CN1160471C - 检测致病性大肠杆菌菌株的TaqManTM－PCR - Google Patents

检测致病性大肠杆菌菌株的TaqManTM－PCR Download PDF

Info

Publication number
CN1160471C
CN1160471C CNB988044099A CN98804409A CN1160471C CN 1160471 C CN1160471 C CN 1160471C CN B988044099 A CNB988044099 A CN B988044099A CN 98804409 A CN98804409 A CN 98804409A CN 1160471 C CN1160471 C CN 1160471C
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
toxin
mark
oligonucleotide probe
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB988044099A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1258320A (zh
Inventor
ѹ��������˾
克劳斯·费弗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bavarian Nordic AS
Original Assignee
Bavarian Nordic Research Institute GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bavarian Nordic Research Institute GmbH filed Critical Bavarian Nordic Research Institute GmbH
Publication of CN1258320A publication Critical patent/CN1258320A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1160471C publication Critical patent/CN1160471C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Abstract

本发明涉及一种检测样品中致病性大肠杆菌的方法，包括使用致病性大肠杆菌特异性的寡核苷酸引物将从所述样品中分离出的DNA进行PCR扩增。

Description

检测致病性大肠杆菌菌株的TaqManTM-PCR
本发明涉及一种基于TaqManTM-PCR技术的检测致病性大肠杆菌的快速高效分析法，和可用于该分析法中的特定的优化的寡核苷酸引物以及标记的寡核苷酸探针。
发明背景技术
肠出血性产志贺氏样毒素(stl)大肠杆菌(EHEC)最近被认为是一种重要的人和动物致病原(1-7)。EHEC导致一些食品传染病的爆发(8)。最值得注意的是在美国西部各州的与快餐链相关的在多州的爆发，在华盛顿600多人受影响，3人死亡(9)，在日本流行病发生，具有6000多病人和约8例死亡病例(10)。EHEC感染导致腹泻、出血性结肠炎、血小板减少紫癜和特征在于急性肾病的溶血性尿毒症(HUS)、血小板减少和微血管溶血性贫血。HUS在受影响的儿童和免疫损害个体中最终可导致致死的后果(3，11-17)。最近，报道了在1995年10月至1996年7月期间在德国东南部(Bavaria)EHEC病例增加，至少有45例严重的导致HUS的感染，伴有7人死亡(18)。估计大约15例EHEC感染中的1例导致HUS，可推测大约600-700受影响的个体。
在大多数报道的发病中，消费被污染的切碎的牛肉是感染的来源(5，8，19-22)，而在日本怀疑为幼茶(10)。EHEC已被从牛奶(6，19，23)、水(19)、小鸡、猪和苹果汁(19，24，25)中分离，但也报道了人平行的污物感染(15)。牛看来可能是储存库(22，26)。交叉污染、不当的处理和不适宜的烹调均引起由EHEC导致的食品传染感染。EHEC产生还已知为vero毒素或细胞毒素的志贺氏样毒素(slt)(12，27)。大部分EHEC被发现属于O157：H7血清型，但值得注意的是，尤其在欧洲还报道了各种属于其它血清型(O22，O26，O55，O111O114，O145)的EHEC(12，15，28-32)。
除开EHEC，一些大肠杆菌的其它菌株可导致肠炎或胃肠炎，并被分组在肠产毒性菌(ETEC)(33-36)、肠致病性菌株(EPEC)(37)、肠侵染性菌株(EIEC)(38，39)和肠聚集性菌株(WaggEC)(40，41)。这些菌株为重要的致病原，并且还导致严重的公共健康问题。由于缺乏特异和敏感程序的检测方法，对这些致病原的诊断被极大地忽略了。ETEC合成可导致类似于霍乱弧菌的分泌性腹泻(“旅行者腹泻”)的热不稳定的和/或热稳定的肠毒索(36，42，43)。ETEC生物对肠上皮细胞的表面附着为毒素产生的先决条件。毒素产生为质粒介导的，最通常包括大肠杆菌血清型O6、O15、O124、O136、O143、O145和O147(32)。
EPEC导致主要发生在婴儿中的腹泻症状(32)。虽然致病机理不清楚，肠的上皮降解和在组织切片中观察到的炎性反应可能是由于细菌的粘附特性的结果。EPEC的特异性附着因子为质粒编码的(EAF＝EPEC粘附因子)(37，44)。EHEC通常包含与已知为eae的EAF极为相关的粘附因子(EHEC附着和消除基因)(45，46)。EPEC最通常属于血清型O6、O8、O25、O111、O119和O142(32)。
EIEC菌株能穿过并侵染肠上皮细胞并产生类似于由志贺氏细菌导致的炎性腹泻(38，47,48)。粪便/污物包含血液、粘液和破碎的嗜中性粒细胞。EIEC包含编码另外的致病性因子的毒性质粒(48)。血清型O28、O112、O115、O124、O136、O143、O145和O147最常见于EIEC(32)。
EaggEC与幼儿持续性腹泻和旅游者腹泻相关。EaggEC特征在于其导致Hep-2细胞聚集的粘附能力。这种作用与毒性质粒(pCVD432)的存在相关。EaggEC被怀疑还产生热稳定肠毒素(EAST1)(49-53)。它们可属于血清型O44和O126(32)。
用于EHEC的常规检测方法包括用选择性和/或指示培养基富集和分离，如大肠杆菌培养基、硫酸月桂基酯胰蛋白
Figure C9880440900091
4-甲基繖形酰-b-酸肉汤、伊红亚甲兰琼脂、McConkey山梨糖醇琼脂和溶血索琼脂(28，32，54-59)。不幸的是，所有这些分析是间接的并缺乏特异性鉴定EHEC或其它致病大肠杆菌菌株的能力。提出了一些生物化学鉴定和免疫检测EHEC的方法(54，60-63)，然而，熟知致病性大肠杆菌菌株不具有或缺乏独特的发酵途径(58，64)。
由于血清型与致病大肠杆菌类型之间的绝对的相互关系不能确定，因此血清分型不是令人确信的(12，27，32，58，65)。
已建立了用于实验研究的DNA杂交技术，但其不能适用于大规模的常规诊断方法(66，67)。报道了基于DNA扩增的使用PCR的分析法(68-72)。这些方法的局限包括麻烦的后PCR检测方法(琼脂糖电泳，生物素/抗生物素蛋白基ELISA检测系统)。
为了克服这些问题，开发了能特异性测定EHEC、ETEC、EPEC、EIEC和EaggEC特有的毒性因子的基于PCR扩增的荧光原检测法的PCR分析法。
该分析法利用Taq-DNA聚合酶5’-3’外切酶活性(73)以裂解在5’和3’末端分别与荧光报道染料(例如6-羧基-荧光素[FAM]；λem＝518nm)和荧光猝灭染料(6-羧基四甲基罗丹明[TAMRA]；λem＝582nm)共价结合的内部寡核苷酸探针。同时通过完整的探针分子TAMRA有效地猝灭来自FAM的荧光(76)。在发生关联PCR扩增的情况下，Taq聚合酶从特定的PCR引物延伸并裂解对模板链退火的内部荧光原寡核苷酸探针。因此，报道染料和猝灭染料被从空间上分开。作为寡核苷酸的水解和报道染料和猝灭染料的物理分离的结果，可在518nm处观察到可测定的荧光强度的增加。PCR循环导致PCR产物和随后的荧光强度的指数增加。
在不打开PCR试管时能测定荧光信号的光学试管中进行TaqManTM-PCR。这大大最小化了后PCR加工时间并几乎完全消除了交叉PCR污染问题。采用这种方法，可在18小时内半自动同时进行生物物质的大肠杆菌菌株和带有毒性基因的其它肠细菌的毒性基因的存在的检测。
根据本发明，提供用于检测致病性大肠杆菌的TaqManTM-PCR，使得首次在常规细菌实验室中实现了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、EaggEC和相关的带有这些毒性基因的肠细菌的特异性、快速和高处理量的常规检测。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种快速、高效用于检测和鉴定生物样品中的致病性大肠杆菌的分析法。
本发明的另一个目的是提供可用于编码致病性大肠杆菌特有的毒性因子/毒素的序列扩增的特异性、优化引物和标记的寡核苷酸探针。
发明概述
本发明尤其单独包括下面或其组合：
一种检测样品中致病性大肠杆菌的方法，包括使用选自下面的一组特异于产毒性大肠杆菌毒性因子/毒素的寡核苷酸引物将从所述样品分离的DNA进行PCR扩增：
与编码热不稳定毒素或热稳定毒素的基因杂交的用于肠产毒性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的基因杂交的引物；
与编码热稳定毒素的基因杂交的用于肠聚集性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物；
与pCVD432质粒杂交的用于肠聚集性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物；
与inv质粒杂交的用于在肠侵染性大肠杆菌中含有的DNA序列扩增的引物；
与EAF质粒或eae基因杂交的用于肠致病性特有的DNA序列扩增的引物；和/或
与编码志贺氏样毒素sltI或sltII的基因杂交的用于肠出血性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物，接着使用常规方法检测和鉴定扩增产物；
如上的方法，其中
与编码肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定毒素的基因杂交的引物组为：
LT-1：    5’GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3’    和
LT-2：    5’AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3’；
与编码肠产毒素性大肠杆菌特有的热稳定毒素的基因杂交的引物组为：
ST-1：    5’TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3’    和
ST-2a：   5’TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3’；
与编码肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定毒素的基因杂交的引物组为：
EASTI-1： 5’AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3’    和
EASTI-2： 5’TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3’；
与pCVD432质粒杂交的引物组为
EA-1：    5’CTG GCG AAA GAC TGT ATC AT TG 3’    和
EA-2：    5’TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3’；
与inv-质粒杂交的引物组为
EI-1：       5’TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3’  和
EI-2：       5’CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3’；
与EAF质粒杂交的引物组为
EP-1：       5’CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3’  和
EP-2：       5’AAT ATG GGG ACC ATG TAT TATC 3’；
与eae基因杂交的引物组为
EPeh-1：     5’CCC GGA CCCGGC ACA AGC ATA AG 3’和
EPeh-2：     5’AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3’；
与编码志贺氏样毒素SltI的基因杂交的引物为
SltI-1：     5’ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3’    和
SltI-2：     5’TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3’；和
与编码志贺氏样毒素SltII的基因杂交的引物为
SltII-1：    5’ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3’  和
SltII-2：    5’TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3’
其中W为A/T，R为A/G，D为A/G/T，Y为C/T和K为G/T；
如上方法，其中具有另外的5’-3’外切酶活性的聚合酶被用于DNA的扩增，并且在大多数5’碱基被荧光染料，在大多数3’碱基被荧光猝灭染料标记的在靶DNA中杂交的寡核苷酸探针包括在扩增方法中；所述标记的寡核苷酸探针易受由所述DNA聚合酶的5’-3’外切酶降解以产生可通过荧光原检测方法检测的片段；
如上方法，其中
用于检测肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定毒素的标记的寡核苷酸探针为
5’AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3’；
用于检测肠产毒素大肠杆菌特有的热稳定毒素的标记的寡核苷酸探针为
5’ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3’；
用于检测肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定毒素的标记的寡核苷酸探针为
5’ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3’；
用于检测pCVD432质粒的标记的寡核苷酸探针为
5’CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3’；
用于检测inv质粒的标记的寡核苷酸探针为
5’CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3’
用于检测EAF质粒的标记的寡核苷酸探针为
5’CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3’；
用于检测eae基因的标记的寡核苷酸探针为
5’TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3’；
用于检测志贺氏样毒素SltI基因的标记的寡核苷酸探针为
5’TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3’；和
用于检测志贺氏样毒素SltII基因的标记的寡核苷酸探针为
5’CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3’；
上述方法，其中荧光报道染料为6-羧基荧光素(fluoroscein)、四氯-6-羧基荧光素或六氯-6-羧基荧光素，而荧光猝灭染料为6-羧基四甲基罗丹明；
上述方法，其中PCR扩增方法由在MgCl2浓度为5.2mmol，55℃退火温度和65℃延伸温度下进行的35次PCR循环组成；
可用于致病大肠杆菌的毒性因子/毒素特异性的DNA的PCR扩增的一组引物选自下面：
与编码肠产毒性大肠杆菌的热不稳定毒素或热稳定毒素的基因杂交的一组引物；
与编码肠聚集性大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交的一组引物；
与编码肠聚集性大肠杆菌的pCVD432质粒杂交的一组引物；
与肠侵染性大肠杆菌的inv质粒杂交的一组引物；
与肠致病性大肠杆菌的EAF质粒，或eae基因杂交的一组引物；
与编码肠出血性大肠杆菌的志贺氏样毒素sltI或sltII的基因杂交的一组引物；
上述的引物组，其中
与编码肠产毒素大肠杆菌的热不稳定毒素的基因杂交的引物组为
LT-1：       5’GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3    和
LT-2：       5’AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3’；
与编码肠产毒素大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交的引物组为
ST-1：       5’TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3’    和
ST-2a：      5’TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3’；
与编码肠聚集性大肠杆菌的热稳定毒素基因杂交的引物组为
EASTI-1：    5’AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3’    和
EASTI-2：    5’TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3’；
与pCVD432质粒杂交的引物组为
EA-1：        5’CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3’    和
EA-2：        5’TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3’；
与inv质粒杂交的引物组为
EI-1：        5’TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3’和
EI-2：        5’CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3’；
与EAF质粒杂交的引物组为
EP-1：        5’CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3’和
EP-2：        5’AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3’；
与eae基因杂交的引物组为
EPeh-1：      5’CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3’和
EPeh-2：      5’AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3’；
与志贺氏样毒素sltI基因杂交的引物组为
SltI-1：      5’ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3’和
SltI-2：      5’TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3’；
和
与志贺氏样毒素sltII杂交的引物组为
SltII-1：     5’ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3’  和
SltII-2：     5’TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3’
其中W为A/T，R为A/G，D为A/G/T，Y为C/T和K为G/T。
上述引物除开用于靶DNA扩增的引物外还包含在大多数5’碱基被荧光报道染料，如6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素标记，在大多数3’碱基被荧光猝灭染料，如6-羧基四甲基罗丹明标记的标记寡核苷酸探针，并具有选自下面的核苷酸序列：
5’AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3’
其与编码肠产毒素大肠杆菌的热不稳定毒素的基因杂交；
5’ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3’其与编码肠产毒素大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交；
5’ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3’其与编码肠聚集性大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交；
5’CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3’其与pCDV432质粒杂交；
5’CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3’其与inv质粒杂交；
5’CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3’其与EAF质粒杂交；
5’TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3’其与eae基因杂交；
5’TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3’其与志贺氏样毒素SltI基因杂交；和
5’CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3’
其与志贺氏样毒素SltII基因杂交；
上述方法在诊断活动物体，包括人的大肠杆菌感染中的用途，或在诊断消费品，如肉、奶和蔬菜的大肠杆菌污染中的用途。
本发明
用于检测PCR扩增的常规方法是费力的，采用可能的致癌物质(溴化乙啶凝胶电泳)，并且不适宜作为微生物常规实验室中的常规分析法(68-72)。这提出一个严重的问题，尤其当由于特征性的生物化学、血清学和/或形态学标准不能将可能的致病细菌与兼性致病或非致病细菌区分时。因此，直接检测这些种类拥有的毒性因子或毒素的特定的基于核酸的诊断方法是必须遵循的。这主要对于致病性大肠杆菌细菌的诊断是这种情况。EHEC、EPEC、EIEC、ETEC和EaggEC的生物化学特性不是独特的，不能被用于将它们从其它大肠杆菌菌株分开中(54，60-62)。而且，也可在其它肠细菌中发现大肠杆菌的毒性质粒(38，48，83，88，89)。由于各异的血清学特性，通过血清分型鉴定致病性大肠杆菌也不是准确的鉴定方法(12，15，28-32)。使用特征性毒性因子和/或毒素基因特异性的探针的传统的菌落杂交分析法是麻烦和费时的(66，67)。为了证实是否发生了靶基因的特异性扩增，传统的PCR方法需要各种后PCR步骤(68-72)。TaqManTM-PCR检测体系(74，75，90)实现了快速、特异性、敏感和高产率的用于区分致病性大肠杆菌细菌和其它大肠杆菌菌株的诊断法。该分析法具有定量起始靶序列的能力。由于在PCR循环后，PCR反应的试管不被打开，交叉PCR污染的可能的危险几乎可以忽略。96个样品的扫描时间约为8分钟，可用可商购的铺展片程序(spred sheet porgram)自动进行试验结果的计算。因此，整个后PCR加工时间被缩至最短。
TaqManTM体系依赖于加入特定的内部荧光原寡核苷酸探针的标准的PCR技术。由于非特异性PCR扩增极不可能产生阳性荧光信号，因此常规PCR与内杂交的寡核苷酸探针的Taq聚合酶依赖性降解结合还使该检测方法具有特异性。必须遵循选择荧光原探针的一些规则(74，75)。标准是探针的长度、报道和猝灭染料的位置和在5’-末端不存在鸟苷(74)。而且，探针距一个特异性PCR引物的距离是非常重要的。这是由于探针必须对模板链退火以被Taq聚合酶裂解。由于退火至少部分依赖于探针的Tm，因此探针被设计具有如引物的较高的Tm。根据本发明，这通过设计比特异性引物长3-6个bp的探针而得以解决(除开sltII)。PCR扩增包括引物退火后的靶序列的延伸，并且延伸引物的Tm增加。对于其中3’末端被加帽以避免延长的荧光原寡核苷酸，Tm保持恒定，这使得在被Taq聚合酶降解前探针更可能解离。寡核苷酸探针的降解可通过荧光原探针和引物的空间邻近最优化。通过将sltI的探针从距引物121bp移至距其9bp，可获得ΔRQ值的显著提高。第二种优化TaqManTM-PCR的方法是在65℃下进行PCR延伸，其中在Taq聚合酶到达并与其杂交之前探针也不太可能从模板上解离。ΔRQ值因此可再次增加1.2-1.5倍。ΔRQ值的增加可能是由于Taq聚合酶获得的退火的寡核苷酸探针的比例或由于Taq聚合酶的增加的持续合成能力。
荧光原探针的浓度影响TaqManTM结果的准确性。当探针浓度大于50pmol/PCR反应时，仅相对小的部分被Taq聚合酶水解。未降解探针与降解探针的比例仍然高，并且未猝灭的报道染料的荧光发射相对于仍接近猝灭报道染料的报道染料的荧光强度没有明显增加。因此，在高的探针浓度下，ΔRQ值比使用中间探针浓度(10-20pmol)的低。当探针浓度太低时，ΔRQ值增加，然而，PCR结果的可变性增加，因为可能吸取的小的误差或PCR反应间的最小的差异变得为关键。产生最小可变性和最高RQ值的最佳探针浓度被发现为20pmol的探针浓度。
由于TaqManTM-PCR使用内部寡核苷酸探针用于模板扩增的检测，可广泛设计特异性引物和探针。当存在给定基因的核苷酸序列变异体时，引物和探针序列的设计尤其重要。对于sltI和sltII就是这种情况。对于sltI，对比所有公开的序列，设计引物和探针以与所有三种变异体的保守区结合。对于sltII，公开基因的仅一个区是保守的，因此，该区被选择用于荧光原寡核苷酸探针。用于sltII扩增的引物被设计在公开的sltII变异体的不确定的位置包含所有可能的核苷酸序列(简并引物方法)(79-83)。通过采用简并引物，可在一个PCR反应中检测所有公开的变异体。
模板DNA的分离方法影响PCR的进行。比较了适宜作为用于常规应用的快速纯化步骤的两种方法，即煮沸制备法或自旋(spin)制备法。煮沸制备物可能仍然包含一些可影响PCR反应的细菌成分，然而，它极为迅速。自旋制备法包括起从可能的阴性影响物质中纯化DNA作用的分离步骤。与当通过自旋制备法制备模板DNA的煮沸制备法比较，来自肠细菌的毒性基因的ΔRQ值和TaqManTM-PCR的敏感性未发现明显增加。
TaqManTM-PCR对所有引物/探针结合的总的敏感性可与通过用溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳检测的PCR产物的视觉值相比。在优化的条件下，每次PCR反应可在107非致病性大肠杆菌中检测到少如103的较小的cfusltI+EHEC。
由于第一种产生slt的菌株被发现为O157：H7阳性(1，2)，免疫磁检测法在大肠杆菌O157中的使用(54，91)被提出作为通过富集这种血清型而提高EHEC诊断灵敏性的方法。然而，显然为O157抗原阴性的EHEC被这种方法遗漏。在最近EHEC分离物的血清分型研究中，这变得很显然，即与非O157EHEC比较，目前O157+EHEC的数目少(12，15，28，29，31)。在德国南部进行的最近的一个研究中，13种分离物中的仅2种为O157阳性(92)。目前未能获得用于其它O血清学的免疫磁检测方法。而且，在毒性基因分析之前，在偏磁富集方法的情况下，可带有志贺氏样毒素的如柠檬酸杆菌属(83)和肠细菌属(89)的其它肠细菌将被遗漏。因此，被设计用于所有肠细菌中的毒性基因检测的TaqManTM-PCR基PCR看来是优良的。
大部分腹泻疾病的感染剂是未知的。对胃肠道中的细菌致病原的常规筛选包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、志贺氏菌(S.aureus)、弯曲杆菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属和(C.difficile)(32)。熟知致病性大肠杆菌，如ETEC、EHEC、EIEC和EaggEC是重要的下胃肠道致病原，并因此可能明显影响腹泻感染的次数(32)。然而，未进行这些细菌的常规细菌诊断方法，而且，在大多数情况下，这些致病性大肠杆菌被误诊为非致病性共生菌群类型。为了解决这个问题，开发了一组特异性引物和荧光原探针并优化用于由这些细菌带有的毒性因子的TaqManTM-PCR基检测(表2和3)。在标准96井微量滴定的排列中，排列病人样品、所有8个检测的毒性基因的阳性和无模板对照，可获得在5小时中从样品DNA制备至荧光测定的来回时间。因此，用于致病性大肠杆菌的TaqManTM-PCR基分析提供一种极迅速的诊断这些细菌的方法。在准确、灵敏和具特异性的同时，与常规方法相比，这种分析法需要最少的后PCR加工时间。当在光学试管中进行TaqManTM-PCR时，而且PCR反应与扩增产物的交叉反应的危险被降至最小。致病性肠细菌带有的毒性质粒的检测可证实这些细菌在宿主中导致疾病的能力。不清楚是否包含毒素基因或附着因子的肠细菌也通常在宿主外表达它们。这可能是为什么在许多包含EHECs的sltI和sltII可通过基于核酸的方法检测的HUS情况下，对志贺氏样毒素的ELISA试验可能是阴性的的一种解释。
接着在用于测定在7个月中从在规定的地理区域(Bavaria南部)患有腹泻的儿童中获得的底样(stool samples)的常规诊断方法中检测用于致病性大肠杆菌检测的根据本发明的TaqManTM-PCR分析。将通过TaqManTM-PCR获得的结果与标准的用于PCR产物检测的方法比较(溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳)。分析100个底样(表4)。22％的样品对于一种或多种毒性因子被发现检测为阳性。具有2例EHEC、5例ETEC、8例EaggEC、1例EIEC和16例EPEC。这指1/5患有腹泻的儿童可能患有由致病性大肠杆菌导致的腹泻。这些数目比所有其它常规筛选的细菌胃肠道致病原组高很多。在这组中观察到仅2例沙门氏菌并且没有弯曲菌。
令人感兴趣的是，诊断带有EHEC的两名儿童为严重患病，一名患有出血性结肠炎，另一名发展成HUS，并被在危重监护病房中治疗。
总的来讲，这些研究表明在儿童中以及还在成人中的大部分腹泻疾病与在标准微生物方法中被误诊为共生菌群的致病性大肠杆菌相关。根据本发明的TaqManTM方法首次实现了对这些重要的致病原的直接、快速、特异和敏感检测。而且，用该方法检测的毒性基因不局限于大肠杆菌，它们还可自由地转移至其它肠细菌中。对这些细菌中的毒性基因的检测还通过本文公开的TaqManTM-PCR检测。该分析法仅需要最少的后PCR检测时间，因此可在18小时内进行，并且消除了PCR交叉污染的问题。
根据本发明，大肠杆菌毒性因子/毒素基因被用作PCR扩增的靶。根据公开的序列设计PCR引物和荧光原探针。特别选择了用于大肠杆菌和相关肠细菌致病组检测的八个不同的引物和探针组，参见表1。
在表2中详细描述了引物的序列和它们的位置以及GenBank登记号。EHEC sltI的检测是基于sltI同源基因排序后的共有引物和探针序列(GenBank登记号Z36899，Z36900和Z36901)(77，78)。sltII变异体的检测是基于同源基因的公开的序列(GenBank登记号M76738，Z37725，L11079，X67515，M59432，M29153，M36727和M21534)(79-83)。对于sltI的扩增，降解的引物组证实是最佳的。ETEC的诊断是基于热不稳定(LT)(84)或热稳定毒素(ST)(36)的扩增，EaggEC基于pCVD432质粒序列(40，50)、EIEC基于inv质粒序列(38，48)、EPEC基于大肠杆菌附着和脱落基因(EAF质粒)(37，85)或对于EHEC附着和脱落蛋白为大肠杆菌基因(eae)(86)。使用大肠杆菌parC基因特异性引物进行完整DNA制备物的PCR对照扩增(拓扑异构酶IV，Genbank登记号M58408)(87)。
寡核苷酸探针和它们的Genbank参考示于表3中。将寡核苷酸探针设计成GC含量为40-60％，在5’末端没有G核苷酸，探针长度为27至30bp。探针在大多数5’和大多数3’碱基处分别与荧光报道染料(例如6-羧基-荧光素[FAM]；λem＝518nm)和荧光猝灭染料(6-羧基四甲基乙基罗丹明[TAMRA]；λem＝582nm)共价结合。所有引物和探针从Perkin Elmer，德国获得。
通过从带有LT、ST、inv-质粒、pCVD342、EAF、eae、sltI和sltII基因的大肠杆菌对照菌株中分离DNA来优化TaqManTM-PCR(参见表1)。为了最大PCR产物产率(如琼脂糖凝胶电泳所证实)和RO值(RQ＝FAM荧光强度/TAMRA荧光强度)使用上述致病性大肠杆菌对照菌株调节MgCl2浓度。在5.2mmol的MgCl2浓度、35次循环、55℃的退火温度和65℃的延伸温度下获得所使用的所有引物/荧光探针的最佳PCR反应。65℃的延伸温度被发现产生较高的RQ值，这可能是由于在Taq聚合酶降解前较低的模板/荧光探针解离速率。
大肠杆菌sltI基因被用作建立PCR和分析探针相对于PCR引物的不同位置的靶序列。引物被设计在sltI基因的保守区退火(参见上文)。比较位于引物上游132bp的sltI和位于距引物21bp的sltI-N1两个探针。用探针sltI-N1(RQm＝6.3800)获得的RQ值被可重复性地发现比在相同的大肠杆菌sltI对照DNA的模板浓度下用探针sltI-NO(RQm＝0.9620)产生的RQ值。通常，而且紧邻(4-20bp)两个PCR引物中的一个的其它靶基因特异的探针一致产生比位于聚引物更远距离的探针更高的RQ值。
由于报道了粗的细菌裂解物可包含可能干扰PCR进行的抑制因子，因此检测了DNA制备对进行TaqManTM-PCR的影响。因此，在McConkey平板上培养过夜后收集细菌。通过煮沸接种在0.9％NaCl溶液中的细菌或通过用商业上的自旋制备法(参见实施例，材料和方法)分离基因组DNA来制备DNA。当比较两种制备法时，TaqManTM-PCR的RQ值和灵敏度没有不同。从来自105包含通过煮沸或通过自旋制备法制备的EHEC的sltI或sltII的DNA的PCR扩增获得的RQ值是可相比较的。
TaqManTM-PCR法依赖于水解后从探针释放的游离的报道染料(FAM)的检测。因此，探针浓度也应通过影响在PCR循环中降解的探针部分对分析的进行产生影响。在100pmol-0.1pmol范围内滴定探针的浓度并测定ΔRQ值。取决于扩增的靶基因，最佳探针浓度在10pmol至20pmol之间变化。
为了检测TaqManTM-PCR法的灵敏度，以对数步骤稀释将包含sltI或sltII的EHEC稀释在包含为107cfu的大肠杆菌菌株ATCC11775的悬液中。在最佳条件下进行PCR，将来自溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶的结果与TaqManTM结果比较。包含sltI的EHEC菌株的最小检测极限在107中为103cfu。对于sltII检测极限，发现在107肠细菌中为103.5cfu。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物的检测和通过TaqMan方法对一个信号的测定这两种方法产生可相比较的结果，即在琼脂糖凝胶中可见ΔRQ值在ΔRQ阀值之上的PCR产物带，而且也在琼脂糖凝胶中ΔRQ值在ΔRQ阀值周围的PCR产物在检测极限之下。在对于所有毒性因子/毒素的最佳检测试验后，建立TaqManTM-PCR用于对常规生物样品的致病性大肠杆菌的存在的检测中。将TaqManTM-PCR结果与琼脂糖凝胶电泳进行比较。
下面的实施例将进一步说明本发明。然而，它不被认为是限制性的。
实施例
1.使用根据本发明的方法检测来自患有腹泻的儿童的底样中的致病性大肠杆菌的流行
为了说明TaqManTM-PCR的进行和检测致病性大肠杆菌的出现，对100份来自0至10岁的具有临床腹泻症状的儿童的底样进行筛选。在下面第2项中将详细描述试验中所采用的材料和方法。
从1996年6月至10月进行样品的收集。本研究中的所有样品来自Bavaria南部区。将底样铺在McConkey琼脂上，保温过夜并收集肠细菌。分离DNA并用作包含sltI、sltII、LT、ST、EAF质粒、eae基因、inv质粒和pCVD432特异性的引物和荧光探针的PCR反应中的模板。为了证实来自各制备的DNA的完整性，建立包含用于大肠杆菌parC基因扩增的引物和内荧光探针的对照PCR反应。作为阳性分析对照，在各分析中进行一个PCR反应，其中存在来自阳性对照菌株的DNA的各毒性因子/毒素。使用该可靠的方法，可获得所有靶基因的特异和灵敏的检测。对100个来自患有腹泻的儿童的底样的系统分析产生22个样品，其中可检测三分之一或三分之二的致病性大肠杆菌毒性因子/毒素。详细地说，2名病人带有EHEC(一名带有出血性结肠炎，以名发展成HUS)。3名病人检测为ETEC阳性，16名为EPEC阳性，1名为EIEC阳性和8名为FaggEC阳性(参见表4)。患有出血性结肠炎的病人被检测为sltI和eae阳性，发展成HUS的病人检测为sltI，SltII，和eae阳性。一名病人同时带有ETEC(LT+，ST+)，EPEC(eae+)和EaggEC(pCVD342+)，一名病人被检测为EIEC(inv+)和EaggEC(pCVD342)阳性，两份底样包含EPEC(eae+)和EaggEC(pCVD342)。
将来自带有EHEC的两名病人的肠细菌与sltI和sltII基因探针杂交以检测TaqManTM-PCR的准确性和特异性。在其中TaqManTM-PCR为sltI阳性的病人1的情况下，可仅发现与sltI杂交的菌落。其中TaqManTM-PCR为sltI、sltII阳性的病人2的菌落与用于sltI和sltII的探针杂交。挑取阳性菌落，生物化学定型为大肠杆菌。
抗体敏感性检测表明EHEC菌株对广谱青霉素、头胞菌素和回旋酶抑制剂敏感。
2.材料和方法
a)细菌菌株、培养基、培养和DNA制备：为了准确的PCR扩增，许多EHEC、ETEC、EPEC、EIEC和EaggEC大肠杆菌菌株被用作对照，它们由H.Karch，Wurzburg，德国和H.Beutin，柏林，德国(参见表1)友善提供。作为不带有这些毒性基因的菌株，使用大肠杆菌ATCC11775。为了TaqManTM-PCR的最优化，37℃下，在McConkey琼脂上(Becton Dickinson，德国)培养阳性对照。过夜培养后，收集细菌并重新悬浮于0.9％NaCL溶液中。将浊度调至McFarland 0.5。通过煮沸(95℃，10分钟)制备或使用QiaAmp组织试剂盒自旋制备柱(Qiagen，德国)分离DNA。10ul DNA悬液被用于PCR。在将适宜量的用于铺展在mcConkey平板上后，进行来自人或牛的底样的致病性大肠杆菌的检测。过夜培养后，收集来自McConkey平板的表面的所有细菌菌落并如上所详细描述地进行处理。
b)PCR循环：在薄壁的0.2ml“光学PCR试管”中，在70ul最终体积中进行PCR反应(Perkin Elmer，德国)。反应混合物包含：10ul细菌裂解液，5.25ul 25mmol MgCl2，7ul 10×PCR缓冲液，40pmol引物，20pmol特异性荧光探针，150uM各种dATP，dTTp，DGTP，dCTP(Perkin Elmer)，1UAmpliTaq-聚合酶(Perkin Elmer)。Perkin Elmer 9600型热循环仪被用于PCR循环。通过94℃下加热5分钟进行细菌DNA的起始变性。所有循环均包括94℃，15秒的变性步骤，55℃，30秒的退火和65℃，30秒的延伸。进行35次循环。
c)后PCR加工：循环完成后，使用装有平板计数器的Perkin Elmer LS50B发光分光光度计测定报道染料，FAM和猝灭染料，TAMRA的荧光强度并在光学试管中校正PCR反应的荧光测定值。如(74)所描述地计算ΔRQ值。根据三份无模板对照的平均值之上的99％置信区间计算ΔRQ阀值值(ΔRQ阀值＝6，95×std无模板对照的平均值)。如果给出ΔRQ样品＞ΔRQ阀值，PCR反应被计为阳性。为了证实TaqManTM-PCR测定的灵敏度，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。将15ul样品与2ul样品缓冲液一起上样。在2％包含溴化乙啶的琼脂糖凝胶中以100V，35分钟将PCR产物分离。在紫外线下可见DNA，使用EagleEyeII系(Stratagene)获得数字图象资料。
d)PCR扩增的证实：将从各阳性对照菌株的模板获得的PCR产物直接亚克隆至TA克隆载体中(Invitrogen，德国)以证实PCR扩增的特异性。在用连接产物转染(CaCl2方法)DH5α细菌后，在包含青霉素(Sigma，德国)的LB平板中选择包含质粒分细菌。用Qiagen DNA纯化柱(Quiagen，德国)纯化质粒DNA。采用与4种染料结合的二脱氧核苷酸对插入物进行PCR循环测序(DNA染料终止子循环测序试剂盒，Perkin Elmer，德国)。用AppliedBiosystems373A型号(Applied BioSystems，德国)获得序列。使用McDNAsis程序(Appligene，英国)将插入序列与如表1所参考的公开序列比较。序列比较证实PCR产物与各毒性因子或毒素相同。
e)TaqManTM技术的灵敏度：为了确定TaqManTM方法的灵敏度，在包含107cfu大肠杆菌参考菌株ATCC11775的溶液中进行阳性对照菌株的系列对数步骤的稀释。通过煮沸法(参见上文)制备或通过使用设计用于基因组细菌DNA分离的自旋制备柱(Qiagen，德国)纯化DNA。纯化根据制造商的方法进行。使用在107大肠杆菌中为103cfu和在107大肠杆菌中为103.5cfu检测包含sltI的菌株和和sltIII的菌株的检测极限。
f)菌落杂交和EHEC细菌的分离：将EHEC细菌菌株和来自在sltI或sltIITaqManTM-PCR中检测为阳性的病人的底样进行菌落杂交。简单地说，将细菌平板接种在McConkey琼脂平板上以致可见单个菌落。将细菌在尼龙膜(Genescreen Plus，NEN，德国)上进行印迹，裂解(1％SDS)，变性(0.5M NaOH，1.5MNaCl)，中和(1MTRIS，1.5M NaCl)，并洗涤(20×SSC)。80℃下将膜烘焙2小时。sltI或sltII特异性DNA探针被荧光素(Gene-Images随机引物标记模件，Amersham，德国)标记。此后，将滤器与标记的探针杂交。通过采用抗FITC过氧化物酶mAb和ECL检测模件(Gene-Images CDP-Star检测模件，Amersham，德国)的非放射性检测系统证实杂交。挑取与探针和非杂交菌落杂交的细菌菌落，通过TaqMan-PCR证实并检测抗生物素敏感性。
抗生物素敏感性试验：在菌落杂交中检测了sltI或sltII或两者毒性基因后，从McConkey平板中挑取EHEC和非EHEC大肠杆菌，并根据肠细菌的NCCLS指南进行MIC试验。
  组 菌株数目   血清型 毒性因子/毒素
 EHEC  1193/89  O157：H-  sltI，ene
 3574/92  O157：H7  sltII，ene
 A9167C  O157：H7  sltI，sltIIc，ene
 5769/87  O157：H7  sltI，sltII，ene
 427/89  O157：H-  sltI，sltIIc，ene
 1249/87  O157：H7  sltII，sltIIc，ene
 ETEC  147/1  O128：H-  ST
 164/82  O148：H28  LT
 EPEC  111/87  O111  EAF，ene
 12810  O114：H2  EAF，ene
 EIEC  76-5  O143  inv-质粒
 12860  O124  inv-质粒
EaggEC  pCVD432质粒
对照  ATCC 11775  --
表1：大肠杆菌菌株-毒性因子/毒性
组 毒性因子/毒素   引物 序列(5’→ 3’) 引物的位置 PCR产物的大小 Gen-bank参考 参考文献
ETEC LT  LT-1LT-2  gcg tta cta tcc tctcta tgt gagt ttt cca tac tgattg ccg c  874-8951213-1192  339  S60731 (84)
ST  ST-1ST-2a  tcc ctc agg atg ctaaac cagtcg att tat tca acaaag caa c  100-120360-339  260  M34916 (36)
EaggEC pCVD432质粒  EA-1EA-2  ctg gcg aaa gactgt atc att gtaa tgt ata gaa atccgc tgt t  66-87695-674  629  X81423 (40，50)
EIEC inv-质粒  EI-1EI-2  ttt ctg gat ggt atggtg aggctt gaa cat aaggaa ata aac  17786-1780618089-18069  303  D50601emb (38，48)
EPEC EAF质粒  EP-1EP-2  cag ggt aaa agaaag atg ata agaat atg ggg accatg tat tat c  546-568944-923  398  X76137 (37，85)
eae  EPeh-1EPeh-2  ccc gga ccc ggcaca agc ata agagt ctc gcc agt attcgc cac c  91-113963-942  872  Z11541 (86)
EHEC sltI  sltI-1sltI-2  atg aaa aaa acatta tta ata gctca cyg agc tat tctgag tca acg  1113-11351400-1376  287  Z36899 (77，78)
sltII  sltII-1sltII-2  atg aag aag atrwtt rtd gcrgyt tta tty gtca gtc atw attaaa ctk cac yts  1148-11781413-1385  265  L11079 (79-83)
 rgc aaa kcc
对照 parC  par-1par-2  aac ctg ttc agc gccgca ttgaca acc ggg attcgg tgt aac  141-161401-381  260  M58408 (87)
表2：用于致病性大肠杆菌检测的引物。W为A/T，R为A/G，
 D为A/G/T，Y为C/T和K为G/T。
  组 毒性因子/毒素   TaqManTM探针(FAM-5’→3’-TAMRA) bP   Gen-bank参考 参考文献
ETEC LT agc tcc cca gtc tat tac aga act atg 903-929  S60731 (84)
ST aca tac gtt aca gac ata atc aga atc ag 334-306  M34916 (36)
EaggEC pCVD432质粒 ctc ttt taa ctt atg ata tgt aat gtc tgg 668-639  X81423 (40，50)
EIEC inv      -质粒 caa aaa cag aag aac cta tgt cta cct 18063-18037  D50601emb (38，48)
EPEC EAF      -质粒 ctt gga gtg atc gaa cgg gat cca aat 575-601  X76137 (37，85)
eae taa acg ggt att atc acc aga aaa atc c 935-908  Z11541 (86)
EHEC sltI tcg ctg aat ccc cct cca tta tga cag gca 1367-1338  Z36899 (77，78)
sltII cag gta ctg gat ttg att gtg aca gtc att 1371-1342  L11079 (79-83)
对照 parC atg tct gaa ctg ggc ctg aat gcc agcgcc 169-199  M58408 (87)
表3：用于致病性大肠杆菌检测的TaqManTM探针
  组 毒性因子/毒素   TaqMan：阳性分离物的数目 琼脂凝胶电泳为：阳性分离物的数目   致病组
 ETEC  LT  2  2  5
 ST  3  3
 EaggEC  60    kb质粒  8  8  8
 EIEC  inv  质粒  1  1  1
 EPEC  EAF  质粒  1  1  16
 eae  15  15
 EHEC  sltI  2  2  2
 sltII  1  1
 对照  parC  100  100
表4：患有腹泻的儿童底样中的致病性大肠杆菌的频率。
参考文献：
1.疾病控制中心1982.来自出血性结肠炎的散发病例的大肠杆菌O157：H7的分离-美国MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep.31：580，585。
2.Karmali，M.A.，M.Petric，C.Lim，P.C.Fleming和B.t.Steele.1983.大肠杆菌细胞毒素，溶血性尿毒综合症和出血性结肠炎[letter]柳叶刀2：1299。
3.Karmali，M.A.，M.Petric，C.Lim，P.C.Fleming.1985自发性溶血性尿毒综合症与产vero细胞毒素大肠杆菌感染之间的相互关系传染病杂志151：775。
4.Riley，L.W.，R.S.Remis，S.D.Helgerson，H.B.McGee，J.G.Wells，B.R.Davis，R.J.Hebert，E.S.OlCott，L.M.Johnson，N.T.Hargrett，P.A.Blake和M.L.Cohen.1983与稀有的大肠杆菌血清型相关的出血性结肠炎新英格兰医学杂志308：681。
5.Pai，C.H.，Gordon，H.V.Sims和L.E.Bryan.1984.与大肠杆菌0157：H7相关的出血性结肠炎的发散病例。临床、流行病学和细菌学特征国际医学年鉴101：738。
6.Borczyk，A.A.，M.A.Karmali，H.Lior和L.M.Duncan.1987.用于产vero细胞毒素大肠杆菌O157：H7[letter]的牛储蓄库柳叶刀1；98。
7.Blanco，J.E.，M.Blanco和J.Blanco1995[食物和临床样品中的产肠毒素、产vero毒素和产坏死毒素大肠杆菌.动物作为人致病菌储蓄库的作用]微生物11：97。
8.Ostroff，S.M.，P.M.Griffin，R.V.Tauxe，L.D.Shipman，K.D.Greene，J.G.Wells，J.H.Lewis，P.A.Blake和J.M.Kobayashi.1990.大肠杆菌0157：H7感染在华盛顿州全州性的爆发美国流行病学杂志132：239。
9.疾病控制中心1993目前：来自hamburgers-western United States，1992-1993.MMWR42：258。
10.Nathan，R.1996.日本大肠杆菌猖獗引发恐惧和气愤天然药物2：956。
11.Griffin，P.M.，S.M.Ostroff，R.V.Tauxe，K.D.Greene，J.G.Wells，J.H.Lewis和P.A.Blake.1988.与大肠杆菌0157：H7感染相关的疾病广泛的临床范围国际医学年鉴109：705。
12.Karmali，M.A.1989.产vero细胞毒素大肠杆菌的感染临床微生物综述2；15。
13.Kovacs，M.J.，Roddy，S.Gregoire，W.Cameron，L.Eidus和J.Drouin.1990.由于大肠杆菌0157：H7的出血性结肠炎后的血栓性血小板减少性紫癜。美国医学杂志88；177。
14.O’Brien，A.D.和R.K.Holmes.1987.志贺菌和志贺样毒素.微生物综述51：206.
15.Karch，H.和J.Bockemuhl.1989[肠出血性大肠杆菌感染(EHEC)：临床和微生物问题和对公共健康服务的挑战]免疫感染17：206。
16.Siegler，R.L.1995.溶血性尿毒综合症.北美临床儿科学42：1505。
17.Rowe，P.C.，W.Walop，H.Hior和A.M.Mackenzie.1991.幼年大肠杆菌O157：H7感染后的溶血性贫血：女性处在增加的危险中？流行病感染106：523。
18.1996.Haufung von EHEC-Erkrankungen in Bayern.Munchner ArztlicheAnzeigen 23：14。
19.Doyle，M.P.1991.大肠杆菌O157：H7和其在食品中的重要性国际食品微生物杂志12：289。
20.Belongia，E.A.，K.L.MacDonald，G.L.Parham，K.E.White，J.A.Korlath，M.N.Lobato，S.M.Strand，K.A.Casale和M.T.Osterholm.1991.与预煮肉肉饼的消费相关的大肠杆菌O157：H7的爆发。传染病杂志164：338。
21.O’Brien，A.D.，A.R.Melton，C.K.Schmitt，M.L.McKee，M.L.Batts和D.E.Griffin.1993.导致出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症在华盛顿州的hamburger-borne爆发的大肠杆菌O157：H7病原体特征临床微生物学杂志31：2799。
22.Beutin，L.D.Geier，H.Steinruck，S.Zimmermann和F.Scheutz.1993.在七种不同种健康家畜中的产vero毒素(志贺菌样毒素)大肠杆菌的流行和一些特性临床微生物学杂志31：2483。
23.Martin，M.L.，L.D.Shipman，J.G.Wells，M.E.Potter，K.Hedberg，I.K.Wachsmuth，R.V.Tauxe，J.P.Davis，J.arnoldi和J.Tilleli.1986.从乳牛分离与两例溶血性尿毒综合症[letter]相关的大肠杆菌O157：H7柳叶刀2：1043。
24.Besser，R.E.，S.M.Lett，J.T.Weber，M.P.Doyle，T.J.barrett，J.G.Wells和P.M.Griffin.1993.在新榨苹果汁中的E.coli O157：H7引起的腹泻和溶血性尿毒症状的爆发[见评述] JAMA 269：2217。
25.Read，S.C.，C.L.Glyes，R.C.Clarke，H.Lior和S.McEwen.1990在安达略省西南部产vero细胞毒素大肠杆菌在切碎的牛肉、猪和鸡中的流行。Epidemiol.Infect.105：11。
26.Gannon，V.P.，R.K.King，J.Y.Kim和E.J.Thomas.1992.使用聚合酶链反应检测切碎的牛肉中的志贺氏菌样产毒素大肠杆菌的快速灵敏的方法。实用环境微生物58：3809。
27.Bopp，C.A.，K.D.Greene，F.P.Downes，E.G.Sowers，J.G.Wells和I.K.Wachsmuth.1987.与出血性结肠炎相关的非寻常的产vero毒素大肠杆菌。临床微生物学杂志25：1486。
28.Farmer，J.J.和B.R.Davis.1985.H7抗血清山梨糖醇发酵培养基：用于检测与出血性结肠炎相关的大肠杆菌O157：H7的单试管筛选培养基。临床微生物学杂志22：620。
29.Scotland，S.M.，B.Rowe，H.R.Smith，G.A.Willshaw和R.J.Gross.1988.来自患有溶血性尿毒综合症的幼儿的产vero细胞毒素大肠杆菌菌株以及用特异性DNA探针的检测。医学微生物杂志25：237。
30.Scotland，S.M.，G.A.Willshaw，H.R.Smith，B.Said，N.Stockes和B.Rowe.1993.属于血清组O26，O55，O111和O128的在英国于1991年从患有腹泻的病人中分离的大肠杆菌菌株的毒力特性。流行病感染111：429。
31.Russmanr，H.，E.Kothe，H.Schmidt，S.Franke，D.Harmsen，A.Caprioli和H.karch.1995.与溶血性尿毒综合症相关的非O157大肠杆菌菌株中的志贺氏样毒素基因的基因型。医学微生物杂志42：404。
32.Koneman，E.W.，S.D.Allen，W.M.Janda，P.C.Schreckenberger和C.W.j.Washington.1992.肠杆菌科诊断微生物J.B.Lippincott公司，费城132-133。
33.Edelman，R.和N.F.Pierce.1984.来自国家变态反应和传染病研究所。第19界美国日本联合霍乱会议总结。传染病杂志149：1014。
34.Hart，CA.，M.Batt和J.R.Saunders.1993.由大肠杆菌导致的腹泻。Ann.Trop.Paediatr.13：121.
35.Chapman，P.A.和C.M.Daly.1993.对检测产肠毒素大肠杆菌的无放射性三价体DNA探针(LT，ST1a，ST1b)的评价。临床病理学杂志46：309。
36.Moseley，S.L.，W.Hard，M.I.Hug，P.Echeverria和S.Falkow.1983.编码大肠杆菌的热稳定肠毒素的基因的分离和核苷酸序列测定。感染性免疫39：1167。
37.Jerse，A.E.，J.Yu，B.D.Tall和J.B.Kaper.1990.导致组织培养细胞损伤的产生和消除所必需的肠致病大肠杆菌的基因座。Proc.Acad.Sci.U.S.A.87：7839。
38.Taylor，D.N.，P.Echeverria，O.Sethabutr，C.Pitarangsi，U.Leksomboon，N.R.Blacklow，B.Rowe，R.Gross和J.Cross.1988.志贺氏菌的临床和微生物学特性以及由DNA杂交检测的肠侵染性大肠杆菌感染。临床微生物学杂志26：1362。
39.Prats，G.和T.Llovet.1995.[肠侵染性大肠杆菌发病机理和流行病学]微生物学11：91。
40.Nataro，J.P.Y.Maneval，A.L.German，W.C.Martin和M.M.Levine.1992.肠聚集大肠杆菌的集聚粘附菌毛介导与HEp-2细胞的粘附以及人红细胞的凝集。感染免疫学60：2297。
41.Cohen，M.B.，J.A.Hawkins，L.S.Weckbach，J.L.Staneck，M.M.Levine和J.E.Heck.1993.肠集聚大肠杆菌在患有和不患有霍乱的旅游者中的集群。临床微生物学杂志31：351。
42.Chang，P.P.，J.Moss，E.M.Twiddy和R.K.Holmes.1987.大肠杆菌II型热不稳定肠毒素通过ADP核糖基化活化人成纤维细胞中的腺苷酸环化酶。感染免疫学55：1854。
43.Pickett，C.L.，D.L.Weinstein和R.K.Holmes.1987.大肠杆菌的IIa型热不稳定肠毒素的遗传学：操纵子融合，核苷酸序列和杂交研究。细菌学杂志169：5180。
44.Giron，J.A.，M.S.Donnenberg，W.C.Martin，K.G.Jarvis和J.B.kaper.1993.维管形成菌毛结构基因(bfpA)在肠致病性大肠杆菌中的分布。传染性疾病168：1037。
45.Karch，H.，J.Heesemann，R.laufs，A.D.O’Brien，C.O.Tacket和M.M.Levine.1987.肠出血性大肠杆菌O157：H7的质粒为新的菌毛抗原的表达和粘附于水平细胞所需要。感染免疫学55：455。
46.Nataro，J.P.，M.M.baldini和J.B.kaper.1985.用DNA探针对肠致病大肠杆菌的粘附因子的检测。感染性疾病杂志152：560。
47.Watanabe，H.，E.Arakawa，K.Ito，J.Kato和A.Nakamura.1990.通过使用Tn3-Lac转座子的对侵染区的遗传分析以及用于宋内氏志贺氏菌的细胞侵染的第二个正调节子基因，invE的鉴定：invE与质粒P1的ParB的显著的同源性。细菌学杂志172：619。
48.Sasakawa，C.，K.Komatsu，T.Tobe，T.Suzuki和M.Yoshikawa.1993.形成操纵子的区5的八个基因对弗氏志贺氏侵染水平细胞是必需的。细菌学杂志175：2334。
49.Echeverria，P.，O.Serichantalerg，S.Changchawalit，B.Baudru，M.M.levine，F.Orskov和I.Orskov.1992.婴儿腹泻中的组织培养物粘附性大肠杆菌。感染性疾病杂志165：141。
50.Schmidt，H.C.Knop，S.Franke，S.Aleksic，J.Heesemann和H.Karch.1995.用于筛选肠聚集性大肠杆菌的PCR的开发。临床微生物学杂志33：701。
51.Faruque，S.M.，K.Haider，M.M.Rahman，A.R.AbdulAlim，A.H.Baqui，Q.S.Ahmad，K.M.Hossain和M.J.Albert.1992。评价DNA探针以鉴定来自孟加拉共和国的患有腹泻的儿童的肠聚集性大肠杆菌。腹泻疾病研究杂志10：31。
52.Yamamoto，T.，P.Echeverria和T.Yokota.1992.肠聚集性大肠杆菌的药物抗性和对人肠的粘附性。感染性疾病杂志165：744。
53.Savarino，S.J.，A.Fasano，J.Watson，B.M.Martin，M.M.Levine，S.Guandalini和P.Guerry.1993.肠聚集性大肠杆菌热稳定内毒素1代表另一亚族大肠杆菌热稳定毒素。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：3093。
54.Bennett，A.R.，S.MacPhee和R.P.Betts.1995.对绞碎的牛肉中的大肠杆菌O1571的分离和检测方法的评价。应用微生物学通讯20：375。
55.March，S.B.和S.Ratnanm.1986.用于检测与出血性结肠炎相关的大肠杆菌O157：H7的Sorbitol-MacConkey培养基。临床微生物杂志23：869。
56.Kleanthous，H.，N.K.Fry，H.R.Smith，R.J.Gross和B.Rowe.1988.Sorbitol-MacConkey琼脂与特定的抗血清结合在检测大肠杆菌O157的产Vero细胞毒素菌株中的用途。流行病感染101：327。
57.March，S.B.和S.Ratnam.1989.检测大肠杆菌血清型O157的乳胶凝聚试验。临床微生物学杂志27：1675。
58.Beutin，L.，S.Aleksic，S.Zimmermann和K.Gleier.1994从德国病人分离的大肠杆菌vero细胞毒性菌株的毒性因子和表型试验。医学微生物与免疫学柏林183：13。
59.Stroeher，U.H.，L.Bode，L.Beutin和P.A.Manning.1993.与大肠杆菌蛋白相关的33kDa肠溶血素(Ehly 1)的表征和序列。基因132：89。
60.Johnson，R.P.，R.J.Durham，S.T.Johnson，L.A.MacDonald，S.R.Jeffrey和B.T.Butman.1995.通过酶联免疫吸附测定，EHEC-Tek对肉中的大肠杆菌O157：H7的检测。应用环境微生物61：386。
61.Padhey，N.V.和M.P.Doyle.1991.快速检测食物中的肠出血性大肠杆菌O157：H7的方法。应用环境微生物57：2693。
62.Clark，C.G.S.Johnson和R.P.Johnson.1995.对大肠杆菌O157：H7具有活性的单克隆抗体的进一步表征。医学微生物杂志43：262。
63.Karmali，M.A.，M.Petric，M.Winkler，M.Bielaszewska，J.Brunton，N.van dekar，T.Morooka，G.B.Nair，S.E.Richardson和G.S.Arbus.1994.用于检测大肠杆菌Vero细胞毒素的免疫球蛋白G抗体的酶联免疫吸附测定。临床微生物学杂志32：1457。
64.Gunzer，F.，H.Bohm，H.Russmann，M.BItzan，S.Aleksic和H.Karch.1992.患有出血性尿毒症的病人中的发酵山梨糖醇的大肠杆菌O157的分子检测。临床微生物学杂志30：1807。
65.Bockemuhl，J.，S.Aleksic和H.Karch.1992.来自德国病人的非O-组157的志贺氏样产毒素(vero细胞毒素)大肠杆菌菌株的血清学和生物化学特性。国际医学微生物与病毒寄生虫感染性疾病杂志276：189。
66.Smith，H.R.，S.M.Scotland，G.A.Willshaw，C.Wray，I.M.McLaren，T.Cheasty和B.Rowe.1988.动物来源的大肠杆菌菌株中的Vero细胞毒素的产生和VT基因的存在。普通微生物学杂志134：829。
67.Karch，H.和T.Meyer.1989.对用于鉴定志贺氏样产毒素大肠杆菌的寡核苷酸探针的评价。临床微生物学杂志27：1180。
68.Jackson，M.P.1991.通过使用掺入Digixigenin-11-dUTP的聚合酶链反应对志贺氏产毒素志贺氏类型1痢疾和大肠杆菌的检测。临床微生物学杂志29：1910。
69.Johnson，W.M.，D.R.Pollard，H.Lior，S.D.Tyler和K.R.Rozee.1990.通过聚合酶链反应区分编码大肠杆菌vero毒素2和与猪水肿病(VTe)相关的vero毒素的基因。临床微生物学杂志28：2351。
70.Johnson，W.M.，S.D.Tyler，G.Wang和H.Lior.1991.通过编码大肠杆菌vero毒素(VTe变异体)的基因中的特定的靶序列的聚合酶链反应的扩增。FEMS微生物学通讯68：227。
71.Karch，H.和T.Meyer.1989.用于通过聚合酶链反应扩增独特的志贺氏样毒素基因片段的单药物对。临床微生物学杂志27：2751。
72.Pollard，D.和W.M.Johnson.1990.通过聚合酶链反应的对大肠杆菌中的vero毒素基因的快速特异性检测。临床微生物学杂志28：540。
73.Holland，P.M.，R.D.Abramson，R.Watson和D.H.Gelfand.1991.通过使用栖热水生菌DNA聚合酶的5’----3’外切核酸酶活性对特定的聚合酶链反应产物的检测。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：7276。
74.Bassler，H.A.，S.J.Flood，K.J.Livak，J.Marmaro，R.Knorr和C.A.Batt.1995.荧光探针在用于检测李斯特菌属单核细胞基因的基于PCR测定中的应用。应用环境微生物61：3724。
75.Livak，K.J.S.J.Flood，J.Marmaro，W.Giusti和K.Deetz.1995.在相反末端具有荧光染料的寡核苷酸提供可用于检测PCR产物和核酸杂交的猝灭探针系统。PCR方法与应用4：357。
76.Forster，V.1948.Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.物理年刊(Leipzig)2：55。
77.Paton，A.W.，J.C.Paton，P.N.Goldwater和P.A.Manning.1993.通过聚合酶链反应对原代粪便培养物中的大肠杆菌志贺氏样毒素基因的直接检测。临床微生物学杂志31：3063。
78.Paton，A.W.，J.C.Paton，P.N.Goldwater，M.W.Heuzenroeder和P.A.Manning.1993.大肠杆菌O111的变异的的志贺氏样毒素类型I操纵子的序列：H-。基因129：87。
79.Paton，A.W.，J.C.Paton和P.A.Manning.1993.变异的大肠杆菌志贺氏样毒素类型II操纵子的聚合酶链反应扩增，克隆和测序。微生物学与病理学15：77。
80.Gyles，C.L.，S.A.De Grandis，C.Mackenzie和J.L.Brunton.1988.决定大肠杆菌的猪水肿病分离物中的vero细胞毒素产生的基因的克隆和核苷酸序列分析。微生物学与病理学5：419。
81.Gannon，V.P.，C.Teerling，S.A.Masri和C.L.Gyles.1990.大肠杆菌志贺氏样毒素II族的另一种变异体的分子克隆和核苷酸序列。普通微生物学杂志136：1125。
82.Schmitt，C.K.，M.L.McKee和A.D.O’Brien.1991。在肠溶血性大肠杆菌菌株中常见的两拷贝的志贺氏样毒素II相关基因导致O157：H-菌株E32511的抗原异质性。感染性免疫59：1065。
83.Schmidt，H.，M.Montag，J.Bockemuhl，J.Heesemann和H.Karch.1993.来自人和牛样品中的弗劳地氏柠檬杆菌菌株中的志贺氏样毒素II相关的细胞毒素。感染性免疫61：534。
84.Inoue，T.，T.Tsuji，M.Koto，S.Imamura和A.Miyama.1993.来自小鸡肠毒性大肠杆菌的热不稳定肠毒素的氨基酸序列与人菌株H10407的序列相同。FEMS微生物通讯108：157。
85.Franke，J.H.Schmidt和H.Karch.1994.肠致病性大肠杆菌(EPEC)粘附因子探针的核苷酸序列分析和用于快速检测EPEC带有毒性的质粒的PCR的开发。临床微生物学杂志32：2460。
86.Yu，J.和J.B.Kaper.1992.肠出血性大肠杆菌O157：H7的族基因的克隆和表征。分子微生物学6：411。
87.Kato，J.，Y.Nishimura，R.Imamura，H.Nike，S.Hiraga和H.Suzuki.1990.大肠杆菌中染色体分离必需的新的拓扑异构酶[公开的erratum出血在细胞1991年6月28日；65(7)：1289]。细胞63：393。
88.Zhao，S.，S.E.Mitchell，J.Meng，M.P.Doyle和S.Kresovich.1995.肠溶血性大肠杆菌O157：H7的eaeA基因上游基因的克隆和核苷酸序列。FEMSMicrobiol.Lett.133：35。
89.PatonA.W.和J.C.Paton.1996.产生与溶血性尿毒症病例相关的志贺氏样毒素II相关的细胞毒素的下水道肠细菌。临床微生物学杂志34：463。
90.Witbam，P.K.，K.J.Livak，C.A.Batt和C.T.Yamashiro.1996.用于检测切碎的牛肉中的大肠杆菌志贺氏样毒素基因的基于PCR的分析。实用环境微生物62：1347。
91.Karch，H.，C.Janetzki-Mittmann，S.Aleksic和M.Datz.1996.通过使用免疫磁分离，基于DNA的方法从患有溶血性尿毒症的病人中分离肠溶血性大肠杆菌O157菌株和直接培养物。临床微生物学杂志34：516。
92.Huppertz，H.I.，D.Busch，H.Schmidt，S.Aleksic和H.Karch.1996.与产生志贺氏样毒素的大肠杆菌非O157生物相关的幼儿腹泻。儿科学杂志128：341。

Claims (15)

1.一种检测样品中致病性肠细菌的方法，包括使用一组寡核苷酸引物对、具有5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶、以及带有标记的寡核苷酸探针，针对从所述样品中分离的DNA进行PCR扩增，
所述引物对允许通过扩增每组致病性大肠杆菌菌株特有的毒性因子/毒素基因而区分至少两组致病性大肠杆菌菌株，其中该组核苷酸引物对包括两个或多个选自下组的引物对：
与编码热不稳定毒素，或热稳定毒素的基因杂交的用于肠产毒性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物对；
与编码热稳定毒素的基因杂交的用于肠聚集性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物对；
与pCVD432质粒杂交的用于肠聚集性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物对；
与inv质粒杂交的用于肠侵染性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物对；
与EAF质粒或eae基因杂交的用于肠致病性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物对；
与编码志贺氏样毒素sltI或sltII的基因杂交的用于肠出血性大肠杆菌特有的DNA序列扩增的引物对，
所述带有标记的寡核苷酸，在最靠5’端的碱基处被荧光染料标记，在最靠3’端的碱基处被荧光猝灭染料标记，它在靶DNA内部杂交，
所述带有标记的寡核苷酸探针，对所述聚合酶的5’-3’外切核酸酶降解作用敏感，被降解后产生通过荧光检测法可检测到的片段。
2.根据权利要求1的方法，其中
与编码肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定毒素的基因杂交的引物对为
LT-1：5’GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3’和
LT-2：5’AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3’；
与编码肠产毒性大肠杆菌特有的热稳定毒素的基因杂交的引物对为
ST-1：5’TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3’  和
ST-2a：5’TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3’；
与编码肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定毒素的基因杂交的引物对为
EASTI-1：5’AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3’和
EASTI-2：5’TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3’；
与pCVD432质粒杂交的引物对为
EA-1：5’CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3’和
EA-2：5’TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3’；
与inv质粒杂交的引物对为
EI-1：5’TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3’和
EI-2：5’CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3’；
与EAF质粒杂交的引物对为
EP-1：5’CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3’和
EP-2：5’AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3’；
与eae质粒杂交的引物对为
EPeh-1：5’CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3’和
EPeh-2：5’AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3’；
与编码志贺氏样毒素sltI的基因杂交的引物对为
SltI-1：5’ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3’和
SltI-2：5’TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC 3’；和
与编码志贺氏样毒素sltII的基因杂交的引物对为
SltII-1：5’ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3’和
SltII-1：5’TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3’
其中W为A/T，R为A/G，D为A/G/T，Y为C/T和K为G/T。
3.根据权利要求1的方法，其中带有标记的寡核苷酸探针特异性针对每种待测的毒性因子/毒素基因。
4.根据权利要求3的方法，其中
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定毒素
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定肠产毒性大肠杆菌特有的热稳定毒素
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定毒素
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定pCVD432质粒
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定inv质粒
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定EAF质粒
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定eae基因
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定志贺氏样毒素sltI基因
带有标记的寡核苷酸探针特异地测定志贺氏样毒素sltII基因。
5.根据权利要求4的方法，其中
用于肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定毒素检测的标记的寡核苷酸探针为
5’AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3’；
用于肠产毒性大肠杆菌特有的热稳定毒素检测的标记的寡核苷酸探针为
5’ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3’；
用于肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定毒素检测的标记的寡核苷酸探针为
5’ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3’；
用于pCVD432质粒检测的标记的寡核苷酸序列为
5’CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3’；
用于inv质粒检测的标记的寡核苷酸序列为
5’CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3’；
用于EAF质粒检测的标记的寡核苷酸序列为
5’CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3’；
用于eae基因检测的标记的寡核苷酸序列为
5’TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3’；
用于志贺氏样毒素sltI基因检测的标记的寡核苷酸探针为
5’TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3’；
和
用于志贺氏样毒素slt II基因检测的标记的寡核苷酸探针为
5’CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3’。
6.根据权利要求1-5之一的方法，其中荧光报道染料为6-羧基-荧光素、四氯-6-羧基荧光素或六氯-6-羧基荧光素和荧光猝灭染料为6-羧基四甲基罗丹明。
7.根据权利要求1-6之一的方法，其中PCR扩增方法包括MgCl2浓度为5.2mmol，退火温度为55℃和延伸温度为65℃的35次PCR循环组成。
8.用于对致病性肠细菌的DNA进行PCR扩增的一组引物对，其允许通过扩增每组致病性大肠杆菌菌株特有的毒性因子/毒素基因来区分至少两组致病性大肠杆菌菌株，包括两个或多个选自下组的引物对：
与编码肠产毒性大肠杆菌的热不稳定毒素或热稳定毒素的基因杂交的引物对；
与编码肠聚集性大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交的引物对；
与肠聚集性大肠杆菌的pCVD432质粒杂交的引物对；
与肠侵染性大肠杆菌的inv质粒杂交的引物对；
与肠致病性大肠杆菌的EAF质粒或eae基因杂交的引物对；
与编码肠出血性大肠杆菌的志贺氏样毒素sltI或sltII的基因杂交的引物对。
9.根据权利要求8的引物对，其中
与编码肠产毒性大肠杆菌的热不稳定毒素的基因杂交的引物对为
LT-1：5’GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G 3’  和
LT-2：5’AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C 3’；
与编码肠产毒性大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交的引物对为
ST-1：5’TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG 3’和
ST-2a：5’TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C 3’；
与编码肠聚集性大肠杆菌的热稳定毒素的基因杂交的引物对为
EASTI-1：5’AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG 3’和
EASTI-2：5’TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG 3’；
与pCVD432质粒杂交的引物对为
EA-1：5’CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G 3’和
EA-2：5’TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3’；
与inv质粒杂交的引物对为
EI-1：5’TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG 3’和
EI-2：5’CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC 3’；
与EAF质粒杂交的引物对为
EP-1：5’CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG 3’和
EP-2：5’AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C 3’；
与eae基因杂交的引物对为
EPeh-1：5’CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG 3’和
EPeh-2：5’AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C 3’；
与编码志贺氏样毒素sltI基因杂交的引物对为
SltI-1：5’ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC 3’和
SltI-2：5’TCA CYG AGC TAT TCT CAG TCA AGC 3’；和
与编码志贺氏样毒素sltII的基因杂交的引物对为
SltI-1：5’ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G 3’和
SltI-2：5’TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC 3’
其中W为A/T，R为A/G，D为A/G/T，Y为C/T和K为G/T。
10.一组标记的寡核苷酸探针，用于通过特异性针对致病性大肠杆菌菌株的毒性因子/毒素基因的TaqManTM-PCR来检测致病性肠细菌，包括
特异地检测肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定性毒素的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测肠产毒性大肠杆菌特有的热稳定性毒素的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定性毒素的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测pCVD432质粒的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测inv质粒的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测EAF质粒的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测eae基因的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测志贺氏样毒素slt I基因的、标记的寡核苷酸探针；
特异地检测志贺氏样毒素slt II基因的、标记的寡核苷酸探针。
11.权利要求10的一组探针，其中
用于肠产毒性大肠杆菌特有的热不稳定毒素检测的标记的寡核苷酸探针为
5’AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG 3’；
用于肠产毒性大肠杆菌特有的热稳定毒素检测的标记的寡核苷酸探针为
5’ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG 3’；
用于肠聚集性大肠杆菌特有的热稳定毒素检测的标记的寡核苷酸探针为
5’ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC 3’；
用于pCVD432质粒检测的标记的寡核苷酸探针为
5’CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG 3’；
用于inv质粒检测的标记的寡核苷酸探针为
5’CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT 3’；
用于EAF质粒检测的标记的寡核苷酸探针为
5’CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT 3’；
用于eae基因检测的标记的寡核苷酸探针为
5’TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C 3’；
用于志贺氏样毒素sltI基因检测的标记的寡核苷酸探针为
5’TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA 3’和
用于志贺氏样毒素sltII基因检测的标记的寡核苷酸探针为
5’CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT 3’。
12.用于通过TaqManTM-PCR法诊断来自活动物体的标本中肠细菌感染的试剂盒，其包括权利要求8或9的一组引物对和权利要求10或11的寡核苷酸探针组。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述活动物体指人。
14.权利要求1-7之一的方法的应用，用于检测标本中的肠细菌感染或检测消费品的肠细菌污染，其中该标本源于活动物体。
15.权利要求14的用途，其中所述消费品为肉、奶和蔬菜，或者所述活动物体为人体。
CNB988044099A 1997-04-22 1998-04-21 检测致病性大肠杆菌菌株的TaqManTM－PCR Expired - Fee Related CN1160471C (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK0451/1997 1997-04-22
DK0451/97 1997-04-22
DK45197 1997-04-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1258320A CN1258320A (zh) 2000-06-28
CN1160471C true CN1160471C (zh) 2004-08-04

Family

ID=8093715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB988044099A Expired - Fee Related CN1160471C (zh) 1997-04-22 1998-04-21 检测致病性大肠杆菌菌株的TaqManTM－PCR

Country Status (10)

Country Link
US (2) US6664080B1 (zh)
EP (1) EP0994965A2 (zh)
JP (1) JP2001521394A (zh)
CN (1) CN1160471C (zh)
AU (1) AU753277B2 (zh)
BR (1) BR9808963A (zh)
CA (1) CA2286310A1 (zh)
HK (1) HK1026002A1 (zh)
NZ (1) NZ337506A (zh)
WO (1) WO1998048046A2 (zh)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1013775A1 (en) * 1998-12-21 2000-06-28 LUTZ, Hans Quantitative polymerase chain reaction using a fluorogenic real-time detection system
DE10004147A1 (de) * 2000-01-31 2001-08-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von 16S-rRNA-Genen von Bakterien
EP1360324A2 (en) 2000-08-31 2003-11-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of varicella-zoster virus
AUPR050700A0 (en) * 2000-10-03 2000-10-26 Id+Plus Ltd Detection method
ES2344594T3 (es) 2001-01-31 2010-09-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Deteccion del virus del herpes simplex.
US7691571B2 (en) 2001-01-31 2010-04-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of bordetella
WO2002089844A1 (en) 2001-05-07 2002-11-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Legionella detection with fluorescent resonance energy transfer
US20050130155A1 (en) * 2001-12-19 2005-06-16 Angles D'auriac Marc B. Primers for the detection and identification of bacterial indicator groups and virulene factors
US20030215814A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-20 Cockerill Franklin R. Detection of Shiga toxin- or Shiga-like toxin-producing organisms
US7074598B2 (en) 2002-09-25 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp.
US7365176B2 (en) 2002-09-26 2008-04-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of Epstein-Barr virus
US7074599B2 (en) 2002-09-27 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of mecA-containing Staphylococcus spp.
US7427475B2 (en) * 2003-11-18 2008-09-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of group B streptococcus
WO2005113773A1 (en) * 2004-05-20 2005-12-01 Warnex Research Inc. Polynucleotides for the detection of escherichia coli 0157:h7 and escherichia coli 0157:nm verotoxin producers
EP1829964A4 (en) * 2004-12-08 2009-03-04 Takeshi Yamamoto METHOD OF STUDYING A SEQUENCE OF A GENE
EP2759307B1 (en) 2006-03-29 2016-11-09 Merial Limited Vaccine against Streptococci
CA2682758C (en) 2007-04-04 2018-08-14 Network Biosystems, Inc. Integrated nucleic acid analysis
JP2012529908A (ja) 2009-06-15 2012-11-29 ネットバイオ・インコーポレーテッド 法医学的ｄｎａの定量化のための改善された方法
CN101812531A (zh) * 2010-05-06 2010-08-25 天津朝海科技有限公司 一种检测大肠杆菌的试剂盒
WO2012155084A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Netbio, Inc. Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci
PL218839B1 (pl) 2011-09-09 2015-01-30 3G Therapeutics Inc Sposób wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), sonda do wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), sekwencje do amplifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga, zastosowanie sond i sekwencji
BR112014007394A2 (pt) 2011-09-28 2018-08-28 Du Pont método para detectar a presença de bactérias, polinucleotídeo isolado, kit e comprimido reagente
CN102605068B (zh) * 2012-03-15 2013-09-11 深圳市生科源技术有限公司 致病性大肠杆菌检测试剂盒及致病性大肠杆菌检测方法
MD4218C1 (ro) * 2012-06-07 2013-11-30 Национальный Центр Общественного Здоровья Министерства Здравоохранения Республики Молдова Procedeu de diagnosticare a infecţiilor cauzate de enterobacterii producătoare de beta-lactamaze
CN103207273A (zh) * 2013-03-26 2013-07-17 南昌大学 一种基于顺磁纳米Fe-Co合金探针的NMR食源性致病菌快速检测方法
CN104865186B (zh) * 2015-05-29 2017-08-25 重庆大学 便携式致病菌快速检测方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541308A (en) * 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5041372A (en) * 1988-11-02 1991-08-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Probe to identify enteroinvasive E. coli and Shigella species
US5468852A (en) * 1992-02-18 1995-11-21 Shimadzu Corporation Oligonucleotides for detecting bacteria
EP1036846A3 (en) * 1994-02-28 2000-10-18 Shimadzu Corporation Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process
US6001564A (en) 1994-09-12 1999-12-14 Infectio Diagnostic, Inc. Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
WO1996012801A1 (en) * 1994-10-24 1996-05-02 The Texas A & M University System Oral immunization with transgenic plants

Also Published As

Publication number Publication date
NZ337506A (en) 2001-08-31
BR9808963A (pt) 2000-08-01
WO1998048046A2 (en) 1998-10-29
EP0994965A2 (en) 2000-04-26
AU8014498A (en) 1998-11-13
US20040175723A1 (en) 2004-09-09
AU753277B2 (en) 2002-10-10
WO1998048046A3 (en) 1999-07-08
CN1258320A (zh) 2000-06-28
CA2286310A1 (en) 1998-10-29
JP2001521394A (ja) 2001-11-06
HK1026002A1 (en) 2000-12-01
US6664080B1 (en) 2003-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1160471C (zh) 检测致病性大肠杆菌菌株的TaqManTM－PCR
Fera et al. Detection of Arcobacter spp. in the coastal environment of the Mediterranean Sea
Friedrich et al. Improved enumeration of lactic acid bacteria in mesophilic dairy starter cultures by using multiplex quantitative real-time PCR and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization
Matsuki et al. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers
Kobayashi et al. Prevalence and characteristics of Shiga toxin-producing Escherichia coli from healthy cattle in Japan
Bélanger et al. Rapid detection of Shiga toxin-producing bacteria in feces by multiplex PCR with molecular beacons on the smart cycler
Stensvold et al. Detecting Blastocystis using parasitologic and DNA-based methods: a comparative study
Diaz et al. High-throughput detection of pathogenic yeasts of the genus Trichosporon
Nielsen et al. Detection and characterization of verocytotoxin-producing Escherichia coli by automated 5′ nuclease PCR assay
Osorio et al. 16S rRNA gene sequence analysis of Photobacterium damselae and nested PCR method for rapid detection of the causative agent of fish pasteurellosis
Wannet et al. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by a rapid and sensitive duplex PCR assay
Bouchara et al. Development of an oligonucleotide array for direct detection of fungi in sputum samples from patients with cystic fibrosis
EP2078756A1 (en) Detection of bacterium by utilizing dnaj gene and use thereof
Cao et al. Use of a DNA microarray for detection and identification of bacterial pathogens associated with fishery products
Wang et al. Detection of Enterobacter sakazakii and other pathogens associated with infant formula powder by use of a DNA microarray
Monnet et al. Quantitative detection of Corynebacterium casei in cheese by real-time PCR
CN1274846C (zh) 用于微生物检测分析系统、套组及方法
Mansfield et al. Identification of enteropathogenic Escherichia coli in simian immunodeficiency virus-infected infant and adult rhesus macaques
KR101990163B1 (ko) 독소 산생성 클로스트리듐·디피실의 검출 방법
Fukumoto et al. Impact of free-living amoebae on presence of Parachlamydia acanthamoebae in the hospital environment and its survival in vitro without requirement for amoebae
Galetto et al. Real-time PCR diagnosis and quantification of phytoplasmas
CN1724686A (zh) 用于检测肺炎支原体的靶序列和试剂盒
CA2718214A1 (en) Detection of bacteria belonging to the genus campylobacter by targeting cytolethal distending toxin
CN110511987A (zh) 一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法
CN110079622A (zh) 基于lamp法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: BAVARIAN NORDIC AS

Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: BAVARIAN NORDIC RESEARCH INST. GMBH

CP03 Change of name, title or address

Address after: Dan Mike Westergaard

Patentee after: Bavarian Nordic Research Inst. A/S

Address before: Danish Glostrup

Patentee before: Bavarian Nordic Research Inst. GmbH

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1026002

Country of ref document: HK

C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee