CN112011619A

CN112011619A - Sfrp2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒

Info

Publication number: CN112011619A
Application number: CN202010978609.1A
Authority: CN
Inventors: 王凯; 向琳
Original assignee: Shenzhen Research Institute Of Shandong University
Current assignee: Shenzhen Research Institute Of Shandong University
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2020-12-01

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒。通过检测生物标志物SFRP2的甲基化程度，可以在早期判断受试者是否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌，及早进行有效的治疗手段，减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率，提供更加及时的临床策略。

Description

SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒。

背景技术

肝细胞癌是最常见的原发性肝癌，也是全球癌症死亡的第三大主要原因。在中国，慢性乙型肝炎病毒感染诱发的肝癌更为普遍。乙肝病毒感染及癌基因激活均在肝癌的发生和发展中发挥着重要作用。

表观遗传修饰是癌基因致癌作用中的重要事件之一，其中包括异常的DNA 甲基化。DNA甲基化是指基因表达的可遗传变化，但是DNA序列没有发生改变。 DNA甲基化已在多种肿瘤中广泛研究，例如胃癌和肺癌。多项研究表明，某些基因的DNA甲基化可以用作诊断的生物标记。

分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)是SFRP家族成员之一,其三维结构中存在一个富含半胱氨酸的结构域，与Wnt配体高度同源，是肿瘤发生相关通路—Wnt 信号通路的拮抗因子。SFRP2基因中存在高密度的CpG岛，研究表明，其异常甲基化与多种恶性肿瘤发生密切相关，例如结直肠癌，胃癌，食管腺癌等。

目前，SFRP2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的甲基化状态及其临床应用前景尚缺少定量研究，因此，确定SFRP2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的价值具有重要意义。

发明内容

本发明提供了SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒，通过检测样本中生物标志物SFRP2的甲基化程度，可以在早期判断受试者是否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌，及早进行有效的治疗手段，减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率，提供更加及时的临床策略，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案之一是：

检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产品中的应用，所述生物标志物为SFRP2。

进一步的，所述SFRP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

TGCAGCCGGCGCGCGGAGCGCGGGGGCCGCCAGCCACTTCCGGGCGTGCGGCAGCG CGGGGCTCAAACCAGCCAGACCAGCTTCGGGCTCCTTGAACTCCCAACAAGGGGCTC TGCGGGGAGGAGGCGACCCCAGCGGAGGGCGTTGGGGATTTAGGGGTTGGCCGGGG CCGGCGGGGGGTTGGGGGGGCGTGAAAGCGAGAGGGCCCTTATCCCACTCCCAGGCC CAAGTCGTAGCATCTCTCAGAGCTCACGCTCTTTATTAGCTCTTTCTTTTGGTGTGCTT CTGTTTCCTTTGTGGTTTCATTGCAAAGTAGTTTATGTTGGGAAGGGGGCTTTTAGGC CTCTTGGTGCTTTCGTTAGAGACGAAAAGGCCCTGAACCAATTTGGGGAAAGAGAGG CCTTTTGCAGCTACCCCGGGCCCTTCCCCAGCAGAGCACCCGGAAGCTGGGCTCTTAG GGACGCAGATTCTTGGAGTTCAGAATGTGCATTCTCTCCAGATGACGATTTTCCTGGCGTGTTTACGGTCAGCAGATAACACTGAGTGGGCTTTTGCCACCCATTCATTCATTACC CGGCTCCTCTAAGCAGCTGGACCGCAAAGTGTGCCTGATAACTTGGGCCTGGGAGCC GCCAAGGCCAACGCATCTTCCGGAAGGAGGGAAATTAGGAAGCCGGGGTCTGAGCC TGTGAATGACTCTTAAGTGGTCGGGAAGTAATAACAATGCGCCCACCTTACATATGA AAGAACTTCGCCCTCCGGGGATTATCTCTTTGGATCTTCACAGCCACCCGGAGACAGC GGCTGAGGAGAGCGAAGGCCTCCTGTCCCCATAGGGAGACTAGGGACAATTAGGCA AAAGGAGCCCACCCCCCAACCCAGAACTTACTGTTTGCAGTCAGAGACACTAGATCC CAGGCTCCACGAGAGCAGAGGCCGGCCTGTTTGTTCATTTCTGCACATCCAGCGCCCA GCATGGTGCCCCCTGGTACGTAGGGGATGAATGAGCTAATTCTAGCCCTCGTGGATCT CTAGGCAGGACTCCTTCCTCTACCTCGCTCCCTCCCAGCCTGCCCATCTTTTGTGCCCG TCTTTTGTGCCGGCCACCAGTCTTTACAAACAGTGCCCTGGGGGCCCATACTCCAGCT TTCCAGAGCGCACAGCTGCAAGGGCGGCTGTGTGTTAGAGCCCGTGATGCCTTCGAG TATTGAGTCATGCCATTCATTTAAGAAGGAAAAATCTCTCCAAAACGGGGAAATGGT GGGCAGTCCTGTGTGACTGGTGAGACTCTTGTAGGGGCGTTTCTACAACGACGAAAC CCTTCCTAGGCACTCACTCCAACAGAATAACAAGCCCATTTTATTAGTATTTCGTTTTC CATGTAAAGTTCTGCTCATACGAATATATTTATAATTCTGATTTTTTTACGGCATTGGG GAGCACACCGACAGGCTGCTGAACGGTGGCTGGAGATTCGAGGGAAAACGAAGTTC GCCGAGGCGGCCTCGGGCGGGCAGGTCCCGGGCTCCATCACAGGGCACACGCGGCTA CCAGGGACGCAGCCCCCCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACA CACACACACCCTCTCCCACTCATGCCTGGCAACCCAGCAGAAACTTCGGACTGGGGC AAAACAAGCCCGGGCCCCGGCGGCACGCGGGGCTAGGCGCGTTCCCGCCAGTACCTG GTCGCGAGGCCGCTCGCGGGGTGCCCTGCGTGCCCCCCACTCCCGCAGCCCGCGCCC TGCTCGCTCACTGTGGGGGCGCAGCGGCCAGGCTTCTCTGTTTGTTGTTTAAAGAAAT CCTAGGGCGGGCGAGCGGCGGCATCTAGGGGAGGGGGCGCAGCCAGAATTCCCTTCC AGCAAGCGCGTGAGGGGCATTCTCAACGCAAAACCAGACCCAGAAAGTAGTGACCA GCCCTCCTCGGATTACCCTTCATTGGCTCCTCCCTTGCTCCCCCCACCCTCC。

进一步的，所述试剂为用于定量检测生物标志物的甲基化程度的试剂。

进一步的，当SFRP2甲基化程度升高时，受试者患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌。

进一步的，所述试剂包括引物、探针、抗体、核酸芯片或蛋白质芯片。

进一步的，所述引物对序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；所述探针序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，所述检测样本为外周血单个核细胞；所述产品包括芯片或试剂盒。

本发明所采用的技术方案之二是：

提供一种用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒，所述试剂盒为特异性检测SFRP2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒。

进一步的，所述试剂盒包括用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对及探针，以及用于内参β-actin的引物对及探针。

进一步的，用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对序列为:正向引物序列如SEQ IDNO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；用于特异性检测 SFRP2甲基化的探针序列如SEQ ID NO.4所示；

用于内参β-actin的引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；用于内参β-actin的探针序列为如SEQ ID NO.7 所示。

进一步的，所述检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、MethyLight Master Mix、高压三蒸水。

本发明的有益效果：

本发明首先定量测定并获得了SFRP2甲基化程度在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的外周血单个核细胞中是升高的，并且明显高于慢性乙型病毒性肝炎患者和健康人的SFRP2甲基化程度，确定了SFRP2甲基化程度与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌具有关联性。本发明提供的生物标志物的甲基化程度能为早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌，可以作为诊断的依据，丰富了乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的辅助诊断,可及早进行有效的治疗手段，减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率提供更加及时的临床策略。

附图说明

图1为SFRP2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、慢性乙型病毒性肝炎组和健康对照组的甲基化的差异；**p<0.01，***p<0.001；

图2为乙型病毒性肝炎组和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的ROC曲线。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。

本研究主要收集山东大学齐鲁医院乙型肝炎病毒相关肝细胞癌107例，慢性乙型病毒性肝炎89例，健康志愿者20例的外周静脉血。

慢性乙型肝炎的诊断标准：①HBsAg阳性>6个月；②血清 HBVDNA>20000IU/mL(105copies/mL)，或2000-20000IU/mL(104-105copies /mL)(常见于HBeAg阴性CHB患者)；③持续性或间断性ALT/AST水平升高；④肝脏活检显示慢性肝脏炎症，伴中度或严重坏死。

乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断标准：慢性乙型肝炎、肝硬化等肝病背景下，有影像学检查结果(包括B超、CT、MRI及血管造影等)以及血清甲胎蛋白AFP水平(AFP>500μg/L，且持续4周，或AFP200-500μg/L持续8周，在排除其他引起的AFP增高的因素)和/或穿刺活检病理结果。

排除标准：①合并其他肝炎病毒感染(甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒等)和/或人类免疫缺陷病毒；②患有其他肝脏疾病，如自身免疫性肝炎、酒精性肝病及代谢性肝病等；③合并其他恶性肿瘤；⑤妊娠女性。

所有患者均签署知情同意书。

1.外周血单个核细胞分离

(1)使用EDTA抗凝试管采集每位研究对象外周静脉血5ml，离心(转速1500转 /分，5分钟)，可见全血分层，上层淡黄色液体即为血浆，下层为血细胞；

(2)去除上层的淡黄色血浆，按照1：1的比例加入PBS缓冲液，缓慢吹打混匀；

(3)l5ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，吸取步骤(2)准备的稀释液沿管壁缓慢加入，使稀释的血细胞悬液位于淋巴细胞分离液液面之上；

(4)2000转/分转速离心20分钟；

(5)缓慢取出离心管，可发现管内液体分为4层，从上到下依次为血浆层(淡黄色)、PBMC层(白色膜状)、淋巴细胞分离液层(透明)及红细胞和粒细胞层(红色、难以区分)。用吸管小心地吸取PBMC层(白膜层)，转移至新的15ml离心管中(尽量吸取全部PBMC同时避免吸入其他杂质细胞)；

(6)加入PBS液定容至1Oml，吹打摇匀，离心(2000转/分，10分钟)；

(7)弃去上清液，可见管底的白色沉淀，即为PBMCs；

(8)重复(6)(7)，反复洗涤PBMCs；

(9)弃去上清液，用约1ml PBS液冲洗离心管底部，并将其转移至1.5mlEP管中；

(10)配平后，离心(3000转/分，5分钟)；

(11)重复(9)(10)，再次洗涤PBMCs；

(12)弃去上清液，置于-80℃冰箱中保存待用，或直接用于提取DNA。

2.手工法提取DNA

开始前操作事项：

(1)无水乙醇；

(2)0.1M柠檬酸钠溶液(10％乙醇溶解)；

(3)75％乙醇；

(4)8mM NaOH。

步骤：

(1)取待处理标本，向EP管内加入l ml Trizol试剂，盖好管盖后摇匀，并将枪头伸入管底反复吹打细胞沉淀，使细胞充分裂解溶解，静置10分钟。

(2)将O.3ml氯仿加入至EP管中，盖好管盖，上下振荡摇匀1分钟，静置10分钟。

(3)配平后，放置于4℃离心机中离心(12000转/分，l5分钟)。

(4)离心后样品分为3层，上层无色透明水相，下层粉红色有机相，两层之间为中间层。DNA主要存在于中间层和有机相中，因此尽量移去上层水相。

(5)加入O.3ml无水乙醇，上下颠倒混匀，室温静置1O分钟。

(6)配平后，放置于4℃离心机中离心(12000转/分，5分钟)。

(7)弃去上清液，加入1mL 10％乙醇O.1M柠檬酸钠溶液，振荡洗涤DNA沉淀30分钟。

(8)重复步骤(6)。

(9)加入l ml 75％乙醇，振荡洗涤DNA沉淀30分钟。

(10)重复步骤(6)。

(11)弃去上清液，室温干燥5-10分钟，避免过度干燥难以溶解，用8mMNaOH溶液溶解DNA，使DNA浓度为200-300ng/ug。

(12)用8mM NaOH溶液将提取的DNA样本稀释100倍，紫外分光光度计测定DNA的浓度，及260/280nm的OD值。

3.DNA的亚硫酸氢盐修饰

开始前注意事项：

适用于每次修饰的DNA量为500pg-2μg，200-500ng最适。

开始前操作事项：

CT Conversion Reagent制备

试剂盒内提供的CT Conversion Reagent为固体混合物，应在使用前准备，步骤如下：

(1)将900μl水、300μl M-Dilution Buffer和50μl M-Dissolving Buffer 加入到CT Conversion Reagent试剂管中。

(2)室温下涡旋或振动10分钟以混匀。

注：在CT Conversion Reagent中看到极少量未溶解试剂是正常现象，每管CTConversion Reagent可处理10个DNA标本。

贮存：CT Conversion Reagent见光分解，应注意避光保存，最好在制备后立即使用，如果未能立即使用，CT Conversion Reagent可以在室温下保存过夜，4℃保存一周，-20℃保存一月，贮存的CT Conversion Reagent必须加热至37℃并涡旋后使用。

M-Wash Buffer制备

将4.8ml无水乙醇加入到1.2ml M-Wash Buffer浓缩液中或96ml无水乙醇加入到24ml M-Wash Buffer浓缩液中。

操作步骤

(1)将130μl CT Conversion Reagent加入到装有20μl DNA样本的PCR管中。如果DNA样本体积少于20μl，用水补足体积。晃动PCR管或移液器吹打混匀后将液体离心至管底。

(2)将样本管进行下列操作步骤：

1)98℃10分钟

2)64℃2.5小时

3)4℃贮存(最长贮存20小时)。

(3)将600μl M-Binding Buffer加入IC Column中，然后放入试剂盒内提供的Collection Tube中。

(4)将样本(来自第2步)加入装有M-Binding Buffer的IC Column中，盖紧管盖反复颠倒混匀。

(5)最高速(≥10000×g)离心30秒，弃掉滤液。

(6)将100μl M-Wash Buffer加入上述IC Column中，最高速离心30秒。

(7)将200μl M-Desulphonation Buffer加入IC Column中室温(20-30℃) 孵育15-20分钟。孵育结束后最高速离心30秒。

(8)将200μl M-Wash Buffer加入IC Column中，最高速离心30秒。再加入200μl M-Wash Buffer，最高速离心30秒。

Collection Tube中可容纳800μl液体。需要时倾倒残液以防止残液污染ICColumn。

(9)将离心柱加入1.5ml微量离心管中，向离心柱中加入10μl M-Elution Buffer，最高速离心30秒以洗脱DNA。

洗脱的DNA可以即刻使用，也可以-20℃或更低温贮存后使用。如果要长期贮存，最好-70℃或更低温贮存。每次PCR推荐使用1-4μl洗脱DNA，但是如果必要的话最多可以一次使用10μl。根据实验要求不同洗脱液可以大于10μl，但是较小体积的洗脱液可以得到更高浓度的DNA。

4.甲基化特异性定量PCR(Methylight)

开始前注意事项：

本方法适用于8μl反应体系的制备，反应体系>8μl时，反应和循环条件应当进一步优化。

同一标本同时应用本发明SFRP2甲基化特异性引物探针和内参β-actin引物探针进行扩增。

每次操作时需平行扩增阳性对照及阴性对照。阳性对照为甲基化完全的DNA标本(Control Methylated DNA)，阴性对照以不含有任何DNA底物成分的Water 作为扩增模板。

操作步骤：

(1)引物探针溶解后轻轻混匀，稀释十倍制成工作液后冰上保存。

(2)配制反应体系

PCR反应体系

成分	体积
		Water	2μl
上游引物	0.4μl
		下游引物	0.4μl
探针	0.2μl
		MethylightMaster Mix	5μl
最终体积	8μl

注：准备多个PCR反应体系时，将上表中“体积”×(反应体系数+1)。温和振荡混匀反应体系，简短离心5秒。

(3)吸取8μl PCR反应体系加入预冷的PCR管中，加入2μl DNA模板。

(4)将配制好的反应体系温和振荡混匀，简短离心5秒。

(5)按下述扩增条件对样本进行扩增。

预变性95℃5min；95℃15s，60℃1min，运行40个循环；4℃保存。

5.结果分析

最终甲基化程度用PMR值表示。

PMR＝100％x 2exp[Delta Ct(目标基因-内参基因)_样本-Delta Ct(目标基因-内参基因)_阳性对照]。

由图1可得，HCC组PMR中位数38.16％,IQR 19.08-53.59％；CHB组PMR 中位数15.60％,IQR 9.41-25.53％；HC组PMR中位数16.78％,IQR 12.13-22.45％。表明SFRP2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、慢性乙型病毒性肝炎组和健康对照组的甲基化的差异明显，乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的SFRP2甲基化程度明显上升，可用于对乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的早期诊断。

图2中各指标测定结果如下表1。

表1

SFRP2甲基化作为标志物时AUC值为0.770，高于AFP(AUC 0.684,p＝0.108)；SFRP2甲基化取最佳临界值为34.51％，此时敏感度+特异度最高；SFRP2甲基化与AFP联合检测可进一步提高AUC值(0.858),明显高于AFP单独作为分子标志物时的诊断效能(p<0.001)。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

。

序列表

<110> 山东大学深圳研究院

<120> SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒

<141> 2020-09-16

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtcgtcgttc gttcgtttta gg 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cgcgaaatac cctacgtacc c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcccgcaacc cgcgccctac t 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tggtgatgga ggaggtttag taagt 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaccaataaa acctactcct cccttaaa 28

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为SFRP2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为用于定量检测生物标志物的甲基化程度的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，当SFRP2甲基化程度升高时，受试者患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括引物、探针、抗体、核酸芯片或蛋白质芯片。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对及探针。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物对序列为:正向引物序列如SEQID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；所述探针序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测样本为外周血单个核细胞；所述产品包括芯片或试剂盒。

8.用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为特异性检测SFRP2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对及探针，以及用于内参β-actin的引物对及探针。

10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；用于特异性检测SFRP2甲基化的探针序列如SEQ ID NO.4所示；

用于内参β-actin的引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQID NO.6所示；用于内参β-actin的探针序列为如SEQ ID NO.7所示。