WO2006061994A1 - 遺伝子配列検査法 - Google Patents

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WO2006061994A1
WO2006061994A1 PCT/JP2005/021554 JP2005021554W WO2006061994A1 WO 2006061994 A1 WO2006061994 A1 WO 2006061994A1 JP 2005021554 W JP2005021554 W JP 2005021554W WO 2006061994 A1 WO2006061994 A1 WO 2006061994A1
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nucleic acid
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target nucleic
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Takeshi Yamamoto
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Takeshi Yamamoto
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    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/30—Detection characterised by liberation or release of label

Definitions

  • the present invention relates mainly to genetic analysis methods in the fields of clinical medicine, forensic medicine, drug chemistry, biochemistry, food chemistry, agricultural chemistry, etc., and mutations or polymorphisms of genes such as genomic genes, viruses or bacteria Used for analysis.
  • a gene polymorphism (hereinafter referred to as "polymorphism”) is a polymorphism of the genome that occurs at a frequency of 1% or more in all individuals, and is a single nucleotide polymorphism (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • deletion or insertion of 1 to several tens of bases, the difference in the number of repetitions in a repetitive sequence (microsatellite) consisting of several bases to several tens of bases, etc. are included.
  • Analyzing gene sequence mutations and polymorphisms is important in a wide range of fields such as clinical medicine, forensic medicine, drug chemistry, biochemistry, food chemistry, and agricultural chemistry.
  • gene mutations generally those with a frequency of less than 1%) have been shown to be closely related to genetic diseases, cancer, etc.
  • polymorphisms (Generally, those with an appearance frequency of 1% or more) have been shown to be related to disease risk, drug sensitivity, and drug metabolism rate.
  • viruses and bacteria it is known to be related to drug resistance and pathogenicity.
  • it is also used for identification of individuals and individuals, and identification of agricultural product varieties.
  • a so-called BZF separation method that selectively dissociates and removes only mismatched heterogeneous breakfasts by appropriately adjusting ⁇ , salt concentration, temperature, etc. in the washing operation after rediscation. Based on. At this time, Tm increases as the probe chain length increases, and the proportion of ⁇ in the total Tm decreases, so this small ⁇ can be used to match mismatched target nucleic acids with mismatched target nucleic acids. Is difficult to separate by adjusting the washing conditions. In addition, when the chain length is shortened, not only the specificity of the hybridization is lowered, but also the total Tm is lowered, so that the affinity for binding between the probe and the target nucleic acid is lowered, and the probe may not be efficiently hybridized. is there. For this reason, even if it is performed under mild conditions, the affinity is low! Therefore, the matched target nucleic acid and the mismatched target nucleic acid are both removed, resulting in a distinction between a match and a mismatch. Are often difficult.
  • Another method is to use a test DNA as a saddle, incorporate a nucleotide of one or several bases by the primer extension method, and identify the type of nucleotide incorporated according to the sequence of the saddle DNA.
  • mini-sequence method PCR amplified DNA is often used as a cocoon. Purification of PCR products is indispensable in order to remove remaining PCR primers and perform reaction solution exchange before primer extension. Yes, the operation is complicated.
  • mass spectrometry is sometimes used as the latest method for identifying the type of incorporated nucleotide, but it requires a very expensive apparatus.
  • the mini-sequence method can point out problems in terms of economy and speed.
  • Patent Document 1 JP-A-6-327499
  • Patent Document 2 International Publication Gazette WO2002Z077282
  • Patent Document 3 International Publication WO2003Z035864
  • Patent Document 4 International Publication WO01Z23583
  • Non-patent literature l BioTecniques, 13, 888-892, 1992
  • Non-Patent Document 2 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58 (2), 719-726 (1967)
  • Non-Patent Document 3 Biochemistry, 37, 10156-10163 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)
  • Non-Patent Document 5 Biochemistry, 38, 3468-3477 (1999)
  • Non-Patent Document 6 Nucleic Acids Res. 28, e63 (2000)
  • Non-patent document 7 Clinical pathology 50, 528-532 (2002)
  • Non-Patent Document 8 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (10), 4641-4645 (1995) Disclosure of the Invention
  • the present invention is a simple, rapid, and highly accurate uniform measurement method for gene sequence inspection using exonuclease, and is caused by mismatch between a target nucleic acid and a probe, which has been difficult in the past.
  • a technique capable of significantly improving sensitivity and specificity in detecting a difference in gene sequence based on a difference in Tm is provided.
  • the present invention provides a detection technique that is easy to obtain all the materials and reagents required for its implementation, is extremely inexpensive, and has excellent economic efficiency.
  • Non-patent Document 1 Nyaexonu Crease ⁇ (Patent Document 1) that specifically digests double-stranded DNA
  • an oligonucleotide probe labeled with a radioactive substance is used.
  • An exonuclease is allowed to act on double-stranded DNA formed by hybridization with a complementary sequence, and a probe that has become shorter due to digestion is dissociated from the target nucleic acid, and then a new probe is hybridized and further digested.
  • the cycling reaction is established by repeating the process. It is shown that the presence or absence of the target nucleic acid can be determined by detecting the degradation product of the probe with an autoradiography scintillation counter or the like.
  • Patent Documents 2 and 3 a homogeneous measurement system for exonuclease cycling assembly without using a radioactive substance has been reported (Patent Documents 2 and 3).
  • the measurement system includes fluorescent materials and Taenthi
  • the probe is digested and the fluorescent energy generated by the fluorescent material is absorbed by Quenchia. Does not emit fluorescent light or weak fluorescent light.
  • the fluorescent substance is released from the probe and the distance to the quencher increases, making it impossible to absorb the fluorescence energy.
  • the fluorescent substance emits fluorescence of its own wavelength, and the amount of probe degradation can be measured by detecting the fluorescence.
  • a technique using such a fluorescent substance and a quencher capable of efficiently absorbing the fluorescent energy as a labeling substance is generally known as fluorescence resonance energy transfer (FRET) (Non-patent Document 2). .
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the base length of the probe is preferably sufficiently long.
  • a mismatch between the probe and the target nucleic acid hereinafter referred to as “mismatch” unless otherwise indicated
  • Tm Tm
  • the present invention is a method based on hybridization, it is possible to use a probe having a sufficiently long length, for example, 25 bases or more, regardless of the presence or absence of a polymorphism. Hybridization with high affinity is possible. Furthermore, since it changes depending on conditions, it cannot be generally stated. However, when polymorphism is detected when the probe is shortened due to the degradation action of exonuclease, the present invention is 5 to Since the difference in Tm ( ⁇ ) generated by the presence or absence of mismatch when shortening to about 15 bases is used, the proportion of ⁇ in the total Tm increases, and a hybrid using a longer probe than the conventional one. It is characterized by higher sensitivity and specificity for polymorphism discrimination than the characterization method.
  • the present invention is a simple operation and a washing operation for removing a probe having a mismatch with a target nucleic acid or a target nucleic acid having a mismatch with a probe as in the conventional hybridization method, No so-called BZF separation operation is required.
  • the present invention can be used for exonuclease cytology immediately without purifying the product amplified by the gene amplification method, and does not require a denaturation operation even when double-stranded DNA is used as a test sample. It is extremely quick and simple.
  • all the reagents necessary for the present invention are commercially available at low cost, and only the most commonly used instruments and devices for genetic analysis are required. It has excellent properties.
  • the present invention relates to
  • a uniform measurement system that quantitatively detects target nucleic acids containing a specific sequence by distinguishing them from nucleic acids containing at least one base substitution, or nucleic acids containing one or more base insertions or deletions.
  • a method comprising the following steps;
  • the oligonucleotide probe is released from the target nucleic acid before the labeling substance contained in the oligonucleotide probe is released by digestion with 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease or 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease.
  • the method according to 1 above comprising detecting that no significant signal increase occurs.
  • the exonuclease is ⁇ ⁇ 3 'exonuclease
  • the oligonucleotide probe is not complementary to at least one base that can form with the target nucleic acid !, base pair portion or loop structure 3.
  • the exonuclease is a 3 ' ⁇ 5' exonuclease
  • the oligonucleotide probe is not complementary with at least one base that can form with the target nucleic acid !, base pair part or loop 3.
  • oligonucleotide probe used in the method according to 3 above, wherein the labeling substance is a fluorescent substance, and the quenching substance having an effect of effectively attenuating the fluorescence emitted from the fluorescent substance is labeled according to the three rules of the fluorescent substance.
  • the labeling substance is a fluorescent nucleotide analog capable of forming a base pair according to the law of Thonson-Crick with any force of guanine, adenine, thymine, and cytosine in the target DNA.
  • the oligonucleotide probe to be used.
  • thermostable enzyme is derived from Archaeoglobus fulgidus.
  • cDNA according to 1 or 2 above which is used as a test sample without purifying the cDNA synthesized by reverse transcription reaction from RNA, the product amplified by polymerase 'chain' reaction method (PCR method) or reverse transcription PCR method. Method.
  • any one of the above 5 to 10 capable of improving the discrimination ability between a nucleic acid and a nucleic acid containing at least one base substitution, or a nucleic acid containing an insertion or deletion of one or more bases.
  • a target nucleic acid having a specific base sequence can be quantitatively detected by distinguishing it from a nucleic acid having a substitution, insertion or deletion sequence of one base or more from the target nucleic acid. . Further, since an expensive reagent raw material is not required, the running cost is low. Furthermore, the procedure is extremely simple, purification of the product after the PCR reaction and denaturation procedures are unnecessary, real-time measurement of the signal is possible, and an extremely rapid test method can be provided.
  • the present invention is a method for quantitatively measuring a target nucleic acid sequence and further identifying a polymorphism or mutation in the target nucleic acid sequence.
  • the present invention relates to a polymorphic site or a mutation site in a target nucleic acid sequence by specifically hybridizing an oligonucleotide probe (hereinafter referred to as “probe”) to which a labeling substance is bound, to the target nucleic acid sequence. From the probe bound to the target nucleic acid only if the surrounding sequence is in principle completely complementary to the probe sequence. It utilizes a mechanism whereby a signal can be obtained by releasing the labeling substance by the action of exonuclease.
  • probe oligonucleotide probe
  • the labeling substance of the present invention relates to the generation or control of a signal, and more specifically, a substance that emits fluorescence or a substance that attenuates fluorescence emitted from another substance.
  • One molecule of probe DNA contains 1 to 2 labeling substances.
  • a fluorescent nucleotide analog can be used as the labeling substance.
  • Some fluorescent nucleotide analogs have strong fluorescence when mononucleotides. When included in polynucleotides or oligonucleotides, the fluorescence is attenuated, and in addition to other bases and Watson-Crick's law. Some form base pairs. Examples of such nucleotide analogs include force 2-aminopurine, which is not particularly limited thereto.
  • 2-Aminopurine forms a base pair with thymine by replacing it with adenine, and a nucleic acid containing 2-aminopurine can serve as a substrate for exonuclease (Non-patent Document 3). Therefore, when a exonuclease cytaring assay is performed using a probe containing 2-aminopurine, the 2-aminopurine released from the probe is decomposed by the exonuclease, and the probe containing 2-aminopurine bound to the target nucleic acid is degraded. By detecting the emitted fluorescence, it is possible to uniformly measure a specific nucleic acid sequence.
  • a fluorescent substance and a substance having the property of effectively attenuating the fluorescence (hereinafter, Quenchia) can be used.
  • the combination of the fluorescent substance and the quencher that effectively attenuates the fluorescence is not limited to the combination having such a function, and the probe DNA and target nucleic acid can be further hybridized and digested by exonuclease. There is no particular limitation as long as it does not substantially interfere.
  • the fluorescent material such as fluorescein, FITC, FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, and Palladium and the absorption wavelength that coincides with the fluorescence wavelength, or has an absorption wavelength in the vicinity, has a longer wavelength.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Non-patent Document 2 a non-fluorescent substance that emits absorbed energy as heat instead of fluorescence can be used as a quencher.
  • Dark Quenchia Many of them have excellent fluorescence attenuation efficiency. Specific examples include Dabcyl, Eclipse, and BHQ (B1 ack Hole Quencher).
  • the one that can be released by the exonuclease reaction can be either a fluorescent substance or a quencher.
  • a quencher is placed on the probe so that the fluorescence of the phosphor is effectively attenuated, and if one of the phosphor or quencher is released from the probe, it is fluoresced. It must be detected as an increase in intensity.
  • Single-stranded DNA used as a probe is generally synthesized organically by an amidite method (Non-patent Document 4). It is well known to those skilled in the art that fluorescent substances and quencher-labeled probes can also be easily synthesized using each labeled amidite reagent and an automatic synthesizer. Alternatively, DNA can be synthesized using an amidite reagent subjected to amination, and then coupled with a labeling substance into which an active ester such as succinimide has been introduced. Labeled DNA by these methods can be obtained using commercial services.
  • the labeling substance two labeling substances are used only when the sequence of the specific region in the target nucleic acid is completely complementary to the probe sequence.
  • at least one of the labeling substances is released by the action of exonuclease ( Figure 1 left).
  • the Tm of the target nucleic acid and the probe is completely complementary. The probe is not able to hybridize to the target nucleic acid because it is lower than in the case (right in Fig. 1).
  • the target nucleic acid and the probe cannot maintain a double strand due to the decrease in Tm, and the exonuclease releases the labeling substance.
  • the target nucleic acid is released, and as a result, there is no or minimal fluorescence (center in Fig. 1).
  • the method of the present invention is characterized by using these facts to identify polymorphisms or mutations in the target nucleic acid.
  • the probe is designed so that when the exonuclease is ⁇ ⁇ 3 'exonuclease, the first labeling substance (hereinafter, of the two labeling substances, the exonuclease reaction is performed first from the probe).
  • the released labeling substance is called “first labeling substance.”
  • the probe has one label.
  • the target nucleic acid polymorphism or mutation site corresponds between the labeling site of “the first labeling substance” and the probe end.
  • the polymorphism or mutation site of the target nucleic acid corresponds between the labeling site of the first labeling substance and the ⁇ terminal of the probe.
  • the mismatch in the probe-target nucleic acid hybrid is near the end of the probe, the mismatch is more stable than the target nucleic acid-probe hybrid compared to when the mismatch is near the center of the probe. There is little influence on. Therefore, if the probe chain length is made sufficiently long, the probe can be efficiently hybridized to the target nucleic acid regardless of the presence or absence of mismatch.
  • Tm decreases and the hybridization becomes unstable.
  • the Tm is further reduced as compared with the case where there is no mismatch, and the stability of the nano- and hybrids further decreases.
  • the probe also releases the target nucleic acid force before the exonuclease releases the first labeled substance ( Figure 1).
  • the labeling site of the first labeling substance must be determined in consideration of the chain length when the remaining portion of the probe shortened by exonuclease is released from the target nucleic acid force. That is, if there is no mismatch between the remaining portion of the probe and the target nucleic acid, the remaining portion of the probe releases the target nucleic acid force after the first labeling substance is released by exonuclease. In addition, when there is a mismatch, the remaining part of the probe is released from the target nucleic acid force before the first labeled substance is released, or the probe does not hybridize at all. As a result, it is necessary to determine the labeling site of the first labeling substance so that the first labeling substance is not released.
  • the length of the chain when a probe that is completely complementary to the target nucleic acid is released from the target nucleic acid is affected by the base composition of the remaining part of the probe, the reaction temperature, the pH of the solution, and the salt concentration.
  • the labeling site on the probe of the first labeling substance is 3 ⁇ when the exonuclease is ⁇ ⁇ 3 'exonuclease, the 6th base force is 16th base, and the exonuclease is ⁇ ⁇ 5 In the case of exonuclease, it is preferable to label the 6th to 16th nucleotides counting from the end.
  • the reaction conditions are such that the chain length when the probe leaves the target nucleic acid is significantly longer than the chain length when the probe leaves when there is no mismatch. Need to be set.
  • the length of time when the probe that has been degraded by exonuclease also breaks away from the target nucleic acid force is markedly different depending on whether there is a mismatch or not. It may not change.
  • the Tm is relatively high, so even if there is a single base mismatch, the effect of ⁇ is generally not significant.
  • mismatched base pairs the hydrogen bonds of GZG and GZT pairs are relatively stable with respect to other mismatched base pairs (Non-Patent Document 5). Discrimination by ⁇ is generally difficult even by the conventional method based on nodularization and hybridization.
  • the Tm of the probe and target nucleic acid around the polymorphic site are lowered.
  • the effect of the difference in ⁇ due to the presence or absence of mismatch can be increased.
  • the probe is hybridized to the target nucleic acid only when it completely matches the polymorphic site and does not match! Sometimes it is not allowed to be hybridized. It is also possible.
  • One of the advantages of the present invention is that there is no particular limitation on the chain length of the probe to be used, although it is a method for detecting polymorphisms or mutations based on hybridization. For example, there are about 4.3 billion 16-base probes that are produced by random permutations of four types of bases. Therefore, since the number of human bases is about 3 billion base pairs, a chain length of 16 bases or more is required to produce a probe with high specificity for the human genome, and high specificity is required. In the hybridization method and PCR method, a probe with a length of 20 to 30 bases is generally used. However, in the conventional method of discriminating base differences by BZF separation by washing after hybridization, the probe length is limited.
  • the longer the probe chain length the smaller the ratio of ⁇ Tm to Tm of the match, making it difficult to distinguish from the mismatch. Therefore, it is preferable that the probe be as short as possible.
  • the probe chain length is shortened in order to increase the ratio of ⁇ to Tm, there arises a problem that the specificity and affinity for the target nucleic acid are lowered.
  • the chain length of the probe is such that the signal generating substance that can be specifically released by the target sequence by the action of exonuclease, that is, the first labeling substance is placed at a suitable site on the probe.
  • the length is not particularly limited. Therefore, even when organisms with a large genome size are targeted for analysis, sufficient specificity and affinity can be ensured by increasing the base length of the probe.
  • it is possible to produce oligomer DNA of 100 bases or more with a general synthesizer it is economically advantageous to use an excessively long probe because the synthesis efficiency of full-length DNA decreases as the chain length increases. is not.
  • the force at which a probe of about 18 to 50 bases is preferably used can be used even outside this range.
  • the second labeling substance in the probe (hereinafter, when the probe contains two labeling substances, another labeling substance that forms a pair with the first labeling substance and establishes the FRET phenomenon is referred to as "second labeling substance".
  • the labeling site of the “substance” is not particularly released by the exonuclease before the first labeling substance, and the fluorescence of the first labeling substance can be effectively attenuated. It is not limited.
  • the exonuclease is ⁇ ⁇ 3 'exonuclease, use a probe labeled with a second label at the ⁇ end, and if the exonuclease is ⁇ ⁇ 5' exonuclease, use a probe labeled with the second label at the end. Can do.
  • the second labeling substance can be labeled in the probe chain in order to shorten the distance between the two labeling substances. That is, when the exonuclease is ⁇ ⁇ 3 'exonuclease, it is the nucleotide between the end and the first labeling substance, and when the exonuclease is 3 ⁇ 5' exonuclease, the end and the first end It is possible to label intranucleotides between the labeling substances.
  • the exonuclease used in the method for detecting a nucleic acid sequence is one that can release the nucleotide labeled with the first labeled substance in the probe hybridized to the target nucleic acid.
  • ⁇ exonuclease and ⁇ 7 Gene6 exonuclease can be mentioned as 5 ′ exonuclease.
  • E. coli exonuclease III can be mentioned as a 3 ′ exonuclease. Both of these are commercially available.
  • nucleotide at the labeled site cannot be released due to steric hindrance caused by the fluorescent substance or the quencher label.
  • a fluorescent nucleotide analog is used as a labeling substance, it can also be a substrate for such an exonuclease, so that the probe force can be effectively released.
  • the reaction is performed at a higher temperature to stabilize the hybridization between the target nucleic acid containing the mismatch and the probe, thereby making the perfect match And a mismatch can be made easy.
  • the reaction can be improved by, for example, performing the reaction at 37 ° C force up to 45 ° C. so There are things you can do.
  • the optimum reaction temperature is around 37 ° C, and if the temperature is raised further, the enzyme activity itself will decrease, and a sufficient signal may not be obtained.
  • thermostable enzyme having a higher optimum reaction temperature.
  • double-stranded DNA-specific ⁇ ⁇ 5, exonuclease has been isolated from thermophilic bacterium Archaeoglobus fulgidus (Afu) (Patent Document 4).
  • Au thermophilic bacterium Archaeoglobus fulgidus
  • the sample is a nucleic acid that can serve as a substrate for the exonuclease to be used.
  • ⁇ exonuclease ⁇ 7 Gene6 exonuclease, exonuclease III, and Afu derived ⁇ ⁇ 5 'exonuclease
  • DNA is used.
  • DNA extracted from biological samples can also be used directly The amount is often insufficient for use in force analysis.
  • a DNA product obtained by amplifying a nucleic acid extracted from a biological sample by PCR or the like can be used for gene mutation analysis according to the present invention.
  • RNA can be amplified by converting it to DNA using techniques (such as RT-PCR) that amplify as DNA after the reverse transcription reaction, and such amplification products can be analyzed.
  • DNA amplified by the LAMP method (Non-patent document 6), ICAN method (Non-patent document 7), Rolling Circle method (Non-patent document 8), etc. is also used as the specimen of the method of the present invention. it can.
  • a probe hybridized with the DNA can serve as a substrate for exonuclease.
  • exonuclease III and the like can be used as a sample in the method of the present invention because an oligonucleotide probe hybridized to circular single-stranded DNA can be used as a substrate.
  • cDNA reverse transcribed from RNA can be used for non-amplified nucleic acids. After reverse transcription, a hybrid of RNA and cDNA is obtained. Therefore, the ability to hybridize probes after denaturation or by degrading only RNA with RNase H, single-stranded cDNA is obtained and It is possible to perform an exonuclease cycling assay by performing hybridization of RNA, and quantitative detection and polymorphism analysis of RNA are possible. In addition, since exonuclease III has RNaseH activity, it is possible to perform exonuclease cycling assay without causing any other enzyme having RNaseH activity.
  • PCR products and reverse transcription products can be used for analysis without purifying PCR products and reverse transcription reaction products only to the extent that exonuclease reaction and probe hybridization are not significantly inhibited by excessive introduction of reaction solution components. It is very simple and quick.
  • Hybridization of the target nucleic acid and the probe in the present invention is usually performed after the target nucleic acid is a double-stranded DNA and is made into a single strand by denaturation. If the target nucleic acid is single-stranded, it can be hybridized with the probe DNA without modification.
  • the denaturing method in the present invention may be carried out according to a usual method. For example, heat denaturation and chemical denaturation are exemplified. As a specific method, the method by heat denaturation is usually performed by heating to 90 ° C or higher. Preferably, the denaturation is carried out by heating at 94 ° C to 98 ° C for about 1 to 5 minutes.
  • Chemical denaturation is performed by the action of denaturing agents such as urea and formaldehyde, or by raising the pH.
  • the pH can be raised by using 0.1 to 1 mol Zl NaOH, but a method using heat denaturation is preferably used from the viewpoint of easy operation.
  • the hybridization method may be the usual method, but the conditions depend on the chain length, base sequence, and Tm of the probe or denatured target nucleic acid. Different. In general, hybridization is performed at a pH of 6.5 to 9.5 and in the presence of 10 to 1000 mM sodium or potassium ions at a temperature of room temperature to 70 ° C. However, exonuclease activity is inhibited in the presence of excess sodium or potassium ions. It is necessary to find a condition that provides a sufficient signal-to-noise ratio (SZ N ratio) within the range of 10 to: LOOOmM.
  • SZ N ratio signal-to-noise ratio
  • the target sequence site of a linear double-stranded DNA such as a PCR product that is the target nucleic acid is made single-stranded by the action of the exonuclease used in the exonuclease cycling assembly method It does not necessarily require a denaturing operation.
  • exonuclease III is used as 3, ⁇ 5, exonuclease
  • the target PCR product is digested from the ⁇ end of both strands by the catalytic activity of exonuclease ⁇ and partially becomes single stranded. .
  • the reaction is performed at a constant temperature by adding exonuclease III and a reagent containing the probe to the PCR product without denaturation. Since the exonuclease cycling reaction is established only by carrying out the above, the method of the present invention is greatly advantageous in terms of simplicity and rapidity.
  • exonuclease When using another exonuclease, for example, exonuclease, a DNA amplified with a primer set in which only one of the PCR primers is phosphorylated at the end is used as a target nucleic acid. Only the strands whose ends are phosphorylated by the nuclease are digested, leaving the unphosphorylated strand, resulting in a single strand of the target DNA. Exonuclease cycling using ⁇ exonuclease without using a denaturation procedure if a probe with a complementary sequence to the single-stranded DNA is used and the end is phosphated Atssey is possible. As described above, according to the present invention, the exonuclease cycling assembly can be performed at a completely constant temperature, and a device for performing complicated temperature control is not required.
  • thermostable enzyme Heat resistance Afu-derived 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease (Patent Document 4) has been reported as a sex exonuclease. By using such an enzyme, it is suitable even at higher temperatures, ie, 50 ° C. or higher. An exonuclease cycling reaction can be performed.
  • Enzyme and probe concentrations affect both target nucleic acid specific signals and background 'signals.
  • the preferred combination of enzyme concentration and probe concentration varies depending on the type of enzyme, target nucleic acid used and probe sequence, and in each case it is necessary to find conditions that give a V, high and SZN ratio. .
  • the probe is decomposed from the terminal by the action of 3 ' ⁇ 5' exonuclease.
  • the fluorescence emitted along with is detected using a fluorometer under the conditions of a maximum excitation wavelength of 494 nm and a maximum fluorescence wavelength of 518 nm. Since the method according to the present invention is easy to operate, it is easy to construct an automation system. In particular, it is convenient to use a microplate to construct a high-throughput system. A fluorescence measuring device corresponding to the microplate is used to detect fluorescence when the microplate is used.
  • Examples of such an apparatus include, but are not limited to, CytoFluor Series 4000 (PerSeptive Biosystems 3) ⁇ Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter RekinElmer Life Science).
  • the selection of the excitation wavelength and the fluorescence measurement wavelength is limited by the type of filter provided in the apparatus, but an appropriate filter is selected based on the excitation and fluorescence wavelength of the fluorescent substance.
  • measurement can be suitably performed using a 485 nm excitation filter and a 535 nm fluorescence measurement filter.
  • the signal generated by the degradation of the probe by exonuclease is amplified by the probe's site reaction, and it is possible to measure the transition of the signal during the progress of the reaction, and select an appropriate reaction time. As a result, reproducibility and quantitative performance can be improved and measurement time can be shortened.
  • the reaction time is preferably several seconds or 60 minutes.
  • Real-time monitoring of signals can be carried out using a probe labeled with a fluorescent substance corresponding to each device using a real-time PCR device.
  • Real-time PCR equipment Examples of devices include PRISM 7700 Sequence Detection System (ABI), LightCycler (Roche Diagnostics), Smart Cycler II System (Takara Bio). Each of these devices can precisely control the reaction temperature between 4 ° C and 100 ° C, and is compatible with fluorescence measurements at various wavelengths, which is suitable for the present invention. used.
  • the K-ras gene is known to act as an oncogene when a mutation occurs in the twelfth codon (GGT) with an amino acid substitution, particularly glycine to parin, aspartate, or arginine.
  • GGGT twelfth codon
  • Kras gene mutations have been detected in about 40% of colorectal cancers, about 20% of lung cancers, and about 80-90% of spleen cancers, and are also used for tests from clinical specimens.
  • Thymine the 3rd base of codon 12
  • the 1st and 2nd bases are accompanied by amino acid substitutions even if they are replaced by misplaced bases. Therefore, when using site-specific single nucleotide polymorphism testing technology, it is essential to prepare a total of 7 probes corresponding to the first and second base substitutions in addition to the wild type sequence. .
  • a base substitution force S is present in any of the consecutive three or more base regions, the fluorescence intensity is significantly reduced, making it possible to distinguish it from a specific sequence. Effective for detecting mutations in cancer-related genes as well as types
  • a product obtained by PCR amplification of part of the K-ras gene from human genomic DNA was used as the target nucleic acid.
  • the sequences of the upstream and downstream primers are as follows. The synthesis of all the oligomeric DNA shown below was commissioned to Japan Bioservice.
  • SEQ ID NO: 1 GAGAGGCCTGCTGAAAATG Sequence number 2: CCTCTATTGTTGGATCATATTC
  • PCR conditions are: 1. 25 U Ex Taq DNA Polymerase (Takara Bio), IX Ex Ta q buffer (Takara Bio), 200 M each dNTP, 200 nM each primer, 10-: Contains LOOng human genomic DNA 50 A reaction solution of 1 was prepared, and a cycle reaction of 94 ° CZ for 20 seconds, 55 ° CZ for 20 seconds, and 72 ° C for Z20 seconds was performed 40 times. In addition, a cycle reaction was similarly performed in a reaction solution containing no human genomic DNA, and used as a negative control.
  • the probe sequence labeled Dabcyl at the end and FITC in the chain has a partial base sequence of the human K-ras gene and is as follows. However, “Z” in the sequence represents FITC-labeled deoxythymidine (FITC—dT).
  • SEQ ID NO: 3 5 '-GCTCCAACZACCACAAGTTTATATTCAGTC
  • the sample was transferred to a microplate (Corning), and fluorescence was measured at a plate reader Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer Life Science) trowel excitation wavelength 485 nm and fluorescence wavelength 535 nm.
  • the standard curve was very excellent in linearity, and the lowest detection sensitivity was 3 fmolz assay or less (3 ⁇ 4D).
  • Example 2 Presence / absence of denaturation operation process
  • Example 1 (3) a step of heat denaturation of the target double-stranded DNA is included before the addition of exonuclease.
  • the 170 fmol K-ras PCR product prepared in Example 1 (1) and the negative sample were converted into a method comprising the heat denaturation step of Example 1 (3) above. Comparison was made with a method not including a heat denaturation step.
  • the method that does not include the heat denaturation step is as follows: IX Exonuclease III Buffer (Takara Bio), 37.5 mM NaCl, 375 nM probe, 21 sample DNA (170 fmol PCR reaction solution) and 0.675 U / 1 exonuclease Prepare 201 reaction solutions containing III, incubate at 37 ° C for 30 minutes, and then incubate at 70 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme. Plate reader Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (Perkin Elma Life Science Co., Ltd.) measured fluorescence at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 535 nm. As a result, as shown in Fig.
  • the method without the heat denaturation step does not include the target nucleic acid! /,
  • the signal was almost the same as that obtained by the method including the steps. For this reason, it was found that the heat denaturation process is indispensable.
  • SEQ ID NO: 4 is a wild-type sequence of the human K ras gene, and includes a sequence that is completely complementary to the base sequence of the probe DNA shown in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 16 are obtained by substituting any one base of SEQ ID NO: 4 with another base, and each was hybridized with the probe DNA shown in SEQ ID NO: 3.
  • the double-stranded DNA formed contains a single base mismatch.
  • Figure 4 shows the positions of these mismatches.
  • the underlined base is a base that forms a mismatch when hybridized with the probe DNA shown in SEQ ID NO: 3.
  • an exonuclease cycling assay was performed under the following conditions.
  • Ie IX Exonuclease III Buffer (Takara Bio), 37.5 mM NaCl, 375 nM probe DNA, 0.675 UZ / H exonuclease III (Takara Bio), lOOfmol synthetic target DNA or 20 1 reaction solution containing purified water instead was prepared in a PCR reaction tube and immediately heated at 37 ° C or 41 ° C for 30 minutes using Mastercycler ep (Eppendorf).
  • each chemically synthesized target DNA was used as target nucleic acids.
  • the base sequence of each chemically synthesized target DNA is as follows.
  • SEQ ID NO: 4 is the wild type sequence of the human K ras gene, and includes a sequence that is completely complementary to the base sequence of the probe DNA shown in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 20 each contain an insertion or deletion of one or three bases in SEQ ID NO: 4, and when each is hybridized with the probe DNA shown in SEQ ID NO: 3.
  • the double-stranded DNA that is formed one of the DNA strands forms a loop structure.
  • the part indicated by a hyphen is the base deletion part, and the underlined base is the insertion sequence.
  • an exonuclease cycling assay was performed under the following conditions.
  • IX Exonuclease III Buffer (Takara Bio)
  • 37.5 mM NaCl 37.5 mM NaCl
  • 375 nM probe DNA 0.675 UZ / H exonuclease ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (Takara Bio)
  • 300 fmol synthetic target DN A or purified water 20 1
  • the reaction solution was prepared on a PCR plate for fluorescence measurement, and immediately heated at 41 ° C for 30 minutes using Maste rcycler ep (Eppendorf).
  • a polymorphism detection system for the human aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) gene has been constructed. did. There is a single nucleotide polymorphism of normal type “G” and mutant type “A” in exon 12 of ALDH2 gene. In order to identify this polymorphism by the exonuclease cycling assay, a region containing this polymorphic site was amplified by PCR from a sample DNA with a known genotype of ALDH2.
  • the primer sequences used for PCR are as follows.
  • SEQ ID NO: 21 GTGGCCGGGAGTTGGGCGAG
  • SEQ ID NO: 22 GCCCCCAACAGACCCCAATC
  • PCR conditions were: IX Ex Taq Buffer (Takara Bio), 200 M each dNTP, 200 ⁇ each primer, 0.625 U Ex Taq DNA polymerase (Treasure Bio), 10-50 ng of human genomic DNA.
  • the success of amplification was electrophoresed on 2% Agarosugeru was sure by staining with E histidinol ⁇ beam bromide 0
  • IX Exonuclease III Buffer (Takara Bio), 40 mM NaCl, 150 nM Probe DNA, 0.4 U / ⁇ 1 Exonuclease III (Takara Bio), 20 ⁇ 1 reaction containing 5 ⁇ 1 of the above PCR reaction solution or purified water
  • the solution was prepared in a PCR reaction tube and immediately heated at 37 ° C for 30 minutes using Mastercycler ep (Eppendorf).
  • SEQ ID NO: 23 TTTCACTTCAGZGTATGCCTGCAGCC
  • SEQ ID NO: 24 CACTTTAGTGZATGCCTGCAGCCCGTA
  • SEQ ID NO: 25 CACTTTAGTGZATGTCTGCAGCCCGTA
  • Z indicates FITC-labeled dT, and the end of the probe is labeled with a dark quencher, Dabcyl!
  • oligomer DNAs were synthesized as the target nucleic acids, which had the ability to sequence wild-type and mutant ALDH2.
  • the relationship between these probes and the target DNA is shown in FIG.
  • the probe consisting of SEQ ID NO: 24 is completely complementary to the mutant target DNA consisting of SEQ ID NO: 27, but forms a GZT mismatch base pair at the polymorphic site with the wild-type target DNA that also has SEQ ID NO: 26.
  • the probe consisting of SEQ ID NO: 25 has the fourth base substituted from C to T (underlined), counting 3 'from the FITC labeling site of SEQ ID NO: 24 (underlined), and the wild type and mutant target DNA. Both were designed to form mismatched base pairs at this site.
  • IX Exonuclease III Buffer (Takara Bio)
  • 40 mM NaCl 250 nM probe DNA
  • 0.05UZ 1 exonuclease III (Takara Bio)
  • 20 ⁇ 1 reaction containing 100 f mol of synthetic target DNA Prepare the solution in a 96-well fluorescence measurement PCR plate, immediately heat at 37 ° C for 30 minutes using Mastercycler ep (Eppendorf), and then heat at 70 ° C for 5 minutes to inactivate the enzyme.
  • the fluorescence was measured at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 535 nm using a plate reader Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer Life Science). As a blind test, the reaction and fluorescence were measured without adding the target DNA.
  • a region containing the ALDH2 gene polymorphism site was amplified in the same manner as in Example 5 from 23 human genomic DNAs of 50 to 50 ng and purified water instead of DNA as negative samples. Each 5 ⁇ l was assayed using ALDH2 gene wild-type and mutant detection systems.
  • 1 X Exonuclease III Buffer (Takara Bio) 40 mM NaCl, 150 nM probe DN A, 51 PCR product, 0.2 UZ 1 (wild Type reaction system) or 0.0375UZ 1 (mutant detection system) of exonuclease III (Takara Bio), prepare a 20 ⁇ 1 reaction and incubate at 37 ° C / 30 minutes, then at 70 ° CZ for 5 minutes.
  • SEQ ID NOS: 23 and 25 show the probe sequences for specifically detecting the wild-type and mutant types used at this time, respectively.
  • Figure 13 shows the distribution of the fluorescence signal of each sample, with the RFU value of the wild-type detection system as the horizontal axis (G allele) and the RFU value of the mutant detection system as the vertical axis (A allele). is there.
  • the distribution of the fluorescence signal was clearly divided into three groups, and each group completely matched the three specimen groups, GZG homozygous, GZA heterozygous, and AZA homozygous whose genotype was determined by the Sanger method. From this, it was shown that the present invention is extremely useful in genotyping of actual biological samples.
  • FIG. 1 is a diagram showing the principle of exonuclease cycling assembly that enables uniform measurement of gene polymorphisms or gene mutations.
  • FIG. 2 is a diagram showing a standard curve of a homogeneous measurement system for exonuclease cycling assembly. (Example 1)
  • FIG. 3 is a diagram showing measurement results based on the presence or absence of a heat denaturation step of DNA before addition of exonuclease. (Example 2)
  • FIG. 4 is a diagram showing sequences of a probe and a synthetic target nucleic acid. (Example 3)
  • FIG. 5 is a diagram showing the result of an attempt to detect mismatches using a homogeneous measurement system for exonuclease cycling assay performed at a reaction temperature of 37 ° C. (Example 3)
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of an attempt to detect mismatches using an exonuclease cycling assembly homogeneous measurement system performed at a reaction temperature of 41 ° C. (Example 3)
  • FIG. 7 is a diagram showing sequences of a probe and a synthetic target nucleic acid. (Example 4)
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of an attempt to detect inserted and deleted sequences using a homogeneous measurement system for exonuclease cycling assembly. (Example 4)
  • FIG. 9 is a diagram showing the sequence of a region containing a single nucleotide polymorphism of the ALDH2 gene and the sequence of a wild type ALDH2 gene-specific probe DNA. (Example 5)
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of ALDH2 gene polymorphism detection using a homogeneous measurement system for exonuclease cycling assembly. (Example 5)
  • FIG. 11 is a diagram showing sequences of a probe and a synthetic target nucleic acid. (Example 6)
  • FIG. 12 shows the results of an attempt to improve the specificity of single-base substitution detection by using an artificial mismatch introduction probe in exonuclease cycling assembly. (Example 6)
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of determination of the gene type of ALDH2 by means of exonuclease cycling assembly. (Example 7)
  • FIG. 14 shows the results of exonuclease cycling assay for samples prepared by mixing two human genomic DNAs with different ALDH2 genotypes at different ratios.

Abstract

　簡便、迅速、高精度且つ安価に特定の核酸配列の定量的検出及び遺伝子多型または変異の検出を均一系にて行う方法及びそれに用いられるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。 　標的核酸にハイブリダイズさせた１個または２個の標識物質を含むプローブＤＮＡを、エキソヌクレアーゼの作用によって５´または３´末端より分解させ、プローブの標識物質のひとつを遊離させた結果発せられるシグナルを検出することにより、特定配列を有する核酸の定量的検出、遺伝子多型または変異の検出がなされる。

Description

明 細 書
遺伝子配列検査法
技術分野
[0001] 本発明は臨床医学、法医学、薬物化学、生化学、食品化学、農芸化学などの分野 における、主として遺伝子解析方法に関するものであり、ゲノム遺伝子、ウィルス又は 細菌等の遺伝子の変異又は多型の解析に用いられる。
背景技術
[0002] 遺伝子多型（以下、「多型」）とは、全個体中 1%以上の頻度で存在するゲノムの多 様性のことであり、 1塩基多型（single nucleotide polymorphism ; SNP)の他、 1 〜数十塩基の欠損もしくは挿入、数塩基〜数十塩基からなる繰り返し配列 (マイクロ サテライト）における繰り返し回数の違 、などが含まれる。
[0003] 遺伝子配列の変異や多型を解析することは、臨床医学、法医学、薬物化学、生化 学、食品化学、農芸化学などの多岐にわたる分野で重要である。ヒトの場合を挙げれ ば、遺伝子の変異（一般的には出現頻度が 1%未満のものを指す）は、遺伝病、癌な どと深く関わりのあることが示されているし、多型（一般的には出現頻度が 1%以上の ものを指す)は、疾患の発症リスク、薬剤感受性、薬剤代謝速度などとの関わりが示さ れている。また、ウィルスや細菌の場合、薬剤耐性、病原性などとの関わりのあること が知られている。さらに、個人及び個体識別や農産物の品種同定などにも利用され る。
[0004] 現在、遺伝子配列の変異や多型を最も精度よく解析するために、主にサンガー法 による塩基配列の決定が行われている。近年では、塩基配列決定の手順の一部が 自動化されているが、なお操作が煩雑であり、解析に長時間を要し、高価な装置と試 薬とを必要とする。
[0005] より簡便、迅速、安価な多型解析の方法として、サンガー法による塩基配列決定以 外の方法が開発されており、なかでもハイブリダィゼーシヨンを基盤とした方法は広く 利用されている一般的なものである。ハイブリダィゼーシヨンを基盤とした方法は、主 にマイクロプレート、メンブレン、ビーズ、スライドガラスなどの固相に、一般的には 15 〜25塩基長程度のプローブを固定させ、これに標的核酸をハイブリダィズさせること によってヘテロデイブレックスを形成させる。そして、該ヘテロデイブレックス中に塩基 対のミスマッチのある場合とな 、場合との融解温度（以下、 Tmと 、う）の差異（以下、 ΔΤπι)を利用し、ハイブリダィゼーシヨン及びノヽイブリダィゼーシヨン後の洗浄操作に おいて ρΗ、塩濃度、温度などを適切に調整することによって、ミスマッチのあるへテロ デイブレックスのみを選択的に解離させ除去する、いわゆる BZF分離と呼ばれる手 法に基づいている。この際、プローブの鎖長が長くなると Tmが高くなり、 ΔΤπιが全 体の Tmに占める割合が小さくなるため、この微小な ΔΤπιを利用してミスマッチのあ る標的核酸とミスマッチのない標的核酸とを洗浄条件の調整によって分離することが 困難となる。また鎖長が短くなるとハイブリダィゼーシヨンの特異性が低くなるだけで なぐ全体の Tmも低くなるため、プローブと標的核酸との結合の親和性も下がり、プ ローブが効率よくハイブリダィズしないことがある。そのため、たとえ穏やかな条件下 でノ、イブリダィズさせたとしても、親和性が低!、ためにマッチした標的核酸とミスマツ チのある標的核酸がともに除去されてしまい、結果としてマッチとミスマッチを区別す ることが困難となることが多い。
他の方法としては、被検 DNAを铸型として、プライマー伸長法によって一塩基また は数塩基のヌクレオチドの取り込みを行い、铸型 DNAの配列に応じて取り込まれた ヌクレオチドの種類を同定することによって多型を解析する、ミニシークェンスと呼ば れる方法がある。ミニシークェンス法では、しばしば PCRによって増幅された DNAが 铸型として用いられる力 プライマー伸長を行う前に残存する PCRプライマーゃヌク レオチドの除去、反応液の交換などのために PCR産物の精製が不可欠であり、操作 が煩雑である。また、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定するための最新の方法 として質量分析法が使用されることがあるが、非常に高価な装置を必要とする。このよ うに、ミニシークェンス法においては、経済性、迅速性の点での問題を指摘すること ができる。
特許文献 1：特開平 6 - 327499
特許文献 2：国際公開公報 WO2002Z077282
特許文献 3：国際公開公報 WO2003Z035864 特許文献 4:国際公開公報 WO01Z23583
非特許文献 l:BioTecniques, 13, 888-892, 1992
非特許文献 2:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58(2), 719-726(1967) 非特許文献 3: Biochemistry, 37, 10156-10163(1998)
非特許文献 4: Tetrahedron Lett. , 22, 1859(1981)
非特許文献 5: Biochemistry, 38、 3468-3477(1999)
非特許文献 6: Nucleic Acids Res. 28, e63(2000)
非特許文献 7:臨床病理 50、 528— 532(2002)
非特許文献 8:Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(10), 4641-4645(1995) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、ェキソヌクレアーゼを用いた遺伝子配列の検査法に関して、簡便、迅速 且つ高精度な均一測定法であり、従来困難であった標的核酸とプローブとの間のミ スマッチによって生じる Tmの差に基づく遺伝子配列の差異の検出において、感度 及び特異性を著しく向上させ得る技術を提供する。また、本発明は、その実施におい て必要とされる材料及び試薬類がすべて容易に入手でき、且つ極めて安価なものば 力りであり、経済性に優れる検出技術を提供するものである。
課題を解決するための手段
[0008] 二本鎖 DNAを特異的に消化する λェキソヌクレアーゼ（非特許文献 1)ゃェキソヌ クレアーゼ ΠΙ (特許文献 1)を用いたサイクリングアツセィ法では、放射性物質を標識 したオリゴヌクレオチドプローブが相補的な配列とハイブリダィズして形成された二本 鎖 DNAにェキソヌクレアーゼを作用させ、消化に伴って短くなつたプローブが標的 核酸から解離した後、新たなプローブがハイブリダィズし、さらにこれが消化される行 程が繰り返されることによってサイクリング反応が成立する。該プローブの分解産物を オートラジオグラフィゃシンチレーシヨンカウンターなどで検出することにより、標的核 酸の有無ある 、は量の判定が可能であることが示されて 、る。
[0009] さらに、放射性物質を用いないェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定 系が報告されている (特許文献 2および 3)。当該測定系は、蛍光物質及びタエンチ ング物質 (タエンチヤー）を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いたもので、プロ ーブが消化を受けて ヽな 、ときは蛍光物質力 発せられる蛍光エネルギーはクェン チヤ一によつて吸収されているため、蛍光を発しないか微弱な蛍光し力発しない。プ ローブがェキソヌクレアーゼによって分解されると、蛍光物質がプローブから遊離して クェンチヤ一との距離が広がり、蛍光エネルギーを吸収することができなくなる。その 結果、蛍光物質がその固有の波長の蛍光を発するようになり、該蛍光を検出すること によって、プローブの分解量を測定することができる。このような蛍光物質およびその 蛍光エネルギーを効率的に吸収することのできるクェンチヤ一を標識物質として用い る手法は、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)として公知である（非特許文 献 2)。
[0010] 上記のように、ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィによって特定の標的配列を定 量的に検出できることは公知である力 ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィによつ て遺伝子多型の検出が可能なことは示されていない。本発明者は鋭意研究を重ね た結果、ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定系によって、標的遺伝子 上のわず力 1塩基あるいは 2塩基以上の塩基配列の差異を簡便、迅速、安価且つ高 精度に識別できることを見出した。
[0011] プローブのハイブリダィゼーシヨンの特異性を高めるには、プローブの塩基長は十 分に長い方が好ましい。しかし、長鎖のプローブ、例えば 25塩基以上の長いプロ一 ブを用いた場合、該プローブと標的核酸との間のミスマッチ（以下、特に示さない限り 「ミスマッチ」には非相補的な塩基対およびループ構造が含まれる）の有無を、ハイブ リダィゼーシヨンの有無で感度及び特異性良く区別することは概して困難である。な ぜなら、長いプローブを用いた場合、ミスマッチのあるときとないときの Tmの差（ΔΤ m)は、それらを BZF分離のための洗浄条件の調整によって区別するにはあまりにも 小さすぎる力もである。本発明は、ハイブリダィゼーシヨンに基づく方法でありながら、 十分に長い、例えば 25塩基以上のプローブを用いることが可能であり、多型の存否 に関わらず、標的となる核酸配列に非常に親和性の高いハイブリダィゼーシヨンが可 能である。さらに、条件によって変化するため一概には言えないが、ェキソヌクレア一 ゼによる分解作用でプローブが短くなつたときに多型を検出する場合、本発明は 5〜 15塩基程度に短くなつたときのミスマッチの有無によって生じる Tmの差（ΔΤπι)を 利用しているため、全体の Tmに占める ΔΤπιの割合が大きくなり、従来のより長いプ ローブを用いたハイブリダィゼーシヨン法に比べて、多型識別の感度と特異性がとも に高いことが特徴である。
[0012] また、本発明は、操作が簡便で、従来のハイブリダィゼーシヨン法のように標的核酸 とのミスマッチを有するプローブ、またはプローブとのミスマッチを有する標的核酸を 除くための洗浄操作、いわゆる BZF分離の操作を必要としない。また、本発明は、 遺伝子増幅法で増幅した産物を精製することなぐ直ちにェキソヌクレアーゼサイタリ ングアツセィに用いることができ、二本鎖 DNAを被検試料としたときも変性操作を必 要とせず、極めて迅速性と簡便性に優れる。さら〖こ、本発明に必要な試薬は全て商 業的に安価に入手可能なものであり、遺伝子解析で最も一般的に用いられる器具及 び装置のみを必要とするため、極めて経済性と汎用性に優れるものである。
[0013] すなわち本発明は、
1.特定の配列を含む標的核酸を、該標的核酸力 少なくとも一つ以上の塩基の置 換を含む核酸、または 1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して定量的 に検出する均一測定系であって、以下の工程からなる方法；
I)標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的 DNAにハイブリダィズさせるェ 程、
Π)ハイブリダィズした該オリゴヌクレオチドプローブを二本鎖 DNA特異的 5'→3^ェ キソヌクレアーゼまたは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼで消化する工程、
III)該オリゴヌクレオチドプローブの消化によってオリゴヌクレオチドプローブ力も少な くともひとつの標識物質が遊離した結果発せられるシグナルを検出する工程。
2.標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で少なくとも 1塩基 以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における塩基の挿入 または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに 、 5'→3 'ェキソヌクレアーゼまたは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼによる消化によってォ リゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチド プローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意 なシグナルの上昇が起こらないことを検出する、ことからなる上記 1に記載の方法。
3.ェキソヌクレア一ゼが^→3 'ェキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプロ ーブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも 1塩基以上の相補的でな!、塩基対部 分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの^末端と標識物質が標識 された部位との間に位置するように設計された上記 1または 2に記載の方法。
4.ェキソヌクレアーゼが 3'→5 'ェキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプロ ーブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも 1塩基以上の相補的でな!、塩基対部 分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの^末端と標識物質が標識 された部位との間に位置するように設計された上記 1または 2に記載の方法。
5.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果 を有するクェンチング物質が蛍光物質の 3 則に標識された上記 3に記載の方法に 使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
6.標識物質カ^ェンチング物質であって、該クェンチング物質によって有効に蛍光 が減弱され得る蛍光物質がクェンチング物質の 3 則に標識された上記 3に記載の方 法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
7.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果 を有するクェンチング物質が蛍光物質の 5 則に標識された上記 4に記載の方法に 使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
8.標識物質カ^ェンチング物質であって、該クェンチング物質によって有効に蛍光 が減弱され得る蛍光物質がクェンチング物質の 5 則に標識された上記 4に記載の方 法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
9.標識物質が標的 DNA中のグァニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれ力とヮト ソン クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである 上記 3または 4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
10.蛍光性ヌクレオチドアナログが 2 ァミノプリンである上記 9に記載のオリゴヌタレ ォチドプローブ。
11. 5'→3 'ェキソヌクレアーゼがえェキソヌクレアーゼまたは T7 Gene6ェキソヌク レアーゼである上記 3に記載の方法。 12. 3'→5 'ェキソヌクレア一ゼがェキソヌクレアーゼ ΙΠである上記 4に記載の方法。
13.ェキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である上記 1から 4のいずれか 1に記載の方法
14.耐熱性酵素が Archaeoglobus fulgidusに由来する上記 13に記載の方法。
15. RNAより逆転写反応により合成した cDNA、ポリメラーゼ'チェイン 'リアクション 法 (PCR法)または逆転写 PCR法にて増幅した産物を精製することなく被検試料とし て用いる上記 1または 2に記載の方法。
16.オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはルー プ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導 入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも一つ以上の塩基の置 換を含む核酸、または 1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向 上させることのできる上記 5から 10のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドプローブ を利用した上記 1から 4及び 11から 15のいずれか 1に記載の方法
17.上記 1〜16のいずれか 1に記載の方法に使用する測定試薬またはキット、 からなる。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸を、その標的核酸とは一塩基 以上の置換、挿入あるいは欠損配列を有する核酸と区別して定量的に検出すること が可能である。また、高価な試薬原料を必要としないためランニングコストが安価であ る。さら〖こ、操作は極めて簡便で、 PCR反応後の産物の精製および変性操作も不要 であり、シグナルのリアルタイム測定も可能であり、極めて迅速な検査方法を提供す ることがでさる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明は標的核酸配列を定量的に測定し、さらに標的核酸配列中の多型または 変異を識別するための方法である。本発明は、標識物質を結合させたオリゴヌクレオ チドプローブ (以下「プローブ」と 、う）を標的核酸配列に特異的にハイブリダィゼーシ ヨンさせて、標的核酸配列中の多型部位または変異部位周辺の配列が、原則として プローブ配列と完全に相補的である場合のみに、標的核酸に結合したプローブから ェキソヌクレアーゼの作用によって標識物質が遊離することによりシグナルが得られ る機構を利用している。
[0016] 本発明の標識物質とは、シグナルの発生またはその制御に関わるものであり、より 具体的には、蛍光を発する物質または別の物質が発する蛍光を減弱させる物質であ る。 1分子のプローブ DNAは 1個ないし 2個の標識物質が含まれる。
[0017] 1個の標識物質のみを用いる場合、標識物質として蛍光性のヌクレオチドアナログ が使用できる。蛍光性のヌクレオチドアナログの中には、モノヌクレオチドのときは強 い蛍光を発する力 ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの中に含まれるときには その蛍光が減弱され、さらに他の塩基とワトソン クリックの法則に合致した塩基対を 形成するものがある。そのようなヌクレオチドアナログとして、特にこれに限定されない 力 2—ァミノプリンを例示することができる。 2—ァミノプリンはアデニンと置き換えるこ とによってチミンと塩基対を形成し、さらに 2—ァミノプリンを含む核酸はェキソヌクレ ァーゼの基質となり得る（非特許文献 3)。したがって、 2 ァミノプリンを含むプローブ を用 ヽてェキソヌクレアーゼサイタリングアツセィを行うと、標的核酸と結合した 2—ァ ミノプリンを含むプローブがェキソヌクレアーゼによって分解され、プローブから遊離 した 2—ァミノプリンが発する蛍光を検出することによって、特定核酸配列の均一測定 が可能となる。
[0018] 2個の標識物質を用いる場合、標識物質として蛍光物質及びその蛍光を有効に減 弱させる性質を有する物質 (以下、クェンチヤ一）が使用できる。蛍光物質およびその 蛍光を有効に減弱させるクェンチヤ一の組み合わせは、このような機能を有する組み 合わせであればよぐさらにプローブ DNAと標的核酸とのハイブリダィゼーシヨン及 びェキソヌクレアーゼによる消化を実質的に妨害しないものであれば特に限定されな い。具体的には fluorescein、 FITC、 FAM、 TAMRA、 Cy3、 Cy5、ユウ口ピウムな どの蛍光性物質とその蛍光波長と一致した吸収波長、もしくは近傍に吸収波長を有 して 、る、より長波長の蛍光を発する別の蛍光性物質カ^ェンチヤ一として組み合わ せて用いられることは、一般的に蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)として公知であ る（非特許文献 2)。また、吸収エネルギーを蛍光ではなく熱として放出する非蛍光性 の物質をクェンチヤ一として使用することもできる。これらはダーククェンチヤ一と呼ば れ、蛍光の減弱効率に優れるものが多い。具体的には Dabcyl、 Eclipseや BHQ (B1 ack Hole Quencher)を例示することができる。
[0019] 2個の標識物質のうち、ェキソヌクレアーゼ反応によってプローブ力 遊離させられ るものは蛍光物質またはクェンチヤ一のいずれでもよい。ただし、いずれの場合もプ ローブ上で蛍光物質の蛍光を有効に減弱するようにクェンチヤ一を配置させ、蛍光 物質またはクェンチヤ一の!、ずれか一方がプローブから遊離した場合に、それを蛍 光強度の上昇として検出できょうにする必要がある。
[0020] プローブとして利用される一本鎖 DNAは、一般的にはアミダイト法で有機化学的に 合成される（非特許文献 4)。蛍光物質及びクェンチヤ一標識プローブも、各標識アミ ダイト試薬と自動合成装置を用いて容易に合成されることは当業者に広く知られると ころである。また、アミノ化を施したアミダイト試薬を用いて DNAを合成した後に、スク シンイミドなどの活性エステルを導入した標識物質とカップリングさせることもできる。 これらの方法による標識 DNAは、商業的サービスを利用して入手することができる。
[0021] 1個ないし 2個の標識物質を用いるいずれの場合においても、標的核酸中の特定 領域の配列がプローブ配列と完全に相補的である場合のみ標識物質 (2個の標識物 質を用いる場合は少なくともいずれか一方の標識物質）がェキソヌクレアーゼの作用 によって遊離する（図 1左)。また、標的核酸配列の特定領域に存在する多型または 変異によってプローブ配列と一塩基または二塩基以上のミスマッチ、またはループ構 造を形成する場合には、標的核酸とプローブの Tmが完全に相補的な場合より低くな るため、プローブが標的核酸にハイブリダィズすることができない（図 1右)。あるいは 、ノ、イブリダィズした後にェキソヌクレアーゼによる分解に伴ってプローブの鎖長が短 くなると、 Tmの低下によって標的核酸とプローブが二本鎖を維持できなくなり、ェキ ソヌクレアーゼが標識物質を遊離する前にプローブが標的核酸力 離脱し、その結 果、蛍光の発生がないか、あるいは最小限となる（図 1中央)。本発明の方法は、これ らのことを利用して標的核酸中の多型または変異を識別することを特徴としている。
[0022] プローブの設計は、ェキソヌクレアーゼが^→3 'ェキソヌクレアーゼの場合には、 第一標識物質 (以下、 2個の標識物質のうち、ェキソヌクレアーゼ反応によってプロ一 ブから最初に遊離される標識物質を「第一標識物質」と呼ぶ。プローブが 1個の標識 物質のみを含む場合は、「第一標識物質」とはその標識物質を表す)の標識部位とプ ローブの^末端と間に標的核酸の多型または変異部位が相当するように行う。一方 、ェキソヌクレアーゼが^→ ^ェキソヌクレアーゼの場合には、第一標識物質の標識 部位とプローブの^末端との間に標的核酸の多型または変異部位が相当するように 行う。
[0023] プローブと標的核酸のハイブリッド中のミスマッチがプローブの末端近傍に存在して いる場合、ミスマッチがプローブの中央付近に存在するときに比べて、ミスマッチが標 的核酸とプローブのハイブリッドの安定性に及ぼす影響が少ない。したがって、プロ 一ブの鎖長を十分に長くすればミスマッチの有無に関わらずプローブを標的核酸に 効率的にハイブリダィズさせることができる。次いで、標的核酸にハイブリダィズした プローブがェキソヌクレアーゼの作用による分解で短縮されるにしたがって Tmが下 がり、ハイブリッド形成が不安定となる。その際に、プローブと標的核酸との間に一塩 基以上のミスマッチがあると、ミスマッチがない場合と比較してさらに Tmが小さくなり、 ノ、イブリツドの安定性がさらに低下する。その結果、ェキソヌクレアーゼが第一標識物 質を遊離させる前にプローブが標的核酸力も離脱することになる（図 1)。
[0024] 第一標識物質の標識部位は、ェキソヌクレアーゼによって短縮されたプローブの残 存部が標的核酸力 離脱するときの鎖長を考慮して決定されなければならない。す なわち、プローブの残存部と標的核酸の間にミスマッチがない場合、ェキソヌクレア ーゼによって第一標識物質が遊離された後にプローブの残存部が標的核酸力 離 脱する。また、ミスマッチがある場合、第一標識物質が遊離される前にプローブの残 存部が標的核酸力 離脱する力、あるいはプローブが全くハイブリダィズしない。そ の結果として第一標識物質が遊離しないよう、第一標識物質の標識部位を決定する 必要がある。
[0025] 標的核酸に完全に相補的なプローブが標的核酸力 離脱する際の鎖長は、プロ一 ブ残存部の塩基組成、反応温度、溶液の pH、塩濃度の影響を受ける。一般に、グァ ニンとシトシンの含量が高ぐ反応温度が低ぐ pHが低ぐまた塩濃度が高いほど、 標的核酸力も離脱する際の鎖長は短くなる。そのため、これに限定されないが、本技 術の一般的な実施条件の範囲内（反応温度が 25°C〜45°C、pHが 7. 0〜10. 0、塩 濃度が 10mM〜200mM)では、プローブ DNAが標的 DNAから離脱するときの鎖 長は、 5〜15塩基程度である。したがって、第一標識物質のプローブ上の標識部位 は、ェキソヌクレアーゼが^→3 'ェキソヌクレアーゼの場合は 3 '末端力 数えて 6塩 基目力も 16塩基目、ェキソヌクレア一ゼが^→5 'ェキソヌクレアーゼの場合は^末 端から数えて 6塩基目から 16塩基目のヌクレオチドに標識するのが好適である。そし て、プローブと標的核酸の間にミスマッチが存在する場合、プローブが標的核酸から 離脱するときの鎖長が、ミスマッチの存在しない場合に離脱するときの鎖長より有意 に長くなるように反応条件を設定する必要がある。
し力しながら、多型の存在する部位周辺の塩基配列によっては、ェキソヌクレア一 ゼによって分解を受けたプローブが標的核酸力も離脱するときの長さが、ミスマッチ のある場合とない場合とで顕著に変化しないこともある。特に、 GC含量の高い領域 の場合、比較的 Tmが高くなるため、わずカゝ 1塩基のミスマッチが存在しても ΔΤπιの 影響は概して大きくないことが多い。また、ミスマッチ塩基対の中でも、 GZGペア及 び GZTペアの水素結合は他のミスマッチ塩基対に対して比較的安定であり（非特許 文献 5)、 GC含量の高い領域内の該ミスマッチ塩基対を ΔΤπιによって識別すること は、従来のノ、イブリダィゼーシヨンを基盤とした方法でも概して困難である。そのような 場合には、標的核酸との間に別のミスマッチを生じさせるように、意図的にプローブの 一部の塩基を置換、挿入または欠損させることで改善できる。人為的ミスマッチの導 入部位及び導入の仕方 (置換、挿入または欠損させる塩基の種類など）は、標的核 酸の多型に由来するミスマッチのあるときとないときで、ェキソヌクレアーゼによって消 化を受けたプローブの残存部が標的核酸力 離脱するときの長さに有意な差を生じ ればよぐ特に限定されない。例えば、 GC含量の高い領域において一部の GZC塩 基対を GZG、 GZTまたは GZAミスマッチとなるようにプローブの塩基を置換するこ とで、多型存在部位周辺のプローブと標的核酸の Tmを下げ、ミスマッチの有無によ る ΔΤπιの差の影響を大きくすることができる。また、このようなプローブへの人為的ミ スマッチの導入によって、多型部位と完全にマッチしたときだけプローブを標的核酸 にハイブリダィズさせ、マッチしな!、ときにはノ、イブリダィズさせな 、よう〖こすることも可 能である。 [0027] 本発明の利点の一つは、ハイブリダィゼーシヨンを基盤にした多型または変異の検 出方法でありながら、使用するプローブの鎖長に特に制限がないことである。例えば 、 4種類の塩基カゝらランダムな順列組合せで作製される 16塩基長のプローブは約 43 億通りある。したがって、ヒトの塩基数は約 30億塩基対であるので、ヒトのゲノムに対 して特異性の高いプローブを作製するには 16塩基以上の鎖長が必要であり、高い 特異性が要求されるハイブリダィゼーシヨン法や PCR法では、 20〜30塩基長のプロ ーブゃプライマーが用いられるのが一般的である。しかし、従来のハイブリダィゼーシ ヨンの後に洗浄による BZF分離によって塩基の差異を識別する方法では、プローブ 長に制限がある。すなわち、プローブの鎖長が長くなるほどマッチの Tmに対する Δ Tmの占める割合が小さくなり、ミスマッチとの識別が困難となるため、できる限りプロ ーブは短い方が好ましい。しかし、前述した通り、 Tmに対する ΔΤπιの占める割合を 大きくするためにプローブの鎖長を短くすると、標的核酸に対する特異性と親和性が 低下するという問題が生じる。
[0028] 本発明によれば、プローブの鎖長は、ェキソヌクレアーゼの作用によって標的配列 特異的に遊離させることのできるシグナル発生物質、すなわち第一標識物質をプロ ーブ上の好適な部位に標識できる最小限の鎖長を確保している限りその長さに特に 制限はない。したがって、ゲノムサイズの大きな生物を解析対象とする場合も、プロ一 ブの塩基長を長くすることによって、十分な特異性と親和性を確保することができる。 一般的な合成装置では 100塩基以上のオリゴマー DNAの作製も可能であるが、鎖 長が長くなるほど完全長の DNAの合成効率が下がるため、過剰に長鎖のプローブ を使用することは経済上有利ではない。また、鎖長が長くなることによって、ェキソヌク レアーゼによる消化に時間を要し、サイクリング反応が効率的に行われなくなる恐れ がある。したがって、本発明の方法では、 18塩基から 50塩基ほどのプローブが好適 に使用される力 この範囲外でも使用可能である。
[0029] プローブにおける第二標識物質 (以下、プローブに 2個の標識物質が含まれる場合 に、第一標識物質と対を成して FRET現象を成立させるもう一つの標識物質を「第二 標識物質」と呼称する）の標識部位は、ェキソヌクレアーゼによって第一標識物質より 先に遊離されず、且つ第一標識物質の蛍光を有効に減弱することができれば特に 限定されない。例えば、ェキソヌクレアーゼが^→3 'ェキソヌクレアーゼの場合は^ 末端に、ェキソヌクレアーゼが^→5 'ェキソヌクレアーゼの場合は^末端に第二標 識物質を標識したプローブを使用することができる。
[0030] ただし、第一標識物質と第二標識物質の距離が離れると、クェンチヤ一による蛍光 の減弱効果が弱まり、ノ ックグラウンドの蛍光シグナルが増大することがある。そのよう な場合には、両標識物質の距離を短くするために第二標識物質をプローブの鎖内に 標識することも可能である。すなわち、ェキソヌクレアーゼが^→3 'ェキソヌクレア一 ゼの場合には^末端と第一標識物質の間のヌクレオチドに、ェキソヌクレアーゼが 3 →5'ェキソヌクレアーゼの場合には^末端と第一標識物質の間のヌクレオチドに鎖 内標識することが可能である。このことにより、第二標識物質が第一標識物質より先 にェキソヌクレアーゼによって遊離されることはなぐまた両標識物質の距離の短縮 によりクェンチング効果を向上させ、ノ ックグラウンド 'シグナルを低減させることがで きる。
[0031] 核酸配列の検出法において使用されるェキソヌクレアーゼとしては、標的核酸にハ イブリダィズしたプローブ中の第一標識物質が標識されたヌクレオチドを該プローブ DNA鎖力 遊離することのできるものであれば良ぐ特に限定されない。例えば、 5' ェキソヌクレアーゼとして λェキソヌクレアーゼ、 Τ7 Gene6 ェキソヌクレアーゼを 挙げることができる。また、 3'ェキソヌクレアーゼとして大腸菌ェキソヌクレアーゼ IIIを 挙げることができる。これらはいずれも商業的に入手可能である。また、ェキソヌクレ ァーゼによっては蛍光物質またはクェンチヤ一の標識による立体障害によって、標識 部位のヌクレオチドを遊離できない可能性がある。しかしながら、そのような場合でも 蛍光性ヌクレオチドアナログを標識物質として用いれば、 、かなるェキソヌクレアーゼ の基質ともなり得るので、効果的にプローブ力 遊離させることができる。
[0032] 本発明による方法において完全マッチとミスマッチとの判別が困難な場合、より高い 温度で反応させて、ミスマッチを含む標的核酸とプローブとのハイブリッド形成を不安 定ィ匕することにより、完全マッチとミスマッチとの判別を容易にすることができる。例え ば、 37°Cの反応で完全マッチとミスマッチとの間で十分なシグナル差あるいは SZN 比が確保できな 、場合は、例えば 37°C力も 45°Cまでの間で反応を行うことで改善で きることがある。しかし、一般の酵素は 37°C付近が至適反応温度であり、それ以上温 度を上昇させると酵素活性そのものが低下することにより十分なシグナルが得られな くなることがある。そのような場合、より至適反応温度の高い耐熱性酵素を使用するこ とが好ましい。例えば、好熱性細菌の Archaeoglobus fulgidus (Afu)から二本鎖 DNA特異的^→5,ェキソヌクレア一ゼが単離されている（特許文献 4)。このような 耐熱性ェキソヌクレアーゼの利用によって、本発明における反応温度の設定範囲を 拡大し、種々の配列のターゲットについてより好適な反応条件の設定を可能にするこ とがでさる。
[0033] さらに、本発明の実施条件について詳細に説明する力 これらは例示的に示すも のであり、限定されるものではない。
[0034] 検体としては、使用されるェキソヌクレア一ゼの基質となり得る核酸であり、例示した λェキソヌクレアーゼ、 Τ7 Gene6 ェキソヌクレアーゼ、ェキソヌクレアーゼ III、 Af u由来^→5 'ェキソヌクレアーゼの場合には DNAが使用される。生物試料から抽出 された DNAを直接用いることもできる力 解析に用いるには量が不十分なことが多 ヽ 。そのような場合には、生物試料力 抽出された核酸を PCR法などによって増幅した DNA産物を本発明による遺伝子変異解析に用いることができる。また、逆転写反応 後に DNAとして増幅する技術 (RT— PCRなど）によって RNAを DNAに変換して増 幅することができ、そのような増幅産物を解析することもできる。
[0035] PCR法以外では、 LAMP法 (非特許文献 6)、 ICAN法 (非特許文献 7)、 Rolling Circle法 (非特許文献 8)などで増幅された DNAも本発明の方法の検体として使用 できる。これらの方法による増幅産物のように末端を有する直鎖状 DNAであれば、 当該 DNAとハイブリダィズしたプローブがェキソヌクレア一ゼの基質となり得るからで ある。また、標的核酸が環状であっても、ェキソヌクレアーゼ IIIなどは環状一本鎖 DN Aにハイブリダィズしたオリゴヌクレオチドプローブを基質とし得るので、本発明による 方法にサンプルとして使用できる。増幅された核酸以外では、 RNAから逆転写され た cDNAを使用できる。逆転写反応後は RNAと cDNAのハイブリッドが得られる。し たがって変性操作の後にプローブのハイブリダィゼーシヨンを行う力 あるいは RNas eHによって RNAのみを分解することで一本鎖の cDNAを得て当該 cDNAにプロ一 ブをノヽイブリダィズさせることにより、ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィを実施す ることが可能であり、 RNAの定量的検出と多型解析が可能である。また、ェキソヌクレ ァーゼ IIIは RNaseH活性を有するので、特に別の RNaseH活性を有する酵素を作 用させることなしにェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィを実施することも可能であ る。
[0036] サンガー法による塩基配列決定法やミニシークェンス法などのように、酵素反応を 利用した多型解析法の多くが、 PCRなどによる増幅産物を検体とする場合には、残 存する酵素、プライマー、デォキシヌクレオチド、塩類、あるいは pHなどの影響を受 けることがある。これらの影響を除くために増幅産物の精製が不可欠である場合が多 ぐこれらの方法の操作は非常に煩雑となっている。本発明では、反応液成分の過剰 な持込によってェキソヌクレアーゼ反応やプローブのハイブリダィゼーシヨンが著しく 阻害されない範囲に限って、 PCR産物や逆転写反応産物の精製を行うことなく解析 に使用することができるため、極めて簡便且つ迅速である。
[0037] 本発明における標的核酸とプローブとのハイブリダィゼーシヨンは、通常は該標的 核酸が二本鎖 DNAの場合は変性により一本鎖とした後に行われる。該標的核酸が 一本鎖であれば変性の必要はなぐそのままプローブ DNAとハイブリダィゼーシヨン させることが可能である。本発明における変性の方法は通常行われる方法に従えば 良い。例えば熱変性によるものと化学的変性によるものが例示される。具体的な方法 として、熱変性による方法は、通常 90°C以上に加熱することにより行われる。好ましく は、 94°C〜98°Cで約 1〜5分間加熱することにより変性が行われる。化学的変性に よる方法は尿素、ホルムアルデヒド等の変性剤の作用により、または pHを上昇させる ことにより行われる。 pHは 0. l〜lmolZl NaOHを用いることにより上昇させること ができるが、操作の簡便性などの点からから熱変性による方法が好適に用いられる。
[0038] ノ、イブリダィゼーシヨンを行う場合、ハイブリダィゼーシヨンの方法は通常行われる 方法に従えば良いが、その条件はプローブ又は変性標的核酸の鎖長、塩基配列、 T mにより異なる。一般的には pH6. 5〜9. 5で、 10〜1000mMのナトリウムまたはカリ ゥムイオン存在下にて室温〜 70°Cの温度下でハイブリダィゼーシヨンが行われる。た だし、過剰のナトリウムまたはカリウムイオン存在下ではェキソヌクレアーゼ活性が阻 害されることがあるため、 10〜： LOOOmMの範囲内で十分なシグナル対ノイズ比（SZ N比）を得るような条件を見出す必要がある。
[0039] ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ法に使用するェキソヌクレアーゼの作用によ つて、標的核酸である PCR産物などの直鎖状二本鎖 DNAの標的配列部位が一本 鎖化される場合は、必ずしも変性操作を必要としない。例えば、 3,→5,ェキソヌクレ ァーゼとしてェキソヌクレアーゼ IIIを用いた場合、標的 PCR産物はェキソヌクレア一 ゼ ΙΠの触媒活性によって両鎖の^末端からの消化を受け、部分的に一本鎖となる。 この一本鎖化された領域を標的配列としたプローブを用いれば、変性操作を行うこと なぐ該 PCR産物にェキソヌクレアーゼ III及びプローブを含んだ試薬を添カ卩して、一 定温度で反応を実施するだけでェキソヌクレアーゼサイクリング反応が成立すること から、本発明の方法は簡便性及び迅速性の点で大いに利点がある。
[0040] 他のェキソヌクレアーゼ、例えばえェキソヌクレアーゼを用いる場合、 PCRプライマ 一の一方のみを^末端リン酸ィ匕したプライマーセットで増幅した DNAを標的核酸と して用いれば、 λェキソヌクレアーゼによって^末端がリン酸ィ匕された鎖のみが消化 され、リン酸化されていない鎖が残り、その結果、標的 DNAは一本鎖化される。当該 一本鎖 DNAに対して相補的な配列を有し、 5,末端がリン酸ィ匕されたプローブを用い れば、やはり変性操作を行うことなく λェキソヌクレアーゼを利用したェキソヌクレア一 ゼサイクリングアツセィが可能となる。このように、本発明によればェキソヌクレアーゼ サイクリングアツセィを完全に一定の温度で実施することが可能であり、複雑な温度 制御を行う機器を必要としな 、。
[0041] 例示したェキソヌクレアーゼのうち、 λェキソヌクレアーゼ、 Τ7 Gene6 ェキソヌク レアーゼ、ェキソヌクレアーゼ IIIを使用する場合、 25°C〜45°Cの間で反応を行うの が好適である。一般的にはこれらいずれの酵素も 37°Cで使用されることが多いが、 本発明によりミスマッチを識別する場合には、マッチとミスマッチのシグナル比が十分 大きくなるように反応温度が設定されるので、必ずしも 37°Cが好適とは限らない。しか し、これらの酵素を 37°C以上で使用すると、反応温度の上昇に伴って酵素活性は低 下するため、過剰に高い温度、例えば 50°C以上の温度でサイクリングアツセィを行う 場合には適さない。このような場合には、耐熱性の酵素を用いるのが好ましい。耐熱 性のェキソヌクレアーゼとしては、 Afu由来の 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ（特許文献 4 )が報告されており、このような酵素を用いることで、より高温、すなわち 50°C以上でも 好適なェキソヌクレアーゼサイクリング反応を実施することが可能となる。
[0042] 酵素濃度とプローブ濃度は、標的核酸特異的なシグナル及びバックグラウンド'シ グナルの両方に影響を及ぼす。好適な酵素濃度とプローブ濃度の組合せは、酵素 の種類、使用される標的核酸及びプローブの配列毎に異なり、それぞれの場合にお V、て高 、SZN比を得るような条件を見出す必要がある。
[0043] FRETの場合の蛍光の検出条件として、例えばプローブの^末端に Dabcyl修飾 、鎖内に FITC修飾の場合、 3'→5 'ェキソヌクレアーゼの作用によりプローブが^末 端より分解されるに伴って発せられる蛍光は、最大励起波長 494nm、最大蛍光波長 518nmの条件で蛍光光度計を用いて検出される。本発明による方法は、操作が簡 便であるために、自動化システムの構築も容易である。特にハイスループットなシステ ムを構築するには、マイクロプレートを用いるのが便利である。マイクロプレートを用い た場合の蛍光の検出には、マイクロプレートに対応した蛍光測定装置が使用される。 このような装置としては、特に限定されないが、 CytoFluor Series 4000 (PerSep tive Biosystems¾：) ^Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counterレ 一キンエルマ一ライフサイエンス社)などを例示することができる。このような装置を使 用する場合、励起波長及び蛍光測定波長の選択は、装置に装備されたフィルターの 種類によって限定されるが、蛍光物質の励起及び蛍光波長から適切なフィルターを 選択して使用する。例えば、 Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter の場合、 485nmの励起用フィルターと 535nmの蛍光測定用フィルターを使用して、 好適に測定することができる。
[0044] ェキソヌクレアーゼによるプローブの分解によって生じるシグナルは、プローブのサ イタル反応によって増幅され、反応の進行中にそのシグナルの推移を測定することが 可能であり、適切な反応時間を選択することにより、再現性並びに定量性の向上及 び測定時間の短縮が図れる。反応時間は数秒力も 60分の間が好ましい。シグナル のリアルタイムモニターについては、リアルタイム PCR装置を用いて、それぞれの装 置に対応した蛍光物質を標識したプローブを用いて実施できる。リアルタイム PCR装 置としては、 PRISM 7700 Sequence Detection System (ABI社）、 LightC ycler (ロシュ ·ダイァグノスティックス社）、 Smart Cycler II System (宝バイオ社） などが挙げられる。これらの装置は、いずれも 4°Cから 100°Cの間での厳密な反応温 度の制御が可能であり、さらに種々の波長の蛍光測定に対応しており、本発明にお いて好適に使用される。
[0045] さらに本発明によれば、特定部位の多型だけでなぐ連続する数塩基の領域に存 在する 1個または複数の変異を識別することができる。例えば、 K— ras遺伝子は、 12 番目のコドン (GGT)にアミノ酸置換、特にグリシンからパリン、ァスパラギン酸あるい はアルギニンへの置換を伴う変異が生じた場合に発癌遺伝子として働くことが知られ ている。 K ras遺伝子の変異は大腸癌の約 40%、肺癌の約 20%、脾癌の約 80〜 90%で検出されており、臨床検体からの検査にも利用されている。コドン 12の 3番目 の塩基であるチミンは、他の 、ずれの塩基に置き換わってもアミノ酸の置換はな！/、が 、 1番目及び 2番目の塩基は 、ずれの塩基に換わってもアミノ酸の置換を伴う。した がって、部位特異的な一塩基多型検査技術を利用した場合、野生型配列に加えて 1 番目及び 2番目の塩基置換に対応した計 7組のプローブを用意することが不可欠で ある。しかし、本発明によれば、連続する 3塩基以上の領域のいずれかに塩基置換 力 Sあった場合においても蛍光強度の著しい低下を引き起こし、特定の配列との区別 を可能としており、一塩基多型のみならず癌関連遺伝子の変異検出にも有効である
実施例
[0046] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定 されるものではない。
[0047] 実施例 1
(1)標的核酸の調製
ヒトゲノム DNAから K— ras遺伝子の一部を PCRにて増幅した産物を標的核酸とし た。上流及び下流プライマーの配列は以下の通りである。なお、以下に示す全ての オリゴマー DNAの合成は、日本バイオサービスに依頼した。
[0048] 配列番号 1： GAGAGGCCTGCTGAAAATG 配列番号 2： CCTCTATTGTTGGATCATATTC
PCRの条件は、 1. 25Uの Ex Taq DNA Polymerase (宝バイオ）、 IX Ex Ta q緩衝液（宝バイオ）、 200 Mの各 dNTP、 200nMの各プライマー、 10〜： LOOngの ヒトゲノム DNAを含む 50 1の反応液を調製し、 94°CZ20秒、 55°CZ20秒、 72°C Z20秒のサイクル反応を 40回行った。また、ヒトゲノム DNAを含まない反応液で同 様にサイクル反応を行い、陰性コントロールとした。
[0049] (2)プローブ DNA
5 末端に Dabcyl、鎖内に FITCを標識したプローブの配列は、ヒト K—ras遺伝子 の一部の塩基配列を有しており、以下の通りである。ただし、配列中の" Z"は FITC 標識デォキシチミジン (FITC— dT)を表す。
[0050] 配列番号 3 : 5' - GCTCCAACZACCACAAGTTTATATTCAGTC
[0051] (3)ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ
上記（1)の K ras遺伝子の増幅産物を PicoGreen dsDNA Quantitation K it (Molecular Probe社)で定量した後、陰性コントロールで 2倍段階希釈を行った 。この 2倍希釈系列及び陰性検体を、配列番号 3によって示された配列を有し、 5,末 端に Dabcylが標識されたプローブを用いてェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ 法で測定を行った。すなわち、 2X ェキソヌクレアーゼ III Buffer (宝バイオ）、 75m M NaCl、 750nMプローブ DNA、 2 μ 1の検体 DNA (PCR産物）を含む 10 μ 1の反 応液を調製し、 Mastercycler ep (エツペンドルフ社）を用いて 95°Cで 2分間加熱し た後、 37°Cで 5秒間加温した。直ちに 10 1の 1. 35 / μ \ ェキソヌクレアーゼ ΠΙ を添カ卩して 37°Cにてさらに 30分間保温した。次いで 70°Cにて 10分間加温して酵素 を失活させた後、 30 1の TE緩衝液（10mM Tris— HC1、 ImM EDTA、 pH8. 0)を加え、全量を蛍光測定用の 96穴マイクロプレート（Corning社）に移し、プレート リーダー Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマーラ ィフサイエンス社）〖こて励起波長 485nm、蛍光波長 535nmで蛍光を測定した。
[0052] その結果、図 2に示した通り、その標準曲線は非常に直線性に優れ、最低検出感 度は 3fmolz assay以下（¾Dつた。
[0053] 実施例 2 (1)変性操作工程の有無
上記実施例 1 (3)で示した方法では、ェキソヌクレアーゼの添加の前に、標的二本 鎖 DNAの熱変性の工程が含まれている。この工程が必須であるカゝ検証するため、上 記実施例 1 (1)で調製した 170fmolの K—ras PCR産物と陰性検体を上記実施例 1 (3)の熱変性の工程を含む方法と熱変性の工程を含まない方法とで比較した。熱 変性の工程を含まない方法は、 IX Exonuclease III Buffer (宝バイオ）、 37. 5 mM NaCl、 375nMプローブ、 2 1の検体 DNA(170fmolの PCR反応液）及び 0 . 675U/ 1のェキソヌクレアーゼ IIIを含む 20 1の反応液を調製し、 37°Cにて 30 分間保温した後、さらに 70°Cで 10分間加温して酵素を失活させ、プレートリーダー Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマ一ライフサイ エンス社）にて励起波長 485nm、蛍光波長 535nmで蛍光を測定することによって実 施した。その結果、図 3に示した通り、熱変性の工程を含まない方法では、標的核酸 を含まな!/、PCR反応液のシグナル及び 170fmolの標的配列を含む PCR反応液の シグナルともに、熱変性の工程を含む方法によるシグナルとほぼ同程度であった。こ のことから、熱変性の工程は必須でな 、ことが分力つた。
実飾 13
(1)合成標的核酸
ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ法の一塩基の置換を識別する能力を検証 するため、標的核酸として 13種の化学合成 DNAを用いた。各化学合成標的 DNA の塩基配列は以下の通りである。
CTTGT
CTTGT
CTTGT
CTTGT CTTGT
CTTGT
GCTTGT
GCTTGT
CTTGT
CTTGT
GCTTGT
CTTGT
GATTGT
[0056] ここで、配列番号 4はヒト K ras遺伝子の野生型の配列であり、配列番号 3で示さ れたプローブ DNAの塩基配列と完全に相補的な配列を含む。一方、配列番号 5か ら配列番号 16は配列番号 4のいずれかの一塩基を他の塩基に置換したものであり、 それぞれを配列番号 3で示されたプローブ DNAとハイブリダィゼーシヨンさせた場合 、形成された二本鎖 DNA中には一塩基のミスマッチを含む。それらのミスマッチの位 置を図 4に示した。図 4において下線のある塩基は、配列番号 3で示されたプローブ DNAとハイブリダィズしたときにミスマッチを形成する塩基である。
[0057] (2)合成標的核酸を用いた一塩基ミスマッチの検出
本発明による一塩基ミスマッチの識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するた め、以下のような条件でェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィを実施した。すなわち 、 IX Exonuclease III Buffer (宝バイオ）、 37. 5mM NaCl、 375nMプローブ DNA、0. 675UZ /H ェキソヌクレアーゼ III (宝バイオ）、 lOOfmol合成標的 DNA またはその代わりに精製水を含む 20 1の反応液を PCR反応チューブに調製し、 M astercycler ep (エツペンドルフ社）を用いて直ちに 37°Cまたは 41°Cにて 30分間加 温した。酵素を失活させるため 70°Cにて 10分間加熱した後、 30 iu lのTE緩衝液を 加え、全量を蛍光測定用の 96穴マイクロプレート（Corning社）に移し、プレートリー ダー Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマ一ライフ サイエンス社）〖こて励起波長 485nm、蛍光波長 535nmで蛍光を測定し、各合成標 的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度 (RFU)力も精製水をサンプルとして測 定したときの RFUを減じた値 ( Δ RFU)を求めた。
[0058] その結果、 37°Cでの反応では、配列番号 7及び 9から 16で示された標的核酸にお Vヽて、配列番号 4で示された完全マッチの標的核酸と比べてある程度のシグナルの 低下が認められた（図 5)。次いで、反応温度を 41°Cとすると、配列番号 9から 15で示 された標的核酸で顕著なシグナルの低下が認められ、バックグラウンド 'シグナル、す なわち標的核酸を含まな 、ときとほぼ同程度のシグナルを示し、プローブとミスマッチ を形成するこれらの標的核酸と、プローブと完全に相補的な配列を有する標的核酸 とを明確に識別できることが示された（図 6)。このことは、本発明によって、 1箇所の特 定の部位だけでなぐ近傍の数塩基に渡る領域の遺伝子変異をも検出し得ることを 示している。
[0059] 実施例 4
(1)合成標的核酸
ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ法の一塩基以上の挿入又は欠損配列を識 別する能力を検証するため、標的核酸として 4種の化学合成 DNAを用いた。各化学 合成標的 DNAの塩基配列は以下の通りである。
CTTGT
TGT AGCTTGT GGAGCTTGT
[0061] 図 7において、配列番号 4はヒト K ras遺伝子の野生型の配列であり、配列番号 3 で示されたプローブ DNAの塩基配列と完全に相補的な配列を含む。一方、配列番 号 17から配列番号 20は、それぞれ配列番号 4に一塩基又は三塩基の挿入又は欠 損を含むものであり、それぞれを配列番号 3で示されたプローブ DNAとハイブリダィ ゼーシヨンさせた場合、形成された二本鎖 DNAの!、ずれかの DNA鎖がループ構造 を形成する。図 7においてハイフンで示した部分は塩基の欠損部分であり、下線を付 した塩基は挿入配列である。
[0062] (2)合成標的核酸を用いた挿入及び欠損配列の検出
本発明による挿入及び欠損配列の識別能力を、合成標的核酸を用いて検証する ため、以下のような条件でェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィを実施した。すなわ ち、 IX Exonuclease III Buffer (宝バイオ）、 37. 5mM NaCl、 375nMプロ一 ブ DNA、0. 675UZ /H ェキソヌクレアーゼ ΠΙ (宝バイオ）、 300fmol合成標的 DN Aまたは精製水を含む 20 1の反応液を蛍光測定用 PCRプレートに調製し、 Maste rcycler ep (エツペンドルフ社）を用いて直ちに 41°Cにて 30分間加温した。酵素を 失活させるため 70°Cにて 10分間加熱した後、 30 1の TE緩衝液をカ卩え、全量を蛍 光測定用の 96穴マイクロプレート（Corning社）に移し、プレートリーダー Wallac Ar vo HTS 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマ一ライフサイエンス社）に て励起波長 485nm、蛍光波長 535nmで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプ ルとしたときの相対蛍光強度 (RFU)カゝら精製水をサンプルとして測定したときの RF Uを減じた値 ( Δ RFU)を求めた。
[0063] その結果、一塩基の置換を有する配列番号 11で示された合成標的 DNA及び挿 入又は欠損を含む配列番号 17から 20で示されたいずれの合成標的 DNAにおいて も、配列番号 4で示された合成標的核酸よりも顕著に低い蛍光強度が観察された (図 8)。このことから、本発明による方法によって、特定の配列を有する標的核酸を、一 塩基以上の挿入または欠損配列を有する標的核酸とも明確に識別して検出できるこ とが示された。
[0064] 実施例 5
(1)ヒトアルデヒド脱水素酵素 2遺伝子の PCR
化学合成した DNAを標的核酸とした場合のみならず、実際の生体試料の多型解 祈が可能であることを示すため、ヒトのアルデヒド脱水素酵素 2 (ALDH2)遺伝子の 多型検出系を構築した。 ALDH2遺伝子のェクソン 12には正常型の「G」と変異型「 A」の一塩基多型が存在する。この多型をェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ法 によって識別するため、 ALDH2の遺伝子型が既知の検体 DNAから、 PCRによって この多型部位を含む領域を増幅した。 PCRに用いたプライマーの配列は以下の通り である。
[0065] 配列番号 21： GTGGCCGGGAGTTGGGCGAG
配列番号 22： GCCCCCAACAGACCCCAATC
[0066] PCRの条件は、 IX Ex Taq Buffer (宝バイオ）、 200 Mの各 dNTP、 200η Μの各プライマー、 0. 625Uの Ex Taq DNA polymerase (宝バイオ）、 10〜50 ngのヒトゲノム DNAを含む 25 μ 1の反応液を調製し、 GeneAmp PCR System 9700 (ABI社）を用いて、 94°CZ2分の変性処理の後、 94°CZ20秒、 63°CZ20秒 、 72°CZ20秒を 40サイクル、さらに 72°CZ2分の伸長反応を行った。増幅の成否は 、 2%ァガロースゲルで電気泳動し、ェチジゥムブロマイドで染色することによって確 した 0
[0067] (2)ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィ法による野生型 ALDH2遺伝子配列の特 異的検出
IX Exonuclease III Buffer (宝バイオ）、 40mM NaCl、 150nMプローブ D NA、 0. 4U/ μ 1ェキソヌクレアーゼ III (宝バイオ）、 5 μ 1の上記 PCR反応液または 精製水を含む 20 μ 1の反応液を PCR反応チューブに調製し、 Mastercycler ep (ェ ッペンドルフ社)を用いて直ちに 37°Cにて 30分間加温した。酵素を失活させるため 7 0°Cにて 10分間加熱した後、 30 1の TE緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の 96穴 マイクロプレート（Corning社）に移し、プレートリーダー Wallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマ一ライフサイエンス社）にて励起波長 485η m、蛍光波長 535nmで蛍光を測定した。このときに用いたプローブ DNAは正常型 の「G」を有する標的核酸と完全マッチする配列力もなり、その配列は以下の通りであ る。
[0068] 配列番号 23： TTTCACTTCAGZGTATGCCTGCAGCC
[0069] ここで、 Zは FITC標識 dTを示しており、該プローブの^末端にはダーククェンチヤ 一である Dabcylが標識されている（図 9)。その結果、 AZA型では、 GZG型及び G ZA型に比べて著しく低い RFU値を示した（図 10)。このことから、本発明による方法 は、生体試料中の一塩基の置換の有無を明確に識別できることが示された。
[0070] 実施例 6
(1)人為的ミスマッチを導入したプローブ
ミスマッチ塩基対のうちでも、 GZGや GZT塩基対は比較的水素結合が強ぐその ため通常のハイブリダィゼーシヨン法では、他のミスマッチ塩基対に比べて完全マツ チの塩基対と区別して検出することは比較的困難である。本発明においても同様の 傾向があるが、プローブ配列の一部を意図的に置換し、標的配列との間でミスマッチ を形成するようにすることで、この問題を回避することができる。その一例を示すため に変異型 ALDH2に含まれる「A」と野生型に含まれる「G」を識別して検出するため の 2種のプローブを以下に示す通り設計した。
[0071] 配列番号 24： CACTTTAGTGZATGCCTGCAGCCCGTA
配列番号 25： CACTTTAGTGZATGTCTGCAGCCCGTA
[0072] ここで、 Zは FITC標識 dTを示しており、該プローブの^末端にはダーククェンチヤ 一である Dabcylが標識されて!、る。
[0073] また、標的核酸として野生型及び変異型 ALDH2の配列力 なる以下に示すオリゴ マー DNAを合成した。
T
T [0075] これらのプローブと標的 DNAの関係を図 11に示した。配列番号 24からなるプロ一 ブは配列番号 27からなる変異型標的 DNAと完全に相補的であるが、配列番号 26 力もなる野生型標的 DNAとは、多型部位で GZTミスマッチ塩基対を形成する。一 方、配列番号 25からなるプローブは、配列番号 24の FITC標識部位から 3'側に数 えて 4番目の塩基を Cから Tに置換しており（下線）、野生型及び変異型標的 DNAと もにこの部位でミスマッチ塩基対を形成するように設計した。
[0076] (2)プローブへの人為的ミスマッチ導入による多型識別能の向上
これらの DNAを用いて、 IX Exonuclease III Buffer (宝バイオ）、 40mM Na Cl、 250nMプローブ DNA、 0. 05UZ 1ェキソヌクレアーゼ III (宝バイオ）、 100f molの合成標的 DNAを含む 20 μ 1の反応液を 96穴の蛍光測定用 PCRプレートに 調製し、 Mastercycler ep (エツペンドルフ社）を用いて直ちに 37°Cにて 30分間加 温し、次いで酵素を失活させるため 70°Cにて 5分間加熱した後、プレートリーダー W allac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマ一ライフサイエ ンス社）にて励起波長 485nm、蛍光波長 535nmで蛍光を測定した。また、盲検とし て標的 DNAを添加せずに反応及び蛍光測定を行った。
[0077] その結果を図 12に示す。野生型配列に完全マッチするプローブを用いたときは、 野生型及び変異型標的 DNAに対する RFU値ともに盲検に比べて顕著に上昇し、 シグナル値から両者を区別することは困難であった。し力しながら、人為的ミスマッチ を導入したプローブを用いたときは、野生型及び変異型標的 DNAに対する RFU値 に顕著な差が認められ、一塩基多型の判別の特異性を向上させることができた。
[0078] 実施例 7
(1)生体試料の ALDH2遺伝子型判定
ALDH2遺伝子の野生型及び変異型をそれぞれ特異的に検出するためのプロ一 ブのデザインを最適化し、それらを用 Vヽたェキソヌクレアーゼサイタリングアツセィによ る測定条件を至適化して、ヒト由来サンプルの ALDH2遺伝子の遺伝子型判定を試 みた。
[0079] 23検体のヒトゲノム DNAl〜50ng及び陰性検体として DNAの代わりに精製水か ら、実施例 5と同じ方法で ALDH2遺伝子の多型存在部位を含む領域を増幅し、そ れぞれ 5 μ 1を ALDH2遺伝子の野生型検出系及び変異型検出系を用いてアツセィ した。すなわち、 4°Cに保ったサーマルサイクラ一上で蛍光測定用 PCRプレートに 1 X Exonuclease III Buffer (宝バイオ）、 40mM NaCl、 150nMのプローブ DN A、 5 1の PCR産物、 0. 2UZ 1 (野生型検出系）または 0. 0375UZ 1 (変異型 検出系）のェキソヌクレアーゼ III (宝バイオ)を含む 20 μ 1の反応液を調製し、 37°C/ 30分、次いで 70°CZ5分間インキュベートし、プレートリーダー Wallac Arvo HT S 1420 Multilabel Counter (パーキンエルマ一ライフサイエンス社）にて励起 波長 485nm、蛍光波長 535nmで蛍光を測定した。このとき用いた野生型及び変異 型をそれぞれ特異的に検出するためのプローブの配列を配列番号 23および 25に示 す。
[0080] 野生型検出系の RFU値を横軸 (Gアレル）、変異型検出系の RFU値を縦軸 (Aァ レル）とし、各試料の蛍光シグナルの分布を示したのが図 13である。蛍光シグナルの 分布は明確に 3つのグループに分けられ、それぞれのグループがサンガー法で遺伝 子型が決定された GZGホモ、 GZAヘテロ、 AZ Aホモの 3つの検体群と完全に一 致した。このことから、本発明が実際の生体試料の遺伝子型判定において極めて有 用であることが示された。
[0081] 実施例 8
(1)混合試料のアレル含有率の定量
ALDH2の遺伝子型が GZGホモのゲノム DNA及び AZAホモのゲノム DNAを混 合し、 GZGホモのゲノム DNAの含有率が 100%、 75%、 50%、 25%、 0%となるよ うに試料を調製した。これらの混合試料 10ngを請求項 5と同じ方法で PCRを行った 。それらの PCR産物 5 1を実施例 7と同じ方法で ALDH2遺伝子の野生型検出系 及び変異型検出系を用!、て 2回ずつアツセィした。
[0082] その結果、混合比の異なるそれぞれの試料のシグナルはそれぞれに独立した分布 を示し、それぞれのアレルの含有率を定量可能であることが示された（図 14)。
図面の簡単な説明
[0083] [図 1]遺伝子多型または遺伝子変異の均一測定を可能にするェキソヌクレアーゼサイ クリングアツセィの原理を示す図である。 [図 2]ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定系の標準曲線を示す図であ る。（実施例 1)
[図 3]ェキソヌクレアーゼ添加前の DNAの熱変性工程の有無による測定結果を示す 図である。 （実施例 2)
[図 4]プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例 3)
[図 5]反応温度 37°Cで実施したェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定系 によってミスマッチの検出を試みた結果を示す図である。（実施例 3)
[図 6]反応温度 41°Cで実施したェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定系 によってミスマッチの検出を試みた結果を示す図である。（実施例 3)
[図 7]プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例 4)
[図 8]ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定系によって挿入及び欠損配 列の検出を試みた結果を示す図である。（実施例 4)
[図 9]ALDH2遺伝子の一塩基多型を含む領域の配列と野生型 ALDH2遺伝子特 異的プローブ DNAの配列を示す図である。（実施例 5)
[図 10]ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィの均一測定系による ALDH2遺伝子の 多型検出の結果を示す図である。（実施例 5)
[図 11]プローブと合成標的核酸の配列を示す図である。（実施例 6)
[図 12]ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィにおいて、人為的ミスマッチ導入プロ一 ブを用いることによって一塩基置換の検出の特異性の改善を試みた結果を示す図で ある。（実施例 6)
[図 13]ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィによって、生体試料力も ALDH2の遺 伝子型の判定を実施した結果を示す図である。 （実施例 7)
[図 14] ALDH2の遺伝子型が異なる 2種のヒトゲノム DNAを異なる比で混合して調製 した試料を、ェキソヌクレアーゼサイクリングアツセィによってアツセィした結果を示す 図である。 （実施例 8)

Claims

請求の範囲
[1] 特定の配列を含む標的核酸を、該標的核酸力 少なくとも一つ以上の塩基の置換 を含む核酸、または 1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して定量的に 検出する均一測定系であって、以下の工程からなる方法；
I)標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的 DNAにハイブリダィズさせるェ 程、
Π)ハイブリダィズした該オリゴヌクレオチドプローブを二本鎖 DNA特異的 5'→3^ェ キソヌクレアーゼまたは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼで消化する工程、
III)該オリゴヌクレオチドプローブの消化によってオリゴヌクレオチドプローブ力も少な くとも一つの標識物質が遊離した結果発せられるシグナルを検出する工程。
[2] 標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で少なくとも 1塩基以 上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における塩基の挿入ま たは欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、 該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダィズしないため^→3 'ェキソヌ クレアーゼまたは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、 5'→3'ェキソ ヌクレアーゼまたは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼによる消化によってオリゴヌクレオチド プローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的 核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上 昇が起こらないことを検出する、ことからなる請求項 1に記載の方法。
[3] ェキソヌクレアーゼが 5'→3 'ェキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプロ一 ブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも 1塩基以上の相補的でな 、塩基対部分 またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの^末端と標識物質が標識さ れた部位との間に位置するように設計された請求項 1または 2に記載の方法。
[4] ェキソヌクレアーゼが 3'→5 'ェキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプロ一 ブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも 1塩基以上の相補的でな 、塩基対部分 またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの^末端と標識物質が標識さ れた部位との間に位置するように設計された請求項 1または 2に記載の方法。
[5] 標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果 を有するクェンチング物質が蛍光物質の 3 則に標識された請求項 3に記載の方法 に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
[6] 標識物質カ^ェンチング物質であって、該クェンチング物質によって有効に蛍光が 減弱され得る蛍光物質カ^ェンチング物質の 3 則に標識された請求項 3に記載の方 法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
[7] 標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果 を有するクェンチング物質が蛍光物質の 5 則に標識された請求項 4に記載の方法 に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
[8] 標識物質カ^ェンチング物質であって、該クェンチング物質によって有効に蛍光が 減弱され得る蛍光物質がクェンチング物質の 5 則に標識された請求項 4に記載の方 法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
[9] 標識物質が標的 DNA中のグァニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれ力とヮトソ ンークリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである請 求項 3または 4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
[10] 蛍光性ヌクレオチドアナログが 2—ァミノプリンである請求項 9に記載のオリゴヌタレ ォチドプローブ。
[11] 5'→3 'ェキソヌクレアーゼが λェキソヌクレアーゼまたは Τ7 Gene6ェキソヌクレ ァーゼである請求項 3に記載の方法。
[12] 3'→5 'ェキソヌクレア一ゼがェキソヌクレアーゼ ΙΠである請求項 4に記載の方法。
[13] ェキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の方 法。
[14] 耐熱性酵素が Archaeoglobus fulgidusに由来する請求項 13に記載の方法。
[15] RNAより逆転写反応により合成した cDNA、ポリメラーゼ'チェイン 'リアクション法（
PCR法)または逆転写 PCR(RT— PCR)法にて増幅した産物を精製することなく被 検試料として用いる請求項 1または 2に記載の方法。
[16] オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ 構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入 することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも一つ以上の塩基の置換 を含む核酸、または 1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上 させることのできる請求項 5から 10のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドプローブ を利用した請求項 1から 4及び 11から 15のいずれか 1に記載の方法。
請求項 1〜16のいずれか 1項に記載の方法に使用する測定試薬またはキット。
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