CN113249485B

CN113249485B - 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用

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Publication number: CN113249485B
Application number: CN202110701127.6A
Authority: CN
Inventors: 颜克亮; 宁志伟; 申峰波; 宋利利; 夏俊强
Original assignee: Shenzhen Judong Biomedical Engineering Co ltd
Current assignee: Shenzhen Judong Biomedical Engineering Co ltd
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2041-06-24
Also published as: CN113249485A

Abstract

本发明公开了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用，其包括用于检测GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化的引物对和探针以及内参ACTB的引物对和探针，所述引物对和探针的序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.12所示。本发明还提供了一种含有上述引物对和探针的试剂盒及其应用，该应用方法对经核酸提取和亚硫酸盐转化后的样本DNA进行QPCR检测，依据扩增后的荧光信号相对强度判定样本是否为宫颈癌病变样本。与常规的宫颈癌检测方法相比，本发明的方法具有无创、快速、灵敏和特异性好等特点，能在癌变早期对宫颈癌进行精准检测。

Description

一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用。

背景技术

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在我国女性恶性肿瘤中居第二位，位于乳腺癌之后。据世界范围内统计，每年约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，其中的80%以上的病例发生在发展中国家。我国每年约有新发病例13万，占世界宫颈癌新发病例总数的28%。患病的高峰年龄为40~60岁，近年来大量研究表明，宫颈癌的发病年龄呈年轻化趋势。宫颈癌发病率分布有地区差异，农村高于城市，山区高于平原，发展中国家高于发达国家。因此，十分有必要在全国范围内规范宫颈癌的诊断与治疗。另一方面，宫颈癌的发生可通过对癌前病变的检查和处理得以有效控制。西方国家的经验显示，宫颈癌的发生率在密切筛查的人群中减少了70%~90%。

研究表明，宫颈癌的诱发，与人类乳头瘤病毒（HPV）的病原体有关。高危型HPV(hrHPV)感染后，宫颈癌的发生需要经历许多步骤：从hrHPV持续感染，到癌前病变(CIN1期→CIN2期→CIN3期)，最后才发展成浸润癌。宫颈癌的发生发展，尤其是癌前病变到浸润癌，绝大多数病人需要经历很长一段时间。hrHPV感染后经3~5年可以进展为高级别病变的CIN2期和CIN3期，而进一步发展为浸润癌则需20~30年。癌前病变及宫颈癌早期可以没有任何症状。癌前病变时间很长，如果在这个阶段通过筛查早发现，尽早采取有效的干预治疗措施，则可以较好的避免癌前病变进一步发展成癌症，大大降低宫颈癌的发生率和死亡率，从而达到预防宫颈癌的目的。

目前宫颈癌的筛查方法主要有两种：宫颈细胞学检查和HPV检查，宫颈细胞学检查主要通过对宫颈脱落细胞进行染色，观察细胞形态变化进而判断宫颈细胞有没有癌变情况；HPV检查通过核酸检测等方法，检测宫颈有没有感染HPV病毒，属于病因检查。细胞学检查特异度较高，但灵敏度较低，且细胞学的结果判断需要专业的病理医生在显微镜下进行判读，结果受主观影响，容易出现漏诊、误诊现象，而且由于病理医生的短缺，低资源地区难以普及。HPV检测的灵敏度高，但特异性较差，其假阳性率比较高，大部分HPV为一过性感染，不会发展为宫颈癌前病变或宫颈癌，HPV阳性结果给妇女造成了不必要的恐慌，也浪费了医疗资源。因此，亟需一种可以识别真正具有宫颈癌高风险的生物学标志物，实现对宫颈癌及癌前病变的早期、灵敏和稳定的诊断，以便进行及时、有效的治疗，降低医疗成本，节约社会资源。

DNA甲基化是一种重要的表观修饰，它在不改变DNA序列的情况下，在CpG岛5 '端胞嘧啶加上甲基基团，从而使该DNA的表达沉默，对基因表达模式以及基因组的稳定性起重要的调控作用。人类抑癌基因启动子的高甲基化，在包括宫颈癌在内的许多肿瘤的发生、发展的各阶段均有其特异性的改变模式。多数研究显示宿主抑癌基因甲基化水平随宫颈病变严重程度的增加而升高，可以作为宫颈癌及癌前病变筛查的生物学标志物。

大量研究结果显示基因甲基化检测宫颈癌及宫颈癌前病变有较高的敏感性及特异性，但单独检测某一个基因甲基化指标，其对宫颈癌的敏感度较低，因此若实现多个基因的联合检测，将大大提高宫颈癌及癌前病变早期诊断的灵敏度和特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒，以及利用该试剂盒进行宫颈癌早期诊断的检测方法。

1、本发明提供一种宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、探针以及相应的试剂盒。与常规的方法相比，本方法具有快速、方便、灵敏及特异性好的特点，对宫颈癌的早期诊断及预后判断起重要作用。

2、本发明所采用的技术：选择了三个与人宫颈癌特异性相关的基因GPR98、SLC46A3和PAX1，在此三个基因的启动子区各设计一组特异性的甲基化检测引物对和探针，然后用该引物对和探针去扩增经核酸提取和亚硫酸盐转化的样本DNA，根据QPCR扩增结果的相对荧光值来确定待测样本是否为宫颈癌及癌前病变。

第一方面，本发明提供了一种用于检测宫颈癌的引物探针组合，其包括用于检测GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化的引物对和探针以及内参基因ACTB的引物对和探针；其中

用于检测GPR98基因甲基化的引物对序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，检测GPR98基因甲基化的探针序列为SEQ ID No.3所示序列；

用于检测SLC46A3基因甲基化的引物对序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列，检测SLC46A3基因甲基化的探针序列为SEQ ID No.6所示序列；

用于检测PAX1基因甲基化的引物对序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列，检测PAX1基因甲基化的探针序列为SEQ ID No.9所示序列；

用于检测ACTB的引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示序列，检测ACTB的探针序列为SEQ ID No.12所示序列；

上述引物及探针的核苷酸序列如下表1所示：

表1引物和探针序列表

进一步地，各所述探针的5 '端标记有报告荧光基团，3 '端标记有淬灭荧光基团，所述报告荧光基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5，等，所述淬灭荧光基团选自BHQ、TAMRA、MGB等。

第二方面：本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其包括PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品；其中，所述PCR反应液含有如上所述的用于检测GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化的引物对和探针以及内参ACTB的引物对和探针。

进一步地，所述PCR反应液还包含PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和ddH₂O；所述阳性质控品包含甲基化基因组DNA；所述阴性质控品包含非甲基化基因组DNA。

第三方面：本发明还提供了一种上述试剂盒在宫颈癌早期检测中的应用。

进一步地，上述利用本发明试剂盒进行宫颈癌早期检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 收集样本，并将样本混匀后进行DNA提取，DNA的提取包括样本裂解、DNA结合、DNA洗涤以及洗脱；

(2) 对提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化，亚硫酸盐转化步骤包括亚硫酸盐转化、结合、第一次洗涤、脱磺基、第二次洗涤、第三次洗涤、第四次洗涤、干燥以及洗脱；

(3) PCR反应液的配制，按PCR反应体系比例加入引物探针(SEQ ID No.1~SEQ IDNo.12)、PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和ddH₂O，使得各引物的终浓度为200nM，各探针的终浓度均为100nM，按常规方法和剂量添加其它试剂；

(4) 采用上述PCR反应液对亚硫酸盐转化后的DNA样本及阴性质控品和阳性质控品进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应条件是： 95℃变性5min；95℃变性5s，55℃退火和延伸35s，45个循环。

(5) PCR结果分析，用荧光PCR仪配套分析软件对PCR扩增结果进行分析，如果PCR扩增中GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因中的任一基因有扩增曲线，则计算其△Ct值，△Ct值为GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因中的任一基因的Ct值与ACTB基因的Ct值之间的差值，差值的大小反映所检基因与内参基因之间的相对定量。

(6) 判断结果时，以GPR98、SLC46A3和PAX1三个△Ct值中最小的△Ct值作为判断标准，当△Ct≦10时结果为阳性，说明具有宫颈癌高风险；当△Ct>10或N.D.时结果为阴性，说明具有宫颈癌风险低，其中N.D.为“Not Detected”的缩写，意思是“未检出”。

进一步地，所述步骤(1) 中的样本选自人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、尿液、宫颈组织、血浆、血清、从血液中分离的细胞，或其组合；优选地，所述样品为人宫颈脱落细胞。

进一步地，所述步骤(1)和(2)其采用市售的DNA提取试剂盒和亚硫酸盐转化试剂盒进行样本处理，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行操作，最后用洗脱液洗脱DNA。

进一步地，所述步骤(3)中PCR扩增反应体系为25.0μl，其中PCR反应液15.0μl ，DNA样本为10.0μl。

进一步地，所述步骤(3)中GPR98探针SEQ ID No.3其5 '端标记有报告荧光基团FAM，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ；SLC46A3探针SEQ ID No.6其5 '端标记有报告荧光基团ROX，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ；PAX1探针SEQ ID No.9其5 '端标记有报告荧光基团CY5，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ；ACTB探针SEQ ID No.12其5 '端标记有报告荧光基团JOE，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ。

进一步地，所述DNA样本的结果判定具有如下前提：内参ACTB显示单个反应中加入DNA的量是足够的，阴性质控品和阳性质控品扩增正常，阴性质控品结果判读为阴性，阳性质控品结果判读为阳性。

本发明基于荧光PCR方法，采用Taqman荧光探针法检测样本中GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因的甲基化，对宫颈癌的早期诊断提供参考，与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1)本发明试剂盒检测速度快，步骤简单。

2)本发明试剂盒检测结果准确，兼有QPCR高灵敏度和特异性的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。

3)本发明试剂盒采用多色荧光PCR检测技术，3个基因检测只用一个管子检测即可，完全闭管操作，有效地降低了污染。

4)本发明试剂盒采用多基因联合检测技术，避免了单基因检测的灵敏度和特异性低的缺点，更适合用于宫颈癌早期检测。

附图说明

图1是宫颈癌QPCR特异性检测结果示意图；其中，纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量QPCR扩增的循环数，Ct值为达到阈值线所需要的循环数；GPR98、SLC46A3和PAX1分别表示宫颈癌阳性样本三个甲基化核酸检测结果；ACTB扩增表示样本含量正常。

具体实施方式

本发明提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，其包括分别用于检测GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化的引物对和探针，所述引物对和探针的序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.9所示，其还可包括如SEQ ID No.10~12所示的内参ACTB的引物对和探针。本发明还提供了一种含有上述引物对和探针的用于早期宫颈癌检测的试剂盒及其应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1一种用于宫颈癌检测的特异性引物探针设计

本发明的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物对和探针，是根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列，使用Primer Express 3.0及MethylPrimer Express v1.0 设计，由上海生工有限公司合成。其包括分别用于检测GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化的引物对和探针以及内参基因ACTB的引物对和探针；其中

其中，所述GPR98探针SEQ ID No.3其5 '端标记有报告荧光基团FAM，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ；所述SLC46A3探针SEQ ID No.6其5 '端标记有报告荧光基团ROX，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ；所述PAX1探针SEQ ID No.9其5 '端标记有报告荧光基团CY5，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ；所述ACTB探针SEQ ID No.12其5 '端标记有报告荧光基团JOE，3 '端标记有淬灭荧光基团BHQ。

实施例2一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒

本实施例为含有实施例1所述的引物对和探针的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒。试剂盒包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；其中，所述PCR反应液包括如SEQ ID No.1~SEQID No.12所述的引物和探针、PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂、UNG酶、TaqDNA聚合酶和ddH₂O，引物和探针的对应关系具体如表1所示；所述阳性质控品采用人甲基化基因组DNA，阴性质控品采用人非甲基化基因组DNA。

实施例3本发明的试剂盒在诊断宫颈癌中的应用

本实施例包括如下的检测步骤：

一、材料、试剂、仪器

本发明采用的DNA提取试剂盒购自于QIAGEN公司；亚硫酸盐转化试剂盒购自于Zymo公司；PCR缓冲液、dNTP、UNG酶、TaqDNA聚合酶购自于Takara公司；MgCl₂购自于Sigma公司；荧光定量PCR仪为ABI7500。

二、样本准备

阳性质控品采用人甲基化基因组DNA，阴性质控品采用人非甲基化基因组DNA；待处理样本为1例宫颈癌患者的宫颈脱落细胞和1例正常健康人的宫颈脱落细胞。

三、DNA提取

1.在1.5mL离心管中加入0.2mL样本，0.5mL核酸裂解吸附液和10µL磁珠，涡旋混匀，把离心管在56℃中放置10分钟。

2.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入0.5mL洗液A，混匀确保磁珠彻底重悬；

3.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10-100µL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥5分钟；

4.加入40µL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，把离心管在56℃中孵育5分钟；

5.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的0.2mL PCR管中。

四、亚硫酸盐转化

1.在40µL DNA的 0.2mL PCR管中加入110 µL亚硫酸盐溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀后短暂离心，将离心管置于普通PCR仪中进行反应，反应条件设置为95°C 5分钟、60°C10分钟、95°C 5分钟、60°C 10分钟；

2.将反应结束后的DNA溶液转移到新的1.5mL离心管中，加入600µL结合液和10µL磁珠涡旋混匀，室温静置5分钟；

3.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液A，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；

4.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL脱磺液，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，室温静置15分钟；

5.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；

6.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液C，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；

7.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入250µL洗液D，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；

8.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10-100µL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥2分钟；

9.加入50µL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，把离心管在56℃中孵育5分钟；

10.将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的离心管管中备用。

五、PCR流程

1、PCR反应液的配制

根据实验数量，按下表所示配制PCR反应液：

2.加样

在准备好的PCR反应管中分别加入15ul的PCR反应液和10ul样本DNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心。阴性质控和阳性质控的加样与样本相同。

4.荧光定量PCR检测

1）荧光通道选择：每个样本选择FAM、JOE、ROX和CY5共4个通道。参比荧光（PassiveReference）设置为none；

2）反应条件设定如下表（反应体积设定为25μL）：

六、结果分析

1.PCR结果分析

反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，如果PCR扩增中GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因中的任一基因有扩增曲线，则计算其△Ct值，△Ct值为GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因中的任一基因的Ct值与ACTB基因的Ct值之间的差值，差值的大小反映所检基因与内参基因之间的相对定量。

2.检测结果判定

以GPR98、SLC46A3和PAX1三个△Ct值中最小的△Ct值作为判断标准，当△Ct≦10时结果为阳性，说明具有宫颈癌高风险；当△Ct>10或N.D.时结果为阴性，说明具有宫颈癌风险低，其中N.D.为“Not Detected”的缩写，意思是“未检出”。

3.检测结果

GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化在正常样本中均未检出，结果为阴性，在宫颈癌样本中均检出，结果为阳性。结果见下表：

实施例4

本实施例采用实施例3所示的试剂盒进行临床样本的检测。各实验结果如下所示：

灵敏度>95%：在25例宫颈癌患者样本中检出25例，在75例CINⅡ及CINⅢ样本中检出71例；

特异性>98%：在51例CIN I样本中检出1例，在100例健康人样本中检出1例；

具体结果如下表所示：

由上述实施例可知，本发明所述的试剂盒及方法适用于样本中GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因的甲基化检测，为宫颈癌的早期诊断提供参考。与常规的宫颈癌诊断方法相比，本发明充分利用了DNA提取、亚硫酸盐转化和QPCR相关联技术，开发出具有高灵敏度、高特异性的试剂盒，可以对人宫颈癌进行早期无创诊断。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 深圳市巨东生物医学工程有限公司

<120> 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttttcgacgt tagagcgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cacctaacca acgaaacg 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cggttatttt cgtttcgttg gtta 24

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gttgtttcgc gtttcgtc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

attctccgac aaccctcg 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aggtcgaggt tcgtagggtc gcg 23

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggagggggta gagtttta 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctcgacaatc acgccg 16

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cgttggggcg tagtgacgg 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atggaggagg tttagtaagt t 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ataaaaccta ctcctccctt aa 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

caccacccaa cacacaataa caaac 25

Claims

1.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合包括检测GPR98、SLC46A3和PAX1基因甲基化的引物对和探针以及内参基因ACTB的引物对和探针；其中用于检测GPR98基因甲基化的引物对序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，检测GPR98基因甲基化的探针序列为SEQ ID No.3所示序列；用于检测SLC46A3基因甲基化的引物对序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列，检测SLC46A3基因甲基化的探针序列为SEQ ID No.6所示序列；用于检测PAX1基因甲基化的引物对序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列，检测PAX1基因甲基化的探针序列为SEQ ID No.9所示序列；用于检测ACTB的引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示序列，检测ACTB的探针序列为SEQ ID No.12所示序列；所述探针的5 '端标记有报告荧光基团，3 '端标记有淬灭荧光基团。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述报告荧光基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5其中一种，所述淬灭荧光基团选自BHQ、TAMRA、MGB其中一种。

3.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于：包含PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；其中，所述PCR反应液包括如权利要求1～2中任一项所述的引物探针组合。

4.根据权利要求3所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液单个PCR反应体系组成为SEQ ID No.1 10uM 0.5μL、SEQ ID No.2 10uM 0.5μL、SEQ ID No.3 10uM 0.25μL、SEQ ID No.4 10uM 0.5μL、SEQ ID No.5 10uM 0.5μL、SEQ IDNo.6 10uM 0.25μL、SEQ ID No.7 10uM 0.5μL、SEQ ID No.8 10uM 0.5μL、SEQ ID No.910uM 0.25μL、SEQ ID No.10 10uM 0.5μL、SEQ ID No.11 10uM 0.5μL、SEQ ID No.12 10uM0.25μL、TaqDNA聚合酶 5U/μL 0.4μL、dNTP 10mM 0.5μL、MgCl₂ 25mM 4μL、10×PCR缓冲液5μL 总量为15μL。

5.根据权利要求3所述的用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品采用人甲基化基因组DNA；所述阴性质控品采用人非甲基化基因组DNA。

6.根据权利要求1～2所述的引物探针组合或权利要求3～5所述的试剂盒在制备宫颈癌检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测方法包括如下检测步骤：

步骤1)收集样本，并将样本混匀后进行DNA的提取；

步骤2)对步骤1)提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；

步骤3)采用权利要求1～2所述的引物探针组合或权利要求3～5所述的试剂盒对步骤2)亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增反应；

步骤4)对步骤3)PCR扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中样本选自人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、尿液、宫颈组织、血浆、血清、从血液中分离的细胞，或其组合。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤1)DNA提取以及所述步骤2)亚硫酸盐转化均采用市售的试剂盒进行样本处理。

9.根据权利要求 6所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增的反应条件是： 95℃变性5min；95℃变性5s，55℃退火和延伸35s并收集荧光信号，45个循环。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，样本的结果判定步骤如下：如果PCR扩增中GPR98、SLC46A3和PAX1三个基因中的任一基因有明显扩增曲线，则计算其△Ct值，△Ct值为GPR98、SLC46A3、PAX1三个基因中的任一基因的Ct值与ACTB基因的Ct值之间的差值，差值的大小反映所检基因与内参基因之间的相对定量，判断结果时，以GPR98、SLC46A3、PAX1三个△Ct值中最小的△Ct值作为判断标准，当△Ct≤10时结果为阳性；当△Ct>10或N.D.时结果为阴性，其中N.D.为“Not Detected”的缩写，意思是“未检出”。