de células de una muestra de tejido está metilado o no metilado en un locus de nucleótido o región de ácido nucleico.

Como se usa en la presente descripción, un “ locus de nucleótidos” se refiere a la ubicación de un nucleótido en una molécula de ácido nucleico. Un locus de nucleótido de un nucleótido metilado se refiere a la ubicación de un nucleótido metilado en una molécula de ácido nucleico.

Típicamente, la metilación del ADN humano ocurre en una secuencia de dinucleótidos que incluye una guanina y una citosina adyacentes donde la citosina está ubicada en 5' de la guanina (también denominadas secuencias de dinucleótidos de CpG). La mayoría de las citosinas dentro de los dinucleótidos de CpG están metiladas en el genoma humano; sin embargo, algunas permanecen sin metilar en regiones genómicas ricas en dinucleótidos de CpG específicas, conocidas como islas de CpG (véase, p. ej., Antequera y col. (1990) Cell 62: 503-514).

[0090] Como se usa en la presente descripción, una “ isla de CpG” se refiere a una región de ADN genómico rica en G:C que contiene un número aumentado de dinucleótidos de CpG en relación con el ADN genómico total. Una isla de CpG puede tener al menos 100, 200 o más pares de bases de longitud, donde el contenido G:C de la región es al menos el 50 % y la relación entre la frecuencia de CpG observada y la frecuencia esperada es 0,6; en algunos casos, una isla de CpG puede tener al menos 500 pares de bases de longitud, donde el contenido G:C de la región es al menos el 55 %) y la relación entre la frecuencia de CpG observada y la frecuencia esperada es 0,65. La frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada puede calcularse según el método proporcionado en Gardiner-Garden y col. (1987) J. Mol. Biol. 196: 261-281. Por ejemplo, la frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada se puede calcular según la fórmula R = (A x B) / (C x D), donde R es la relación entre la frecuencia de CpG observada y la frecuencia esperada, A es el número de dinucleótidos de CpG en una secuencia analizada, B es el número total de nucleótidos en la secuencia analizada, C es el número total de nucleótidos C en la secuencia analizada y D es el número total de nucleótidos G en la secuencia analizada. El estado de metilación típicamente se determina en las islas de CpG, por ejemplo, en las regiones promotoras. Sin embargo se apreciará que otras secuencias en el genoma humano son propensas a la metilación del ADN, como CpA y CpT (véase, Ramsahoye (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5237-5242; Salmon y Kaye (1970) Biochim. Biophys. Acta. 204: 340-351; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2827-2842; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4353-4367; Woodcock (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 888-894).

Como se usa en la presente descripción, un reactivo que modifica un nucleótido de la molécula de ácido nucleico en función del estado de metilación de la molécula de ácido nucleico, o un reactivo específico de metilación, se refiere a un compuesto o composición u otro agente que puede cambiar la secuencia de nucleótidos. de una molécula de ácido nucleico de manera que refleje el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico. Los métodos para tratar una molécula de ácido nucleico con dicho reactivo pueden incluir poner en contacto la molécula de ácido nucleico con el reactivo, junto con etapas adicionales, si se desea, para lograr el cambio deseado de secuencia de nucleótidos. Dicho cambio en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido metilado se modifica en un nucleótido diferente. Dicho cambio en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido no metilado se modifica en un nucleótido diferente. Dicho cambio en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada uno de los nucleótidos seleccionados que no está metilado (p. ej., cada citosina no metilada) se modifica en un nucleótido diferente. El uso de dicho reactivo para cambiar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido que es un nucleótido metilado (p. ej., cada citosina metilada) se modifica en un nucleótido diferente. Como se usa en la presente descripción, el uso de un reactivo que modifica un nucleótido seleccionado se refiere a un reactivo que modifica un nucleótido de los cuatro nucleótidos que ocurren típicamente en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para ADN y C, G, U, y A para ARN), de modo que el reactivo modifica un nucleótido sin modificar los otros tres nucleótidos. En una realización ilustrativa, dicho reactivo modifica un nucleótido seleccionado no metilado para producir un nucleótido diferente. En otra realización ilustrativa, dicho reactivo puede desaminar nucleótidos de citosina no metilados. Un ejemplo de reactivo es bisulfito.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ reactivo de bisulfito” se refiere a un reactivo que comprende en algunas realizaciones bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos para distinguir entre citidinas metiladas y no metiladas, por ejemplo, en secuencias de dinucleótidos de CpG.

La expresión “ ensayo de metilación” se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos de CpG dentro de una secuencia de un ácido nucleico.

El término “AP-PCR MS” (reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente sensible a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un escaneo global del genoma usando cebadores ricos en CG para enfocarse en las regiones con mayor probabilidad de contener dinucleótidos de CpG, y descrita por Gonzalgo y col. (1997) Cancer Research 57: 594-599.

El término “ MethyLight™” se refiere a la técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads y col. (1999) Cancer Res. 59: 2302-2306.

El término “ HeavyMethyl™” se refiere a un ensayo en donde las sondas de bloqueo específicas para la metilación (también denominadas en el presente documento bloqueantes) que cubren las posiciones de CpG entre o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

La expresión ensayo “ HeavyMethyl™ MethyLight™” se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.

El término “ Ms-SNuPE” (extensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531.

El término “ MSP” (PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826, y en la patente US- 5.786.146.

El término “ COBRA” (análisis combinado de restricción de bisulfito) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534.

El término “ MCA” (amplificación de las islas de CpG) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota y col. (1999) Cancer Res. 59: 2307-12, y en el documento WO 00/26401A1.

Como se usa en la presente descripción, un “ nucleótido seleccionado” se refiere a un nucleótido de los cuatro nucleótidos típicos en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para ADN y C, G, U y A para ARN), y puede incluyen derivados metilados de los nucleótidos típicos (p. ej., cuando C es el nucleótido seleccionado, tanto C metilado como no metilado se incluyen en el significado de un nucleótido seleccionado), mientras que un nucleótido seleccionado metilado se refiere específicamente a un nucleótido típico metilado y un nucleótido no metilado se refiere específicamente a un nucleótido de aparición típica no metilado.

Las expresiones “ enzima de restricción específica de metilación” o “ enzima de restricción sensible a la metilación” se refieren a una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiendo del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. En el caso de una enzima de restricción que corta específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o está hemimetilado, el corte no tendrá lugar o tendrá lugar con una eficiencia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento está metilado. En el caso de una enzima de restricción que corta específicamente si el sitio de reconocimiento está metilado, el corte no tendrá lugar o tendrá lugar con una eficiencia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento no está metilado. Se prefieren enzimas de restricción específicas de metilación, cuya secuencia de reconocimiento contiene un dinucleótido de CG (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento tal como CGCG o CCCGGG). Además, para algunas realizaciones se prefieren enzimas de restricción que no cortan si la citosina en este dinucleótido está metilada en el átomo de carbono C5.

Tal como se usa en la presente descripción, un “ nucleótido diferente” se refiere a un nucleótido que es químicamente diferente de un nucleótido seleccionado, típicamente de tal forma que el nucleótido diferente tiene propiedades de emparejamiento de bases de Watson-Crick que difieren del nucleótido seleccionado, por lo que el nucleótido que se presenta típicamente que es complementario al nucleótido seleccionado no es lo mismo que el nucleótido típico que es complementario al nucleótido diferente. Por ejemplo, cuando C es el nucleótido seleccionado, U o T pueden ser el nucleótido diferente, lo que se ejemplifica por la complementariedad de C con G y la complementariedad de U o T con A. Como se usa en la presente descripción, un nucleótido que es complementario al nucleótido seleccionado o que es complementario al nucleótido diferente se refiere a un nucleótido que forma pares de bases, en condiciones de alta rigurosidad, con el nucleótido seleccionado o con un nucleótido diferente con mayor afinidad que la unión de bases del nucleótido complementario con tres de los cuatro nucleótidos típicos. Un ejemplo de complementariedad es el apareamiento de bases de Watson-Crick en el ADN (p. ej., A-T y C-G) y el ARN (p. ej., A-U y C-G). Por tanto, por ejemplo, G forma un emparejamiento de bases, en condiciones de alta rigurosidad, con mayor afinidad a C que el emparejamiento de bases de G con G, A o T y por tanto, cuando C es el nucleótido seleccionado, G es un nucleótido complementario al nucleótido seleccionado.

Como se usa en la presente descripción, la “ sensibilidad” de un marcador dado se refiere al porcentaje de muestras que informan un valor de metilación del ADN por encima de un valor umbral que distingue entre muestras neoplásicas y no neoplásicas. En algunas realizaciones, un positivo se define como una neoplasia confirmada por histología que informa un valor de metilación del ADN por encima de un valor umbral (por ejemplo, el intervalo asociado con la enfermedad), y un falso negativo se define como una neoplasia confirmada por histología que informa un valor de metilación del ADN por debajo del valor umbral (por ejemplo, el intervalo asociado con la ausencia de enfermedad). El valor de la sensibilidad, por lo tanto, refleja la probabilidad de que una medida de metilación del ADN para un marcador dado obtenido de una muestra de enfermedad conocida esté en el intervalo de medidas asociadas a la enfermedad. Como se define en la presente descripción, la relevancia clínica del valor de sensibilidad calculado representa una estimación de la probabilidad de que un marcador dado pueda detectar la presencia de una afección clínica cuando se aplica a un sujeto con dicha afección.

Como se usa en la presente descripción, la “ especificidad” de un marcador dado se refiere al porcentaje de muestras no neoplásicas que informan un valor de metilación del ADN por debajo de un valor umbral que distingue entre muestras neoplásicas y no neoplásicas. En algunas realizaciones, un negativo se define como una muestra no neoplásica confirmada por histología que informa un valor de metilación del ADN por debajo del valor umbral (p. ej., el intervalo asociado con ausencia de enfermedad) y un falso positivo se define como una muestra no neoplásica confirmada por histología que informa un valor de metilación del ADN por encima del valor umbral (p. ej., el intervalo asociado con la enfermedad). El valor de la especificidad, por lo tanto, refleja la probabilidad de que una medida de metilación del ADN para un marcador dado obtenido de una muestra no neoplásica conocida esté en el intervalo de medidas no asociadas a enfermedades. Como se define en la presente descripción, la relevancia clínica del valor de especificidad calculado representa una estimación de la probabilidad de que un marcador determinado pueda detectar la ausencia de una afección clínica cuando se aplica a un paciente sin dicha afección.

El término “ABC” , como se usa en la presente descripción, es una abreviatura de “ área bajo la curva” . Concretamente, se refiere al área bajo una curva de características operativas del receptor (ROC). La curva ROC es una gráfica de la tasa de verdaderos positivos frente a la tasa de falsos positivos para los diferentes puntos de corte posibles de una prueba de diagnóstico. Muestra el compromiso entre sensibilidad y especificidad según el punto de corte seleccionado (cualquier aumento de la sensibilidad irá acompañado de una disminución de la especificidad). El área bajo una curva ROC (ABC) es una medida de la precisión de una prueba de diagnóstico (cuanto mayor sea el área, mejor; el valor óptimo es 1; una prueba aleatoria tendría una curva ROC en diagonal con un área de 0,5; por referencia: J. P. Egan. (1975) Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, Nueva York).

Como se usa en la presente descripción, el término “ neoplasia” se refiere a “ una masa anormal de tejido, cuyo crecimiento excede y no se coordina con el de los tejidos normales” . Véase, p. ej., Willis RA, “ The Spread of Tumors in the Human Body” , Londres, Butterworth & Co, 1952.

Como se usa en la presente descripción, el término “ adenoma” se refiere a un tumor benigno de origen glandular. Aunque estos crecimientos son benignos, con el tiempo pueden progresar y volverse malignos.

El término “ precanceroso” o “ preneoplásico” y sus equivalentes se refieren a cualquier trastorno proliferativo celular que esté experimentando una transformación maligna.

Un “ sitio” o “ región” de una neoplasia, adenoma, cáncer, etc. es el tejido, órgano, tipo de célula, área anatómica, parte del cuerpo, etc. en el cuerpo de un sujeto donde se localiza la neoplasia, adenoma, cáncer, etc.

Como se usa en la presente descripción, una aplicación de prueba de “ diagnóstico” incluye la detectar o identificar una patología o afección en un sujeto, determinar la probabilidad de que un sujeto contraerá una determinada enfermedad o afección, determinar la probabilidad de que un sujeto con una enfermedad o afección responderá a la terapia, determinar el pronóstico de un sujeto con una enfermedad o afección (o su probable progresión o regresión), y determinar el efecto de un tratamiento en un sujeto con una enfermedad o afección. Por ejemplo, se puede usar un diagnósti

presencia o probabilidad de que un sujeto contraiga una neoplasia o la probabilidad de que dicho sujeto responda favorablemente a un compuesto (p. ej., un producto farmacéutico, p. ej., un fármaco) u otro tratamiento.

El término “ marcador” , como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia (p. ej., un ácido nucleico o una región de un ácido nucleico) que es capaz de diagnosticar un trastorno (p. ej., un trastorno no canceroso) (p. ej., un trastorno canceroso) al distinguir las células asociadas a trastornos (p. ej., células no cancerosas asociadas con el trastorno) (p. ej., células cancerosas asociadas con el trastorno) de las células normales, p. ej., basado en su estado de metilación.

El término “ aislado” cuando se usa en relación con un ácido nucleico, como en “ un oligonucleótido aislado” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos un ácido nucleico contaminante con el que normalmente se asocia en su fuente natural. El ácido nucleico aislado está presente en una forma o configuración que es diferente de aquella en la que se encuentra en la naturaleza. Por el contrario, los ácidos nucleicos no aislados, como el ADN y el ARN, se encuentran en el estado en que existen en la naturaleza. Los ejemplos de ácidos nucleicos no aislados incluyen: una secuencia de ADN dada (p. ej., un gen) que se encuentra en el cromosoma de la célula hospedadora en la proximidad de los genes vecinos; las secuencias de ARN, como una secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con muchos otros ARNm que codifican una multitud de proteínas. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína particular incluye, a modo de ejemplo, dicho ácido nucleico en células que normalmente expresan la proteína, donde el ácido nucleico se encuentra en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales, o está flanqueado por una secuencia de ácido nucleico diferente que la que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico u oligonucleótido aislado puede estar presente en forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando se va a utilizar un ácido nucleico u oligonucleótido aislado para expresar una proteína, el oligonucleótido contendrá como mínimo la cadena codificante o con sentido (es decir, el oligonucleótido puede ser monocatenario), pero puede contener las cadenas con sentido y las antisentido (es decir, el oligonucleótido puede ser bicatenario). Un ácido nucleico aislado puede, después del aislamiento de su entorno natural o típico, combinarse con otros ácidos nucleicos o moléculas. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede estar presente en una célula hospedadora en la que se ha colocado, por ejemplo, para la expresión heteróloga.

El término “ purificado” se refiere a moléculas, ya sean secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que se extraen, se aíslan o se separan de su entorno natural. Por lo tanto, una “ secuencia de ácido nucleico aislada” puede ser una secuencia de ácido nucleico purificada. Las moléculas “ sustancialmente purificadas” están libres al menos en un 60 %, preferiblemente al menos en un 75 % y más preferiblemente en al menos un 90 % de otros componentes con los que están asociadas de forma natural. Como se usa en la presente descripción, los términos “ purificado” o “ para purificar” también se refieren a la eliminación de contaminantes de una muestra. La eliminación de proteínas contaminantes da como resultado un aumento en el porcentaje de polipéptido o ácido nucleico de interés en la muestra. En otro ejemplo, los polipéptidos recombinantes se expresan en células hospedadoras de plantas, bacterias, levaduras o mamíferos y los polipéptidos se purifican mediante la eliminación de proteínas de células hospedadoras; el porcentaje de polipéptidos recombinantes aumenta de ese modo en la muestra.

La expresión “ composición que comprende” una secuencia polinucleotídica o polipéptido dado se refiere, en términos generales, a cualquier composición que contenga la secuencia polinucleotídica o el polipéptido dado. La composición puede comprender una solución acuosa que contenga sales (p. ej., NaCl), detergentes (p. ej., SDS) y otros componentes (p. ej., solución de Denhardt, leche en polvo, ADN de esperma de salmón, etc.).

El término “ muestra” se utiliza en su sentido más amplio. En cierto sentido, puede referirse a una célula o tejido animal. En otro sentido, se entiende que incluye un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas se pueden obtener de plantas o animales (incluidos los humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras ambientales incluyen material ambiental como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, una “ muestra remota” , como se usa en algunos contextos, se refiere a una muestra recolectada indirectamente de un sitio que no es la fuente de células, tejidos u órganos de la muestra. Por ejemplo, cuando el material de la muestra que se origina en el páncreas se evalúa en una muestra de heces (p. ej., no de una muestra tomada directamente del páncreas), la muestra es una muestra remota.

Como se usa en la presente descripción, los términos “ paciente” o “ sujeto” se refieren a organismos que se someterán a diversas pruebas proporcionadas por la tecnología. El término “ sujeto” incluye animales, preferiblemente mamíferos, incluidos los seres humanos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización aún más preferida, el sujeto es un ser humano.

Como se usa en la presente descripción, el término “ kit” se refiere a cualquier sistema de administración para administrar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, dichos sistemas de administración incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o administración de reactivos de reacción (p. ej., oligonucleótidos, enzimas, etc. en los contenedores apropiados) y/o materiales de apoyo (p. ej., tampones, instrucciones para realizar el ensayo, etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (p. ej., cajas) que contienen los reactivos de reacción relevantes y/o los materiales de apoyo. Como se usa en la presente descripción, el término “ kit fragmentado” se refiere a sistemas de administración que comprenden dos o más contenedores separados, cada uno de los cuales contiene una subporción de los componentes totales del kit. Los contenedores se pueden entregar al destinatario previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer contenedor puede contener una enzima para usar en un ensayo, mientras que un segundo contenedor contiene oligonucleótidos. La expresión “ kit fragmentado” pretende abarcar kits que contienen reactivos específicos de analitos (ASR) regulados por la sección 520(e) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, pero no se limita los mismos. De hecho, cualquier sistema de administración que comprenda dos o más contenedores separados, cada uno de los cuales contiene una subporción de los componentes totales del kit, se incluye en la expresión “ kit fragmentado” . Por el contrario, un “ kit combinado” se refiere a un sistema de administración que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un solo contenedor (p. ej., en una sola caja que contiene cada uno de los componentes deseados). El término “ kit” incluye tanto kits fragmentados como combinados.

Realizaciones de la tecnología

En la presente descripción se proporciona una tecnología para la detección de HCC (p. ej., la vigilancia) y particularmente, pero no exclusivamente, métodos, composiciones y usos relacionados para detectar la presencia de HCC en sujetos.

Se identificaron marcadores y/o paneles de marcadores (p. ej., una región cromosómica que tiene una anotación proporcionada en las Tablas 1 y 4) capaces de detectar HCC (véanse, los Ejemplos I, II y III) (p. ej., ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, EFNB2, HOXA1, LRRC4, SPINT2, TSPYL5, CCNJ 3707, CCNJ 3124, PFKP, SCRN1, y ECE1).

Aunque la descripción en la presente descripción se refiere a ciertas realizaciones ilustradas, debe entenderse que estas realizaciones se presentan a modo de ejemplo y no a modo de limitación.

Los métodos comprenden determinar el estado de metilación de al menos un marcador de metilación en una muestra biológica aislada de un sujeto, en donde un cambio en el estado de metilación del marcador es indicativo de la presencia, clase o de HCC. Algunos aspectos particulares se relacionan con marcadores que comprenden una región diferencialmente metilada (DMR, p. ej., DMR 1-400 (de las Tablas 1 y 4) que se usan para el diagnóstico (p. ej., detección) de HCC.

Además de los aspectos en donde el análisis de metilación de al menos un marcador, una región de un marcador, o una base de un marcador que comprende una DMR (p. ej., DMR 1-400) proporcionada en la presente descripción y enumerada en las Tablas 1 y 3 se analiza, la tecnología también proporciona paneles de marcadores que comprenden al menos un marcador, región de un marcador, o base de un marcador que comprende una DMR con utilidad para la detección de HCC en un sujeto.

Algunos aspectos de la tecnología se basan en el análisis del estado de metilación de CpG de al menos un marcador, región de un marcador, o base de un marcador que comprende una DMR.

En algunos aspectos, la presente tecnología proporciona el uso de la técnica de bisulfito en combinación con uno o más ensayos de metilación para determinar el estado de metilación de las secuencias de dinucleótidos de CpG dentro de al menos un marcador que comprende una DMR (p. ej., como se proporciona en las Tablas 1 y 4 (p. ej., DMR 1-400)). Los dinucleótidos de CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (conocidos como alternativa como hiper e hipometilados, respectivamente). Sin embargo, los métodos de la presente invención son adecuados para el análisis de muestras biológicas de naturaleza heterogénea, por ejemplo, una baja concentración de células tumorales, o materiales biológicos de las mismas, dentro de un fondo de una muestra remota (por ejemplo, sangre, efluentes de órganos o heces). Por consiguiente, cuando se analiza el estado de metilación de una posición de CpG dentro de dicha muestra, se puede usar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo, porcentaje, fracción, relación, proporción o grado) de metilación en una posición de CpG particular.

Según la presente tecnología, la determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG en marcadores que comprenden una DMR tiene utilidad tanto en el diagnóstico como en la caracterización de HCC en sujetos.

Combinaciones de marcadores

En algunos aspectos, la tecnología se relaciona con la evaluación del estado de metilación de combinaciones de marcadores que comprenden dos o más DMR de las Tablas 1 y/o 4 (p. ej., dos o más DMR a partir del DMR n.° 1 400). En algunos aspectos, evaluar el estado de metilación de más de un marcador aumenta la especificidad y/o sensibilidad de una pantalla o diagnóstico para identificar la presencia de HCC en un sujeto.

Diversos tipos de cáncer se predicen mediante diversas combinaciones de marcadores, por ejemplo, identificados mediante técnicas estadísticas relacionadas con la especificidad y la sensibilidad de la predicción. La tecnología proporciona métodos para identificar combinaciones predictivas y combinaciones predictivas validadas para algunos tipos de cáncer.

Por ejemplo, se identificaron marcadores y/o paneles de marcadores (p. ej., una región cromosómica que tiene una anotación proporcionada en las Tablas 1 y 4) capaces de detectar HCC (véanse, los Ejemplos I, II y III) (p. ej., ACPI, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, EFNB2, HOXA1, LRRC4, SPINT2, TSPYL5, CCNJ 3707, CCNJ 3124, PFKP, SCRN1, y ECE1).

Métodos para analizar el estado de metilación

El método utilizado más frecuentemente para analizar un ácido nucleico en busca de 5-metilcitosina se basa en el método del bisulfito descrito por Frommer y col. para la detección de 5-metilcitosinas en el ADN (Frommer y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31) o variaciones del mismo. El método del bisulfito para cartografiar las 5-metilcitosinas se basa en la observación de que la citosina, pero no la 5-metilcitosina, reacciona con el ion sulfito de hidrógeno (también conocido como bisulfito). La reacción generalmente se realiza según las siguientes etapas: en primer lugar, la citosina reacciona con el sulfito de hidrógeno para formar una citosina sulfonada. A continuación, la desaminación espontánea del intermedio de reacción sulfonado da como resultado un uracilo sulfonado. Finalmente, el uracilo sulfonado se desulfona en condiciones alcalinas para formar uracilo. La detección es posible porque el uracilo forma pares de bases con la adenina (por lo que se comporta como la timina), mientras que la 5-metilcitosina se empareja con la guanina (por lo que se comporta como la citosina). Esto hace posible la discriminación de citosinas metiladas de citosinas no metiladas, p. ej., secuenciación genómica de bisulfito (Grigg G y Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98) o PCR específica de metilación (MSP) como se describe, p. ej., en la patente US-5.786.146.

Algunas tecnologías convencionales se relacionan con métodos que consisten en encerrar el ADN a analizar en una matriz de agarosa, impidiendo así la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con el ADN monocatenario), y reemplazando las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A, y col. (1996) “A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis” Nucleic Acids Res.

24: 5064-6). Por lo tanto, es posible analizar el estado de metilación de las células individuales, lo que ilustra la utilidad y la sensibilidad del método. Se proporciona una descripción general de los métodos convencionales para detectar la 5-metilcitosina en Rein, T., y col. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 2255.

La técnica del bisulfito típicamente implica amplificar fragmentos específicos, cortos de un ácido nucleico conocido después de un tratamiento con bisulfito, y posteriormente analizar el producto mediante secuenciación (Olek y Walter (1997) Nat. Genet. 17: 275-6) o una reacción de extensión del cebador (Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res.

25: 2529-31; documento WO 95/00669; solicitudes de 6.251.594) para analizar posiciones individuales de citosina. Algunos métodos usan la digestión enzimática (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-4). La detección por hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek y col, documento WO 99/28498). De forma adicional, se ha descrito el uso de la técnica de bisulfito para la detección de metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark (1994) Bioessays 16: 431-6; Zeschnigk y col. (1997) Hum Mol Genet. 6: 387-95; Feil y col. (1994) Nucleic Acids Res.

22: 695; Martin y col. (1995) Gene 157: 261-4; documento WO 9746705; documento WO 9515373).

Se conocen en la técnica varios procedimientos de ensayo de metilación y se pueden usar junto con el tratamiento con bisulfito según la presente tecnología. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos de CpG (por ejemplo, islas de CpG) dentro de una secuencia de ácido nucleico. Dichos ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ácido nucleico tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis de transferencia de Southern y uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de patrones de metilación y distribuciones de 5-metilcitosina usando el tratamiento con bisulfito (Frommer y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-1831). De forma adicional, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito resulta útil para evaluar el estado de metilación, p. ej., como describen Sadri y Hornsby (1997) Nucl. Acids Res. 24: 5058-5059 o como se incorpora en el método conocido como COBRA (Análisis combinado de restricción de bisulfito) (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534).

El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativa útil para determinar los niveles de metilación del ADN en loci específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). Brevemente, la digestión con enzimas de restricción se usa para revelar diferencias de secuencia dependientes de la metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante un tratamiento estándar con bisulfito según el procedimiento descrito por Frommer y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). A continuación, se realiza la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito usando cebadores específicos para las islas de CpG de interés, seguida de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y detección usando sondas de hibridación marcadas y específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de forma cuantitativa lineal en un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de forma fiable al ADN obtenido a partir de muestras de tejido embebido en parafina microdiseccionado.

Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para locus específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); enzima de restricción y tampón adecuado; oligonucleótido de hibridación génica; oligonucleótido de hibridación de control; kit de marcaje de cinasa para sonda de oligonucleótidos; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (p. ej., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de a Dn .

Preferiblemente, los ensayos como “ MethyLight™” (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads y col, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), las reacciones Ms-SNuPE™ (extensión del cebador de nucleótido único sensible a la metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación (“ MSP” ; Herman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; solicitudes de 5.786.146), y amplificación de las islas de CpG metiladas (“ MCA” ; Toyota y col., Cancer Res. 59:2307-12, 1999) se usan solos o en combinación con uno o más de estos métodos.

La técnica de ensayo “ HeavyMethyl™” es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación según la amplificación específica de metilación del ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación (“ bloqueadores” ) que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación o están cubiertas por ellos permiten la amplificación selectiva específica de la metilación de una muestra de ácido nucleico.

La expresión ensayo “ HeavyMethyl™ MethyLight™” se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también puede utilizarse combinado con cebadores de amplificación específicos de metilación.

Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis HeavyMethyl™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para locus específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG, etc.); oligonucleótidos bloqueantes; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.

La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de prácticamente cualquier grupo de sitios de CpG dentro de una isla de CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; solicitudes de 5.786.146). Brevemente, el ADN se modifica con bisulfito de sodio, que convierte las citosinas no metiladas, pero no a las metiladas, en uracilo, y los productos se amplifican posteriormente con cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. MSP requiere solo pequeñas cantidades de ADN, es sensible al 0,1 % de alelos metilados de un locus de isla de CpG determinado y se puede realizar en ADN extraído de muestras embebidas en parafina. Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit típico basado en MSP) para el análisis de MSP pueden incluir, entre otros: cebadores de PCR metilados y no metilados para locus específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados, y sondas específicas.

El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza PCR en tiempo real basada en fluorescencia (p. ej., TaqMan®) que no requiere manipulaciones adicionales tras la etapa de PCR (Eads y col, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso de MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción de bisulfito de sodio, en un grupo mixto de diferencias de secuencia dependientes de la metilación según los procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los restos de citosina no metilados en uracilo). A continuación, se realiza una PCR basada en fluorescencia en una reacción “ sesgada” , por ejemplo, con cebadores de PCR que se solapan con dinucleótidos de CpG conocidos. La discriminación de secuencias se produce tanto a nivel del proceso de amplificación como a nivel del proceso de detección de fluorescencia.

El ensayo MetyLight™ se usa como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en un ácido nucleico, por ejemplo, una muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencias se produce al nivel de la hibridación de la sonda. En una versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un supuesto sitio de metilación particular. Una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido de CpG proporciona un control no sesgado de la cantidad de ADN de entrada. Como alternativa, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica sondando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (p. ej., una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren posibles sitios de metilación.

El proceso de MetyLight™ se utiliza con cualquier sonda adecuada (por ejemplo, una sonda “TaqMan®” , una sonda Lightcycler®, etc.) Por ejemplo, en algunas aplicaciones, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas TaqMan®, por ejemplo, con cebadores MSP y/u oligonucleótidos bloqueadores de HeavyMethyl y una sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene doble marcaje con moléculas fluorescentes “ indicadoras” e “ inactivadoras” y está diseñada para ser específica para una región con un contenido de GC relativamente alto, de modo que se funde a una temperatura aproximadamente 10 °C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, eventualmente llegará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora sin inactivar utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para locus específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); sondas TaqMan® o LigthCycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.

El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencias se produce a nivel de hibridación de sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación sin sesgo en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un supuesto sitio de metilación particular. Una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido de CpG proporciona un control no sesgado de la cantidad de ADN de entrada. Como alternativa, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica sondando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren posibles sitios de metilación.

El proceso QM™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, p. ej., sondas “ TaqMan®” , sondas LightCycler®, en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y a la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene doble marcaje con moléculas fluorescentes “ indicadoras” e “ inactivadoras” y está diseñada para ser específica para una región con un contenido de GC relativamente alto, de modo que se funde, a una temperatura aproximadamente 10 °C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, eventualmente llegará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora sin inactivar utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real. Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit basado en QM™ típico) para el análisis QM™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para locus específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); sondas TaqMan® o LigthCycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.

La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios de CpG específicos basados en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido de la extensión del cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo mientras se deja la 5-metilcitosina sin cambios. A continuación, se realiza la amplificación de la secuencia diana deseada utilizando cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como plantilla para el análisis de metilación en el sitio de CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (p. ej., secciones de anatomopatología diseccionadas) y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios de CpG.

Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para locus específicos (por ejemplo, genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE™ para locus específicos; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o un kit de recuperación de ADN (p. ej., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de a Dn .

La secuenciación con bisulfito de representación reducida (RRBS) comienza con el tratamiento con bisulfito del ácido nucleico para convertir todas las citosinas no metiladas en uracilo, seguido de la digestión con enzimas de restricción (p. ej., una enzima que reconoce un sitio que incluye una secuencia CG como Msμl) y la secuenciación completa de los fragmentos después del acoplamiento a un ligando adaptador. La elección de la enzima de restricción enriquece los fragmentos para las regiones densas de CpG, lo que reduce el número de secuencias redundantes que pueden asignarse a múltiples posiciones de genes durante el análisis. Como tal, la RRBS reduce la complejidad de la muestra de ácido nucleico mediante la selección de un subconjunto (p. ej., mediante selección de tamaño mediante electroforesis en gel preparativa) de fragmentos de restricción para la secuenciación. A diferencia de la secuenciación con bisulfito del genoma completo, cada fragmento producido por la digestión con enzimas de restricción contiene información de metilación del ADN para al menos un dinucleótido de CpG. Como tal, la RRBS enriquece la muestra en promotores, islas de CpG y otras características genómicas con una alta frecuencia de sitios de corte de enzimas de restricción en estas regiones y, por lo tanto, proporciona un ensayo para evaluar el estado de metilación de uno o más locus genómicos.

Un protocolo típico de RRBS comprende las etapas de digerir una muestra de ácido nucleico con una enzima de restricción como Msμl, rellenar salientes y añadir colas de A, ligar adaptadores, conversión de bisulfito y PCR. Véase, p. ej., y col. (2005) “ Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution” Nat Methods 7: 133-6; Meissner y col. (2005) “ Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis” Nucleic Acids Res. 33: 5868-77.

En algunas realizaciones, se usa un ensayo de amplificación de señal y diana en tiempo real específico de alelo cuantitativo (QuARTS) para evaluar el estado de metilación. Tres reacciones ocurren secuencialmente en cada ensayo QuARTS, incluida la amplificación (reacción 1) y la escisión de la sonda diana (reacción 2) en la reacción primaria; y escisión de FRET y generación de señal fluorescente (reacción 3) en la reacción secundaria. Cuando el ácido nucleico diana se amplifica con cebadores específicos, una sonda de detección específica con una secuencia de solapa se une débilmente al amplicón. La presencia del oligonucleótido invasivo específico en el sitio de unión diana hace que la escisión libere la secuencia del flap cortando entre la sonda de detección y la secuencia del flap. La secuencia del flap es complementaria a una parte sin horquilla de un casete de FRET correspondiente. En consecuencia, la secuencia del flap funciona como un oligonucleótido invasivo en el casete de FRET y efectúa una escisión entre el fluoróforo del casete de FRET y un inactivador, que produce una señal fluorescente. La reacción de escisión puede cortar múltiples sondas por diana y, por lo tanto, liberar múltiples fluoróforos por flap, lo que proporciona una amplificación exponencial de la señal. QuARTS puede detectar múltiples objetivos en un solo pocillo de reacción mediante el uso de casetes de FRET con diferentes colorantes. Véase, p. ej., Zou y col. (2010) “ Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology” Clin Chem 56: A199; solicitudes de patente de los EE. UU. con serie núm. 12/946.737, 12/946.745, 12/946.752, y 61/548.639.

La expresión “ reactivo de bisulfito” se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles como se describe en la presente descripción para distinguir entre secuencias de dinucleótidos de CpG metilados y no metilados. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (p. ej., el documento PCT/EP2004/011715). Se prefiere que el tratamiento con bisulfito se lleve a cabo en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, entre otros, n-alquilenglicol o éter dimetílico de dietilenglicol (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. En algunas realizaciones, los disolventes desnaturalizantes se utilizan en concentraciones entre el 1 % y el 35 % (v/v). En algunas realizaciones, la reacción de bisulfito se lleva a cabo en presencia de depuradores tales como, entre otros, derivados de cromano, por ejemplo, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8,-tetrametilcromano 2-carboxílico o ácido trihidroxibenzona y derivados del mismo, por ejemplo, ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La conversión de bisulfito se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de reacción entre 30 °C y 70 °C, por lo que la temperatura se aumenta a más de 85 °C durante breves períodos de tiempo durante la reacción (véase: documento PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito se purifica preferiblemente antes de la cuantificación. Esto puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la técnica, como, entre otros, ultrafiltración, por ejemplo, por medio de columnas Microcon™ (fabricadas por Millipore™). La purificación se lleva a cabo según un protocolo modificado del fabricante (véase, p. ej., el documento PCT/EP2004/011715).

En algunas realizaciones, los fragmentos del ADN tratado se amplifican utilizando conjuntos de oligonucleótidos cebadores según la presente invención (p. ej., véase la tabla 2) y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN puede realizarse simultáneamente en un mismo recipiente de reacción. Típicamente, la amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los amplicones tienen normalmente una longitud de 100 a 2000 pares de bases.

En otra realización del método, el estado de metilación de las posiciones CpG dentro o cerca de un marcador que comprende una DMR (p. ej., DMR 1-400; Las Tablas 1 y 4) pueden detectarse usando oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) ha sido descrita en la patente US- 6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estado de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que se hibrida con un dinucleótido de CpG tratado con bisulfito. Por tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido de CpG. Los cebadores de MSP específicos para el ADN no metilado contienen una “ T” en la posición de la posición de C en el CpG.

Los fragmentos obtenidos mediante la amplificación pueden llevar un marcador directa o indirectamente detectable. En algunas realizaciones, los marcadores son marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas separables que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, algunas realizaciones prevén que los amplicones marcados tengan una única carga neta positiva o negativa, lo que permite una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse por medio de, por ejemplo, espectrometría de masas de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI) o usando espectrometría de masas de electropulverización (ESI).

Los métodos para aislar ADN adecuados para estas tecnologías de ensayo son conocidos en la técnica. En particular, algunas realizaciones comprenden el aislamiento de ácidos nucleicos como se describe en la solicitud patente de los EE. UU. con serie n.° 13/470.251 (“ Isolation of Nucleic Acids” ).

Métodos

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos tecnológicos que comprenden las siguientes etapas:

1) poner en contacto un ácido nucleico (p. ej., ADN genómico, p. ej., aislado de fluidos corporales como una muestra de sangre (p. ej., una muestra de plasma, una muestra de heces, o una muestra de tejido) obtenido del sujeto con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador que comprende una DMR (p. ej., las DMR 1-400 de las Tablas 1 y 4)) y

2) detectar una falta de HCC (p. ej., proporcionado con una sensibilidad mayor o igual al 80 % y una especificidad mayor o igual al 80 %).

2) clasificar el HCC (p. ej., proporcionado con una sensibilidad mayor o igual al 80 % y una especificidad mayor o igual al 80 %).

Preferiblemente, la sensibilidad es de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 85 %. Preferiblemente, la especificidad es de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 85 %.

El ADN genómico puede aislarse por cualquier medio, incluido el uso de kits comercialmente disponibles. Brevemente, en donde el ADN de interés está encapsulado en una membrana celular, la muestra biológica debe romperse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. A continuación, la solución de ADN puede eliminarse de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, mediante digestión con proteinasa K. A continuación, el ADN genómico se recupera de la solución. Esto puede llevarse a cabo por medio de diversos métodos que incluyen la precipitación salina, la extracción orgánica o la unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores, incluidos el tiempo, el coste y la cantidad requerida de ADN. Todos los tipos de muestras clínicas que comprenden materia neoplásica o materia preneoplásica son adecuados para su uso en el presente método, por ejemplo, líneas celulares, portaobjetos de histología, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, heces, efluentes colónicos, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos.

La tecnología no está limitada en los métodos utilizados para preparar las muestras y proporcionar un ácido nucleico para la prueba. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se aísla un ADN de una muestra de heces o de una muestra de sangre o de plasma usando la captura directa de genes, p. ej., como se detalla en la solicitud patente de los EE. UU. con serie n.° 61/485386 o mediante un método relacionado.

Posteriormente, la muestra de ADN genómico se trata con al menos un reactivo, o una serie de reactivos, que distingue entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de al menos un marcador que comprende una DMR (p. ej., DMR 1-400, p. ej., como se proporciona en las Tablas 1 y 4).

En algunas realizaciones, el reactivo convierte bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' en uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. Sin embargo, en algunas realizaciones, el reactivo puede ser una enzima de restricción sensible a la metilación.

En algunas realizaciones, la muestra de ADN genómico se trata de tal manera que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. En algunas realizaciones, este tratamiento se lleva a cabo con bisulfato (sulfito de hidrógeno, disulfito) seguido de hidrólisis alcalina.

El ácido nucleico tratado se analiza después para determinar el estado de metilación de las secuencias del gen diana (al menos un gen, secuencia genómica o nucleótido de un marcador que comprende una DMR, p. ej., al menos una DMR elegida de DMR 1-400, p. ej., como se proporciona en las Tablas 1 y 4). El método de análisis puede seleccionarse entre los conocidos en la técnica, incluidos los enumerados en la presente descripción, por ejemplo, QuARTS y MSP como se describe en la presente descripción.

La tecnología se relaciona con el análisis de cualquier muestra asociada con HCC. Por ejemplo, en algunas realizaciones la muestra comprende una muestra de plasma de un paciente. En algunas realizaciones, la muestra comprende un tejido y/o fluido biológico obtenido de un paciente. En algunas realizaciones, la muestra comprende tejido hepático En algunas realizaciones, el detergente comprende SDS. En algunas realizaciones, la muestra comprende sangre, plasma y/o suero. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Estas muestras pueden proceder de la porción alta del tubo digestivo, la porción baja del tubo digestivo o comprender células, tejidos y/o secreciones tanto de la parte alta como de la parte baja del tubo digestivo. La muestra puede incluir células, secreciones o tejidos del hígado, conductos biliares, páncreas, estómago, colon, recto, esófago, intestino delgado, apéndice, duodeno, pólipos, vesícula biliar, ano y/o peritoneo. En algunas realizaciones, la muestra comprende fluido celular, ascitis, orina, heces, fluido pancreático, fluido obtenido durante una endoscopia, sangre, moco o saliva. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de heces.

Dichas muestras se pueden obtener por cualquier número de medios conocidos en la técnica, como será evidente para el experto en la materia. Por ejemplo, las muestras de orina y heces se obtienen fácilmente, mientras que las muestras de sangre, ascitis, suero o líquido pancreático se pueden obtener por vía parenteral utilizando, por ejemplo, una aguja y una jeringa. Las muestras libres de células o sustancialmente libres de células se pueden obtener sometiendo la muestra a diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, centrifugación y filtración. Aunque generalmente se prefiere que no se usen técnicas invasivas para obtener la muestra, aún puede ser preferible obtener muestras como homogeneizados de tejido, secciones de tejido y muestras de biopsia.

En algunas realizaciones de la tecnología, se proporciona un método para diagnosticar el HCC en un sujeto. Los términos “ diagnóstico” y “ diagnóstico” tal como se usan en la presente descripción se refieren a métodos mediante los cuales el experto en la materia puede estimar e incluso determinar si un sujeto sufre o no una determinada enfermedad o afección o puede desarrollar una determinada enfermedad o afección en el futuro. El experto en la materia a menudo realiza un diagnóstico basándose en uno o más indicadores de diagnóstico, como por ejemplo un biomarcador (por ejemplo, una DMR como se describe en la presente descripción), cuyo estado de metilación es indicativo de la presencia, gravedad o ausencia de la afección.

Junto con el diagnóstico, el pronóstico clínico del cáncer (p. ej., para HCC) se relaciona con la determinación de la agresividad del cáncer y la probabilidad de recurrencia del tumor para planificar la terapia más eficaz. Si se puede hacer un pronóstico más preciso o incluso se puede evaluar un riesgo potencial de desarrollar el cáncer, se puede elegir la terapia adecuada y, en algunos casos, una terapia menos agresiva para el paciente. La evaluación (p. ej., determinar el estado de metilación) de los biomarcadores del cáncer es útil para separar sujetos con buen pronóstico y/o bajo riesgo de desarrollar cáncer que no necesitarán terapia o una terapia limitada de aquellos con mayor probabilidad de desarrollar cáncer o sufrir una recurrencia del cáncer que podrían beneficiarse de tratamientos más intensivos.

Como tal, “ hacer un diagnóstico” o “ diagnosticar” , tal como se usa en la presente descripción, incluye además determinar un riesgo de desarrollar cáncer o determinar un pronóstico, lo que puede permitir predecir un resultado clínico (con o sin tratamiento médico), seleccionar un tratamiento adecuado (o si el tratamiento sería efectivo), o supervisar un tratamiento actual y posiblemente cambiar el tratamiento, en función de la medida de los biomarcadores de diagnóstico (p. ej., DMR) descritos en la presente descripción. Además, en algunas realizaciones de la materia descrita actualmente, pueden realizarse múltiples determinaciones de los biomarcadores a lo largo del tiempo para facilitar el diagnóstico y/o el pronóstico. Se puede usar un cambio temporal en el biomarcador para predecir un resultado clínico, monitorear la progresión del HCC y/o monitorear la eficacia de las terapias apropiadas dirigidas contra el cáncer. En una realización de este tipo, por ejemplo, se podría esperar ver un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores (p. ej., DMR) descritos en la presente descripción (y potencialmente uno o más biomarcadores adicionales, si se controlan) en una muestra biológica a lo largo del tiempo durante el curso de una terapia eficaz.

La materia descrita actualmente proporciona además en algunas realizaciones un método para determinar si iniciar o continuar la profilaxis o el tratamiento de HCC en un sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende proporcionar una serie de muestras biológicas durante un periodo de tiempo del sujeto; analizar la serie de muestras biológicas para determinar un estado de metilación de al menos un biomarcador descrito en la presente descripción en cada una de las muestras biológicas; y comparar cualquier cambio medible en los estados de metilación de uno o más de los biomarcadores en cada una de las muestras biológicas. Cualquier cambio en los estados de metilación de los biomarcadores durante el periodo de tiempo puede usarse para predecir el riesgo de desarrollar HCC, predecir el resultado clínico, determinar si debe iniciarse o continuar la profilaxis o la terapia del cáncer y si una terapia actual está tratando el HCC de manera eficaz. Por ejemplo, se puede seleccionar un primer punto de tiempo antes del inicio de un tratamiento y se puede seleccionar un segundo punto de tiempo en algún momento después del inicio del tratamiento. Los estados de metilación se pueden medir en cada una de las muestras tomadas de diferentes puntos de tiempo y se pueden observar las diferencias cualitativas y/o cuantitativas. Un cambio en los estados de metilación de los niveles de biomarcadores de las diferentes muestras puede correlacionarse con el riesgo (p. ej., riesgo de HCC), el pronóstico, la determinación de la eficacia del tratamiento, y/o la progresión del trastorno en el sujeto.

En realizaciones preferidas, los métodos y composiciones de la invención son para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades en una etapa temprana, por ejemplo, antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad. En algunas realizaciones, los métodos y composiciones de la invención son para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades en una etapa clínica.

Como se indica, en algunas realizaciones, se pueden realizar múltiples determinaciones de uno o más biomarcadores de diagnóstico o pronóstico, y se puede usar un cambio temporal en el marcador para determinar un diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, se puede determinar un marcador de diagnóstico en un momento inicial y de nuevo en un segundo momento. En dichas realizaciones, un aumento en el marcador desde el tiempo inicial hasta el segundo tiempo puede ser un diagnóstico de un tipo o gravedad particular del trastorno, o de un pronóstico dado. Asimismo, una disminución en el marcador desde el tiempo inicial hasta el segundo tiempo puede ser indicativo de un tipo o gravedad particular de un trastorno, o de un pronóstico dado. Además, el grado de cambio de uno o más marcadores puede relacionarse con la gravedad del trastorno y futuros acontecimientos adversos. El experto en la materia comprenderá que, si bien en ciertas realizaciones se pueden realizar mediciones comparativas del mismo biomarcador en múltiples puntos de tiempo, también se puede medir un biomarcador dado en un punto de tiempo y un segundo biomarcador en un segundo punto de tiempo, y una comparación de estos marcadores puede proporcionar información de diagnóstico.

Como se usa en la presente descripción, la expresión “ determinar el pronóstico” se refiere a métodos mediante los cuales el experto en la materia puede predecir el curso o el resultado de una afección en un sujeto. El término “ pronóstico” no se refiere a la capacidad de predecir el curso o el resultado de una afección con un 100 % de precisión, o incluso que un curso o resultado determinado sea previsiblemente más o menos probable en función del estado de metilación de un biomarcador (p. ej., una DMR). En su lugar, el experto en la materia entenderá que el término “ pronóstico” se refiere a una mayor probabilidad de que ocurra un cierto curso o resultado; es decir, que es más probable que ocurra un curso o resultado en un sujeto que muestra una afección dada, en comparación con aquellos individuos que no presentan la afección. Por ejemplo, en individuos que no presentan la afección (p. ej., que tienen un estado de metilación normal de una o más DMR), la posibilidad de un resultado dado puede ser muy baja.

En algunas realizaciones, un análisis estadístico asocia un indicador de pronóstico con una predisposición a un resultado adverso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un estado de metilación diferente al de una muestra de control normal obtenida de un paciente que no tiene un trastorno puede indicar que es más probable que un sujeto sufra un trastorno que los sujetos con un nivel que es más similar al estado de metilación en la muestra de control, como se determina por un nivel de significación estadística. Además, un cambio en el estado de metilación desde un nivel inicial (por ejemplo, “ normal” ) puede reflejar el pronóstico del sujeto, y el grado de cambio en el estado de metilación puede estar relacionado con la gravedad de los acontecimientos adversos. La significación estadística se determina frecuentemente comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor p (véase, p. ej., Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983). Los intervalos de confianza ilustrativos de la presente materia son 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % y 99,99 %, mientras que los valores p ilustrativos son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, y 0,0001.

En otras realizaciones, puede establecerse un grado umbral de cambio en el estado de metilación de un biomarcador de pronóstico o diagnóstico descrito en la presente descripción (p. ej., una DMR), puede establecerse, y el grado de cambio en el estado de metilación del biomarcador en una muestra biológica se compara simplemente con el grado umbral de cambio en el estado de metilación. Un cambio de umbral preferido en el estado de metilación para los biomarcadores proporcionados en la presente descripción es de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 100 % y aproximadamente el 150 %. En otras realizaciones más, se puede establecer un “ nomograma” , mediante el cual un estado de metilación de un indicador de pronóstico o diagnóstico (biomarcador o combinación de biomarcadores) está directamente relacionado con una disposición asociada hacia un resultado dado. El experto en la materia está familiarizado con el uso de dichos nomogramas para relacionar dos valores numéricos con el entendimiento de que la incertidumbre en esta medición es la misma que la incertidumbre en la concentración del marcador porque se hace referencia a mediciones de muestras individuales, no a promedios de población.

En algunas realizaciones, una muestra de control se analiza simultáneamente con la muestra biológica, de manera que los resultados obtenidos de la muestra biológica pueden compararse con los resultados obtenidos de la muestra de control. Además, se contempla que se puedan proporcionar curvas patrón con las que se puedan comparar los resultados del ensayo para la muestra biológica. Estas curvas patrón presentan los estados de metilación de un biomarcador en función de las unidades de ensayo, por ejemplo, la intensidad de la señal fluorescente, si se utiliza un marcador fluorescente. Usando muestras tomadas de múltiples donantes, pueden proporcionarse curvas estándar para estados de metilación de control del uno o más biomarcadores en tejido normal, así como para los niveles “ en riesgo” del uno o más biomarcadores en tejido tomado de donantes con metaplasia o de donantes con un trastorno (p. Ej., HCC) En ciertas realizaciones del método, se identifica que un sujeto tiene HCC al identificar un estado de metilación aberrante de una o más DMR proporcionadas en la presente descripción en una muestra biológica obtenida del sujeto. En otras realizaciones del método, la detección de un estado de metilación aberrante de uno o más de tales biomarcadores en una muestra biológica obtenida del sujeto da como resultado que se identifique que el sujeto tiene HCC.

El análisis de marcadores se puede realizar por separado o simultáneamente con marcadores adicionales dentro de una muestra de prueba. Por ejemplo, se pueden combinar varios marcadores en una prueba para el procesamiento eficiente de múltiples muestras y para proporcionar potencialmente una mayor precisión de diagnóstico y/o pronóstico. Además, un experto en la técnica reconocería el valor de probar múltiples muestras (por ejemplo, en puntos de tiempo sucesivos) del mismo sujeto. Dicha prueba de muestras en serie puede permitir la identificación de cambios en los estados de mutilación del marcador a lo largo del tiempo. Los cambios en el estado de metilación, así como la ausencia de cambios en el estado de metilación, pueden brindar información útil sobre el estado de la enfermedad que incluye, entre otros, identificar el tiempo aproximado desde el inicio del evento, la presencia y la cantidad de tejido salvable, la idoneidad de las terapias farmacológicas, la eficacia de varias terapias y la identificación del resultado del sujeto, incluido el riesgo de eventos futuros.

El análisis de biomarcadores se puede llevar a cabo en una variedad de formatos físicos. Por ejemplo, se puede utilizar el uso de placas de microtitulación o la automatización para facilitar el procesamiento de un gran número de muestras de prueba. Como alternativa, se podrían desarrollar formatos de muestra única para facilitar el tratamiento y diagnóstico inmediatos de manera oportuna, por ejemplo, en transporte ambulatorio o salas de urgencias.

En algunas realizaciones, se diagnostica que el sujeto tiene un HCC si, en comparación con un estado de metilación de control, existe una diferencia medible en el estado de metilación de al menos un biomarcador en la muestra. Por el contrario, cuando no se identifica ningún cambio en el estado de metilación en la muestra biológica, puede identificarse que el sujeto no tiene HCC, que no tiene riesgo de HCC o que tiene un riesgo bajo de HCC. A este respecto, los sujetos que tienen HCC o riesgo del mismo pueden diferenciarse de sujetos que tienen riesgo bajo o sustancialmente nulo de HCC o tienen riesgo del mismo. Aquellos sujetos que tienen un riesgo de desarrollar HCC pueden colocarse en un programa de detección más intensivo y/o regular.

Como se mencionó anteriormente, dependiendo de la realización del método de la presente tecnología, detectar un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores puede ser una determinación cualitativa o puede ser una determinación cuantitativa. Como tal, la etapa de diagnosticar que un sujeto tiene, o corre el riesgo de desarrollar, HCC indica que se realizan ciertas mediciones de umbral, p. ej., el estado de metilación del uno o más biomarcadores en la muestra biológica varía con respecto a un estado de metilación de control predeterminado. En algunas realizaciones del método, el estado de metilación de control es cualquier estado de metilación detectable del biomarcador. En otras realizaciones del método en las que se analiza una muestra de control simultáneamente con la muestra biológica, el estado de metilación predeterminado es el estado de metilación en la muestra de control. En otras realizaciones del método, el estado de metilación predeterminado se basa y/o se identifica mediante una curva patrón. En otras realizaciones del método, el estado de metilación predeterminado es un estado o rango de estado específico. Como tal, se puede elegir el estado de metilación predeterminado, dentro de límites aceptables que serán evidentes para los expertos en la técnica, basándose en parte en la realización del método que se practica y la especificidad deseada, etc.

Además, con respecto a los métodos de diagnóstico, un sujeto preferido es un sujeto vertebrado. Un vertebrado preferido es uno de sangre caliente; un vertebrado de sangre caliente preferido es un mamífero. Un mamífero preferido es más preferiblemente un ser humano. Como se usa en la presente descripción, el término “ sujeto” incluye tanto sujetos humanos como animales. Por lo tanto, en la presente descripción se proporcionan usos terapéuticos veterinarios. Como tal, la presente tecnología permite el diagnóstico de mamíferos como los humanos, así como de aquellos mamíferos de importancia por estar en peligro de extinción, como los tigres siberianos; de importancia económica, como animales criados en granjas para el consumo humano; y/o animales de importancia social para los seres humanos, como animales que se mantienen como mascotas o en zoológicos. Algunos ejemplos de dichos animales incluyen, pero no se limitan a: carnívoros tales como gatos y perros; cerdos, incluidos cerdos y jabalíes; rumiantes y/o ungulados, tales como vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos; y caballos. Por lo tanto, también se proporciona el diagnóstico y tratamiento de ganado, incluidos, entre otros, cerdos domesticados, rumiantes, ungulados, caballos (incluidos caballos de carreras) y similares. La materia de la presente invención incluye además un sistema para diagnosticar HCC en un sujeto. El sistema puede proporcionarse, por ejemplo, como un kit comercial que puede usarse para detectar un riesgo de tal trastorno en un sujeto del que se ha recogido una muestra biológica. Un sistema ilustrativo proporcionado según la presente tecnología incluye evaluar el estado de metilación de una DMR, como se proporciona en las Tablas 1 y/o 4.

Ejemplos

Ejemplo I.

Este ejemplo describe la identificación de 311 regiones diferencialmente metiladas (DMR) para discriminar muestras de ADN de HCC del ADN derivado de controles normales (p. ej., individuos sin HCC con o sin cirrosis hepática).

Los experimentos se condujeron en cuatro fases.

Primero, el descubrimiento del marcador de metilación del ADN se realizó usando RRBS en ADN extraído de tejidos tumorales de HCC congelados (con y sin cirrosis) y de tejidos hepáticos normales congelados (con y sin cirrosis) y muestras de capa leucocitaria de voluntarios sanos. Las regiones metiladas diferencialmente (DMR) discriminantes se identificaron mediante criterios estrictos de filtración y volvieron a analizarse en muestras iguales o dilatadas para asegurar la reproducibilidad de los resultados usando un ensayo de PCR cuantitativa específico de metilación en tiempo real (qMSP) (validación técnica).

En segundo lugar, se seleccionaron marcadores candidatos mediante criterios de clasificación adicional para la validación biológica mediante ensayos de qMSP ciegos en ADN extraído de tejidos de control y casos de archivo independientes.

En tercer lugar, los resultados de secuenciación para los marcadores candidatos se compararon a través de un conjunto de secuenciación RRBS pan-GI para determinar el nivel de especificidad de metilación.

En cuarto lugar, se aplicó un modelo de decisión separado para seleccionar un pequeño conjunto de marcadores de HCC que se comportarían mejor en un entorno a base de sangre donde la mayoría del ADN es de origen no hepático. Los marcadores seleccionados se probaron después en muestras de plasma independientes ciegas para evaluar la detección de HCC en un medio clínico.

La figura 1 resume estas cuatro fases.

Resultados

Se realizó una secuenciación imparcial de metiloma completa en ADN extraído de 18 tejidos de HCC y 35 de control (9 cirrosis, 26 hígado normal). A través de la validación del tejido, las mejores DMR se confirmaron en ADN extraído de tejidos independientes de 75 HCC y 29 controles (16 cirrosis, 13 hígado normal) usando PCR específica de metilación. Se realizaron ensayos cuantitativos ciegos de amplificación de señales y dianas en tiempo real específicos de alelos dirigidos a las DMR superiores en ADN plasmático de conjuntos de pacientes independientes que comprendían 21 casos de HCC (9 BCLC [estadificación del cáncer de hígado en Barcelona] etapa A, 6 etapa B, 6 etapa C) y 33 controles cirróticos. Se usó el análisis de decisión de partición recursiva para identificar las mejores combinaciones de DMR. La secuenciación inicial identificó 311 DMR con ABC superiores a 0,75. Después de la validación biológica, las 12 DMR superiores (ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, EFNB2, HOXA1, LRRC4, SPINT2, TSPYL5, CCNJ_3707, CCNJ_3124, PFKP, SCRN1, y ECE1) se seleccionaron para llevar adelante a prueba de plasma. El marcador más discriminante en plasma, EMX1, solo tuvo un ABC de 0,89. Una combinación complementaria de 3 marcadores (EMX1, LRRC4 y BDH1) identificó 20/21 HCC y 32/33 controles en plasma; 1 HCC tuvo niveles bajos de BDH1 y 1 control tuvo LRRC4 elevado. El panel fue sensible al 95 % (IC del 95 %, 74 %-100 %) para HCC a una especificidad del 97 % (IC del 95 %, 82 %-100 %) y alcanzó un ABC de 0,98 (véase, la Figura 2). Área bajo la información de la curva característica operativa del receptor para ACP1, Chr12.133, CLEC11A, DAB2IP, DBNL, EMX1, HOXA1, LRRC4, SPINT2, y TSPYL5 de la fase de validación del tejido biológico se proporciona en la Figura 3A-I.

La Figura 4A-CC proporciona representaciones de cajas (escala logarítmica) de 27 marcadores de cáncer gástrico (29 con análisis de punto de ajuste añadidos) a partir de datos biológicos de validación del tejido. Las muestras se disponen con hígado normal en la parte izquierda, seguido de HCC c/s cirrosis, HCC c/cirrosis, y controles de cirrosis (inflamatoria). El eje vertical es metilación fraccional (normalizada a hebras de p-actina).

La Figura 5 muestra el rendimiento de 27 marcadores de cáncer de HCC en 75 muestras de tejido de HCC y 29 controles (16 cirrosis, 13 hígado normal) en un formato de matriz con un 95 % de especificidad normal. Los marcadores se enumeran verticalmente y las muestras horizontalmente. Las muestras se disponen con hígado normal (NI) en el extremo izquierdo, seguido de HCC c/s cirrosis (HN), HCC c/cirrosis (HC), y controles de cirrosis (In). Los aciertos positivos están en gris claro y las fallas en gris oscuro. Este gráfico permite evaluar los marcadores de forma complementaria. Nota: 2 marcadores, TBX15 y EGR2, se analizaron una segunda vez usando un método de puntos de ajuste en los datos de qMSP y se incluyen en esta descripción.

La Tabla 1 proporciona información para las DMR que distinguen el HCC de los controles normales.

La Tabla 2 proporciona información del cebador para las DMR seleccionadas para de la Tabla 1.

La Tabla 3 proporciona información sobre el ABC y el cambio de veces para DMR específicas en la comparación entre HCC frente al hígado normal, en donde el cambio de veces es la proporción de la metilación fraccionaria de los casos y la metilación fraccionaria de los controles.

Tabla 1.

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Tabla 2.

Tabla 3.

Tales experimentos dieron como resultado adicionalmente la identificación de 89 DMR epiteliales hepáticas que están metiladas en el hígado (cáncer y normal) pero no en muestras normales de ADN de leucocitos normales.

La Tabla 4 proporciona información para las DMR epiteliales hepáticas que están metiladas en hígado (cáncer y normal), pero no en muestras normales de ADN de leucocitos normales.

Tabla 4.

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Sujetos y muestras del estudio

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Mayo Clínica (IRB, Rochester, MN). Los biobancos de pacientes aprobados por la IRB proporcionaron muestras de tejido fresco congelado (FF, por sus siglas en inglés), plasma, y capa leucocitaria. Las secciones de tejido tumoral fueron revisadas nuevamente por un patólogo GI experto para confirmar el diagnóstico y estimar la celularidad neoplásica. A continuación, las secciones se macrodisecaron. El ADN genómico se purificó usando el kit QiaAmp Mini (Qiagen, Valencia CA) y posteriormente se volvió a purificar con el kit AMPure XP (Beckman Coulter, Brea CA).

Preparación de bibliotecas de secuenciación de bisulfito de representación reducida

Las bibliotecas de secuenciación se prepararon usando una versión modificada de un método publicado previamente. El ADN genómico (300 ng) se digirió durante la noche con 10 U de MspI. Todas las enzimas usadas para esta y las etapas posteriores fueron proporcionadas por New England Biolabs (NEB) salvo que se indique lo contrario. Los fragmentos se repararon en los extremos y colas en A con 5 U del fragmento Klenow (3'-5' exo-), y se ligaron durante la noche a adaptadores TruSeq (Illumina) que contenían secuencias de código de barras y citosinas químicamente metiladas. Se usó qPCR SYBR Green (LightCycler 480-Roche) para medir la eficiencia de la ligación y la calidad del fragmento. Las muestras se trataron con bisulfito y se purificaron (dos veces) usando un protocolo EpiTect modificado (Qiagen) y después se sometieron a una limpieza final con AMPure XP. Se usó qPCR para determinar los ciclos de PCR óptimos para el enriquecimiento de la biblioteca. Las siguientes condiciones se usaron para la PCR de enriquecimiento: Cada reacción de 50 ul contuvo 5 ul de tampón 10X, 1,25 ul de cada trifosfato de desoxirribonucleótidos (dNTP) de 10 mM, cóctel de cebadores de 5 ul (~5 uM), muestra de 15 ul, inicio con calor de 1 ul de PfuTurbo Cx y 22,75 μl de agua; temperaturas y tiempos fueron 95C-5 min; 98 C-30 s; 12 a 16 ciclos de 98C-10 s, 65C-30 s, 72C-30 s, 72C-5 min y 4C de retención, respectivamente. Las muestras se cuantificaron mediante el ensayo PicoGreen (Molecular Probes), se combinaron en bibliotecas aleatorizadas 4-plex, y se analizaron con el Bioanalizador 2100 (Agilent) para la verificación del tamaño. Se realizaron rondas adicionales de selección de tamaño/purificación con AMPure XP a concentraciones de tampón determinadas empíricamente para minimizar la contaminación del dímero del adaptador y eliminar insertos mayores de 350 bp. Se realizó una evaluación final de la biblioteca mediante qPCR usando estándares de control phiX (Illumina) y cebadores específicos del adaptador.

Secuenciación masivamente paralela y bioinformática

Las muestras se cargaron en celdas de flujo según una asignación aleatoria de carriles con carriles adicionales reservados para controles de ensayo internos. La secuenciación se realizó por el Next Generation Sequencing Core en el Medical Genome Facility de la Clínica Mayo en un instrumento Illumina HiSeq 2000. Las lecturas fueron unidireccionales durante 101 ciclos. Cada carril de celda de flujo generó 100-120 millones de lecturas, suficiente para una mediana de cobertura de 30 a 50 veces la profundidad de secuenciación para secuencias alineadas. El software estándar de las tuberías Illumina se denomina bases y generó lecturas en el formato fastq. Se usó SAAP-RRBS (análisis simplificado y conducto de anotaciones para la secuenciación con bisulfito de representación reducida) para la evaluación de la lectura de secuencia y la limpieza, la alineación con el genoma de referencia, la extracción del estado de metilación, y la generación de informes y anotaciones de CpG. Se excluyeron los CpG con baja cobertura (≤ 10). El análisis terciario consistió en eliminar los CpG no informativos o de baja cobertura de muestra, e identificar regiones CpG metiladas con bajo fondo y grupos densos dentro de las ventanas deslizantes 100 pb. Los criterios de lectura-profundidad se basaron en la potencia estadística deseada para detectar una diferencia del 10 % en la metilación entre casos y controles. La significación estadística se determinó mediante regresión logística del porcentaje de metilación por DMR, basado en recuentos de lectura. Para tener en cuenta las diferentes profundidades de lectura entre sujetos individuales, se utilizó un modelo de regresión logística sobredisperso, donde el parámetro de dispersión se estimó utilizando la estadística de x-cuadrado de Pearson de los residuos del modelo ajustado. Las DMR, clasificadas según su nivel de significación, se consideraron además si %-metilación en grupos de control fue ≤1 % y >10 % en cánceres. En la mayoría de los sitios de órganos, esto dio como resultado cientos de potenciales candidatos. Los filtros adicionales utilizados fueron el área bajo la curva característica operativa del receptor, las proporciones de % de metilación de señal a fondo (cambio de veces), y muestra positiva para muestrear la cometilación de las CpG a lo largo de la DMR (y la falta de la misma en los controles).

Validación técnica y biológica de tejidos

Los ensayos de marcadores de PCR específicos de mutilación (MSP) se desarrollaron para 30 de las DMR más prometedoras del conjunto de datos de descubrimiento de hígado, según lo determinado por los criterios enumerados anteriormente. Los cebadores se diseñaron por software (Methprimer - University of California, San Francisco CA; MSP Primer-Johns Hopkins, Baltimore, MD) o a mano. Los ensayos se probaron rigurosamente y se optimizaron mediante qPCR de SYBR Green en el bisulfito convertido (ADN genómico metilado y no metilado), controles no convertidos y sin molde. Los ensayos que reaccionaron de forma cruzada con controles negativos se rediseñaron o descartaron. Además, se realizó un análisis de la curva de fusión para garantizar que se estaba produciendo una amplificación específica. Para la fase de validación técnica, las mismas muestras usadas para el descubrimiento de RRBS se volvieron a analizarse con qMSP. Se usó un ensayo de p-actina diseñado para ser ciego a la metilación como un denominador que representa copias totales de ADN. Los datos se analizaron mediante regresión logística y el ABC y la señal a resultados de fondo en comparación con los valores de descubrimiento. Se eliminó ligeramente menos de la mitad de los marcadores. El resto (N=16) se probó mediante qMSP en un conjunto expandido de 104 muestras de tejido independientes. Además, los experimentos incluyeron 11 marcadores de cáncer de metilación que se identificaron y validaron en estudios de secuenciación anteriores sobre otros cánceres GI (colon, esófago, páncreas, conducto biliar) y que son potentes marcadores de cáncer de múltiples órganos. Las métricas de resultado el ABC y la proporción de veces de cambio (Tabla 3). Las representaciones de caja y una matriz de complementariedad para los marcadores ensayados se representan en las Figuras 4 y 5, respectivamente.

A través de la validación de órganos

Para evaluar cómo se realizaron los mejores marcadores de metilación fuera del hígado, los experimentos construyeron una matriz de % de metilación del CpG comparativa usando las lecturas de secuenciación para las DMR de validación a través de las muestras de HCC y otros cánceres GI principales que se secuenciaron antes-colon, pancreático, esofágico, y estómago. Se eligió un panel final de marcadores para probar en plasma basado en 1) rendimiento general en la fase de validación de tejido biológico y 2) las características específicas del sitio de los marcadores en otros cánceres. Para detectar mejor el HCC en sangre, dado el exceso de ADN no de HCC, se eligió un panel de 12 marcadores robusto que exhibiría señales específicas de cáncer tanto universales como hepáticas. 10 de los marcadores fueron de la validación del tejido; 2 marcadores adicionales que demostraron especificidad extraordinaria del sitio del hígado, EFNB2 y BDH1, se diseñaron directamente y se utilizaron a partir de los datos de RRBS sin la validación posterior del tejido.

Validación plasmática

El ADN plasmático se extrajo desde fracciones de 2 ml mediante un método automatizado de glóbulos de sílice desarrollado en Exact Sciences.

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Después el ADN se convirtió en bisulfito y se purificó, usando el método patentado descrito a continuación.

Las muestras se realizaron en un instrumento de PCR en tiempo real (Roche LC480) en el formato QuARTs (véase la patente US-8.361.720) usando cebadores y sondas desarrolladas a partir de la secuencia DMR (véase, Tabla 2), ADN polimerasa de GoTaq (Promega), Cleavasa II (Hologic) y casetes indicadores de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (los FRET, por sus siglas en inglés) que contienen colorantes FAM, HEX y Quasar 670 (Biosearch Technologies).

Los plásmidos que contienen la secuencia marcadora de interés se obtuvieron de Genscript y se diluyeron en reactivos QuARTs IX hasta una concentración nominal de 1 copia por reacción de 15 ul. La mezcla de reacción se distribuyó a cada uno de los 384 pocillos, se sometió a ciclos durante 45 ciclos en un LightCycler, y se recogieron los datos. Se indicó que los pocillos contenían o no contenían la muestra. La variable aleatoria de Poisson se estableció en 1 y la velocidad promedio de los valores de éxito se ingresó por ensayo y error y se usó para calcular la probabilidad acumulativa para ese valor. Cuando la probabilidad acumulativa es igual al porcentaje de pocillos con señal, se ha encontrado la velocidad promedio correcta de éxito, en este caso el número de copias. Estos plásmidos se diluyeron y usaron como patrones de ensayo.

QuARTs-X (véase, la patente provisional de Estados Unidos no. 62/249.997) se realiza creando primero una placa de preamplificación de muestras realizadas con cebadores para hasta 12 objetivos que se someten a 11 ciclos de amplificación. A continuación, este producto se diluye 1:9 y se usa como plantilla para reacciones de QuART posteriores que contienen solo tres dianas en una reacción triple. Los estándares usados para calcular los recuentos de cadenas no pasan por la preamplificación. Al amplificar previamente las muestras, pero no los estándares, se aumenta la sensibilidad de los ensayos.

Los resultados se analizaron mediante partición regresiva (rPart). El uso de la regresión logística para combinar múltiples marcadores de metilación en una puntuación de riesgo única es una técnica estándar. Sin embargo, es difícil descubrir y/o modelar interacciones de alto orden entre marcadores dentro del modelo logístico. Esto limita las capacidades de predicción de nuestro panel de marcadores cuando existen tales efectos. Los árboles de partición de regresión (rPart) son un enfoque del árbol de decisión que es capaz de descubrir interacciones de alto orden entre los marcadores de tal manera que maximicen la precisión predictiva de un panel de marcadores. Con rPart, la sensibilidad y especificidad de las muestras de sangre de HCC para la combinación de 3 marcadores superiores (EMX1, BDH1, LRRC4) fue 97 % y 95 %, respectivamente. (Figura 7A) Se modelaron tres combinaciones de marcadores alternativas:

Alternativa n.° 1 (EMX1, DAB2IP, TSPYL5): Especificidad = 100 % de sensibilización = 90 % (Figura 7B)

Alternativa n.° 2 (EMX1, HOXA1, ACPI): Especificidad = 88 % de sensibilización = 100 % (Figura 7C)

Alternativa n.° 3 (EMX1, EFNB2, SPINT2): Especificidad = 100 % de sensibilización = 90 % (Figura 7D)

El mejor marcador único en plasma, EMX1, tuvo un ABC de 0,89 con un 77 % de sensibilidad al 100 % de especificidad. Las señales para EMX1 mostraron una señal normalizada de beta actina más alta con una etapa creciente. (Figura 8).

Ejemplo II.

Las muestras de tejido (75 HCC, 20 cirrosis, y 30 normales) se realizaron en un instrumento de PCR en tiempo real (Roche LC480) en el formato QuARTs (véase la patente US-8.361.720) usando cebadores y sondas desarrolladas a partir de la secuencia DMR (véase, Tabla 5), ADN polimerasa de GoTaq (Promega), Cleavasa 2.0 (Hologic) y casetes indicadores de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (los FRET, por sus siglas en inglés) que contienen colorantes FAM, HEX y Quasar 670 (Biosearch Technologies). La Tabla 6 muestra la capacidad de cada marcador para discriminar HCC de cirrosis y normal a 100 % de sensibilidad.

Tabla 5.

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Tabla 6.

Ejemplo III.

Un objetivo principal de esto fue determinar un panel de marcadores que son predictivos de carcinoma hepatocelular (HCC). El plasma de 244 sujetos (95 carcinoma hepatocelular y 149 controles) se ajustó a 2 ml y se extrajo. Los 149 controles consistieron en 51 pacientes cirróticos y 98 normales.

La figura 9 representa la importancia relativa de cada uno de los marcadores de metilación considerados en este análisis. La estimación validada cruzada de sensibilidad y especificidad para todo el panel de marcadores fue del 75 % y el 96 %, respectivamente.

En el 88,6 % de especificidad de los controles frente a la normal, el siguiente panel marcador (Chr12.133, CLEC11A, EMX1, HOXA1, CCNJ_3707) dio como resultado una sensibilidad del 85,3 % para HCC (Tabla 7). Tabla 7.

El mismo panel (Chr12.133, CLEC11A, EMX1, HOXA1, CCNJ_3707) dio como resultado la siguiente descomposición de especificidades para pacientes normales y cirróticos (grupo de control) (Tabla 8).

Tabla 8.

Un procedimiento ilustrativo para aislar el ADN de una muestra de 4 ml de plasma se conduciría de la siguiente manera:

• A una muestra de 2 ml de plasma, se añaden 300 μl de proteinasa K (20 mg/ml) y se mezclan. Cuando las muestras son menos de 2 ml de plasma, se ajustan a 2 ml añadiendo Tris-HCl 10 mM, solución de EDTA 0,1 mM • Añadir 6 ml de tampón de lisis de plasma 1 al plasma y mezclar a temperatura ambiente de tampón de lisis de plasma es:

- tiocianato de guanidina 4,3 M

- IGEPAL CA-630 al 10 % (octilfenoxi poli(etilenoxi) etanol, ramificado) (5,3 g de IGEPAL CA-630 combinado con 45 ml de tiocianato de guanidina 4,8 M)

• Añadir 200 μl de glóbulos de unión de sílice magnética [16 μg de glóbulos/μl] y mezclar de nuevo.

• Añadir 7 ml de tampón de lisis 2 a tubos.

El tampón de lisis de plasma 2 se prepara mezclando una proporción de 60 % de tampón de lisis 1 con isopropanol al 40 %.

Mezclar las muestras con tampón de lisis 2 durante 60 minutos

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante.

Añadir 1000 μl de tampón de lavado (Tris HCl 10 mM, EtOH al 80 %) a los glóbulos, e incubar a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante.

Añadir 500 μl de tampón de lavado a los glóbulos e incubar a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Añadir 250 μl de tampón de lavado e incubar a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el tampón restante.

Secar los glóbulos a 70 °C durante 15 minutos, con agitación.

Añadir 125 μl de tampón de elución (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) a los glóbulos e incubar a 65 °C durante 25 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen durante 10 minutos.

Aspirar y transferir el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo recipiente o tubo.

Conversión de bisulfito

I. Sulfonación de ADN usando sulfito de hidrógeno de amonio

1. En cada tubo, combinar 64 μl de ADN, 7 μl de NaOH 1 N y 9 μl de solución portadora que contiene 0,2 mg/ml de BSA y 0,25 mg/ml de ADN de pescado.

2. Incubar a 42 °C durante 20 minutos.

3. Añadir 120 μl de sulfito de hidrógeno de amonio al 45 % e incubar a 66 °C durante 75 minutos.

4. Incubar a 4 °C durante 10 minutos.

II Desulfonación usando glóbulos magnéticos

Materiales

Glóbulos magnéticos (partículas paramagnéticas de Promega MagneSil, número de catálogo Promega AS1050, 16 μg/μl). Tampón de unión: 6,5-7 M de clorhidrato de guanidina.

Tampón de lavado después de conversión: Etanol al 80 % con Tris HCl 10 mM (pH 8,0).

Tampón de desulfonación; Se seleccionó alcohol isopropílico al 70 %, NaOH 0,1 N para el tampón de desulfonación. Las muestras se mezclan usando cualquier dispositivo o tecnología apropiado para mezclar o incubar muestras a las temperaturas y velocidades de mezcla esencialmente como se describe a continuación. Por ejemplo, puede usarse un Thermomixer (Eppendorf) para la mezcla o incubación de muestras. Una desulfonación ilustrativa es la siguiente: 1. Mezclar bien la reserva de glóbulos agitando la botella durante 1 minuto.

2. Alícuota de 50 |jl de glóbulos en un tubo de 2,0 ml (p. ej., de USA Scientific).

3. Añadir 750 j l de tampón de unión a los glóbulos.

4. Añadir 150 j l de ADN sulfonado de la etapa I.

5. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 30 minutos).

6. Colocar el tubo en el soporte del imán y dejarlo en el lugar durante 5 minutos. Con los tubos en el soporte, retirar y desechar el sobrenadante.

7. Añadir 1000 j l de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

8. Colocar el tubo en el soporte del imán y dejarlo en el lugar durante 5 minutos. Con los tubos en el soporte, retirar y desechar el sobrenadante.

9. Añadir 250 j l de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

10. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

11. Añadir 200 j l de tampón de desulfonación. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 5 minutos).

12. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

13. Añadir 250 j l de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

14. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

15. Añadir 250 j l de tampón de lavado al tubo. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

16. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

17. Incubar todos los tubos a 30 °C con la tapa abierta durante 15 minutos.

18. Retirar el tubo del soporte magnético y añadir 70 j l de tampón de elución directamente a los glóbulos.

19. Incubar los glóbulos con tampón de elución (p. ej., 1000 RPM a 40 °C durante 45 minutos).

20. Colocar los tubos en el soporte magnético durante aproximadamente un minuto; eliminar y guardar el sobrenadante. El ADN convertido se usa después en ensayos de preamplificación y/o endonucleasa de solapa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para caracterizar una muestra biológica que comprende:

medir un nivel de metilación de un sitio CpG para el gen HOXA1 y uno o más genes seleccionados de EMX1, DAB2IP, TSPYL5, ACP1, BDH1, Chr12.133, CLEC11A, DBNL, EFNB2, LRRC4, SPINT2, CCNJ_3707, CCNJ_3124, PFKP, SCRN1, y ECE1 en una muestra biológica de un individuo humano a través del tratamiento del ADN genómico en la muestra biológica con bisulfito; amplificar el ADN genómico tratado con bisulfito usando un conjunto de iniciadores para los genes; y

determinar el nivel de metilación del sitio CpG mediante PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa, análisis de enzimas de restricción de ADN sensible a la metilación, pirosecuenciación con bisulfito cuantitativa, o PCR de secuenciación genómica de bisulfito, y comparar el nivel de metilación con un nivel de metilación de un conjunto correspondiente de genes en muestras de control sin HCC; y determinar que el individuo tiene HCC cuando el nivel de metilación medido en los genes es mayor que el nivel de metilación medido en las respectivas muestras de control.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el siguiente conjunto de iniciadores para los genes se usa si la muestra biológica es un tejido una muestra de plasma:

para EMX1, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 16 y 17 o Id. de sec. n.°: 91 y 92, para DAB2IP, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 4 y 5 o Id. de sec. n.°: 46 y 47, para TSPYL5, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 1 y 2 o Id. de sec. n.°: 43 y 44, para HOXA1, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 28 y 29 o Id. de sec. n.°: 88 y 89, para ACP1, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 10 y 11 o Id. de sec. n.°: 58 y 59, para BDH1, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 13 y 14 o Id. de sec. n.°: 61 y 62, para Chr12.133, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 25 y 26 o Id. de sec. n.°: 49 y 50, para CLEC11A, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 7 y 8 o Id. de sec. n.°: 52 y 53, para DBNL, un conjunto de iniciadores que consisten en las Id. de sec. n.°: 34 y 35 o Id. de sec. n.°: 82 y 83, para EFNB2, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 37 y 38 o Id. de sec. n.°: 64 y 65, para LRRC4, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 40 y 41 o Id. de sec. n.°: 85 y 86, para SPINT2, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 31 y 32 o Id. de sec. n.°: 55 y 56, para CCNJ_3707, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 67 y 68,

para CCNJ_3124, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 70 y 71,

para PFKP, un conjunto de iniciadores que consisten en las Id. de sec. n.°: 73 y 74,

para SCRN1, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 76 y 77, y

para ECE1, un conjunto de iniciadores que consiste en las Id. de sec. n.°: 79 y 80.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es una muestra de plasma o una muestra de tejido.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho sitio CpG está presente en una región codificante o una región reguladora.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha medición del nivel de metilación de un sitio CpG para dos o más genes comprende una determinación seleccionada del grupo que consiste en determinar la puntuación de metilación de dicho sitio CpG y determinar la frecuencia de metilación de dicho sitio CpG.

6. El método según la reivindicación 2, en donde la muestra biológica es una muestra de plasma

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho sitio CpG está presente en una región codificante o una región reguladora.

8. El método de la reivindicación 6, en donde dicha medición del nivel de metilación de un sitio CpG para los genes comprende una determinación seleccionada del grupo que consiste en determinar la puntuación de metilación de dicho sitio CpG y determinar la frecuencia de metilación de dicho sitio CpG.