CN103361404A

CN103361404A - 一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒

Info

Publication number: CN103361404A
Application number: CN 201210094755
Authority: CN
Inventors: 任峻; 张华忠
Original assignee: ZHEJIANG AIYI BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG AIYI BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒。该试剂盒包括同时检测MICA基因上的rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上的rs9275572号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与肝癌密切相关的MICA和HLA-DQ的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患肝癌的风险性。

Description

一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒，通过同时检测与肝癌关联的基因MICA和HLA-DQ的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患肝癌的风险性。

背景技术

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。随着人类在基因方面的不断深入研究，先已发现了两个与肝癌相关的风险基因，分别是MICA和HLA-DQ。

MHC-I类链相关基因（Major histocompatibility complex class I chain-related gene，MIC）定位于人类第6号染色体MHC-I类基因区域，包括MICA、MICB、MICC

、MICD、MICE、MICF和MICG，其中仅MICA、MICB为功能基因，可编码功能蛋白，其它5种均为假基因。

MICA基因编码的蛋白产物属于膜蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞浆区。MICA的表达具有组织特异性，研究发现MICA蛋白仅表达于新鲜分离的内皮细胞、成纤维细胞和胃肠道上皮细胞表面。在各种变异细胞，特别是上皮细胞来的肿瘤细胞中MICA分子的表达可发生上调。病毒感染、受热等也会引起MICA表达的变化，因此MICA被认为是一种应激性蛋白。NKG2D（the actiating killer cell lectin-like receptor K ，NKG2D）是MICA的受体，可表达于多种免疫细胞，在NK、γδ⁺T细胞和CD8⁺T细胞介导的对肿瘤和感染的免疫反应中起重要作用，参与适应性及固有性免疫应答。

MICA已被发现在多种肿瘤中出现高表达，如乳腺癌、肺癌、消化道肿瘤、前列腺癌等，并且这些肿瘤中会出现高水平的γδ⁺T细胞浸润，γδ⁺T细胞通过识别MICA分子对表达MICA的细胞有较强的细胞毒作用，这种肿瘤免疫监视机制在早期对抗肿瘤有一定积极作用。Wagsater等研究了直肠癌中MICAmRNA的表达水平，发现直肠癌中MICA的表达水平增高，提示MICA可能是免疫系统实施免疫监视的效应分子之一。免疫系统通过MICA与NKG2D的结合，激活NK等免疫细胞以清除肿瘤细胞。

人类MHC主要为人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），分为Ⅰ类和Ⅱ类。MHCⅡ类分子只在少数细胞表达，如树突状细胞、B淋巴细胞等，其中最具代表性的为HLA-DR和HLA-DQ抗原。HLA-DR，-DQ通过MHCⅡ类分子限制的T细胞对外来抗原的识别，在介导淋巴细胞活化、抗原递呈等机体免疫应答和免疫调节过程中发挥重要的作用。

经过研究，我们认为HLA-DR和-DQ在肝癌组织中的表达机制有一下可能：（1）肝癌细胞中有明显的低甲基化和局部高甲基化，Ⅱ类分子表达主要受Ⅱ类反式激活因子（Class Ⅱ trans – activator，CⅡTA）的调控，CⅡTA启动子由DNA甲基化调控，使用5-aza-CdR处理后或传染CⅡTA基因均可诱导上述瘤细胞MHCⅡ的表达，并使瘤细胞恢复抗原处理和递呈的功能，而达到增强CTL和抗体依赖的特异免疫反应的目的。在人类肿瘤中，如绒癌、白血病、T细胞来源的恶性肿瘤以及视网膜母细胞均缺乏MHCⅡ的表达，其机制也与CⅡTA的高甲基化有关。（2）肿瘤组织刺激机体产生炎症反应，浸润型T细胞释放多种细胞因子，这些细胞因子有诱导肿瘤细胞表达HLA-DR等。IFN-γ等多种细胞因子对血源性或非血源性的组织都能够诱导其表达HLAⅡ类分子，但提前是CⅡTA基因必须是未甲基化的。在我国HCC多数伴有HBV感染,因此在慢性肝炎、肝硬化及肝癌这个发展过程中，CⅡTA基因发生不同程度的低甲基化，在炎症细胞释放的细胞因子的诱导下，肝癌细胞发生不同程度的HLA分子的表达。

总之，正常肝细胞中是不表达或弱表达的，在肝癌细胞中HLAⅡ类分子的表达可能是按照上述两个可能的顺序发生的。首先是要有CⅡTA启动子去甲基化，然后由IFN-γ等细胞因子提供促进HLA表达的信号。

发明内容

基于MICA基因、HLA-DQ基因上的2个SNPs位点多态性可用来评估个体罹患肝癌风险性的基础上，本发明提供一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒。

试剂盒包括：

检测MICA基因上rs2596542号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；

检测HLA-DQ基因上rs9275572号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；

荧光定量PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、反应缓冲液、去离子水等）。

本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对MICA基因上rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上rs9275572号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2、3和4所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物。

本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对MICA基因上rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上rs9275572号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这两个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：5和6、7和8所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这两对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估个体罹患肝癌风险性的两个SNPs位点的探针均在本发明范围内。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

5μl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，

0.5μl 25mM dNTP混合液，

3μl 25mM MgCl₂溶液，

0.125μl （5units/μl）Taq DNA聚合酶，

20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，

10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，

去离子水26.625μl。

本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1. 检测试剂盒的使用

步骤1：DNA模板的提取

用真空采血管采集人体外周血，提取血液中的基因组DNA。

步骤2：荧光定量PCR反应

使用可检测肝癌相关风险基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，包含下列引物对和荧光探针对：

有义引物1：5’- TTTTAATGACAACA – 3’（SEQ ID NO：1）

反义引物1：5’- ATCGTCTCCCAAAG – 3’（SEQ ID NO：2）

有义引物2：5’- ATTATGGTGATTCT – 3’（SEQ ID NO：3）

反义引物2：5’- ACTTAGACTAGGTC – 3’（SEQ ID NO：4）

带VIC荧光基团探针1：5’- TTTTATcGTGTAG -3’（SEQ ID NO：5）

带FAM荧光基团探针1：5’- TTTTATtGTGTAG -3’（SEQ ID NO：6）

带VIC荧光基团探针2：5’- ATAGCAaCTTCAT -3’（SEQ ID NO：7）

带FAM荧光基团探针2：5’- ATAGCAgCTTCAT -3’（SEQ ID NO：8）

有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测MICA基因上的rs2596542号SNP位点多态性；

有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测HLA-DQ基因上的rs9275572号SNP位点多态性；

2个SNPs位点分别进行2次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl、1μl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl₂溶液、0.025μl （5units/μl）Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。

在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。

步骤3：SNP基因型分析

熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。

实施例2. 对患者进行肝癌相关风险基因检测的服务

步骤1：DNA提取

由医院检验科医师对被检者进行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因组DNA。

步骤2：基因分型检测

使用本发明提供的试剂盒，对被检者基因组DNA的MICA基因上的rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上的rs9275572号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这两个SNPs位点的基因型。

步骤3：个体罹患肝癌风险性的分析

通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具罹患肝癌风险性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者罹患肝癌风险性的高低，并由医师向被检测者详细说明和解读罹患肝癌风险性的分析报告单。

<110> 浙江爱易生物医学科技有限公司

<120> 一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒

<130> 2012

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>引物

<400> 1

ttttaatgac aaca 14

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>引物

<400> 2

atcgtctccc aaag 14

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>引物

<400> 3

attatggtga ttct 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>引物

<400> 4

acttagacta ggtc 14

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>探针

<400> 5

ttttatcgtg tag 13

<210> 6

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>探针

<400> 6

ttttattgtg tag 13

<210> 7

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>探针

<400> 7

atagcaactt cat 13

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>探针

<400> 8

atagcagctt cat 13

Claims

1.一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒，其特征在于：包括同时检测MICA基因上rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上rs9275572号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对MICA基因上rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上rs9275572号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针对是指针对MICA基因上rs2596542号SNP位点和HLA-DQ基因上rs9275572号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的Taqman探针对。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2、3和4所示序列的引物对。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO：5和6、7和8所示序列的Taqman探针对。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包括10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.5μl 25mM dNTP混合液、3μl 25mM MgCl₂溶液、0.125μl （5units/μl）Taq DNA聚合酶、20μM特异性引物对每条引物各0.225μl、10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl、去离子水26.625μl，本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。