CN112063717B - Mdm2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒。通过检测生物标志物MDM2的甲基化频率,可以在早期判断受试者是否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌,及早进行有效的治疗手段,减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率,提供更加及时的临床策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒。
背景技术
肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,也是全球癌症死亡的第三大主要原因。在中国,慢性乙型肝炎病毒感染诱发的肝癌更为普遍。乙肝病毒感染及癌基因激活均在肝癌的发生和发展中发挥着重要作用。
表观遗传修饰是癌基因致癌作用中的重要事件之一,其中包括异常的DNA 甲基化。DNA甲基化是指基因表达的可遗传变化,但是DNA序列没有发生改变。 DNA甲基化已在多种肿瘤中广泛研究,例如胃癌和肺癌。多项研究表明,某些基因的DNA甲基化可以用作诊断的生物标记。
MDM2是一种E3泛素连接酶,其基因编码肿瘤抑制因子p53的负调控因子。 MDM2与p53的转录激活域结合,以调节p53的稳定和激活。在正常的生理条件下,MDM2和p53形成一个自我调节的负反馈环,以确保两者之间的平衡。然而,在各种肿瘤中经常观察到负反馈环被破坏的现象。尤其是MDM2过表达与多种肿瘤有关,例如肉瘤、结肠癌和胃癌。
目前,MDM2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的作用尚未有研究,因此,确定MDM2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的价值具有重要意义。
发明内容
本发明提供了MDM2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒,通过检测样本中生物标志物MDM2的甲基化频率,可以在早期判断受试者是否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌,及早进行有效的治疗手段,减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率,提供更加及时的临床策略,解决了现有技术中存在的问题。
本发明所采用的技术方案之一是:
检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产品中的应用,所述生物标志物为MDM2。
进一步的,所述MDM2基因序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1
AACCGCTCCCCTCCCCGCCAACGGTAACCAGCATCTTCGTTCTCCAACCAGAACAGCT GTATGCACCGGTGTATAAGCCTGCCTTAAGTGCTATTTTTAATCTTTTTTAAAAACAGGC CTTAAAATAACTCATTTGGGTACAACTCCAGCGGCTGGTGGAGTGGGCTTAATATATTA AACAGCTGTTAATTTTGGTTTCTTTTTGGTAACAGCGACACGGAGATCCGCATTTGTCG CAGTTTCCACCGCGGGCGGGAAGTGTAAACACAAGAAATACAAACATAGCGCAACGGCTAAAGGAGTGTCACAGCGCCAAACCTTGCTGGCTCCGCGCCAGGCCGAGCCCCACC CTCTCAGCTCGCGGCCAACACCCCCACCCCGCCTCACAGCCCGCCGCGCCCGCGGGG CGACACCCCCCACTCCATCATCCCGGAGGTGGTGCGGCCGAGCCCCGGACCCAATTGG CGGAAGCGGGGCCGGTTGTGTGCGCGCGCACAAATGCCCGGATGCGCCGCGACGACC CGCGCGCTCCCCTCGGGCGGTAGGGGGCGCGCACCGAGGCACCGCGGCGAGCTTGGC TGCTTCTGGGGCCTGTGTGGCCCTGTGTGTCGGAAAGATGGAGCAAGAAGCCGAGCC CGAGGGGCGGCCGCGACCCCTCTGACCGAGATCCTGCTGCTTTCGCAGCCAGGAGCA CCGTCCCTCCCCGGATTAGTGCGTACGAGCGCCCAGTGCCCTGGCCCGGAGAGTGGAA TGATCCCCGAGGCCCAGGGCGTCGTGCTTCCGCGCGCCCCGTGAAGGAAACTGGGGA GTCTTGAGGGACCCCCGACTCCAAGCGCGAAAACCCCGGATGGTGAGGAGCAGGTAC TGGCCCGGCAGCGAGCGGTCACTTTTGGGTCTGGGCTCTGACGGTGTCCCCTCTATCG CTGGTTCCCAGCCTCTGCCCGTTCGCAGCCTTTGTGCGGTTCGTGGCTGGGGGCTCGG GGCGCGGGGCGCGGGGCATGGGGCACGTGGCTTTGCGGAGGTTTTGTTGGACTGGGG CTAGGCAGTCGCCGCCAGGGAGGAGGGCGGGATTTCGGACGGCTCTCGCGGCGGTGG GGGTGGGGGTGGTTCGGAGGTCTCCGCGGGAGTTCAGGGTAAAGGTCACGGGGGCCG GGGGCTGCGGGGCCGCTTCGGCGCGGGAGGTCCGGATGATCGCAGGTGCCTGTCGGG TCACTAGTGTGAACGCTGCGCGTAGTCTGGGCGGGATTGGGCCGGTTCAGTGGGCAGGTTGACTCAGCTTTTCCTCTTGAGCTGGTCAAGTTCAGACACGTTCCGAAACTGCAGT AAAAGGAGTTAAGTCCTGACTTGTCTCCAGCTGGGGCTATTTAAACCATGCATTTTCCC AGCTGTGTTCAGTGGCGATTGGAGGGTAGACCTGTGGGCACGGACGCACGCCACTTTT TCTCTGCTGATCCAGGTAAGCACCGACTTGCTTGTAGCTTTAGTTTTAACTGTTGTTTAT GTTCTTTATATATGATGTATTTTCCACAGATGTTTCATGATTTCCAGTTTTCATCGT
T:transcription start site。
进一步的,所述试剂为用于检测生物标志物的甲基化频率的试剂。
进一步的,当MDM2非甲基化时,受试者患有早期乙型肝炎病毒相关肝细胞癌。
进一步的,所述试剂包括引物、探针、抗体、核酸芯片或蛋白质芯片。
进一步的,所述试剂包括PCR/Southern、高通量测序平台、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法、甲基化特异性多连接依赖性探针扩或甲基化特异性PCR 检测MDM2甲基化频率的试剂。
进一步的,所述试剂包括甲基化特异性PCR检测MDM2甲基化频率的引物对。
进一步的,所述引物对包括甲基化引物对和非甲基化引物对;所述甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示,所述甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示;所述非甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.4 所示,所述非甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的,所述检测样本为外周血单个核细胞;所述产品包括芯片或试剂盒。
本发明所采用的技术方案之二是:
提供一种用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒,所述试剂盒为特异性检测MDM2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒。
进一步的,所述甲基化特异性PCR试剂盒包括以下引物对:甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示,甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示;非甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示,非甲基化引物对的反向引物序列如SEQ IDNO.5所示。
进一步的,所述甲基化特异性PCR试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、Taq PCRMaster Mix,高压三蒸水。
本发明的有益效果:
本发明首先获得了MDM2甲基化频率在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的外周血单个核细胞中是降低的,并且明显低于慢性乙型病毒性肝炎患者和乙肝肝硬化患者的MDM2甲基化频率,确定了MDM2甲基化与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌具有关联性。本发明提供的生物标志物的甲基化程度能为早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌,可以作为诊断的依据,可及早进行有效的治疗手段,减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率提供更加及时的临床策略。
附图说明
图1为MDM2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、肝硬化组和慢性乙型病毒性肝炎组的甲基化的差异;
图2乙型病毒性肝炎组和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的ROC曲线;
图3乙肝肝硬化组和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的ROC曲线。
其中,图1中A为乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、肝硬化组、慢性乙型病毒性肝炎组的甲基化频率柱状图,图1中B为乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、肝硬化组、慢性乙型病毒性肝炎组及阳性、阴性对照组的凝胶电泳图。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点,下面通过具体实施方式,结合附图,对本发明进行详细阐述。
本发明主要收集山东大学齐鲁医院慢性乙型病毒性肝炎37例,乙肝肝硬化31例,乙型肝炎病毒相关肝细胞癌100例的外周静脉血。
慢性乙型肝炎的诊断标准:①HBsAg阳性>6个月;②血清 HBVDNA>20000IU/mL(105copies/mL),或2000-20000IU/mL(104-105copies /mL)(常见于HBeAg阴性CHB患者);③持续性或间断性ALT/AST水平升高;④肝脏活检显示慢性肝脏炎症,伴中度或严重坏死。
肝硬化的诊断标准:(1)肝硬化经由影像学诊断;(2)超过半年的血清 HBsAg阳性史;(3)明显的肝损害症状,如肝病面容、蜘蛛痣、肝掌等;(4) 腹水,静脉曲张出血,肝性脑病和/或黄疸。
乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断标准:慢性乙型肝炎、肝硬化等肝病背景下,有影像学检查结果(包括B超、CT、MRI及血管造影等)以及血清甲胎蛋白AFP 水平(AFP>500μg/L,且持续4周,或AFP200-500μg/L持续8周,在排除其他引起的AFP增高的因素)和/或穿刺活检病理结果。
排除标准:①合并其他肝炎病毒感染(甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒等)和/或人类免疫缺陷病毒;②患有其他肝脏疾病,如自身免疫性肝炎、酒精性肝病及代谢性肝病等;③合并其他恶性肿瘤;⑤妊娠女性。
所有患者均签署知情同意书。
1.外周血单个核细胞分离
(1)使用EDTA抗凝试管采集每位研究对象外周静脉血5ml,离心(转速1500转 /分,5分钟),可见全血分层,上层淡黄色液体即为血浆,下层为血细胞;
(2)去除上层的淡黄色血浆,按照1:1的比例加入PBS缓冲液,缓慢吹打混匀;
(3)15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液,吸取步骤(2)准备的稀释液沿管壁缓慢加入,使稀释的血细胞悬液位于淋巴细胞分离液液面之上;
(4)2000转/分转速离心20分钟;
(5)缓慢取出离心管,可发现管内液体分为4层,从上到下依次为血浆层(淡黄色)、PBMC层(白色膜状)、淋巴细胞分离液层(透明)及红细胞和粒细胞层(红色、难以区分)。用吸管小心地吸取PBMC层(白膜层),转移至新的15ml离心管中(尽量吸取全部PBMC同时避免吸入其他杂质细胞);
(6)加入PBS液定容至1Oml,吹打摇匀,离心(2000转/分,10分钟);
(7)弃去上清液,可见管底的白色沉淀,即为PBMCs;
(8)重复(6)(7),反复洗涤PBMCs;
(9)弃去上清液,用约1ml PBS液冲洗离心管底部,并将其转移至1.5mlEP管中;
(10)配平后,离心(3000转/分,5分钟);
(11)重复(9)(10),再次洗涤PBMCs;
(12)弃去上清液,置于-80℃冰箱中保存待用,或直接用于提取DNA。
2.手工法提取DNA
开始前操作事项:
(1)无水乙醇;
(2)0.1M柠檬酸钠溶液(10%乙醇溶解);
(3)75%乙醇;
(4)8mM NaOH。
步骤:
(1)取待处理标本,向EP管内加入1mlTrizol试剂,盖好管盖后摇匀,并将枪头伸入管底反复吹打细胞沉淀,使细胞充分裂解溶解,静置10分钟;
(2)将O.3ml氯仿加入至EP管中,盖好管盖,上下振荡摇匀1分钟,静置10分钟;
(3)配平后,放置于4℃离心机中离心(12000转/分,l5分钟);
(4)离心后样品分为3层,上层无色透明水相,下层粉红色有机相,两层之间为中间层。DNA主要存在于中间层和有机相中,因此尽量移去上层水相;
(5)加入O.3ml无水乙醇,上下颠倒混匀,室温静置1O分钟;
(6)配平后,放置于4℃离心机中离心(12000转/分,5分钟);
(7)弃去上清液,加入1mL 10%乙醇O.1M柠檬酸钠溶液,振荡洗涤DNA沉淀30分钟;
(8)重复步骤(6);
(9)加入1ml 75%乙醇,振荡洗涤DNA沉淀30分钟;
(10)重复步骤(6);
(11)弃去上清液,室温干燥5-10分钟,避免过度干燥难以溶解,用8mMNaOH溶液溶解DNA,使DNA浓度为200-300ng/ug;
(12)用8mM NaOH溶液将提取的DNA样本稀释100倍,紫外分光光度计测定DNA的浓度,及260/280nm的OD值。
3.DNA的亚硫酸氢盐修饰
开始前注意事项:
适用于每次修饰的DNA量为500pg-2μg,200-500ng最适。
开始前操作事项:
CT Conversion Reagent制备
试剂盒内提供的CT Conversion Reagent为固体混合物,应在使用前准备,步骤如下:
(1)将900μl水、300μl M-Dilution Buffer和50μl M-Dissolving Buffer 加入到CT Conversion Reagent试剂管中;
(2)室温下涡旋或振动10分钟以混匀。
注:在CT Conversion Reagent中看到极少量未溶解试剂是正常现象,每管CTConversion Reagent可处理10个DNA标本。
贮存:CT Conversion Reagent见光分解,应注意避光保存,最好在制备后立即使用,如果未能立即使用,CT Conversion Reagent可以在室温下保存过夜, 4℃保存一周,-20℃保存一月,贮存的CT Conversion Reagent必须加热至37℃并涡旋后使用。
M-Wash Buffer制备
将4.8ml无水乙醇加入到1.2ml M-Wash Buffer浓缩液中或96ml无水乙醇加入到24ml M-Wash Buffer浓缩液中。
操作步骤:
(1)将130μl CT Conversion Reagent加入到装有20μl DNA样本的PCR 管中。如果DNA样本体积少于20μl,用水补足体积。晃动PCR管或移液器吹打混匀后将液体离心至管底;
(2)将样本管进行下列操作步骤:
1)98℃10分钟
2)64℃2.5小时
3)4℃贮存(最长贮存20小时)。
(3)将600μl M-Binding Buffer加入IC Column中,然后放入试剂盒内提供的Collection Tube中;
(4)将样本(来自第2步)加入装有M-Binding Buffer的IC Column中,盖紧管盖反复颠倒混匀;
(5)最高速(≥10000×g)离心30秒,弃掉滤液;
(6)将100μl M-Wash Buffer加入上述IC Column中,最高速离心30秒;
(7)将200μl M-Desulphonation Buffer加入IC Column中室温(20-30℃) 孵育15-20分钟。孵育结束后最高速离心30秒;
(8)将200μl M-Wash Buffer加入IC Column中,最高速离心30秒。再加入200μl M-Wash Buffer,最高速离心30秒;
Collection Tube中可容纳800μl液体。需要时倾倒残液以防止残液污染ICColumn;
(9)将离心柱加入1.5ml微量离心管中,向离心柱中加入10μl M-Elution Buffer,最高速离心30秒以洗脱DNA。
洗脱的DNA可以即刻使用,也可以-20℃或更低温贮存后使用。如果要长期贮存,最好-70℃或更低温贮存。每次PCR推荐使用1-4μl洗脱DNA,但是如果必要的话最多可以一次使用10μl。根据实验要求不同洗脱液可以大于10μl,但是较小体积的洗脱液可以得到更高浓度的DNA。
4.甲基化特异性PCR
开始前注意事项:
本方法适用于25μl反应体系的制备,反应体系<25μl时,反应和循环条件应当进一步优化。
同一标本同时应用本发明的MDM2甲基化特异性(M)引物(SEQ ID NO.2 和SEQ IDNO.3)和本发明非甲基化特异性(U)引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5) 进行扩增。
SEQ ID NO.2methylated forward primer 5’-TAACGGTTAAAGGAGTGTTATAGCG-3’
SEQ ID NO.3methylated reverse primer 5’-GAAATAAAAATATTAACCGCGAAC-3’
SEQ ID NO.4unmethylated forward primer 5’-AATGGTTAAAGGAGTGTTATAGT-3’
SEQ ID NO.5unmethylated reverse primer 5’-CAAAATAAAAATATTAACCACAAAC-3’。每次操作时需平行扩增阳性对照及阴性对照。阳性对照为甲基化完全的DNA标本(Control Methylated DNA),阴性对照以不含有任何DNA底物成分的Water 作为扩增模板。
操作步骤:
(1)Master Mix(2×浓缩液)及引物溶解后轻轻混匀,冰上保存;
(2)配制反应体系
PCR反应体系
成分 | 体积 |
Water | 10μl |
上游引物 | 0.5μl |
下游引物 | 0.5μl |
Master Mix(2×浓缩液) | 12.5μl |
最终体积 | 23.5μl |
注:准备多个PCR反应体系时,将上表中“体积”×(反应体系数+1)。温和振荡混匀反应体系,简短离心5秒;
(3)吸取23.5μl PCR反应体系加入预冷的PCR管中,加入1.5μl DNA模板;
(4)将配制好的反应体系温和振荡混匀,简短离心5秒;
(5)按下述扩增条件对样本进行扩增;
预变性95℃5min,95℃变性30s,50-60℃退火45s,72℃引物延伸30s,共运行40个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存。
5.琼脂糖凝胶电泳
开始前操作事项:
1.8%琼脂糖凝胶的配制:
取0.54g琼脂糖加入30ml的1×TAE溶液中,放入微波炉加热至充分溶解,自然冷却至60℃左右时,加入1μl核酸染料,充分摇匀后将温热的凝胶倒入已放置好梳子的灌胶器中,在室温放置约30分钟后,上样,进行电泳。
操作步骤:
取10μl PCR扩增产物加样后,进行电泳,条件为120V,40分钟。电泳结束后,在紫外光下观察结果并用凝胶电泳图像分析系统分析结果。
6.结果分析
MDM2基因甲基化标本可见甲基化引物(M)扩增条带,MDM2基因非甲基化标本可见非甲基化引物(U)扩增条带。试验中,阴性对照组应无任何引物扩增条带出现,阳性对照组出现甲基化(M)引物扩增条带。阳性对照与阴性对照作为本发明的质量控制,若阳性对照与阴性对照未出现上述相应结果,则表示实验过程或操作有误。从图1中A可以看出:相比CHB组和LC组,HCC组的 MDM2甲基化率显著下降;从图1中B可以看出:CHB组和LC组均可见甲基化引物扩增条带,HCC组可见非甲基化引物扩增条带。因此,在获得MDM2甲基化频率与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的相关性的基础上,可较好的用于早期乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断。
图2是对于MDM2异常甲基化联合AFP测定,灵敏度为89.00%,特异性为 62.16%,阳性预测值(PPV)为87.25%,阴性预测值(NPV)为62.07%,优于单独使用AFP(灵敏度:52%,特异性:62.16%,PPV:78.79%,NPV:32.39%) 和MDM2启动子异常甲基化(敏感性:70.00%,特异性:72.97%,PPV:87.5%, NPV:43.37%)。此外,联合测定的曲线下面积(AUC)为0.756[标准误差(SE) =0.0434,95%CI=0.675-0.825)],高于单独使用AFP(AUC=0.639,SE=0.0471,95%CI=0.553-0.720;P=0.0056),MDM2启动子异常甲基化(AUC=0.715, SE=0.0436,95%CI=0.632-0.789;P>0.05)。
图3联合AFP与MDM2甲基化灵敏度为89.00%,特异性为58.06%,PPV为 87.25%,NPV为62.07%,高于AFP(灵敏度:52.00%,特异性:58.06%, PPV:80.00%,NPV:27.27%)和MDM2甲基化的结果(灵敏度:70%,特异性:64.52%,PPV:86.42%,NPV:40.00%)。联合测定的AUC为0.735(SE =0.0477,95%CI=0.651-0.809),高于单独使用AFP(AUC=0.634,SE= 0.0533,95%CI=0.545-0.716;P=0.0128)和MDM2甲基化(AUC=0.673, SE=0.0494,95%CI=0.585-0.752;P=0.0356)。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制,对于本技术领域的技术人员来说,对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处,均为本技术领域技术人员的公知技术。
序列表
<110> 山东大学深圳研究院
<120> MDM2 作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒
<141> 2020-09-15
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
taacggttaa aggagtgtta tagcg 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaaataaaaa tattaaccgc gaac 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aatggttaaa ggagtgttat agt 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caaaataaaa atattaacca caaac 25
Claims (4)
1.检测样本中MDM2基因甲基化状态的试剂在制备早期辅助诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产品中的应用,其特征在于,所述试剂包括甲基化特异性PCR检测MDM2基因甲基化状态的引物对,所述引物对包括甲基化引物对和非甲基化引物对;所述甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示,所述甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示;所述非甲基化引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示,所述非甲基化引物对的反向引物序列如SEQ ID NO.5所示;
所述样本为外周血单个核细胞;当MDM2基因非甲基化时,受试者患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括探针或核酸芯片。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂包括结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法、甲基化特异性多连接依赖性探针扩或甲基化特异性PCR检测MDM2基因甲基化状态的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括芯片或试剂盒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010978593.4A CN112063717B (zh) | 2020-09-17 | 2020-09-17 | Mdm2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒 |
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Publications (2)
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