CN101285758A - 一种基因甲基化定量检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基因甲基化定量检测方法，该方法通过对基因的CpG岛进行甲基化与非甲基化引物的设计，采用SYBR Green荧光掺入法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR，通过数据转换，可以快速、准确地进行基因甲基化定量检测。

Description

一种基因甲基化定量检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地讲，涉及一种核酸的检测方法，尤其涉及一种基因甲基化定量检测的方法。

背景技术

基因的异常甲基化在胰腺癌的发生发展中起重要作用，据报道，在胰腺癌组织或胰液中检测出多个胰腺癌相关基因发生异常甲基化，比如基因P16的异常甲基化(Virmani AK，et al.Clin Cancer Res 2001；7：584-9)、MUC2(Ho JJ，et al.Int J Oncol 2003；22：273-9)、RASSF1A(Dammann R，etal.Oncogene 2003；22：3806-12；)、SOCS-1(Fukushima N，et al.Br J Cancer2003；89：338-43；)、ppENK(Fukushima N，et al.Am J Pathol2002；160：1573-81)、NPTX2(Sato N，et al.Cancer Res，2003，63：3735-3742)等。

研究表明，检测胰腺癌相关基因的异常甲基化可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。目前DNA的检测方法很多，其中甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性PCR(MSP)法是应用最普遍的方法中的两种。

甲基化敏感性限制性内切酶法

原理：此方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，再进行分析。通常使用的甲基化敏感性限制性内切酶有Hpa II-Msp I(识别序列CCG6)和Sma I-Xmal(CCCGGG)等。由于后者识别的碱基数相对较多，其碱基序列出现的概率相对较低，所以前者即Hpa II-Msp I更常用。其中Hpa II和Msp I均能识别CCGG序列，然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时，Hpa II不切割，利用Hpa II-Msp I的这种属性处理DNA，随后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态。

其操作步骤包括：

1.分别取1μg组织DNA，加入：①空白对照；②1μg DNA加入Msp I 40U和10×Buffer 2μl，补水至20μl，充分混匀；③1μg DNA加入Hpa II 40U和10×Buffer 2μl，补水至20μl，充分混匀，根据不同公司酶的不同特性，消化不同时间。

2.酶切产物中加入醋酸钠、无水乙醇后，在-20℃下沉淀2h，倒液晾干。

3.进行PCR。

该方法存在下列缺点：

1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；

2.存在着酶消化不完全而引起的假阳性问题；

3.无法进行定量分析。

MSP法

原理：将DNA先用重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后进行引物特异性的PCR。MSP中需设计两对引物，并要求：1.引物末端均设计至检测位点结束；2.两对引物分别只能与经重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即其中一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MSP扩增产物，如果使用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若使用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。

其步骤包括：

1.常规抽提DNA。

2.取18μl DNA样品，加入2.2μl新鲜配制的3N NaOH，搅拌混匀，短暂离心。

3.37℃水浴15min。90℃水浴2min，然后置于冰上，短暂离心。

4.加入208μl饱和的Na₂S₂O₅pH 5.0。加12μl 10mM氢醌，混匀并短暂离心。

5.加200μl矿物油，55℃水浴4-16h。

6.吸弃上层矿物油。

7.①加入1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，按照说明书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连，用吸管吸到注射器中，底部装上2ml的离心管；轻轻加压；②加入2ml 80％的异丙醇洗涤，离心10000rpm，30s，底部换管；柱子换到新1.5ml EP管上，弃注射器；③加入50μl预热水(60-70℃)静置2-3min；柱子与离心管一起离心，10000rpm，30s，弃柱子。

8.将50μl水加到微型柱中，室温下静置5mi n。

9.离心20s，收积洗涤液，弃掉微型柱。

10.加入5.5μl 3N NaOH，然后37℃水浴15min。短暂离心。

11.加入1μl糖原(10mg/ml)，加入33.3μl 5M NH₄Ac，pH 7.0，加入330μl-20℃无水乙醇，充分混匀。-20℃过夜。

12.4℃下14000rpm离心15min。

13.弃上清，加70％乙醇洗涤，4℃下14000rpm离心15min。

14.重悬DNA于10μl水中，针对甲基化和非甲基化引物进行PCR。

由上述介绍可知，该方法存在下列缺点：

1.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测；

2.若要区分甲基化引物与非甲基化引物扩增产物量的不同，需要严格控制PCR反应的条件及循环数。

发明内容

本发明的目的在于为克服上述两种方法的缺点，从而提供一种操作简便、敏感性高的基因甲基化定量检测方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基因甲基化定量检测方法，包括如下步骤：从已发表的文献中筛选出在胰腺癌中发生高度甲基化的胰腺癌相关基因；用EZ DNA Methylation-Gold Kit^TM试剂盒对从个体样本中得到的DNA进行亚硫酸盐处理，用作扩增模板；针对基因的CpG岛分别设计甲基化引物及非甲基化引物；运用SYBR Green荧光掺入法进行甲基化引物与非甲基化引物的扩增，利用Real Time PCR仪得到甲基化引物的Ct值(Ct_M)和非甲基化引物的Ct值(Ct_U)；通过数据转化得到甲基化指数(MI)，从而达到甲基化定量检测的目的。

本发明的另一个目的在于提供上述方法在早期诊断胰腺癌等肿瘤疾病中的应用，如对测试个体的DNA进行检测，若检测出多个胰腺癌相关基因发生高甲基化，则强烈提示该个体患有胰腺癌。

本发明的技术方案操作简便，敏感性高，可定量检测多种基因的异常甲基化，提高了准确性，可用于诊断胰腺癌等肿瘤疾病的检测。

附图说明

图1是BSP菌液测序曲线。其中A为Patu8988细胞株中完全甲基化的单克隆；B为健康个体全血DNA完全非甲基化的单克隆。

图2是标准品甲基化定量PCR检测扩增曲线与熔解曲线。其中左图为扩增曲线；右图为熔解曲线。

图3是组织HE染色显微照片。其中A是胰腺癌组织HE染色；B是癌旁组织HE染色。

图4是胰腺癌组织与癌旁组织甲基化定量PCR检测扩增曲线与熔解曲线。其中左图为扩增曲线；右图为熔解曲线。

图5是胰腺癌组织与癌旁组织MI的比较。

具体实施方式

下面以检测NPTX2基因(GeneID：4583)在胰腺癌个体中的甲基化为例，对本发明作详细描述。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

本发明中，待测DNA取自个体样本，所述样本选自下组：胰液、全血、血清、粪便、胰腺穿刺物。

通过文献检索得知，NPTX2基因在Sato N，et al.CancerRes，2003，63：3735-3742一文中已被证明在胰腺癌中发生高甲基化。

主要试剂及仪器来源：EZ DNA Methylation-Gold KitTM试剂盒购买于北京天漠科技开发有限公司，pMD18-T Vector、EX-taq酶购买于宝生物工程(大连)有限公司，SYBR Green PCR Master Mix购买于日本TOYOBO生物有限公司，ABI 7500Real Time PCR仪购买于美国应用生物系统公司，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

操作步骤：

一、利用胰腺癌细胞株PaTu8988及健康个体全血DNA制备标准品，对其进行NPTX2基因甲基化检测。

1.基因组DNA提取

按常规酚抽提法抽提DNA。详见F.M.奥斯伯等，精编分子生物学实验指南，北京：科学出版社，2005：46。

2.DNA浓度测定

应用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度。并稀释DNA浓度至100ng/μl。

3.亚硫酸盐转化

参照EZ DNA Methylation-Gold Kit^TM说明书，将抽提的DNA进行亚硫酸盐处理。

4.亚硫酸盐测序(BSP)

4.1BSP反应

设计BSP引物

上游：5′-GGTTGTTTTTGTTGGAGAAA-3′

下游：5′-CCCCTTTCTCAAAATAACTTCT-3′

扩增片段长度：93bp

共包含9个CpG位点。

反应体系为25μl，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环。2.0％琼脂糖凝胶电泳确定了产物正确性。

4.2T载体连接及转化

将PCR产物纯化后，按pMD18-T Vector的说明书进行连接，然后用电击法转化至E.coli DH5α。

4.3菌液测序

DNA测序由invitrogen公司承接。

4.4测序结果

DNA测序证明，发生甲基化的CpG经亚硫酸盐处理后保持不变，而未发生甲基化的CpG中的C则转化为T，从测序结果中挑选出完全甲基化与完全非甲基化序列，如图1所示。

5.标准品的制备

用Tiangen普通质粒小提试剂盒(离心柱型)对挑选出的完全甲基化与完全非甲基化的单克隆进行质粒抽提。

模板拷贝数换算：拷贝数＝质量/分子量×6.02×10²³

质粒分子量计算：MW＝(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61≈碱基数×324.5

本实验中1ng质粒拷贝数约为3×10⁸。将完全甲基化与完全非甲基化的质粒进行预混，配比成终浓度为5×10⁵拷贝/μl，完全甲基化的质粒所占百分比为100％、75％、50％、25％、10％、1％、0。

6.对标准品进行甲基化定量检测

6.1引物设计：

在BSP扩增片段内设计甲基化与非甲基化特异性引物。其中，

甲基化引物：

上游：5′-GGTTGTTTTTGTTGGAGAAA-3′

下游：5′-ACTTCTAACGCGACACGAAA-3′

非甲基化引物：

上游：5′-GGTTGTTTTTGTTGGAGAAA-3′

下游：5′-ACTTCTAACACAACACAAAACC-3′

6.2实时定量PCR反应

分别取2μl标准品为模板，运用SYBR Green荧光掺入法进行甲基化引物与非甲基化引物的扩增，反应体系25μl，反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15s.60℃退火15s.72℃延伸45s，共45个循环。其扩增曲线与熔解曲线如图2所示。利用ABI 7500 Real Time PCR仪得到两组Ct值，甲基化引物的Ct值(Ct_M)与非甲基化引物的Ct值(Ct_U)，运用以下公式换算得到甲基化指数(MI)，所测得的Ct_M、Ct_U与MI见表1。

$\frac{U}{M}=2^{-\mathrm{\ΔCt}}=2^{C{t}_M-{\mathrm{Ct}}_U}$

$\mathrm{MI}=\frac{M}{M+U}=\frac{1}{1+\frac{U}{M}}=\frac{1}{1+2^{C{t}_M-{\mathrm{Ct}}_U}}$

表1甲基化定量检测标准品的CtM、CtU与MI

7.数据分析

所测得的MI值与实际的甲基化百分比极为接近，证实此方法的准确性。

二、对胰腺癌组织及癌旁组织的测试

1.组织标本收集

取自2007年9月～2007年11月第二军医大学附属长海医院胰腺外科手术切除标本8例，在手术切除病灶后用锋利刀片迅速切取原发肿瘤和切缘癌旁正常组织各1块，立即冷冻于液氮中保存，取材时间不超过10min。所有胰腺癌经H-E染色病理学证实均为导管源性，代表性切片HE染色如图3所示，并用冰冻切片进行粗分离。男性4例，女性4例，年龄45～75岁，平均60.25岁。

2.基因组DNA提取、DNA浓度测定、亚硫酸盐转化方法同前。

3.甲基化定量检测

引物、反应体系、反应条件及MI计算同前，扩增曲线与熔解曲线如图4所示。

4.数据分析

经过检测及数据转换，得到胰腺癌组织癌旁组织两组MI值。运用SPSS15.0 for Windows软件，MI不成正态分布，采用非参检验中的Wilcoxon检验得到两组有显著差异(P＜0.05)，两组的比较如图5所示。证实胰腺癌组织中NPTX2基因的甲基化程度高于癌旁组织，与文献报道相符。

由上述实施例可知，本发明的DNA甲基化检测结果与医疗机构的诊断结果有很大的相似性，证明该技术方案完全可以用于胰腺癌的诊断，并且具有快速准确的优点。如对多个胰腺癌相关基因进行检测，若其中多数基因发生异常甲基化，那么强烈提示此患者为胰腺癌，其意义大于简单的基因检测。

虽然以上仅以NPTX2基因为靶基因；以胰腺癌组织为检测样本；以胰腺癌检测为例，对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，也可以采集患者的胰液、粪便、全血、血清、胰腺穿刺物等为DNA样本，也同样可以方便地检测该基因或其它基因的甲基化程度，甚至应用于其他肿瘤的诊断，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，采用SYBR Green荧光掺入的DNA甲基化特异性定量PCR进行个体基因甲基化检测，同样应属于本发明的范围。

Claims (4)

1.一种基因甲基化定量检测方法，该方法包括如下步骤：用EZ DNAMethylation-Gold Kit^TM试剂盒对来自于个体样本的DNA进行亚硫酸盐处理，用作扩增模板；针对基因的CpG岛，设计出特异性的甲基化及非甲基化引物；运用SYBR Green荧光掺入法进行甲基化引物与非甲基化引物的实时定量PCR，得到甲基化引物的Ct值(Ct_M)和非甲基化引物的Ct值(Ct_U)；计算出被检测基因的甲基化指数MI。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本选自下组：胰液、全血、血清、粪便、胰腺穿刺物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因为NPTX2，所述引物为甲基化与非甲基化引物，所述实时定量PCR方法为SYBR Green荧光掺入法。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MI的换算方法为：

$\frac{U}{M}=2^{-\mathrm{\ΔCt}}=2^{C{t}_M-{\mathrm{Ct}}_U}$

$\mathrm{MI}=\frac{M}{M+U}=\frac{1}{1+\frac{U}{M}}=\frac{1}{1+2^{C{t}_M-{\mathrm{Ct}}_U}}$

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