CN105420370B - 用于肝癌早期预警和筛查的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学(肿瘤筛查)领域，具体涉及一种可用于肝癌早期预警和筛查的技术。本发明属于分子生物学(肿瘤筛查)领域，具体涉及一种用于肝癌早期预警和筛查的技术。本发明要解决的技术问题是为肝癌早期预测提供一种新选择。本发明的技术方案是用于肝癌早期预警和筛查的试剂盒，包括扩增如下基因的引物：启动区CpG岛甲基化状态的RASSF相关区域家族1A基因(RASSF1A)、p16基因、胚肝血影蛋白(ELF)、细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling)基因、分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled‑related protein)基因和基因组重复序列LINE1。本发明为本领域早期肝癌以及肝硬化预警和筛查提供了新的有效检测方法，且成本低，使用起来也非常方便，灵敏度高，特异性好，具有很好的应用前景。

Description

用于肝癌早期预警和筛查的试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学(肿瘤筛查)领域，具体涉及一种可用于肝癌早期预警和筛查的技术。
背景技术
人原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌,为我国常见恶性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位,仅次于胃癌和食管癌。我国约有1.2亿乙型肝炎表面抗原携带者,每年约有300万人可能从急性乙型肝炎发展为慢性肝炎,死于肝病30万人,其中12万人死于HCC，在我国，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染是导致发展原发性肝癌(HCC)的最直接原因，大多数肝癌患者的发病进展过程表现为慢性肝炎(chronic hepatitis,CH)、肝硬化(liver cirrhosis,LC)到HCC的发展进程。而在全世界每年新发现的肝癌病人中，其中就有42.5％发生在中国，因此中国是一个肝癌大国。对于肝癌患者来说早期手术治疗是根本的方法。目前早期对小肝癌行肝叶切除，可有根治的希望。然而诊断较晚，事实上80％以上肝癌患者被诊断时肿瘤已进入中晚期而失去手术机会。
通过临床研究表明，肝癌发现得越早，治疗效果越好，能提高病人的预后及存活率，因此早期预警筛查则显得尤其重要。然而，目前临床上早期筛查HCC的主要指标是血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平和影像学B超监测，但是一部分HCC患者血清AFP长期保持低水平(<20ng/ml)，而B超在检测和进一步判断结节的特征时有一定的局限性，从而影响到肝癌早期诊断的灵敏性。但目前临床上未有十分有效的早期检测方法，因此建立高灵敏，经济，简便的分子技术筛查方法尤为重要。
研究表明，肝细胞癌组织中存在多种肿瘤相关基因CpG岛的甲基化，构成其独特的甲基化谱，成为肝细胞癌的表观遗传标志，且在肿瘤发生的癌变前阶段中，肿瘤相关因子启动子甲基化异常在肿瘤发生发展中起重要作用。有研究认为，部分抑癌基因的异常甲基化在正常肝和慢性肝炎阶段未发现，肝硬化(liver cirrhosis,LC)开始出现，到HCC阶段有累加的趋势，而部分癌基因则与之相反，正常肝和慢性肝炎阶段至HCC阶段甲基化程度逐渐降低，这为肿瘤的早期诊断提供新的干预靶点。
RASSF相关区域家族1A基因(ras-association domain family 1A,RASSF1A)是定位于肿瘤高频杂合性丢失区域3p21.3位点的抑瘤基因,编码一个微管相关蛋白。该基因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默,是迄今为止在肿瘤组织中甲基化程度最高的基因之一。p16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，这是一种细胞周期中的管家基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，检测p16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。胚肝血影蛋白(embryonic liver fodrin，ELF)是一种新发现的β血影蛋白(β-Spectrin),在TGF-β信号通路中与Smad3/4相互作用，缺失ELF则Smad3/4不能定位。文献报道，抑癌基因ELF在正常肝组织中表达，而肝癌干细胞及肝癌组织中表达下调，并且在敲除ELF基因的小鼠中，40％自发产生肝癌，表明ELF在肝癌发生的早期发挥重要作用，但ELF在肝癌组织中表达下调的原因尚未明确。细胞因子信号转导负调控因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)家族是1997年以来被发现的JAK/STATs途径负性调节因子，包括CIS和SOCSl—7共8个成员，结构相似，由N区、中央区SH2结构域和C端SOCS box盒组成，SOCS3是调节机体诸多细胞因子信号的重要调控分子，在发育、免疫、肿瘤发生、代谢等许多生理调节过程中具有重要作用。SFRP1属于SFRP(secreted frizzled-related protein)基因家族，为Wnt/frizzled信号的胞外调节物，通过与Wnt反应或直接与frizzled反应而调节Wnt信号的传导，具有调节凋亡，在胚胎形成和肿瘤发生等多种生物学过程中发挥重要作用的功能，称为分泌型凋亡相关蛋白(SARP)。基因组重复序列LINE1(long interspersed nuclear elements)是一种分布在人类基因组内的内源性的易变基因序列。研究报道，大约有4×105的LINE1重复拷贝存在于人类基因组，它们占据整个人类基因组的5％。LINE1启动子甲基化会抑制反转座子激活和转录,所以L1的甲基化程度可以作为衡量基因组稳定性和癌基因活跃程度的标志之一。
正常人循环血液中存在少量游离DNA(约10ng/ml)，而肿瘤患者血浆DNA水平远远高于正常人(超过100ng/ml)。肿瘤患者循环血中游离DNA主要是肿瘤细胞凋亡或组织坏死后释放，并且保持有肿瘤细胞DNA的生物学特征改变。检测外周血游离DNA中基因甲基化的状态可能反应出患者肿瘤细胞的甲基化状态。鉴于理想的分子标志物出现在疾病发生的早期含量较低，所以迫切需要寻找高灵敏度和无创性的早期检测手段。
甲基化是蛋白质和核酸一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT),以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为供体，将甲基转移到待定的碱基上的过程。他能通过结合甲基化结合域(MBD)等和组蛋白去乙酰化能引起基因的表达沉默，在肿瘤形成中，DNA甲基化紊乱可表现为基因组整体的低甲基化(hypomethylation)以及特定区域(如启动子区域)高甲基化。而研究结果提示亚硫酸氢盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。由于尿嘧啶与胸腺嘧啶(T)相似，在DNA聚合反应过程中可以作为胸腺嘧啶，根据修饰后的差异DNA设计PCR引物，当进行PCR反应时，在扩增后的产物中变成胸腺嘧啶，而5-甲基胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理过程中不发生改变，经PCR扩增后的产物依然是胞嘧啶，最后对PCR产物进行分析就可判断CpG位点是否发生甲基化。
复合扩增基因座技术(multiplex ploymerase chain reaction,m-PCR)也称多重PCR，是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段；多重PCR是在同一PCR反应体系里加上多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR扩增体系中包含有化学修饰热启动Taq酶的Master Mix，可避免由非特异性扩增和引物二聚体引起的非特异性产物的形成，适用于50-1500bp、多达30对引物的多重PCR扩增，对不同的引物对能保证相近的扩增效率，可处理不同长度和GC含量的片段。它的特点主要有三点：①高效性，在同一PCR反应管内对有多个型别的目的基因进行分型②经济性，可最大限度的节省检材用量及试剂消耗。③简便性，多个基因在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，为临床提供更多更准确的诊断信息。而本专利中主要用于RASSF1A、p16、ELF、SOCS3、SFRP1、LINE1六基因的甲基化反应，而PCR产物检测方法主要有两种—PAGE银染和毛细管电泳。
PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)即聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。用于分离蛋白质和寡核苷酸。其原理是因为聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；该技术选用非变性聚丙烯酰胺凝胶，其在电泳的过程中，PCR产物能够保持完整状态，并依据其分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。银染显色中，在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银(银离子)还原成金属银，以使银颗粒沉积在PCR产物带上，染色的程度与基团有关。
毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。本技术采用的毛细管电泳分离模式为毛细管凝胶电泳，在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为肝癌早期预测提供一种新选择。
本发明的技术方案是用于肝癌早期预警和筛查的试剂盒，包括扩增如下基因的引物：启动区CpG岛甲基化状态的RASSF相关区域家族1A基因(RASSF1A)、p16基因、胚肝血影蛋白(ELF)、细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3)基因SOCS3、分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled-related protein)基因SFRP1和基因组重复序列LINE1，引物序列见表1；
表1引物序列
注：表中的M，即methylation，表示针对启动区CpG岛的甲基化特异性PCR引物。表中的U，即unmethylation，表示针对启动区CpG岛的非甲基化特异性PCR引物。
具体的，所述的引物按照RASSF1A：p16：SFRP1：ELF摩尔比＝4：2：2：3，SOCS3：LINE1摩尔比＝30:1分别配制使用；或按照RASSF1A：p16：SFRP1：ELF：SOCS3：LINE摩尔比＝4：2：2：3：6：0.5的比例配制使用。
具体的，将RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3和LINE的引物混合使用时，采用毛细管电泳对扩增产物进行分离。
具体的，将RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3和LINE的引物分为RASSF1A、p16、SFRP1和ELF混合，SOCS3和LINE1混合使用时，采用PAGE对扩增产物进行分离。
具体的，将RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3和LINE的引物混合包装时，采用毛细管电泳对扩增产物进行分离。
具体的，将RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3和LINE的引物分为RASSF1A、p16、SFRP1和ELF混合，SOCS3和LINE1混合包装时，采用PAGE对扩增产物进行分离。
具体的，PAGE电泳后采用银染显色法。
具体的，所述引物的扩增条件如下：94℃30s，30cycles；95℃预变性15min，63℃退火1min30s，72℃延伸10min；72℃1min30s。
由于p16扩增条带片段大小与SOCS3相近，LINE1扩增条带片段大小与ELF相近，所以在进行PAGE电泳时，需将6基因分两组进行电泳，而毛细管电泳由于其特异性及荧光引物的区分，6基因可同时电泳，采用PAGE电泳后，也可进行琼脂糖凝胶电泳，但考虑到病人血浆的低浓度，则采用灵敏度更高的银染显色法。
本发明的有益效果：本发明创造性地提供了能有效进行肝癌尤其是早期肝癌以及肝硬化预警和筛查的技术方法。该方法结合了复合扩增PCR技术以及灵敏度更高的PAGE银染和毛细管电泳检测技术。首先通过对六基因进行复合扩增PCR，大大节约了模板的DNA量以及时间的消耗，既有高效性、经济性以及简便性三大特点，而随后的检测方法—PAGE银染法能够检测到琼脂糖胶电泳不能看到的PCR产物，约提高灵敏度20倍，毛细管电泳技术是基于使用荧光引物的电泳分离分析方法，相比银染法，其灵敏度更甚，相较于琼脂糖提高上万倍，具体为当模板DNA浓度为50ng/ul时，毛细管能检测到5基因的甲基化情况，当模板DNA浓度为为12.5ng/ul时，毛细管能检测到4基因的甲基化情况(除SOCS3外)，当模板DNA浓度为6.25ng/ul时，毛细管能检测到3基因的甲基化情况(除SOCS3及SFRP1外)。本发明为本领域早期肝癌以及肝硬化预警和筛查提供了新的有效检测方法，且成本低，使用起来也非常方便，灵敏度高，特异性好，具有很好的应用前景。
附图说明
图1、RASSF1A、p16、SFRP1、ELF及SOCS3基因甲基化引物阳性对照毛细管电泳检测结果(利用经过SssI甲基化转移酶及亚硫酸氢盐修饰后的胎盘DNA作为阳性对照)。
图2、RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3基因非甲基化引物阳性对照毛细管电泳检测结果(利用正常人肝脏组织DNA经过亚硫酸氢盐修饰后作为对照)。
图3、RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3基因非甲基化引物阴性对照(反应体系中除无甲基化引物外，其余成分与甲基化阳性对照相同，此对照作用为避免假阳性的出现)
图4、LINE1基因阳性对照(由于LINE1为癌基因，其他5基因为抑癌基因，且据相关文献报道LINE1在胎盘各时期均呈不同甲基化水平状态，故查阅相关文献采用经过亚硫酸氢盐修饰后的K562细胞作为对照)
图5、空白对照(反应体系中除模板DNA外，其余成分与甲基化阳性对照和非甲基化阳性对照相同)；M，methylation；U，unmethylation。
图6、复合扩增甲基化特异性PCR毛细管电泳检测方法的灵敏度。a，血浆DNA浓度为100ng/ul；b，血浆DNA浓度为50ng/ul；c，血浆DNA浓度为12.5ng/ul；d，血浆DNA浓度为6.25ng/ul。
图7、RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3甲基化引物阳性对照毛细管电泳检测方法的可靠性(三个重复)，即对对照进行重复性检测，确保其重复性。
图8、RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3非甲基化引物阳性对照毛细管电泳检测方法的可靠性(三个重复)，即对对照进行重复性检测，确保其重复性。
图9、RASSF1A、p16、SFRP1、ELF、SOCS3甲基化引物阴性对照毛细管电泳检测方法的可靠性(三个重复)，即对对照进行重复性检测，确保其重复性。
图10、LINE1基因阳性对照(三个重复)。M，methylation；U，unmethylation。
图11、空白对照(三个重复)。M，methylation；U，unmethylation。
图12、RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因阳性对照PAGE电泳银染结果。1，RASSF1A、p16、SFRP1、ELF甲基化引物阳性对照；2，RASSF1A、p16、SFRP1、ELF非甲基化引物阳性对照；3，RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF甲基化引物阴性对照；4，LINE1甲基化产物；7，LINE1非甲基化产物；5、6，DL2000Marker；8，SOCS3甲基化产物；9，SOCS3非甲基化产物；M，methylation；U，unmethylation；DNA分子量标准DL2000。
图13、人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化PAGE电泳银染结果。a，肝癌病人；b，肝硬化病人；c，良性病变病人，d，正常人。
图14、肝癌病人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化毛细管电泳检测结果。M，methylation；U，unmethylation。
图15、肝硬化病人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化毛细管电泳检测结果。M，methylation；U，unmethylation。
图16、正常人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化毛细管电泳检测结果。M，methylation；U，unmethylation。
图17、10例肝癌病人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化状态汇总。
图18、5例肝硬化病人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化状态汇总。
图19、4例正常人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化状态汇总。
图6～11中的横坐标代表扩增片段的长度，图1～5、14～16中的横坐标代表代表扩增片段的长度，纵坐标代表峰值高低。
图17～19中，黑色区域表示检测DNA中相应的基因启动子区域发生了甲基化。
具体实施方式
本发明采用了复合扩增甲基化特异性PCR(Multiplex methylation-specificPCR)检测了10例HCC的血浆、5例LC患者的肝硬化血浆，以及4例正常人血浆中ELF、RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1和SOCS3基因启动子区启动区CpG岛的甲基化状态。研究了HCC发生发展进程各阶段患者的血浆DNA甲基化状态。寻找灵敏性较高的无创性血浆生物分子标志物，用于HCC早期诊断及LC患者的监测以对早期肝癌进行高危预警。
上述的早期预警和筛查技术中还包括PAGE银染检测以及毛细管电泳检测方法。
主要实验仪器设备与器材：隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；-80℃低温冰箱(SANYO)；凝胶成像系统(Bio-Rad)；台式高速离心机(Hettich)；TG16-W微量台式离心机(湘仪离心机有限公司)；3-18K冷冻台式离心机(Sigma)、J2-21冷冻离心机(Beckman)；Smart Spec紫外分光光度仪(Bio-Rad)；Mygene 25型PCR仪(Long Gene)：电泳槽、电泳仪(PHARMACIA)；Type 16700漩涡振荡器(Thermolyne)；LH506-2恒温水浴箱(上海科乐理化机械公司)；DHG-9030电热恒温鼓风干燥箱(上海鸿都电子科技公司)；ECLPS E600倒置显微镜(Nikon)；SW-CJ-IF超净工作台(苏净公司)；MCO-15A型CO2培养箱(SANYO)；GeneticAnalyzer 310(ABI公司)；K562细胞及Hep3B细胞均购于上海生化细胞所。
银染的扩增体系见表2，毛细管电泳的扩增体系见表3，引物信息见表4。本申请正文及序列表中的同义引物即指本领域常称呼的正向引物或者上游引物，反义引物即指本领域常称呼的反向引物或者也叫下游引物。
表2银染扩增体系
表3毛细管电泳扩增体系
复合扩增PCR反应条件为：94℃30s，30cycles；95℃预变性15min，63℃退火1min30s，72℃延伸10min；72℃1min30s。
表4引物信息
上表中的M，即methylation，表示针对启动区CpG岛的甲基化特异性PCR引物。表中的U，即unmethylation，表示针对启动区CpG岛的非甲基化特异性PCR引物。
实施例1复合扩增甲基化特异性PCR毛细管电泳检测方法试验
1、特异性
以K562细胞作为LINE1阳性对照，Hep3B细胞作为SOCS3阳性对照，经过Sssl甲基化转移酶(购于NBI公司)修饰后的胎盘DNA作为RASSF1A、p16、SFRP1、ELF四基因的甲基化引物阳性对照，而正常人肝组织DNA则作为非甲基化引物阳性对照。以上六基因均经过亚硫酸氢盐修饰后进行复合扩增甲基化特异性PCR。结果见图1、2、3、4、5，其中图1为利用经过SssI甲基化转移酶及亚硫酸氢盐修饰后的胎盘DNA作为模板，5基因甲基化引物进行复合扩增甲基化特异性PCR后，毛细管电泳检测条带，图2为以正常人肝脏组织DNA经过亚硫酸氢盐修饰后作为模板，5基因非甲基化引物进行复合扩增甲基化特异性PCR后，毛细管电泳检测条带，图3为以正常人肝脏组织DNA经过亚硫酸氢盐修饰后作为模板，5基因甲基化引物进行复合扩增甲基化特异性PCR后，毛细管电泳检测条带，反应体系中除无甲基化引物外，其余成分与甲基化阳性对照相同，此对照作用为避免假阴性的出现，图4为以K562细胞经过亚硫酸氢盐修饰后的DNA作为模板，LINE1基因甲基化引物以及非甲基化引物进行复合扩增甲基化特异性PCR后，毛细管电泳检测条带，图5为空白对照，反应体系中除模板DNA外，其余成分与甲基化阳性对照和非甲基化阳性对照相同，此对照作用避免假阳性的出现。
2、灵敏度
将经过Sssl甲基化转移酶(购于NBI公司)修饰后的胎盘DNA溶于正常人血浆，使用试剂盒重新提取DNA，然后将5个基因RASSF1A、p16、SFRP1、ELF及SOCS3复合扩增甲基化特异性PCR(由于LINE1属于癌基因，而以上5个基因属于抑癌基因，两者阳性对照不同，故灵敏度实验未将LINE1基因纳入)。结果见图6，其中a图表示当血浆DNA浓度为100ng/ul时，毛细管电泳能够检测到ELF、RASSF1A、p16、SFRP1及SOCS3基因甲基化状态，b图表示当血浆DNA浓度为50ng/ul时，毛细管电泳能够检测到ELF、RASSF1A、p16、SFRP1及SOCS3基因甲基化状态，c图表示当血浆DNA浓度为12.5ng/ul时，毛细管电泳能够检测到ELF、RASSF1A、p16及SFRP1基因甲基化状态，d图表示当血浆DNA浓度为6.25ng/ul，毛细管电泳能够检测到ELF、RASSF1A及p16基因甲基化状态。
3、可靠性
为了增加实验技术的可靠性，即重复特异性实验三次。结果见图7-11，根据结果所示说明该技术稳定较好。
实施例2人肝癌、肝硬化、肝良性病变，以及正常人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区复合扩增甲基化特异性PCR及相关检测
抑癌基因RASSF1A、p16、SFRP1、ELF及SOCS3在正常人血浆中表达，肝癌病人血浆及肝癌组织中表达下调，而癌基因LINE1则与之相反。本发明从DNA甲基化的角度利用高效便利的复合扩增PCR技术及高灵敏的PAGE银染与毛细管电泳检测技术探讨RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动子区启动区CpG岛的甲基化状态与HCC的关系，为进一步分析DNA含量微量的血浆标本中基因RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3启动子区甲基化状态奠定实验基础。
本实施例通过复合扩增PCR方法扩增RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动子区，为进一步进行检测研究奠定实验基础。
1临床标本
本实施例中采用的标本均在签署知情同意书前提下，于2012年3月至2012年5月期间收集自四川大学华西第一医院的患者，包括在普外科接受手术治疗的原发性肝癌患者、肝硬化患者和肝血管瘤患者，而正常人血浆在病人签署知情同意书前提下来自四川大学华西第四医院。
血浆标本共19例，分别来自10例原发性肝癌(HCC)患者的血浆，5例未并发肝癌的肝硬化(LC)患者的肝硬化血浆，4例正常人血浆。
1.1细胞基因组DNA提取
K562细胞为LINE1阳性对照，Hep3B细胞为SOCS3阳性对照。取用普通方法培养的贴壁细胞，根据TIANamp Genomic DNA试剂盒(购于北京天根生化科技有限公司)关于细胞基因组DNA提取的操作说明稍作进行细胞基因组DNA提取。所得DNA溶液，经琼脂糖电泳鉴定、紫外分光光度法检测纯度及浓度后，用于后续实验模板或置于-20℃储存。
1.2组织基因组DNA提取
根据TIANamp Genomic DNA试剂盒关于组织基因组DNA提取的操作说明进行新鲜或冷冻人肝组织及胎盘标本的组织基因组DNA提取。经过Sssl甲基化转移酶(购于NBI公司)修饰后的胎盘DNA作为RASSF1A、p16、SFRP1、ELF四基因的甲基化引物阳性对照，而正常人肝组织DNA则作为非甲基化引物阳性对照。
1.3外周血标本血浆游离DNA提取
采用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒分离纯化血浆游离DNA，按照试剂盒操作说明进行外周血标本血浆游离DNA提取。所得DNA溶液紫外分光光度法定量，立即用于后续实验模板或置于-20℃储存。
1.4基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰
采用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold kit进行纯化修饰DNA，按照试剂盒操作说明进行外周血标本血浆DNA及组织DNA修饰。所得DNA溶液立即用于后续实验模板或置于-20℃储存。
2引物设计
根据文献查找确定基因RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3启动子区甲基化与非甲基化引物序列。引物序列如表4。
3RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因复合扩增PCR
以来自肝癌病人血浆DNA、肝硬化病人血浆DNA以及正常人血浆DNA为模板进行复合扩增PCR。每个PCR反应体系组成：80ng DNA模板，复合扩增PCR MIX，RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3上下游引物混合物(PAGE银染引物混合比例为RASSF1A：p16：SFRP1：ELF＝4：2：2：3，SOCS3：LINE1＝30:1；毛细管荧光引物混合比例RASSF1A：p16：SFRP1：ELF：SOCS3：LINE＝4：2：2：3：6：0.5)，用灭菌双蒸水补足总体积25ul，混匀后瞬时离心去除管盖内壁水珠。
扩增条件为：94℃30s，30cycles；95℃预变性15min，63℃1min30s，72℃延伸10min；72℃1min30s。
本实验成功建立RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区复合扩增甲基化特异性PCR体系，为进一步分析DNA含量微量的血浆标本中基因RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3启动子区甲基化状态奠定实验基础。
4PAGE和银染
4.1 12％PAGE，配方见表5。
表5 PAGE配方
4.2银染液与染色液，配方见表6。
表6银染液配方
银染液(1％AgNO<sub>3</sub>) 显色液
0.5g AgNO<sub>3</sub>+500ml H<sub>2</sub>O 20g NaOH+4ml甲醛，溶于1L H<sub>2</sub>O
4.3PAGE电泳，100V电泳2h。
4.4银染
胶置于盘中加入银染液(1％AgNO3)约250ml，放在摇床上反应约15min后，双蒸水洗两次，再加入显色液(即20g NaOH与4ml甲醛一起溶于1L H2O)，磁盘放于摇床上反应直至条带出现，PAGE胶变黄。
4.5电泳结果
银染的电泳结果见图12和图13，其中图12为RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因阳性对照PAGE电泳银染的结果，根据图中所示，各基因条带产物位置准确，无特异性条带出现，图13为肝癌病人、肝硬化病人、良性病变病人及正常人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化PAGE电泳银染结果，由结果可见肝癌病人、肝硬化病人、良性病变病人及正常人血浆DNA中6基因的甲基化状态结果具有差异。
5毛细管电泳
毛细管电泳荧光引物修饰及纯化方式如表7。电压15KV，温度60℃，每个样品30min。结果见图14，15，16，17，18，19。其中图14，15，16分别为肝癌病人、肝硬化病人及正常健康人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化毛细管电泳检测结果，据图所知，肝癌病人、肝硬化病人、良性病变病人及正常人血浆DNA中6基因的甲基化状态结果具有显著差异，图17，18，19分别为10例肝癌病人、5例肝硬化病人及4例正常人血浆DNA中RASSF1A、p16、SFRP1、LINE1、ELF及SOCS3基因启动区甲基化状态汇总，据统计图所知(图17～19)，肝癌病人、肝硬化病人、良性病变病人及正常人血浆DNA中6基因的甲基化状态结果具有显著差异。
表7引物修饰及纯化
引物名称 5修饰 3修饰 纯化方式
RASSF1A-M同义引物 FAM 否 HPLC
RASSF1A-M反义引物 否 否 HPLC
RASSF1A-U同义引物 FAM 否 HPLC
RASSF1A-U反义引物 否 否 HPLC
P16-M同义引物 FAM 否 HPLC
P16-M反义引物 否 否 HPLC
P16-U同义引物 FAM 否 HPLC
P16-U反义引物 否 否 HPLC
SFRP1-M同义引物 FAM 否 HPLC
SFRP1-M反义引物 否 否 HPLC
SFRP1-U同义引物 FAM 否 HPLC
SFRP1-U反义引物 否 否 HPLC
LINE1-M同义引物 FAM 否 HPLC
LINE1-M反义引物 否 否 HPLC
LINE1-U同义引物 FAM 否 HPLC
LINE1-U反义引物 否 否 HPLC
ELF-M同义引物 FAM 否 HPLC
ELF-M反义引物 否 否 HPLC
ELF-U同义引物 FAM 否 HPLC
ELF-U反义引物 否 否 HPLC
SOCS3-M同义引物 TAMRA 否 HPLC
SOCS3-M反义引物 否 否 HPLC
SOCS3-U同义引物 TAMRA 否 HPLC
SOCS3-U反义引物 否 否 HPLC
上表中的HPLC即高效液相层析(High Performance Liquid Chromatography)。

Claims (1)

1.用于肝癌早期预警和筛查的试剂盒，其特征在于：包括扩增如下基因的引物：启动区CpG岛甲基化状态的RASSF相关区域家族1A基因RASSF1A、p16基因、胚肝血影蛋白ELF、细胞因子信号转导抑制因子3基因SOCS3、分泌型卷曲相关蛋白1基因SFRP1和基因组重复序列LINE1，引物序列见 下表；
注：表中的M，即methylation，表示针对启动区CpG岛的甲基化特异性PCR引物；表中的U，即unmethylation，表示针对启动区CpG岛的非甲基化特异性PCR引物；
所述的引物按照RASSF1A：p16：SFRP1：ELF摩尔比＝4：2：2：3，SOCS3：LINE1摩尔比＝30：1分别配制使用；或按照RASSF1A：p16：SFRP1：ELF：SOCS3：LINE摩尔比＝4：2：2：3：6：0.5的比例配制使用。
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