CN111961667B - 一种经修饰荧光探针及其应用 - Google Patents
一种经修饰荧光探针及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111961667B CN111961667B CN202011144174.7A CN202011144174A CN111961667B CN 111961667 B CN111961667 B CN 111961667B CN 202011144174 A CN202011144174 A CN 202011144174A CN 111961667 B CN111961667 B CN 111961667B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- probe
- region
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Abstract
本发明提供一种寡核苷酸探针,其包含寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物,其中,所述寡核苷酸分子包含:能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区,所述标记物(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。
Description
技术领域
本发明涉及核酸分子检测领域,具体涉及荧光探针领域,更具体包括经修饰荧光探针、其制备方法和应用。
背景技术
荧光探针技术是基于荧光共振能量转移基础,用于核酸定性、定量的检测技术。含有某种特异序列的核苷酸序列上包含一对荧光物质,其中一个是能量的供体,另一个为能量的受体。当供体和受体在空间上足够近时,激发供体产生的荧光能量被受体吸收,检测器只获得一个本底背景荧关信号。在荧光PCR检测过程中,通过把目的核酸序列含量与供体、受体空间距离变化带来的荧光信号改变进行正向关联的方式,进行目的核酸的定性、定量检测。
目前常用的荧光探针技术,主要包括水解探针法(包括Taqman技术和MGB技术)和杂交探针法(包括双杂交探针和分子信标技术)。Taqman水解探针在检测靶位点完全匹配的序列基础上,5’端加上荧光报告基团,3’端加上淬灭基团,常见的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、CY5等,常见的淬灭基团有TAMRA、BHQ等。在未进行PCR检测时,荧光基团和淬灭基团空间位置很近,荧光基团因淬灭而不产生荧光。PCR检测退火过程中探针结合到目标序列上,扩增Taq酶延伸到探针结合位置时,其5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,荧光基团释放,产生荧光信号。随着目标序列的增加,被Taq酶降解的探针越多,产生的荧光信号也就越多。从而可以进行扩增曲线绘制和定量。
分子信标技术是另一种常见荧光探针设计方式,其两端的核酸序列互补配对,形成茎环结构,茎部分的序列与检测靶位点序列无关但具备互补性,使两端标记的荧光基团和淬灭基团空间位置紧紧靠近,具有本底信号低的特征。探针的环状位置是目标位点识别序列。分子信标探针不依赖于扩增过程中Taq酶的降解,而是在检测过程中打开茎环结构,当环状位置序列与目标序列结合时,保持整个探针是打开状态,使得荧光基团和淬灭基团空间位置分开,从而产生可检测的荧光。
DNA甲基化是重要的表观遗传修饰,已有研究发现DNA甲基化参与到众多生命过程的调节,特别是与肿瘤的发生、发展相关。目前已有众多DNA甲基化检测技术,这其中基于亚硫酸氢盐转化后的荧光PCR检测,依然是对已知靶点检测最实用的一项技术。经亚硫酸氢盐处理后的DNA序列,其碱基平衡性差,DNA损伤断裂多,因而PCR检测的难度相对常规检测大,检测特异性和准确性低。因此需要背景信号弱、灵敏度高同时具备特异性高的一种荧光PCR检测方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是在于提供一种特异性强、背景信号弱的荧光探针。
具体而言,本发明第一方面提供一种寡核苷酸分子,包含:能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区。
在一个或多个实施方案中,所述寡核苷酸分子用于与靶核酸杂交。
在一个或多个实施方案中,所述寡核苷酸分子还包含位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区。
在一个或多个实施方案中,自互补区包括5’末端互补区、3’末端互补区,
在一个或多个实施方案中,所述寡核苷酸分子从5’至3’依次包含:5’末端互补区、靶核酸识别区、接头区、靶核酸识别类似区、与5’末端互补区互补的3’末端互补区。
在一个或多个实施方案中,自互补区(5’末端互补区或3’末端互补区)包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸,或1-20个核苷酸,更优选1-10个核苷酸。在一个或多个实施方案中,5’末端互补区或3’末端互补区的GC含量大于55%、60%、70%、80%或90%。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别区包含与靶核酸中序列相同或互补的核苷酸序列。在一个或多个实施方案中,靶核酸识别区具有至少3个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个核苷酸,或5-50个核苷酸,更优选10-30个核苷酸。在一个或多个实施方案中,所述靶核酸中序列是经转化的核苷酸序列。优选地,所述转化是非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别类似区包含与所述靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补的核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸中序列片段的序列中至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%是C。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸中序列片段起始于所述靶核酸中序列的5’端的至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个、至少第5个、至少第6个、至少第7个、至少第8个、至少第9个、至少第10个、至少第11个、至少第12个核苷酸。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸中序列片段的长度是靶核酸中序列的长度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。
在一个或多个实施方案中,所述修饰包括双脱氧化、磷酸化、生物素化、巯基取代、甲基化、氨基化、硫代、氟代、溴代、次黄嘌呤取代、碱基的置换(转换)或颠换。优选地,所述修饰是碱基的置换。更优选地,所述修饰选自以下一种或多种(1)G变为A,(2)A变为G,(3)T或U变为C,(4)C变为T或U。优选地,所述修饰是靶核酸中序列或其片段的C置换为T或U。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸中序列或其片段中的C是甲基化的C,例如是CpG中的C。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别类似区的长度是靶核酸识别区的长度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别类似区的长度是靶核酸识别区的长度的10-99%、15-90%、20-80%、30-70%、30-60%、30-50%、30-40%、30-35%。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别类似区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸,或1-30个核苷酸,更优选2-20个核苷酸。
在一个或多个实施方案中,接头区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸,或1-20个核苷酸,更优选1-10个核苷酸。
在一个或多个实施方案中,所述接头区不与靶核酸杂交。
在一个或多个实施方案中,所述接头区不与靶核酸识别区或其互补序列杂交。
在一个或多个实施方案中,所述接头区不是回文序列。
在一个或多个实施方案中,靶核酸是DNA或RNA。
本发明还提供一种寡核苷酸探针,其包含本文第一方面所述的寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物,所述标记物(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。
在一个或多个实施方案中,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,例如5’端报告基团和3’端激发基团或5’端激发基团和3’端荧光报告基团。在一个或多个实施方案中,报告基团和激发基团分别是荧光共振能量转移对的受体荧光团和供体荧光团。
在一个或多个实施方案中,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团,例如5’端荧光报告基团和3’端淬灭基团或5’端淬灭基团和3’端荧光报告基团。优选地,荧光报告基团选自FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red和Cy5。优选的,淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和TAMRA。
在一个或多个实施方案中,所述探针还包含固体支持物,所述寡核苷酸分子附着于所述固体支持物。
在一个或多个实施方案中,所述寡核苷酸分子通过连接分子连接至所述固体支持物。
在一个或多个实施方案中,所述连接分子是官能化的聚乙二醇。
在一个或多个实施方案中,所述连接分子是多核苷酸。
本发明还提供包含本文第一方面所述寡核苷酸探针的试剂盒。该试剂盒还包含检测靶核酸或检测核酸扩增的其他试剂,例如缓冲液、dNTP、聚合酶、限制性内切酶等,和任选的使用说明书。
本发明还提供一种用于检测靶核酸的方法,包括:
(1)将本文所述寡核苷酸分子或探针与靶核酸接触,
(2)测定接触后混合物的可检测信号,和
(3)基于所述可检测信号检测靶核酸的存在和/或水平。
在一个或多个实施方案中,所述标记物(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。
在一些实施方案中,所述可检测信号的减弱或消失对应于靶核酸的存在和/或水平。优选地,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,例如5’端报告基团和3’端激发基团或5’端激发基团和3’端荧光报告基团。在一个或多个实施方案中,报告基团和激发基团分别是荧光共振能量转移对的受体荧光团和供体荧光团。
在其他实施方案中,所述可检测信号的产生或增强对应于靶核酸的存在和/或水平。优选地,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团,例如5’端荧光报告基团和3’端淬灭基团或5’端淬灭基团和3’端荧光报告基团。优选地,荧光报告基团选自FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red和Cy5。优选的,淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和TAMRA。
在一个或多个实施方案中,所述靶核酸可以是未经转化或经转化的核酸分子。所述转化优选是靶核酸的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。在一个或多个实施方案中,所述转化使用酶促方法进行,优选脱氨酶处理,或所述转化使用非酶促方法进行,优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理,更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵处理。
本发明还提供一种检测核酸扩增的方法,包括:
(1)使用核酸聚合酶,能够与靶核酸杂交的引物和能够与所述靶核酸杂交的本文所述寡核苷酸分子和/或探针对靶核酸进行核酸扩增,所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区与靶核酸中序列相同或互补,所述靶核酸识别类似区与所述靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补;
任选的(2)当所述分子和/或探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以改变所述标记物提供的可检测信号;和
(3)监测所述可检测信号,可检测信号的产生、消失、增强和/或减弱对应于核酸扩增的发生和/或水平。
在一个或多个实施方案中,所述标记物(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。
在一个或多个实施方案中,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团,例如5’端荧光报告基团和3’端淬灭基团或5’端淬灭基团和3’端荧光报告基团。优选地,荧光报告基团选自FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red和Cy5。优选的,淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和TAMRA。
在一个或多个实施方案中,(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与猝灭基团分离;(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的产生和/或增强对应于核酸扩增的发生和/或水平。
在一个或多个实施方案中,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,例如5’端报告基团和3’端激发基团或5’端激发基团和3’端荧光报告基团。在一个或多个实施方案中,报告基团和激发基团分别是荧光共振能量转移对的受体荧光团和供体荧光团。
在一个或多个实施方案中,(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与激发基团分离;(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的减弱和/或消失对应于核酸扩增的发生和/或水平。
本发明还提供一种检测核酸甲基化的方法,包括:
(1)将靶核酸的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,
(2)使用核酸聚合酶,能够与经转化的靶核酸杂交的引物和能够与经转化的靶核酸杂交的本文第一方面所述寡核苷酸探针对靶核酸进行核酸扩增,其中,所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区包含与经转化的靶核酸中序列相同或互补的核苷酸序列,所述靶核酸识别类似区包含与所述经转化的靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补的核苷酸序列;
任选的(3)当所述分子和/或探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以改变所述标记物提供的可检测信号;和
(4)监测所述可检测信号,可检测信号的产生、消失、增强和/或减弱对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。
在一个或多个实施方案中,所述转化使用酶促方法进行,优选脱氨酶处理,或所述转化使用非酶促方法进行,优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理,更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵处理。
在一个或多个实施方案中,所述标记物(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。
在一个或多个实施方案中,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团,例如5’端荧光报告基团和3’端淬灭基团或5’端淬灭基团和3’端荧光报告基团。优选地,荧光报告基团选自FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red和Cy5。优选的,淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和TAMRA。
在一个或多个实施方案中,(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与猝灭基团分离;(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的产生和/或增强对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。
在一个或多个实施方案中,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,例如5’端报告基团和3’端激发基团或5’端激发基团和3’端荧光报告基团。在一个或多个实施方案中,报告基团和激发基团分别是荧光共振能量转移对的受体荧光团和供体荧光团。
在一个或多个实施方案中,(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与激发基团分离;(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的减弱和/或消失对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。
本发明的优点:本发明的探针在末端包含互补序列,使得报告基团和淬灭基团在空间上较常规Taqman探针更为紧密,有更好的淬灭效果,因而能够降低探针中荧光报告基团的本底信号;接头序列使得探针更易形成类环状结构,促进末端互补序列的结合;更低的本底信号增加了低荧光增量检出,因而提高了检测灵敏度;靶核酸识别类似序列是检测靶位点的类似序列,发明人发现,靶核酸识别类似序列可提高探针的靶位点识别特异性。
附图说明
图1,本发明探针示意图。
图2A-2B,本发明探针甲基化特异性检测评估,显示梯度稀释预转化甲基化DNA至预转化非甲基化DNA的检测结果。图2A:各梯度本发明探针,图2B:各梯度内参探针。
图3A-3D,本发明探针与常规探针在不同浓度模板下的原始荧光分析曲线对比。图3A:甲基化模板比例100%,图3B:甲基化模板比例50%,图3C:甲基化模板比例25%,图3D:甲基化模板比例10%。
图4A-4D,本发明探针与常规探针在不同浓度模板下的扩增曲线对比。图4A:甲基化模板比例100%,图4B:甲基化模板比例50%,图4C:甲基化模板比例25%,图4D:甲基化模板比例10%。
图5,本发明探针用于结直肠组织样本ASCL4甲基化检测结果。
图6A-6B,本发明探针与不含靶核酸识别类似区的探针的扩增曲线对比。图6A:荧光增值的对比;图6B,荧光值的对比。
图7A-7B,含不同接头的本发明探针的扩增曲线对比。图7A:荧光增值的对比;图7B,荧光值的对比。
具体实施方式
应理解,在本发明范围中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成优选的技术方案。
本说明书中,“靶核酸”是指用于使用本文探针作为检测对象的核酸。靶核酸可为想要测量的任何类型、长度的核酸分子。靶核酸可来自任何物种例如动物、植物、菌类、微生物、病毒等。另外,靶核酸的制备方法也没有特殊限定,可由生物体或病毒直接制备,也可以由特定的组织制备,可以从作为模板的核酸人工克隆进行制备,也可以是通过PCR法或LAMP法得到的扩增产物。
本文所述探针与靶核酸杂交。在讨论引物或探针时,本文所述“识别”或“杂交”指引物或探针与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交,所述严谨或高度严谨条件本领域周知,例如所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1%SDS的溶液中,在65℃下杂交并洗膜。通常,杂交是由于一个核酸分子的全部或部分序列与另一核酸分子的全部或部分序列互补。本文所述互补表示一种核酸序列与另一种核酸序列能以碱基互补配对原则(A与T、A与U和G与C的对应关系)互相以氢键相连。互补可以是完全互补或部分互补。
本发明所用术语“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。提到核酸时,本文所用术语“变体”可以是天然发生的等位变体或非天然发生的变体。这些核苷酸变体包括简并变体、取代变体、缺失变体和插入变体。如本领域所知的,等位变体是一个核酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。
本发明提供一种寡核苷酸探针,其包含寡核苷酸分子和与所述与所述寡核苷酸分子结合的标记物,其中,所述寡核苷酸分子包含:能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区,所述标记物(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。所述寡核苷酸分子还包含位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区。优选地,所述寡核苷酸分子从5’至3’依次包含:5’末端互补区、靶核酸识别区、接头区、靶核酸识别类似区、与5’末端互补区互补的3’末端互补区。图1示例性地显示一种实施方案中的本发明探针,其中各图示为,a:5’末端互补区,b:靶核酸识别区,c:接头区,d:靶核酸识别类似区,e:3’末端互补区,A、B:标记物。所述探针还可包含固体支持物,所述寡核苷酸分子附着于所述固体支持物。
本文所述可检测信号主要是荧光信号,所述标记物通常包括位于寡核苷酸分子两端的两部分,分别对应于图1中的A和B。该两部分可以是荧光报告基团和激发基团,所述报告基团和激发基团可以分别是荧光共振能量转移对的受体荧光团和供体荧光团。该两部分还可以是荧光报告基团和淬灭基团,所述荧光报告基团可以选自FAM、HEX/VIC、TAMRA、Texas Red和Cy5,所述淬灭基团可以选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和TAMRA。
所述自互补区包含5’末端互补区或3’末端互补区,各自由至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸,或1-20个核苷酸,更优选1-10个核苷酸组成。在一个或多个实施方案中,5’末端互补区或3’末端互补区的GC含量大于55%、60%、70%、80%或90%。
所述靶核酸识别区包含与靶核酸中序列互补、结合和杂交的核苷酸序列。在一个或多个实施方案中,靶核酸识别区具有至少3个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个核苷酸,或5-50个核苷酸,更优选10-30个核苷酸。靶核酸识别区所互补、结合和杂交的靶核酸中序列是经转化的核苷酸序列。优选地,所述转化是非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。
探针中的靶核酸识别类似区包含识别(互补、结合或杂交)与所述靶核酸中序列(即靶核酸识别区所互补、结合或杂交的区域)或其片段的经修饰的变体(本文有时称为靶核酸类似区)的核苷酸序列。所述修饰包括但不限于硫代、2氟代核糖核酸(2氟代C或U)、2'-O-甲基核糖核酸、5-甲基脱氧胞嘧啶、脱氧次黄嘌呤、脱氧脲嘧啶、2-氨基嘌呤、5-溴-脱氧尿嘧啶、反向dT、双脱氧胞苷、内部氨基修饰、5'氨基修饰、3'氨基修饰、巯基修饰、磷酸化、地高辛修饰、生物素修饰、碱基的置换或颠换。优选地,所述修饰是碱基的置换。更优选地,所述修饰选自以下一种或多种(1)G变为A,(2)A变为G,(3)T或U变为C,(4)C变为T或U。优选地,所述修饰是靶核酸中序列或其片段的C置换为T或U。在一个或多个实施方案中,所述靶核酸中序列或其片段中的C是甲基化的C,例如是CpG中的C。
靶核酸识别类似区所对应的靶核酸区域可以是靶核酸识别区所互补、结合或杂交的区域(上述靶核酸中序列)的片段。所述靶核酸中序列的片段可以起始于所述靶核酸中序列的5’端的任意核苷酸,例如至少第1个核苷酸。在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别类似区的长度是靶核酸识别区的长度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。在一个或多个实施方案中,所述靶核酸识别类似区的长度是靶核酸识别区的长度的10-99%、15-90%、20-80%、30-70%、30-60%、30-50%、30-40%、30-35%。通常,靶核酸识别类似区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸,或1-30个核苷酸,更优选2-20个核苷酸。
靶核酸识别类似区具有和靶核酸检测位点类似序列,但因其识别靶位点的经修饰序列(例如错配碱基)的原因,其与靶位点的结合并不稳定。在靶核酸检测过程中,靶核酸识别类似区序列产生一定的占位效应,与靶核酸识别区有一定的自竞争作用,该自竞争过程,可提高靶点检测的特异性。当检测模板中存在与靶位点经修饰序列相同的序列(即靶核酸类似区,例如将靶核酸中序列的C置换为T或U的序列)时,靶核酸识别类似区与之结合较强,也就提高了自竞争靶核酸识别区结合的困难度,进一步提高检测特异性。此外,靶核酸识别类似区也可以对整个探针二级结构的形成,荧光基团和淬灭基团的空间距离等有调节作用。
本文中,碱基“转化(conversion)”指核酸序列中的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的过程。本文中,碱基“置换或转换(transition)”是指在碱基变化中一种嘌呤被另一种嘌呤,或者是一种嘧啶被另一种嘧啶替代;碱基“颠换(transversion)”是指在碱基置换中嘌呤与嘧啶之间的替代。
靶核酸识别类似区可采用识别模板片段经碱基置换(例如C置换为T)后序列的序列作为类似序列,即靶核酸识别类似区所识别的序列为靶核酸中序列或其片段中的部分或全部C置换为T的序列。所述片段的序列中至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%是C。其中,置换为T的C可以是或不是甲基化的C,例如CpG中的C。
因此,在涉及甲基化检测的探针设计中,靶核酸中序列A可经转化(例如C→U/T转化),获得非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的序列A’,将A’中的剩余胞嘧啶C(甲基化的C)中的部分或全部经修饰(例如置换为T)获得序列A’’。所以置换为T的C是甲基化的C,例如CpG中的C。此时,本文所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区与A’的序列相同或互补,靶核酸识别类似区与A’’的序列或其片段相同或互补。靶核酸识别类似区所识别的序列为靶核酸中序列中的部分或全部甲基化C置换为T的序列。
在不涉及甲基化检测的探针设计中,靶核酸中序列A不经转化(例如C→U/T转化),将A中的部分或全部胞嘧啶C修饰(例如置换为T)获得序列A’。所以置换为T的C可以是或不是甲基化的C。此时,本文所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区与A的序列相同或互补,靶核酸识别类似区与A’的序列或其片段相同或互补。靶核酸识别类似区所识别的序列为靶位点序列中的部分或全部C置换为T的序列。
探针中的接头区为用于使探针的自由度增加的区域。接头区将靶核酸识别区和靶核酸识别类似区连接。接头区域具有由与靶核酸、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区的碱基序列都不互补的碱基序列构成的寡核苷酸。接头区通常包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸,或1-20个核苷酸,更优选1-10个核苷酸。所述接头区不与靶核酸识别区或其互补序列杂交。通常,所述接头区不是回文序列。
在实施例的示例方法中,本文所述探针的序列如下所示,
ACGTCGGCGTTTTCGTTTAGTAGCGCTGTTGGTGTCGT
其中,5’末端互补区为ACG,靶核酸识别区为TCGGCGTTTTCGTTTAGTAGCG,接头区为CTG,靶核酸识别类似区为TTGGTGT,3’末端互补区为CGT。
检测方法
图1示例性地显示一种实施方案中的本发明探针。当本发明探针处于未杂交形式时,探针两端的标记物的两部分靠近,因此荧光淬灭或产生;当所述探针与靶核酸杂交时,探针两端的标记物的两部分分离,因此荧光增强或降低。因此,本发明提供使用上述探针检测靶核酸的方法,包括:(1)将本文所述探针与靶核酸接触,(2)测定接触后混合物的荧光强度,和(3)基于所述荧光强度检测靶核酸的存在和/或水平。在一些实施方案中,当探针为非杂交形式时所述标记物提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。此时,所述可检测信号的减弱或消失对应于靶核酸的存在和/或水平。或者,在其他实施方案中,当探针与互补核酸杂交时所述标记物提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。此时,所述可检测信号的产生或增强对应于靶核酸的存在和/或水平。
本发明探针因为具备更高的靶序列特异性和更低的背景荧光,所以尤其适用于检测核酸扩增。当所述探针处于未杂交形式时,探针两端的标记物的两部分靠近,因此荧光淬灭或产生;当所述探针与靶核酸杂交并进行扩增时,核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的两部分分离,因此荧光增强或降低。基于此,本发明还提供检测核酸扩增的方法,包括:(1)使用核酸聚合酶,能够与靶核酸杂交的引物和能够与所述靶核酸杂交的本文所述寡核苷酸分子或探针对靶核酸进行核酸扩增,所述寡核苷酸分子或探针的靶核酸识别区与靶核酸中序列相同或互补,所述靶核酸识别类似区与靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补;任选的(2)当所述分子和/或探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以改变所述标记物提供的可检测信号;和(3)监测所述可检测信号,可检测信号的产生、消失、增强和/或减弱对应于核酸扩增的发生和/或水平。在某些实施方案中,所述探针中的标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团,(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与猝灭基团分离;(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的产生和/或增强对应于核酸扩增的发生和/或水平。在某些实施方案中,所述探针中的标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与激发基团分离;(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的减弱和/或消失对应于核酸扩增的发生和/或水平。本发明探针较常规探针产生更优的扩增曲线,表现为更低的荧光背景,更高的荧光增量和更小的Ct值,并可显著提高在低模板量时的扩增效率,使用本发明设计探针,即使样本中甲基化DNA占比仅10%,也可产生稳定扩增信号,而常规探针已经无法产生稳定扩增,因此本发明探针具有更高的灵敏性。
示例性地,本发明探针可用于检测核酸甲基化。检测核酸甲基化的方法包括:(1)将靶核酸的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,(2)使用核酸聚合酶,能够与经转化的靶核酸杂交的引物和能够与经转化的靶核酸杂交的本文第一方面所述寡核苷酸探针对靶核酸进行核酸扩增,其中,所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区包含与经转化的靶核酸中序列相同或互补的核苷酸序列,所述靶核酸识别类似区包含与所述经转化的靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补的核苷酸序列;任选的(3)当所述分子和/或探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以改变所述标记物提供的可检测信号;和(4)监测所述可检测信号,可检测信号的产生、消失、增强和/或减弱对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。本文所述“转化”可使用本领域已知的任何方法进行,例如酶促和/或非酶促方法。酶促方法优选脱氨酶处理;非酶促方法优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理,更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵处理。在某些实施方案中,所述探针中的标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团,(3)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与猝灭基团分离,(4)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的产生和/或增强对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。在某些实施方案中,所述探针中的标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,(3)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与激发基团分离,(4)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的减弱和/或消失对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。
在本文中,浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解,使用这种范围形式只是为了方便和简洁,应该被弹性地解读为包括范围上下限所明确提及的数值,还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供,并不意欲为限制性的,除非另有规定。因此,本发明决不应被解释为限于以下实施例,而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂,除非另有说明,否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实施例1:本发明设计探针用于甲基化特异性检验
选取经亚硫酸氢盐处理的参考DNA来验证引物的特异性。首先,本实施例选取针对ASCL4基因区域内的目标DNA作为检测位点,同时设计了内参基因ACTB分别设计了引物和探针。然后,梯度配置了100%、50%、25%、10%比例的甲基化DNA(Qiagen 59655)至非甲基化DNA(Qiagen 59665)中,DNA总量为4 ng。最后,在各个梯度的DNA混合物中使用设计的引物来扩增DNA,重复两次。用于检测ASCL4的引物和本发明的经修饰的探针,以及用于检测内参基因ACTB的无甲基化特异性引物和探针的序列参见表1。其中ASCL4采用本发明设计甲基化特异性探针,内参基因使用常规Taqman设计方式,且不具备甲基化检测特异性。在PCR反应体系中,引物终浓度为500 nM,探针终浓度为100 nM。
表1. ASCL4基因区域内的目标DNA区域和内参基因ACTB的引物序列和探针序列
PCR反应体系如下:4 ng不同甲基化比例的DNA混合物10 ul;表1所示引物和探针预混液2.5 ul;PCR试剂(EpiTect MethyLight PCR kit, Qiagen)12.5 ul。
PCR反应条件如下:95℃ 5分钟;95℃ 15秒,56℃ 40秒(采集荧光),50个循环。针对不同基因探针修饰荧光,选择相应检测荧光通道,使用ABI 7500 Real-Time PCR仪器进行检测。
结果
分析各个DNA混合物中ASCL4和内参基因ACTB PCR反应得到的Ct值。结果如表2和图2A-2B所示,对于ASCL4,Ct值随着DNA混合物中转化的甲基化DNA百分比的增加而降低(如图2A所示),这表明用于扩增本发明涉及的ASCL4探针具备甲基化特异性检测能力。相对应的内参基因ACTB,每种DNA混合物的曲线重合(如图2B所示),表明探针不具备甲基化特异性检测性能。
表2. 本发明探针与内参探针对比
实施例2:本发明设计探针与常规Taqman探针对比
对照实施例1中的检验方法,对比本发明设计探针与常规探针的检测性能。其中ASCL4常规探针序列为:TCGGCGTTTTCGTTTAGTAGC。
梯度配置100%、50%、25%、10%比例的甲基化DNA(Qiagen 59655)至非甲基化DNA(Qiagen 59665)中,DNA总量为4 ng。各个梯度的DNA混合物分别使用设计的引物来扩增DNA,重复两次。
结果
结果显示,在相同模板梯度下,本发明探针较常规探针产生更优的扩增曲线,表现为更低的荧光背景(图3A-3D),更高的荧光增量和更小的Ct值(图4A-4D),并可显著提高在低模板量时的扩增效率,使用本发明设计探针,即使样本中甲基化DNA占比仅10%,也可产生稳定扩增信号,而常规探针已经无法产生稳定扩增,证明本发明探针具有更高的灵敏性。
表3. 本发明探针与常规探针检测效果对比(Ct值)
实施例3:本发明设计探针用于结直肠组织样本检测
对照实施例1中的检验方法,采用本发明设计的ASCL4探针序列,及实施例1中的内参检测引物、探针序列,检测了10个白细胞DNA、癌旁组织DNA、肠道腺瘤组织DNA和结直肠癌组织DNA。
所述检测包括如下步骤:
分别从血细胞、癌旁组织、高级别腺瘤组织和结直肠癌组织各获取10份DNA样本(即,总共40份样本)。采用商业化试剂盒QIAamp DNA Mini Kit按照说明书要求提取血细胞DNA;对于癌旁组织、高级别腺瘤组织和结直肠癌组织DNA,采用商业化试剂盒QIAamp DNAFFPE Tissue Kit按照说明书要求进行提取;
使用商业化亚硫酸氢盐转化试剂MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit对步骤1中获取的DNA样本进行亚硫酸盐转化处理,得到转化后的DNA;
对转化后的DNA进行荧光PCR检测,使用如表1所示的引物和探针序列,并且同时对内参基因ACTB进行检测,作为对照。引物终浓度为500 nM,探针终浓度为100 nM;
PCR反应体系如下:转化后的DNA 10 ul;表1所示引物和探针预混液 2.5 ul;PCR试剂(PCR mix Luna® Universal Probe qPCR Master Mix (NEB))12.5 ul。PCR反应条件如下:95℃ 3分钟;95℃ 30秒,56℃ 60秒(采集荧光),15个循环。针对不同基因探针修饰荧光,选择相应检测荧光通道,使用ABI 7500 Real-Time PCR仪器进行检测;
计算和汇总各检测的Ct值,比较血细胞、癌旁组织、高级别腺瘤组织和结直肠癌组织样本的Ct值分布。
结果
结果显示在内参基因大体相同的情况下,ASCL4基因区域在血细胞中的甲基化丰度远远低于组织样本,且在癌旁组织中低于腺瘤组织和结直肠癌组织(图5)。本实施例充分体现了本发明探针在核酸检测领域的实际应用。
实施例4:本发明探针与不含靶核酸识别类似区探针对比
使用甲基化DNA(Qiagen 59655)4 ng,使用表1中ASCL4上下游引物来扩增DNA,分别采用本发明设计探针及ASCL4不含靶核酸识别类似区探针进行检测,重复两次。引物终浓度为500 nM,探针终浓度为25 nM,其余实验条件同实施例1。其中ASCL4不含靶核酸识别类似区探针序列为:
ACGTCGGCGTTTTCGTTTAGTAGCGCTGCGT
结果如图6A-6B所示,在相同模板下,本发明探针较不含靶核酸识别类似区探针产生更优的扩增曲线,表现为更低的荧光背景和更高的荧光增量。从荧光值曲线来看,这两种探针产生靶位点检测信号所需的扩增循环数非常接近,本发明探针的低荧光背景,可能是其最终获得更高荧光增量和更优的扩增曲线的原因。
实施例5:不同接头区序列探针对比
使用甲基化DNA(Qiagen 59655)4 ng,使用表1 ASCL4上下游引物来扩增DNA,分别采用实施例1本发明设计探针及替换接头区序列探针,重复两次。引物终浓度为500 nM,探针终浓度为25 nM,其余实验条件同实施例1。其中,接头序列替换为“GACC”,探针序列如下:
ACGTCGGCGTTTTCGTTTAGTAGCGGACCTTGGTGTCGT
结果如图7A-7B显示,在相同模板下,这两种接头序列探针的荧光基底值和扩增情况均类似。
序列表
<110> 上海鹍远健康科技有限公司
<120> 一种经修饰荧光探针及其应用
<130> 204712
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgtaatagcg acgggg 16
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acgcgaaaat cctaacca 18
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acgtcggcgt tttcgtttag tagcgctgtt ggtgtcgt 38
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcggcgtttt cgtttagtag c 21
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
acgtcggcgt tttcgtttag tagcgctgcg t 31
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acgtcggcgt tttcgtttag tagcggacct tggtgtcgt 39
Claims (13)
1.一种寡核苷酸分子,包含:能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区,和任选的位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区,所述靶核酸识别区包含与靶核酸中序列互补的核苷酸序列,所述靶核酸识别类似区包含与所述靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体互补的核苷酸序列,其中,所述自互补区包括5’末端互补区、3’末端互补区,所述修饰包括碱基的置换或颠换。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸分子,其特征在于,所述寡核苷酸分子从5’至3’依次包含:5’末端互补区、靶核酸识别区、接头区、靶核酸识别类似区、与5’末端互补区互补的3’末端互补区。
3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸分子,其特征在于,
所述自互补区包含至少1个核苷酸,和/或
所述接头区包含至少1个核苷酸,和/或
所述靶核酸识别区具有至少3个核苷酸,和/或
所述靶核酸中序列的片段的序列中至少10%是C,和/或
所述靶核酸中序列的片段起始于所述靶核酸中序列的5’端的至少第1个核苷酸,和/或
所述靶核酸中序列的片段的长度是靶核酸中序列的长度的至少10%。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸分子,其特征在于,所述修饰是碱基的置换。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸分子,其特征在于,所述碱基的置换是C置换为T或U。
6.一种寡核苷酸探针,包含权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物,所述标记物:(a)当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号,或(b)当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸探针,其特征在于,所述可检测信号是荧光信号,所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团,或所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团。
8.包含权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸分子或权利要求6或7所述的寡核苷酸探针的试剂盒,所述试剂盒还任选包含检测靶核酸或检测核酸扩增的其他试剂。
9.一种检测靶核酸的方法,包括:
(1)将权利要求6或7所述的寡核苷酸探针与靶核酸接触,
(2)测定接触后混合物的可检测信号,和
(3)基于所述可检测信号检测靶核酸的存在和/或水平。
10.一种检测核酸扩增的方法,包括:
(1)使用核酸聚合酶,能够与靶核酸杂交的引物和能够与所述靶核酸杂交的权利要求6或7所述的寡核苷酸探针对靶核酸进行核酸扩增,所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区与靶核酸中序列互补,所述靶核酸识别类似区与靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体互补,所述修饰包括碱基的置换或颠换;
任选的(2)当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以改变所述标记物提供的可检测信号;和
(3)监测所述可检测信号,可检测信号的产生、消失、增强和/或减弱对应于核酸扩增的发生和/或水平。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,
项目(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与猝灭基团分离;项目(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的产生和/或增强对应于核酸扩增的发生和/或水平;或
项目(2)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与激发基团分离;项目(3)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的减弱和/或消失对应于核酸扩增的发生和/或水平。
12.一种检测核酸甲基化的方法,包括:
(1)将靶核酸的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,
(2)使用核酸聚合酶,能够与经转化的靶核酸杂交的引物和能够与经转化的靶核酸杂交的权利要求6或7所述的寡核苷酸探针对靶核酸进行核酸扩增,其中,所述寡核苷酸探针的靶核酸识别区包含与经转化的靶核酸中序列互补的核苷酸序列,所述靶核酸识别类似区包含与所述经转化的靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体互补的核苷酸序列,所述修饰包括碱基的置换或颠换;
任选的(3)当所述分子和/或探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以改变所述标记物提供的可检测信号;和
(4)监测所述可检测信号,可检测信号的产生、消失、增强和/或减弱对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,
项目(3)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与猝灭基团分离,项目(4)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的产生和/或增强对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平;或
项目(3)是:当所述探针与所述靶核酸杂交时,所述核酸聚合酶在扩增过程中消化所述寡核苷酸探针以将所述标记物的报告基团与激发基团分离,项目(4)是:监测所述报告基团的荧光,荧光的减弱和/或消失对应于所述靶核酸中序列的甲基化的存在和/或水平。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011144174.7A CN111961667B (zh) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | 一种经修饰荧光探针及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011144174.7A CN111961667B (zh) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | 一种经修饰荧光探针及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111961667A CN111961667A (zh) | 2020-11-20 |
CN111961667B true CN111961667B (zh) | 2021-02-12 |
Family
ID=73387210
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011144174.7A Active CN111961667B (zh) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | 一种经修饰荧光探针及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111961667B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113249485B (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-28 | 深圳市巨东生物医学工程有限公司 | 一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物探针组合和试剂盒及其应用 |
CN115410648A (zh) * | 2022-09-02 | 2022-11-29 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种应用卡扣式载玻片培养盒检测细胞遗传学异常的方法及装置 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000001850A2 (en) * | 1998-07-02 | 2000-01-13 | Gen-Probe Incorporated | Molecular torches |
WO2006086502A2 (en) * | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Stratagene California | Key probe compositions and methods for polynucleotide detection |
CN101200759A (zh) * | 2007-12-13 | 2008-06-18 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种茎-环型寡聚核苷酸探针 |
-
2020
- 2020-10-23 CN CN202011144174.7A patent/CN111961667B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000001850A2 (en) * | 1998-07-02 | 2000-01-13 | Gen-Probe Incorporated | Molecular torches |
WO2006086502A2 (en) * | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Stratagene California | Key probe compositions and methods for polynucleotide detection |
CN101200759A (zh) * | 2007-12-13 | 2008-06-18 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种茎-环型寡聚核苷酸探针 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
分子信标的构建及其应用研究进展;向东山,等;《应用化学》;20140131;第31卷(第1期);第11-19页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111961667A (zh) | 2020-11-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2183379B1 (en) | Enrichment of a target sequence | |
CN110872631B (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
US20080274458A1 (en) | Nucleic acid quantitation methods | |
ES2386729T3 (es) | Detección de metilación genica para el diagnostico de un trastorno proliferativo | |
EP3152332B1 (en) | Method for methylation analysis | |
AU2006339538A1 (en) | Materials and methods for assaying for methylation of CpG islands associated with genes in the evaluation of cancer | |
CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
CN111961667B (zh) | 一种经修饰荧光探针及其应用 | |
WO2006061994A1 (ja) | 遺伝子配列検査法 | |
CN113186278B (zh) | 甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用 | |
US20200283854A1 (en) | Method for methylation analysis | |
JP2023517394A (ja) | 結腸直腸新生物をスクリーニングするための方法およびキット | |
CN110511984B (zh) | Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用 | |
WO2024012467A1 (en) | Fluorescent pcr method for nucleic acids detection using the combination of primer-activated polymerization and probes | |
CN112852927A (zh) | 一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统及方法 | |
CN113493835A (zh) | 通过检测bcan基因区域的甲基化状态筛查大肠瘤的方法和试剂盒 | |
CN113637754B (zh) | 生物标志物在诊断食管癌中的应用 | |
WO2004113567A9 (en) | Improved heavymethyl assay for the methylation analysis of the gstpi gene | |
WO2022170984A1 (zh) | 结直肠进展期腺瘤的筛查、风险评估及预后方法和试剂盒 | |
CN114134208A (zh) | 荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法 | |
WO2023104136A1 (zh) | 甲状腺癌良恶性结节诊断的甲基化标志物及其应用 | |
CN110669828A (zh) | 转化dna回收率的检测方法及引物 | |
CN117660622A (zh) | 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 | |
CN115558714A (zh) | 甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用 | |
CN117778568A (zh) | 鉴别胃癌的标志物及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |