CN110541040B - 一种利用arms-pcr技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒 - Google Patents
一种利用arms-pcr技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用ARMS‑PCR技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒。其检测方法为：(1)提取待测样本DNA，并用亚硫酸氢盐对其进行处理；(2)利用设计的引物对步骤(1)处理后的DNA片段进行ARMS‑PCR即可。本发明针对甲基化和未甲基化的CpG位点设计ARMs引物来特异性扩增体液特异性的CpG位点，进而识别体液样本。该技术可检测CpG位点的甲基化水平，检测方法特异性高，操作简单，成本低，检测准确，识别能力高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用ARMS-PCR技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒。
背景技术
在法医学案件现场，血液、精液、唾液、阴道分泌物以及月经血等体液是常见的物证检材。这些体液检材，不仅能用于DNA分型和个体识别，并且检材的生物学来源对案件性质的判定、案件方向的指明以及犯罪现场的重塑具有重要意义。
既往研究已经开发了多种体液识别方法，例如化学检测、免疫学检测、光谱分析和显微镜检测等。这些传统的体液检测方法特异性低，破坏并消耗检材，检测结果还容易受假阳性和假阴性结果的影响。另外，传统的体液识别方法大多是推定结果，并且一次检测仅针对一种体液，不能实现对多种体液的复合鉴定(即通过一次实验便可对多种体液进行性质鉴定)。随着分子生物学技术的发展，已经有大量的文献报道了具有体液特异性的mRNA、miRNA以及DNA甲基化等分子生物学标记，在法医学实践中具有体液鉴定的潜在价值。对于mRNA，自然环境中的RNA酶使它非常容易降解，尤其是对微量检材或者陈旧检材的影响更大。对于miRNA，它虽然是研究的热点，但其体液识别鉴定标准还不完善，在实际应用中仍存在一定的缺陷。而对于DNA甲基化，它相对稳定，不仅与个人识别相兼容，而且不会进一步损耗检材尤其是微量检材。
表观遗传是在不改变DNA序列的情况下发生的基因表达变化。在人类中，研究最广泛的表观遗传修饰就是DNA甲基化，其主要发生在胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)(CpG)二核苷酸上。在人类基因组中，大约60-90％的CpG位点是被甲基化的，高频率的CpG位点区域称为CpG岛，通常与基因的调控区域相关。既往研究表明，通过全基因组分析，证实了DNA携带组织特异性的甲基化模式，并且在法医学领域已经初步得到可用于体液鉴定的组织特异性DNA甲基化标记。
因此对组织特异性差异甲基化区(tDMR，tissue-specific differentiallymethylated regions)中某些CpG位点的甲基化状态进行检测能够鉴定样本的细胞或者组织来源。同时，对DNA甲基化的检测不会消耗额外样本，并能利用DNA分子的稳定性鉴别体液类型。因此，对CpG位点甲基化检测可以克服现有方法的很多局限性，如稳定性差、微量检材和陈旧检材鉴定困难等。当然，理想的体液特异性CpG位点应该在目标体液中完全甲基化(>90％)，在其他所有体液中完全未甲基化(<10％)，反之亦然。
目前，已经有较多文献对组织特异性甲基化模式进行了报道。2011年Frumkin等人首次利用甲基敏感的限制酶检测DNA甲基化状态并进行法医学体液鉴定。2012年，Wasserstrom等人开发了一个用DNA甲基化来识别精斑的试剂盒(NucleixDSI-Semenkit)。2012年，Lee等人和Madi等人采用亚硫酸氢盐测序技术检测DNA甲基化水平，对精液、唾液、月经血、阴道分泌物和口腔拭子等体液检材进行了识别。2017年，Jung等人联合了7个实验室通过单碱基延伸法(SNaPshot)检测了多个CpG位点，最终构建了由7个CpG位点组成的复合扩增系统，检测并体液特异性的甲基化位点。
不过既往研究仍存在较多问题：(1)目前得到的体液特异性CpG位点很少。之前已根据芯片和测序结果筛选出了一些识别体液的CpG位点，但有效识别体液的CpG位点较少，而且特异性不高；
(2)已有的甲基化状态检测方法比较复杂，操作繁琐、检测成本高、效率低。目前对甲基化的检测手段有酶切法、甲基化特异性扩增、单碱基延伸法和焦磷酸测序法。其中，酶切技术受限于内切酶的种类和酶切效率，并且酶切不完全会影响最终的体液识别结果；甲基化特异性扩增法并不能反映体液样本中甲基化的真实水平；而单碱基延伸法虽然准确性好，但是需要经过两次扩增才能检测位点的甲基化水平，操作繁琐；另外，焦磷酸测序法虽然是检测甲基化水平的高标准，但成本高，操作复杂，而且成功率低。
(3)目前构建的有效识别体液的复合系统容量较小，识别能力有待提高。既往研究虽然已初步得到鉴定结果，但是并没有建立大容量的复合系统以提高体液鉴定的能力，同时目前还没有根据已有的检测结果建立体液鉴定的判别标准，而且不同实验室获得的结果在准确性和特异性上还存在差异。因此，需要进一步研究筛选体液特异性CpG位点，建立全新的体液鉴定方法，简化体液鉴定的流程，提高样本的检测效率。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种利用ARMS-PCR技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒，本发明针对甲基化和未甲基化的CpG位点设计ARMs引物特异性扩增CpG位点，检测CpG位点的甲基化水平，进而识别体液样本，同时，该检测方法特异性高，操作简单，成本低，检测准确，识别能力高。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测甲基化水平的引物，该引物包括若干组分别与若干CpG位点一一对应的引物；每组引物包括两条位于CpG位点上游的特异性引物和一条位于CpG位点下游的通用引物；或两条位于CpG位点下游的特异性引物和一条位于CpG位点上游的通用引物；
该特异性引物的3’端末端碱基分别与CpG位点的甲基化和未甲基化保持一致，每条特异性引物的3’端倒数第二或第三位碱基上引入错配碱基，在毛细管检测过程中用荧光标记。
进一步地，CpG位点为利用生物信息学检索方法确认的CpG位点，或DNA甲基化芯片筛选得到的CpG位点。
进一步地，CpG位点为USP49、cg26763284、cg17610929、cg23521140、cg05261336、cg05656364-283d、cg22407458-288d、cg17621389、cg09696411、cg25416153、cg09765089-CVF2、cg08792630、cg06379435-VB1、cg06379435-VB2、cg01607849、cg26285698、cg16732616、cg21597595、cg26107890、cg15731815、cg09652652-2d、cg05761971、cg09765089-CVF1。
进一步地，该引物包括：
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USP49-R-T:CCRCCACACTCAAACTTCA；(SEQ ID NO.2)
USP49-R-C:CCRCCACACTCAAACTTCG；(SEQ ID NO.3)
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cg17610929-R:TCCCTTATCAACACCAACACAACT；(SEQ ID NO.9)
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cg23521140-F-T:GGGGTGTTGAATTTTTTTTAGGTCTT；(SEQ ID NO.11)
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一种利用ARMS-PCR技术检测甲基化水平的方法，前期研究包括以下步骤：
(1)提取待测样本DNA，并用亚硫酸氢盐对其进行处理；
(2)利用上述引物对步骤(1)处理后的DNA片段进行ARMS-PCR扩增即可。
一种用于检测CpG位点甲基化水平的试剂盒，包括上述引物，以及试剂盒中的常规成分。
本发明的有益效果为：
本发明针对甲基化和未甲基化的CpG位点设计ARMs引物来特异性扩增CpG位点，检测CpG位点的甲基化水平，进而识别体液样本，同时，该检测方法特异性高，操作简单，成本低，检测准确，识别能力高。
附图说明
图1为USP49位点ARMS-PCR扩增结果和Sanger测序结果；其中，图1A为ARMS-PCR扩增结果；图1B、图1C、图1D为Sanger测序结果；
图2为cg05261336位点ARMS-PCR扩增结果和Sanger测序结果；其中，图2A为ARMS-PCR扩增结果；图2B、图2C、图2D为Sanger测序结果；
图3为cg17610929位点ARMS-PCR扩增结果和Sanger测序结果；其中，图3A为ARMS-PCR扩增结果；图3B、图3C、图3D为Sanger测序结果；
图4为cg06379435位点ARMS-PCR扩增结果和Sanger测序结果；其中，图4A为ARMS-PCR扩增结果；图4B、图4C为Sanger测序结果；
图5为cg15731815位点ARMS-PCR扩增结果和Sanger测序结果；其中，图5A为ARMS-PCR扩增结果；图5B为Sanger测序结果；
图6为cg06379435位点ARMS-PCR扩增结果和Sanger测序结果；其中，图6A为ARMS-PCR扩增结果；图6B为Sanger测序结果；
图7为本发明的流程图；
图8为复合体系检测结果，其中，图8A为Panel A-M和Panel A-UM的检测结果；图8B为Panel B-M和Panel B-UM的检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
1、样本收集
遵照知情同意原则，收集血液、精液、阴道分泌物、月经血、口腔拭子等无关个体的体液样本。外周静脉血样本1ml，并EDTA抗凝。取阴道分泌物、口腔上皮细胞于无菌棉签拭子上，月经血、静脉血于无菌纱布上，室温下晾干。以上样本均置于-20℃冰箱中保存备用。
2、样本基因组DNA提取和亚硫酸氢盐转换
有机法提取收集得到的样本基因组DNA，并用NanoDrop 1000来检测样本的浓度和纯度。根据Epitect Fast DNA Bisulfite Kit的说明书，对体液样本的DNA进行亚硫酸氢盐转换。
实施例2
1、CpG位点筛选
可以利用生物信息学的检索方法，将目前已确认的CpG位点作为候选位点，也可以利用芯片公司合成的DNA甲基化芯片筛选，根据位点的甲基化水平确定具有鉴定意义的CpG位点。
2、引物设计
基于ARMS技术原理设计CpG位点的引物，在CpG位点的上游分别设计针对甲基化和未甲基化状态的特异性引物以及位于CpG位点下游的普通引物，反之亦然。
针对CpG位点设计ARMS引物主要分两个部分：(1)首先使用Primer5引物设计工具设计普通引物，要求前引物3’末端碱基位于目标CpG位点上，后引物位于CpG位点下游，目标片段长度低于300bp；(2)然后对CpG位点的甲基化和未甲基化设计特异性引物，修改(1)中前引物3’末端的碱基，使其与CpG位点的甲基化和未甲基化状态一致，得到两条前引物后再在每条引物3’末端倒数第二或第三位碱基上引入错配，最终获得ARMS特异性引物。并使用Oligo 7评估其性能，并根据软件测评结果调整引物错配。
实施例3
检测引物的扩增情况和特异性：
取一个CpG位点的两条CpG特异性引物(FC，FT)保存液各2μL，分别加入到两个均装有16μL TE和2μL后引物(R)保存液的200μL离心管中，充分混匀，得到浓度为10μM的引物工作液PC、PT。
在预实验中，使用
Multiplex PCR Kit(包含2×QIAGEN MultiplexPCR Master Mix和RNase-free water)，根据说明书提供的扩增体系及扩增参数建议，采用10μL反应体系(见表1)及梯度退火温度扩增(见表2)。
表1预实验中ARMS-PCR反应体系
表2预实验中ARMS-PCR反应条件
对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE电泳)，检测PCR产物的扩增情况，根据跑胶结果对引物进行调整优化，以获得较高特异性的引物和最适退火温度。最后扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果与跑胶结果对比。根据单对引物扩增预实验结果和测序结果，获得候选CpG位点特异性引物，并对特异性引物标记不同的荧光，通用引物不标记荧光。本申请中共筛选出了以下位点，设计出了与之相匹配的引物，并用FAM和HEX荧光分别标记甲基化和未甲基化引物，其结果见表3。
表3 CpG位点及引物详细信息
实施例4
根据实施例3建立的ARMS-PCR和引物信息对CpG位点进行PCR，然后对扩增产物进行PAGE电泳，并用Sanger测序验证扩增结果，具体如下：
1、以精液特异性的USP49位点为例，用Primer C(USP49-R-C)和Primer T(USP49-R-T)分别扩增精液、阴道分泌物、月经血、静脉血和唾液样本各一例，电泳结果如图1A所示。
然后再对阴道分泌物、月经血和精液样本进行Sanger测序，测序结果分别如图1B、图1C和图1D所示，与PAGE电泳结果一致。
2、以精液特异性的cg05261336位点为例，用Primer C(cg05261336-F-C)和PrimerT(cg05261336-F-T)分别扩增月经血、唾液、静脉血、精液和阴道分泌物样本各两例，电泳结果如图2A所示。
然后再对阴道分泌物、月经血和精液样本进行Sanger测序，测序结果分别如图2B、图2C、图2D所示，与PAGE电泳结果一致。
3、以精液特异性的cg17610929位点为例，用Primer C和Primer T分别扩增月经血、唾液、静脉血、精液和阴道分泌物样本各两例，电泳结果如图3A所示。
然后再对阴道分泌物、月经血和精液样本进行Sanger测序，测序结果分别如图3B、3C和3D所示，为与C碱基互补的G碱基，与PAGE电泳结果一致。
4、以血液特异性的cg06379435位点为例，用Primer C和Primer T分别扩增静脉血、阴道分泌物、精液、月经血和唾液样本，电泳结果如图4A所示。
然后再对精液和血液样本进行Sanger测序，测序结果分别如图4B和图4C所示，与PAGE电泳结果一致。
5、以唾液特异性的cg15731815位点为例，用Primer C和Primer T分别扩增静脉血、阴道分泌物、精液、月经血和唾液样本，电泳结果如图5A所示。
然后再对精液样本进行Sanger测序，测序结果显示为T碱基，测序结果如图5B所示，与PAGE电泳结果一致。
6、以血液特异性的cg06379435位点为例，用Primer C和Primer T分别扩增静脉血、阴道分泌物、精液、月经血和唾液样本各一例，电泳结果如图6A所示。
然后再对精液样本进行Sanger测序，测序结果显示为T碱基，测序结果如图6B所示，与PAGE电泳结果一致。
在图1-6A中，阴分表示阴道分泌物，M表示DNA marker，C和T分别表示针对甲基化的引物Primer C和针对未甲基化的引物Primer T
通过上述位点的检测结果可知，本发明设计的ARMS-PCR检测方法和引物可以有效地检测甲基化位点并进行分型。并且结果电泳结果与文献报道基本一致，初步证明ARMS-PCR技术可特异性扩增DNA甲基化位点，从而进行体液性质鉴定。
实施例6
1、建立复合引物体系
依据表1中各CpG位点扩增产物片段长度，以及各引物的不同荧光标记，建立引物复合引物体系(Primer Mix)，根据扩增产物电泳分型图调整体系内引物浓度配比，最终构建了4个Panel(PanelA-M，PanelA-UM，PanelB-M，PanelB-UM)用于体液鉴定，调整的复合体系详情见表4～5，优化后的扩增反应和扩增反应条件见表6和表7。
表4 Panel A-M和Panel A-UM中的引物浓度
表5 Panel B-M和Panel B-UM中的引物浓度
注：SA表示唾液；SE表示精液；VB表示静脉血；CVF表示阴道分泌物；
表6复合体系的PCR反应体系
表7复合体系的PCR反应条件
2、根据表4和表5中引物以及试剂的相关配比，建立了4个复合引物体系(PanelA-M，PanelA-UM，PanelB-M，PanelB-UM)，根据表6和表7对体液样本的亚硫酸氢盐转化后的DNA模板以及空白对照(去离子水)进行扩增，扩增产物使用3130遗传分析仪进行电泳分析，复合体系检测到的蓝色峰表示由FAM标记的甲基化特异性产物峰，绿色峰表示由HEX标记的非甲基化特异性产物峰。在毛细管检测甲基化分型分析中，将相对荧光单位100设为检测阈值。单个CpG位点在单个样本中甲基化值的计算是通过甲基化峰面积/(甲基化峰面积+非甲基化峰面积)而获得。
静脉血样本(VB33)的检测结果如图8所示，图8A为PanelA-M和PanelA-UM的检测结果；图8B为Panel B-M和PanelB-UM的检测结果，其中*表示非特异性的峰。在血液特异性高甲基化位点cg01607849，cg06379435-VB2，cg06379435-VB1，cg08792630中，VB33样本的甲基化值分别为0.796，0.921，0.942，0.43，在血液特异性低甲基化位点cg26285698中，VB33样本的甲基化值为0.000。均与文献报道结果一致。本专利对血液、精液、唾液、阴道分泌物以及月经血等体液各5个样本的检测结果，以均值和标准差的形式展示于表8中。
表8检测结果汇总
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种利用ARMS-PCR技术检测甲基化水平识别法医学体液检材的方法及其引物和试剂盒
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaagggtt aaggttgagg aaa 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccrccacact caaacttca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccrccacact caaacttcg 19
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attattaggg agggaaatag gttgatc 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attattaggg agggaaatag gttgatt 27
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctaaaacaa ccrattccca ac 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
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<400> 7
ttgatatgtt ttgaattatt acgc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgatatgtt ttgaattatt acgt 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcccttatca acaccaacac aact 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggggtgttga atttttttta ggtctc 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggggtgttga atttttttta ggtctt 26
<210> 12
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<212> DNA
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<400> 12
gctaccacaa aaaaaacaaa ctaaacc 27
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
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gttttttagt ggtttttagg gtac 24
<210> 14
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<212> DNA
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gttttttagt ggtttttagg gtat 24
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
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<400> 15
cccataactc taaactacta aaccacaa 28
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<211> 26
<212> DNA
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agtaagtagg aagtgaattg agggtt 26
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<211> 22
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tatctcaaaa caacccaaag ca 22
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<212> DNA
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<400> 18
tatctcaaaa caacccaaag cg 22
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<211> 25
<212> DNA
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ttttttttat atgtgaggaa agtgc 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttttttttat atgtgaggaa agtgt 25
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
catacataaa acttttcttc aaactat 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
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gttgaggttt ttgtagttga agt 23
<210> 23
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<212> DNA
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gcccaaataa caaacracra aaaacg 26
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<211> 26
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<400> 24
gcccaaataa caaacracra aaaaca 26
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<212> DNA
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gtggygtttg ttgttgggtc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtggygtttg ttgttgggtt 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
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<400> 27
accctctaaa acttatactc cc 22
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<211> 23
<212> DNA
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tgttttaaga ggatgataag gaa 23
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<400> 29
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<212> DNA
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taataacttc tacctataaa taaacacg 28
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<212> DNA
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gaggaatagy gagttttytg ac 22
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gaggaatagy gagttttytg at 22
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<212> DNA
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gacttcaact acaaaaacct caac 24
<210> 34
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<212> DNA
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tgttttaaga ggatgataag gaa 23
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<212> DNA
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<212> DNA
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taataacttc tacctataaa taaacacg 28
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<212> DNA
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ggggtttagg ttatgttatt gttgta 26
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<212> DNA
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attaaaccct actttccrac aaacg 25
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<212> DNA
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gggtatygtt aggaaagaaa aatgt 25
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caactatctc taattaaacc ctactttgcg 30
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<212> DNA
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gggaggggta gtttatatag gtatagatt 29
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attcctacca aaccttacca acc 23
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attcctacca aaccttacca acc 23
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gttggggtat agttgtttag taatatgt 28
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gtctatcccc cacatcctcc atcta 25
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gttggaagga ttgtttgtg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 24
<212> DNA
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ataccrtaaa acaactacaa cacg 24
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<212> DNA
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ttttggtggt ttggggttta 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cttctttcac aacrctctca 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttctttcac aacrctctcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tttgggtttt ttatttttgg attag 25
<210> 56
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<212> DNA
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<400> 56
tccraaaccc ttcctgca 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tccraaaccc ttcctgcg 18
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<212> DNA
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<400> 58
gtagagtttt attttttgtt ttttat 26
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caaccccctc ccctctca 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
caaccccctc ccctctcg 18
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggggattygt ttygttaggt 20
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ccacraataa ataaccacra taaacca 27
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ccacraataa ataaccacra taaaccg 27
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggagaaaggt gagttataga atagtt 26
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctctcccttc ccttctaaaa ca 22
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ctctcccttc ccttctaaaa cg 22
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gtgtattaga ttatgtttat gaggtatc 28
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gtgtattaga ttatgtttat gaggtatt 28
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atacctacct caatactaac cc 22
Claims (6)
1.一种用于检测甲基化水平的引物，其特征在于，所述引物包括若干组分别与CpG位点一一对应的引物；每组引物包括两条位于CpG位点上游的特异性引物和一条位于CpG位点下游的通用引物；或两条位于CpG位点下游的特异性引物和一条位于CpG位点上游的通用引物；
所述特异性引物的3’端末端碱基分别与CpG位点的甲基化和未甲基化保持一致，每条特异性引物的3’端倒数第二或第三位碱基上引入错配碱基，且每组引物中的每条特异性引物具有不同的荧光标记；
所述引物具体序列如SEQ ID NO.1~69所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测甲基化水平的引物，其特征在于，所述CpG位点为能够利用生物信息学检索方法确认的体液特异性CpG位点。
3.根据权利要求2所述的用于检测甲基化水平的引物，其特征在于，所述CpG位点为USP49上的CpG位点、cg26763284、cg17610929、cg23521140、cg05261336、cg05656364-283d、cg22407458-288d、cg17621389、cg09696411、cg25416153、cg09765089-CVF2、cg08792630、cg06379435-VB1、cg06379435-VB2、cg01607849 、cg26285698、cg16732616、cg21597595、cg26107890、cg15731815、cg09652652-2d、cg05761971、cg09765089-CVF1。
4.一种利用ARMS-PCR技术检测法医学体液检材甲基化水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样本DNA，并用亚硫酸氢盐对其进行处理；
（2）利用权利要求3所述的位点和引物建立复合引物；所述复合引物为Panel A-M、Panel A-UM、Panel B-M和Panel B-UM；再利用上述复合引物对步骤（1）处理后的DNA片段进行ARMS-PCR，然后根据检测所得甲基化水平，即可判断该样本属于何种类型的法医学体液；
所述Panel A-M由如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.15所示的引物组成；
所述Panel A-UM由如SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示的引物组成；
所述Panel B-M由如SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQID NO.61、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.30所示的引物组成；
所述Panel B-UM由如SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的引物组成。
5.根据权利要求4所述的利用ARMS-PCR技术检测法医学体液检材甲基化水平的方法，其特征在于，步骤（2）中所述ARMS-PCR的反应体系包括：5μL 2×QIAGEN Multiplex PCRMaster Mix、2.5μL引物工作液Panel A-M/A-UM/B-M/B-UM、2μL 模板DNA，0.5μL RNase-free water。
6.根据权利要求4所述的利用ARMS-PCR技术检测法医学体液检材甲基化水平的方法，其特征在于，步骤（2）中所述ARMS-PCR的反应条件为：95℃预变性15min，前10个循环：94℃变性30s，62℃退火90s，且前10个循环中每增加一个循环降0.5℃，72℃延伸60s; 后25个循环：94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸60s；最后60℃延伸30min。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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