PL218839B1

PL218839B1 - Sposób wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), sonda do wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), sekwencje do amplifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga, zastosowanie sond i sekwencji

Info

Publication number: PL218839B1
Application number: PL396283A
Authority: PL
Inventors: Bożena Nejman-Faleńczyk; Grzegorz Węgrzyn
Original assignee: 3G Therapeutics Inc
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2015-01-30
Also published as: US20150044671A1; WO2013036152A1; PL396283A1; EP2758548A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), sonda do wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), sekwencje do amplifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga, zastosowanie sond i sekwencji. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy metody wizualnego wykrywania i diagnostyki enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC) poprzez detekcję sygnału pochodzącego z sond przy użyciu transiluminatora emitującego promieniowanie UV.

Ze względu na to, że pacjenci zainfekowani EHEC różnią się znacząco od tych zainfekowanych większością zwykłych szczepów bakterii, właściwa identyfikacja tego patogenu jest kluczowa, gdy podejrzewa się produkcję toksyny Shiga, przez co wymaga się szybkich procedur diagnostycznych, co nie jest zadaniem prostym.

Choć fenotyp EHEC został skorelowany z serotypem 0157, i faktycznie większość infekcji szczepami produkującymi toksynę Shiga dotyczy tego serotypu, jest jasne, że serotypy E.coli inne niż O157 mogą być odpowiedzialne za ten fenotyp [1]. W związku z tym, metody poświęcone wykrywaniu obecności serotypu O157 mogą być niewystarczające. Wcześniejsze badania wskazywały, że EHEC nie powodują fermentacji sorbitolu [2, 3], dlatego też jednym z polecanych testów było wykorzystanie płytek McConkey z sorbitolem do wykrywania szczepów E.coli sorbitol-ujemnych. Kolejne badania wskazały jednak, że niektóre szczepy E. coli O157 są sorbitol-pozytywne, w związku z czym, zaprezentowano wniosek, że nie jest możliwe oznaczanie fenotypu EHEC w drodze pomiarów mikrobiologicznych lub immunologicznych ze względu na brak w tym przypadku korelacji serotyp-fenotyp [1-3]. Wobec tego, wyłącznie testy genetyczne mogą być odpowiednie dla jednoznacznej identyfikacji EHEC.

Pomimo tego, że geny stx mogą być wykryte w materiale klinicznym bez izolacji bakterii, US Centers for Disease Control and Prevention wskazało istotne wady wykorzystania wyłącznie oznaczeń nieopartych na hodowli. Po pierwsze, nie izoluje się organizmu infekującego w celu oznaczenia serotypu i specyficznej diagnostyki. Po drugie, brak wyizolowanego organizmu ogranicza zdolność lekarza do przewidywania potencjalnej ostrości infekcji, ryzyka ciężkiej choroby w następstwie kontaktów z pacjentem oraz ograniczaną zdolność służb zdrowia publicznego do wykrywania i zwalczania epidemii oraz monitorowania trendów w epidemiologii.

Z tego względu opisano następujące konkretne wytyczne dla procedur wykrywania EHEC [1]:

i) próbki powinny być hodowane na selektywnych i różnicujących płytkach agarowych;

ii) płytki te powinny być jednocześnie mierzone przy pomocy testu, który wykrywa toksyny

Shiga lub geny kodujące te toksyny;

iii) izolaty te powinny być przekazane jak najszybciej do stanowych lub lokalnych laboratoriów zdrowia publicznego w celu ich dodatkowego scharakteryzowania molekularnego;

iv) wykrycie EHEC lub toksyny Shiga powinno być zgłoszone bezzwłocznie do lekarza prowadzącego, do laboratorium zdrowia publicznego, dla potwierdzenia, izolacji i następczego badania organizmu oraz odpowiednich służb zdrowia publicznego w celu przeprowadzenia śledztwa.

Powyższe zalecenia mogą być zastosowane właściwie wyłącznie w przypadku użycia odpowiednich metod. Problemem było to, że jak do tej pory dostępna była niewielka ilość testów laboratoryjnych pozwalających wykryć EHEC, a ponadto wiele z nich było zarówno czasochłonne, jak i drogie. To było powodem, dla którego opracowano w ostatnich kilku latach dużą liczbę nowych testów wykrywających EHEC.

Pierwszą klasą testów są nowe testy pozwalające na wykrycie EHEC w oparciu o PCR. W wielu przypadkach wykorzystywano wielokrotne procedury PCR i posługiwano się najpowszechniej genem targetowym stx1, stx2 (kodujące toksyny Shiga) oraz eae (kodujący intyminę), podczas gdy również często uwzględniano geny kodujące różne O antygeny. Poszczególne oznaczenia różnią się szczegółami, jednakże trwają one zwykle od jednej do kilku godzin, a ich wrażliwość waha się od 10² do 10⁶komórek bakteryjnych (w szczególności jednostek tworzących kolonię, cfu) na reakcję, odpowiadających 10⁴-10⁸ cfu/ml próbki [4-18].

W kilku podejściach, autorzy oznaczeń wykorzystywali technikę Real Time PCR (RT-PCR), która może dać nie tylko wynik jakościowy, ale i ilościowy. Jest to ewidentną zaletą tych metod, szczególnie w połączeniu z możliwością wykorzystania ultraszybkich procedur RT-PCR, które dają wyniki w czasie poniżej 10 minut. Ponadto, granica detekcji może leżeć pomiędzy 3 a 50 równoważnikami

PL 218 839 B1 genomu, co jest istotne w świetle małej liczby komórek EHEC zdolnych do wywołania infekcji w jelicie. Problemem jest jednakże względnie wysoki koszt sprzętu do RT-PCR i często skomplikowany proces optymalizacji warunków reakcji. To sprawia, że metody te trudno wdrożyć w zwykłych laboratoriach szpitalnych. Niemniej niektóre procedury wykrywania EHEC oparte na RT-PCR wydają się być potencjalnie użyteczne zarówno w szczegółowych, jak i wyjątkowo ważnych analizach.

Interesującą diagnostyczną możliwością jest wykorzystanie techniki LAMP (ang. loop-mediated isothermal amplification). W oznaczeniach opartych na LAMP możliwe jest wykrycie obecności nawet pojedynczych patogennych komórek lub wirusów w przeciągu jednej godziny. Chociaż metoda ta nie jest jeszcze zbyt popularna, może się wydawać obiecującą alternatywą. Ważne jest, że w przypadku tak wrażliwej metody może być użyteczne wykrywanie patogenów, których dawka zakaźna jest tak niska jak 100 lub mniej, tak jak w przypadku EHEC. Dodatkowo można łączyć LAMP z innymi metodami, takimi jak RT-PCR, czy metoda FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [19-22].

Inna klasa testów jest oparta na nowatorskich metodach hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Obejmują one wykorzystanie w pełni zautomatyzowanych, elektrycznych bioczipów, metodę detekcji kolorymetrycznej opartą na fotopolimeryzacji i mikromacierze połączone z DNA [23-25]. Takie nowatorskie metody hybrydyzacji są wyrafinowane i skuteczne, niemniej, być może wciąż zbyt skomplikowane w stosowaniu w standardowym laboratorium klinicznym.

Nowym podejściem jest zastosowanie nanocząstek do wykrywania zarówno EHEC jak i toksyn Shiga. Ze względu na to, że toksyny Shiga mogą specyficznie oddziaływać z nanocząstkami Gal-αΐ ,4-Gal glikopolidiacetylenu (GPDA) lub nanocząstkami złota sfunkcjonalizowanymi globotriozą (AuNP), to można je użyć do wykrywania tych białkowych protein [26-27]. Ponadto zaproponowano użycie nanocząstek węglowych w paskach „lateral flow (test immunologiczny typu „lateral flow” na kwasy nukleinowe) w celu wykrycia genów kodujących toksynę Shiga [28]. Nanocząstki złota wykorzystano również w zmodyfikowanej metodzie do wykrywania genu stx2 w oznaczeniu kolorymetrycznym [29]. Ponownie, choć wyrafinowane, metody te mogą być szeroko wykorzystywane w laboratoriach klinicznych raczej w przyszłości niż w obecnych czasach.

Ulepszone oznaczenia immunolog iczne dla wykrywania EHEC, fagów konwertujących toksynę Shiga lub toksyny Shiga są ciągle opracowywane, szczególnie łączone z innymi metodami, takimi jak PCR, użycie elektrycznych bioczipów czy testów translacji pozakomórkowej [30-40]. Dodatkowo, ulepszone klasyczne metody, oparte na hodowli bakteryjnej, są przez niektórych autorów uznawane jako szczególnie korzystne we właściwej identyfikacji EHEC, szczególnie razem z testami molekularnymi [41, 42].

Ostatnia, bardzo interesująca metoda oparta na wydajnej indukcji profagów konwertujących toksynę Shiga została opisana niedawno [43]. Wykrywanie profagów było możliwe, po przesączeniu płynu hodowlanego (stosując płytkę 96-dołkową w celu testowania wielu kultur w tym samym czasie) i traktowaniu norfloksacyną (w celu indukcji profagów) oraz następcze reakcje PCR specyficzne dla genu faga. Procedura ta może być użyteczna w wykrywaniu EHEC oraz w dalszych szczegółowych badaniach bakteriofagów posiadających geny kodujące toksyny Shiga. Można przypuszczać również, że metoda ta może być wykorzystana w przewidywaniu zjadliwości izolatów E. coli.

Zgłoszenie patentowe EP 2 292 799 A1 (opubl. 9. marca 2011) ujawnia proces oceny ryzyka molekularnego (MRA, ang. Molecular risk assessment) w próbce, w której podejrzewa się obecność Escherichia coli kodującej toksynę Shiga (STEC), obejmujący takie etapy jak: kontaktowanie wspomnianej próbki lub wyizolowanego z niej DNA z parą starterów otrzymanych z zastępujących genów targetowych stx1, stx2 oraz eae, przy czym proces charakteryzuje się tym, że obejmuje także kontaktowanie próbki lub wyizolowanego z niej DNA z parą starterów otrzymanych z następujących genów targetowych nleB, nleH1-2, nleE, ent/espL2 i wykrywanie obecności lub nieobecności produktu amplifikacji każdego z genów targetowych.

W zgłoszeniach US 20050282194A1 (opubl. 22-12-2005), EP 1380655A2 (opubl. 19-10-1998) oraz US 20030215814A1 (opubl. 20-11-2003) ujawniono sposób wykrywania organizmów produkujących toksyny Shiga lub toksyny typu toksyn Shiga, w szczególności E. coli produkujące toksyny typu toksyn Shiga, w próbkach biologicznych z wykorzystaniem RT-PCR.

W wynalazku przedstawiono również startery oraz sondy dla wykrywania organizmów wytwarzających toksyny Shiga lub toksyny typu toksyn Shiga, jak również produkt zawierający te startery i sondy dla wykrywania tych organizmów.

Natomiast w zgłoszeniu WO 9848046A2 (opubl. 1998-10-29) oraz opisie patentowym US 6664080B1 (opubl. 16-12-2003) przedstawiono sposób wykrywania patogennego E. coli w próbce

PL 218 839 B1 obejmujący amplifikację PCR DNA wyizolowanego ze wspomnianej próbki, stosując specyficzne oligonukleotydowe startery.

W świetle powyżej przedstawionych informacji, nadal istnieje potrzeba stworzenia pojedynczej metody wykrywania EHEC, która charakteryzowałaby się prostotą, szybkością, wrażliwością i niskimi kosztami. Dlatego też, wybiera się między tanimi i łatwymi procedurami o niezbyt wysokiej, lecz wciąż akceptowalnej wrażliwości (prawdopodobnie najbardziej użyteczne w zwykłych laboratoriach szpitalnych) a wyrafinowanymi i skomplikowanymi metodami, dającymi bardzo dokładne wyniki (prawdopodobnie najbardziej użyteczne w laboratoriach badawczych i dużych centrach medycznych).

Celem przedmiotowego rozwiązania było opracowanie nowego sposobu szybkiego wykrywania i diagnostyki enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC) opartego na reakcji PCR z wykorzystaniem aktywności 5'-egzonukleazy polimerazy Taq i sond typu TaqMan oraz na detekcji sygnału pochodzącego z ww. sond przy użyciu transiluminatora emitującego promieniowanie UV.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów doprowadziła do opracowania i dostarczenia metody cechującej się nowym sposobem detekcji, co odróżnia ją od dotychczas opisanych metod, w których stosowano skomplikowany i drogi sprzęt, taki jak maszyny do Real-Time PCR, czy czytniki płytek. Wskazane w niniejszym ujawnieniu rozwiązanie pozwala na wizualną ocenę obecności enterokrwotocznej bakterii E. coli (EHEC), niosącej toksyny Shiga 1 lub/i 2 oraz rodzaju niesionej przez bakterię toksyny za pomocą standardowego transiluminatora UV.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), charakteryzujący się tym, że oparty jest na reakcji PCR z wykorzystaniem aktywności 5'-egzonukleazy polimerazy Taq i sond typu TaqMan oraz na detekcji sygnału pochodzącego z tych sond przy użyciu transiluminatora emitującego promieniowanie UV, przy czym sondy stanowią krótkie oligonukleotydy, komplementarne do genów toksyn Shiga 1 i 2, które zawierają na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1.

Korzystnie, gdy w a) pierwszym etapie przeprowadza się reakcję PCR z wykorzystaniem sond typu TaqMan i aktywności 5'-egzonukleazy polimerazy Taq (ang. 5'-nuclease assay), po czym podczas reakcji PCR sonda wiąże się z komplementarną sekwencją na matrycy DNA i jest degradowana na etapie wydłużania przez polimerazę Taq posiadającą aktywność 5'-egzonukleazową, po czym następuje rozdział obu cząsteczek i emisja światła fluorescencyjnego, a następnie w b) drugim etapie, po zakończeniu reakcji PCR, probówkę, w której prowadzono reakcję, umieszcza się na transiluminatorze o źródle promieniowania ultrafioletowego 312 nm, po czym światło UV wzbudza fluorescencję pochodnej fluoresceiny FAM uwolnionej spod działania wygaszacza BHQ-1, i obserwuje się zielonożółte świecenie roztworu w probówce.

Korzystnie, gdy sondy stanowią krótkie oligonukleotydy, komplementarne do genów toksyn Shiga 1 i 2, które zawierają na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1 i określone są sekwencjami określonymi jako seq. ID nr 3 i 6.

Korzystnie, gdy sekwencje do genu kodującego toksynę Shiga 1 opisane są przez Seq. ID No. 1 i/lub Seq. ID No. 2.

Korzystnie, gdy sekwencje do genu kodującego toksynę Shiga 2 opisane są przez Seq. ID No. 4 i/lub Seq. ID No. 5.

Korzystnie, gdy fluorescencja jest widoczna, tylko gdy znakowana sonda ulegnie degradacji, a tym samym, gdy do probówki zostanie wprowadzone DNA komplementarne do zaprojektowanych sond.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sonda do wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), charakteryzująca się tym, że stanowi krótki oligonukleotyd nie dłuższy niż 80 nt, komplementarny do genów toksyn Shiga 1 i/lub 2, który zawiera na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1 (ang. Black Hole Quencher).

Korzystnie, gdy sonda stanowi sekwencję odpowiadającą fragmentowi genu kodującego toksynę Shiga 1 lub 2.

Korzystnie, gdy sonda wybrana jest spośród sekwencji Seq. ID No. 3 lub Seq. ID No. 6.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja do amplifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga 1 charakteryzująca się tym, że opisana jest przez Seq. ID No. 1 lub Seq. ID No. 2.

PL 218 839 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja do amplifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga 2 znamienna tym, że opisana jest przez Seq. ID No. 4 lub Seq. ID No. 5.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sond określonych powyżej do wykrywania i/lub diagnostyki enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji określonych powyżej do wykrywania i/lub diagnostyki enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC).

W celu lepszego zrozumienia wynalazku rozwiązanie zostało częściowo przedstawione na rysunku, gdzie:

• figura 1 przedstawia analizę 19 szczepów EHEC na obecność genu kodującego toksynę Shiga 1 za pomocą reakcji PCR z sondą typu TaqMan (+). Detekcja sygnału pochodzącego z sondy: tox1probe, komplementarnej do genu kodującego toksynę Shiga 1: A) za pomocą systemu do dokumentacji żeli (Gel Doc XR-Bio-Rad); C) oraz transiluminatora UV przy 312 nm dł. fali; B) Analiza produktów reakcji PCR za pomocą elektroforezy agarozowej; D) Pomiar sygnału fluorescencji 485/535 nm za pomocą czytnika Perkin Elmer Multilabel Counter Victor3, Wallac 1420. Reakcja kontrolna przeprowadzona bez sondy (-), bez matrycowego DNA (-DNA) oraz reakcja z wykorzystaniem genomowego DNA szczepu E.coli MG1655 niezawierającego genów kodujących toksyny Shiga 1 i 2;

• figura 2 przedstawia analizę 19 szczepów EHEC na obecność genu kodującego toksynę Shiga 2 za pomocą reakcji PCR z sondą typu TaqMan (+). Detekcja sygnału pochodzącego z sondy: tox2probe, komplementarnej do genu kodującego toksynę Shiga 2. A) za pomocą systemu do dokumentacji żeli (Gel Doc XR-Bio-Rad). C) oraz transiluminatora UV przy 312 nm dł. fali. B) Analiza produktów reakcji PCR za pomocą elektroforezy agarozowej. D) Pomiar sygnału fluorescencji 485/535 nm za pomocą czytnika Perkin Elmer Multilabel Counter Victor3, Wallac 1420. Reakcja kontrolna przeprowadzona bez sondy (-), bez matrycowego DNA (-DNA) oraz reakcja z wykorzystaniem genomowego DNA szczepu E.coli MG1655 niezawierającego genów kodujących toksyny Shiga 1 i 2.

Poniżej przedstawiono przykładowe realizacje wynalazku.

Przykłady realizacji

Niniejsza metoda polega na tym, że w pierwszym etapie przeprowadza się reakcję PCR z wykorzystaniem sond typu TaqMan i aktywności 5'-egzonukleazy polimerazy Taq (ang. 5'-nuclease assay). Zastosowane tu sondy opisane sekwencjami określonymi jako seq. ID nr 3 i 6 stanowiące krótkie oligonukleotydy, komplementarne do genów toksyn Shiga 1 i 2, które zawierają na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1 (ang. Black Hole Quencher). Ponieważ fluorochrom i jego wygaszacz znajdują się w bliskim kontakcie, nie dochodzi do emisji sygnału fluorescencyjnego. Podczas reakcji PCR z wykorzystaniem pary starterów (ID nr 1-2 lub ID nr 4-5) oraz sond (odpowiednio ID nr 3 i ID nr 6) każda z sond wiąże się z komplementarną sekwencją na matrycy DNA (odpowiednio gen stx1 oraz stx2) i jest degradowana na etapie wydłużania przez polimerazę Taq posiadającą aktywność 5'-egzonukleazową, przez co fluorochrom ulega oddzieleniu od wygaszacza. Rozdział obu cząsteczek umożliwia emisję światła fluorescencyjnego. W drugim etapie, po zakończeniu reakcji PCR, 0.2 mL probówkę, w której prowadzono reakcję, umieszcza się na transiluminatorze o źródle promieniowania ultrafioletowego 312 nm. Światło UV wzbudza fluorescencję pochodnej fluoresceiny FAM uwolnionej spod działania wygaszacza BHQ-1, dzięki czemu „gołym okiem można obserwować zielonożółte świecenie roztworu w probówce. Zielonożółta fluorescencja jest widoczna tylko w przypadku, gdy znakowana sonda ulegnie degradacji, a tym samym, gdy do probówki zostanie wprowadzone DNA komplementarne do zaprojektowanych sond (ID nr 3 i 6) oraz starterów (ID nr 1-2 oraz 4-5).

Izolacja DNA za pomocą lizy przez gotowanie

Bakterie hodowano przez noc w 5 ml pożywki LB w 37°C, a następnie wirowano przy 10 000 rpm, przez 10 min. Osad zawieszono w 250 μΐ destylowanej wody, inkubowano przez 10 min w temp.

100°C i ponownie wirowano przy 10 000 rpm, przez 5 min. Supernatant rozcieńczono 10 razy wodą destylowaną i przechowywano w temp. -20°C. Do reakcji PCR dodano 2 μl rozcieńczonego DNA, co przekładało się na stężenia w zakresie 100-300 ng.

Izolacja DNA za pomocą lizy z wykorzystaniem lizozymu oraz proteinazy-K DNA izolowano z 1 ml świeżej kultury hodowanej na podłożu płynnym TBS (Tryptic Soy Broth).

Po 4 h inkubacji w 37°C z napowietrzaniem (300 rpm), kulturę zwirowano. Osad bakteryjny zmieszano z 40 μl lizozymu o stężeniu 10 mg/ml i inkubowano przez 30 min w temp. 37°C. Następnie do probówek dodano, 160 μl buforu do lizy (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 10 mM EDTA i 1% Triton X-100) zawierającego 2 mg/ml proteinazy-K i inkubowano w temp. 52°C przynajmniej 1 h lub do czasu uzyskania

PL 218 839 B1 przezroczystej zawiesiny. Następnie dodano 0.8 ml 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 i probówki ogrzewano w 95°C przez 30 min. Tak przygotowane DNA rozcieńczono 10 razy wodą destylowaną i 2 μΐ dodano do reakcji PCR.

Reakcje PCR

W doświadczeniach z Polimerazą DFS-Taq Bioron do reakcji wykorzystano matrycowe DNA w ilości 250 ng i MgCI2 o stężeniu 4 mM, reakcja zachodziła prawidłowo. W doświadczeniach z Polimerazą SuperHotTaq DNA Bioron detekcja sygnału była możliwa już przy zastosowaniu DNA w ilości 130 ng (pozostałe wartości, podobnie jak program, były bez zmian. Reaction buffer „incomplete” to nazwa handlowa buforu dla Polimerazy DFS-Taq (Bioron), bufor nie zawiera magnezu stąd „incomplete” i dlatego trzeba dodawać magnez osobno.

P r z y k ł a d 1

Wykrywanie bakterii z genem toksyny Shiga 1, warunki reakcji PCR

Składnik	Końcowe stężenie lub ilość
DNA	250 ng
10x Reaction buffer „incomplete” (Bioron)	1x
dNTPs mix (4mM każdy dNTP)	160 μM (każdy)
MgCl2 (Bioron)	4 mM
Starter F: tox1F	1 μM
Starter R: tox1 R	1 μM
Sonda: tox1probe (rozc. ok. 20x)	150 nM
DFS-Taq DNA polimeraza (Bioron)	1.25 U
H2O	do 25 μί

Program

95°C-2 min

95°C-15s | cykli

60°C-60s | 20 Wielkość produktu tox1 = 196 pz

Po zakończeniu reakcji, probówki w których prowadzono reakcję (0.2 ml objętości np. Nippon, w paskach z płaskim wieczkiem) wyjmuje się z termocyklera (Eppendorf), krótko odwirowuje, umieszcza się w transiluminatorze i wzbudza światłem UV o długości fali 312 nm (Vilber Lourmat). Charakterystyczna zielonożółta fluorescencja świadczy o obecności EHEC z genem toksyny Shiga 1.

P r z y k ł a d 2

Wykrywanie bakterii z genem toksyny Shiga 2, warunki reakcji PCR

Składnik	Końcowe stężenie lub ilość
DNA	250 ng
10x Reaction buffer „incomplete” (Bioron)	1 x
dNTPs mix (4 mM każdy dNTP)	160 μM (każdy)
MgCl2 (Bioron)	4 mM
Starter F: tox2F	1 μΜ
Starter R: tox2R	1 μΜ
Sonda: tox2probe (rozc. ok. 20x)	150 nM
DFS-Taq DNA polimeraza (Bioron)	1.25 U
H2O	do 25 μί

PL 218 839 B1

Program

95°C-2 min 5

95°C-15s | Wielkość produktu tox2 = 211 pz cykli

60°C-60s |

Po zakończeniu reakcji probówki, w których prowadzono reakcję (0.2 ml objętości np. Nippon, w paskach z płaskim wieczkiem) wyjmuje się z termocyklera (Eppendorf), krótko odwirowuje, umieszcza się w transiluminatorze i wzbudza światłem UV o długości fali 312 nm (Vilber Lourmat). Charakterystyczna zielonożółta fluorescencja świadczy o obecności EHEC z genem toksyny Shiga 2.

Przykłady wykorzystania metody

Opracowaną metodę sprawdzono na 19 próbach. 17 otrzymano z Państwowego Zakładu Higieny (PHZ). Były to próbki DNA wyizolowane z werotoksycznych pałeczek E. coli izolowanych z kału od pacjentów w Polsce. Obecność werotoksyn oznaczona została przez PZH przy użyciu testu cytotoksyczności na linii komórkowej Vero, testu RPLA-VTEC (Oxoid) oraz metodą standardowych testów PCR [18, 32]. W tabeli poniżej zamieszczono listę prób otrzymanych z PZH. Dwie dodatkowe próby DNA (571 i EDL933W) pochodziły z kolekcji własnej. Uzyskane wyniki potwierdzono ponadto sprawdzając obecność produktu za pomocą elektroforezy agarozowej oraz dokonując pomiaru fluorescencji 485 nm/535 nm przy użyciu czytnika płytek (Perkin Elmer Multilabel Counter Victor3). Próby DNA otrzymane z PZH zostały wyizolowane, jak opisano powyżej, za pomocą lizy z wykorzystaniem lizozymu i proteinazy-K, pozostałe próby izolowano za pomocą lizy przez gotowanie (10 min. 100°C).

T a b e l a 1

Lista prób DNA otrzymanych z PZH

Numer szczepu	Serotyp	Toksyna Shiga 1	Toksyna Shiga 2
286/00	0157	0	1
44/02	0157	1	1
174/03	0157	0	1
49/04	0157	1	1
365/05	0157	1	1
206/06	0157	1	1
443/07	0157	1	1
474/07	0157	1	1
9/08	0157	0	1
221/08	0157	1	1
371/08	0157	0	1
171/09	0157	0	1
74/10	0157	0	1
245/10	0111	0	1
251/10	0157	1	1
201/01	026	0	1
319/01	026	1	0

PL 218 839 B1

Lista sekwencji

Seq. ID No. 1

Sekwencja do genu kodującego toksynę Shiga 1

Starter Forward: toxlF 5'- GACGATACCTTTACAGTTAAAGTGGGT - 3'

Seq. IDNo.2

Sekwencja do genu kodującego toksynę Shiga 1

Starter Reverse: toxlR 5’- TCTCCGCCTGCTATTTTCACT - 3'

Seq. ID No. 3

Sekwencja do genu kodującego toksynę Shiga 1

Sonda: toxlprobe 5'-FAM -AATCTTCAGTCTCTTCTTCTCAGTGCGCAAAT-BHQ-l-3'

Seq. ID No. 4

Sekwencja do genu kodującego toksynę Shiga 2

Starter Forward: tox2F 5’- TTCCAAGTATAATGAGGATGACACA - 3'

Seq. ID No. 5

Sekwencja do genu kodującego toksynę Shiga 2

Starter Reverse: tox2R 5'- CCCACATACCACGAATCAGGT - 3'

Seq. ID No. 6

Sekwencja do genu kodującego toksynę Shiga 2

Sonda: tox2probe 5-FAM-AATCTGCAACCGTTACTGCAAAGTGCTCA -BHQ-l-3'

PL 218 839 B1

Literatura

1. Gould LH, Bopp C, Strockbine N et al.: Recommendations for diagnosis of Shiga toxinproducing Escherichia coli infections by clinical laboratories. MMWR Recomm. Rep. 58(RR-12), 1-14 (2009)

2. Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, McGee HB, Wells JG, Davis BR: Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N. Engl. J. Med. 308(12), 681-685 (1983).

3. Blanco JE, Blanco M, Alonso MP et al.: Serotypes, virulence genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from human patients. J. Clin. Microbiol. 42(1), 311-319 (2004).

4. Persson S, Olsen KE, Scheutz F, Krogfelt KA, Gerner-Smidt P: A method for fast and simple detection of major diarrhoeagenic Escherichia coli in the routine diagnostic laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 13(5), 516-524 (2007).

5. Riyaz-UI-Hassan S, Syed S, Johri S, Verma V, Qazi GN: Application of a multiplex PCR assay for the detection of Shigella, Escherichia coli and Shiga toxin-producing E. coli in milk. J. Dairy Res. 76(2), 188-194 (2009).

6. Mull B, Hill VR: Recovery and detection of Escherichia coli 0157:H7 in surface water, using ultrafiltration and real-time PCR. Appl. Environ. Microbiol. 75(11), 3593-3597 (2009).

7. Fratamico PM, DebRoy C, Miyamoto T, Liu Y: PCR detection of enterohemorrhagic Escherichia coli 0145 in food by targeting genes in the E. coli 0145 O-antigen gene cluster and the shiga toxin 1 and shiga toxin 2 genes. Foodborne Pathog. Dis. 6(5), 605-611 (2009).

8. Rajkhowa S, Das R, Bora S, Rajkhowa C, Rahman H, Bujarbaruah KM: Detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli and enteropathogenic Escherichia coli in faecal samples of healthy mithun (Bos frontalis) by multiplex polymerase chain reaction. Zoonoses Public Health. 57(6), 397-401 (2010).

9. Gómez-Duarte OG, Arzuza O, Urbina D et al.: Detection of Escherichia coli enteropathogens by multiplex polymerase chain reaction from children's diarrheal stools in two Caribbean-Colombian cities. Foodborne Pathog. Dis. 7(2), 199-206 (2010).

10. Rooks DJ, Yan Y, McDonald JE, Woodward MJ, McCarthy AJ, Allison HE: Development and validation of a qPCR-based method for quantifying Shiga toxin-encoding and other lambdoid bacteriophages. Environ. Microbiol. 12(5), 1194-1204 (2010).

11. Chui L, Couturier MR, Chiu T et al.: Comparison of Shiga toxin-producing Escherichia coli detection methods using clinical stool samples. J. Mol. Diagn. 12(4), 469-475 (2010).

12. Cunningham SA, Sloan LM, Nyre LM, Vetter EA, Mandrekar J, Patel R: Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. J. Clin. Microbiol. 48(8), 2929-2933 (2010).

13. DebRoy C, Roberts E, Davis M, Bumbaugh A: Multiplex polymerase chain reaction assay for detection of nonserotypable Shiga toxin-producing Escherichia coli strains of serogroup 0147. Foodborne Pathog. Dis. 7(11), 1407-1414 (2010).

14. Bonetta S, Borelli E, Bonetta S, Conio O, Palumbo F, Carraro E: Development of a PCR protocol for the detection of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella spp. in surface water. Environ. Monit. Assess. 177(1-4), 493-503 (2011).

15. Park SH, Hanning I, Jarquin R et al.: Multiplex PCR assay for the detection and quantification of Campylobacter spp., Escherichia coli 0157:H7, and Salmonella serotypes in water samples. FEMS Microbiol. Lett. 316(1), 7-15 (2011).

16. Bernini V, Sgarbi E, Bove CG, Gatti M, Neviani E: A polyphasic approach to detect enterotoxigenic Staphylococcus aureus and diarrheagenic Escherichia coli in raw milk Italian cheeses by multiplex PCR. J. Food Prot. 73(12), 2281-2284 (2010).

17. Bugarel M, Beutin L, Scheutz F, Loukiadis E, Fach P: Identification of genetic markers for differentiation of Shiga toxin-producing, enteropathogenic and avirulent strains of Escherichia coli 026. Appl. Environ. Microbiol. 77(7), 2275-2281 (2011).

18. Chassagne L, Pradel N, Robin F, Livrelli V, Bonnet R, Delmas J: Detection of stxl, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64(1),98-101 (2009).

19. Hara-Kudo Y, Nemoto J, Ohtsuka K et al.: Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli using loop-mediated isothermal amplification. J. Med. Microbiol. 56(3), 398-406 (2007).

PL 218 839 B1

20. Ohtsuka K, Tanaka M, Ohtsuka T, Takatori K, Hara-Kudo Y: Comparison of detection methods for Escherichia coli 0157 in beef livers and carcasses. Foodborne Pathog. Dis.7(12), 1563-1567 (2010).

21. Kouguchi Y, Fujiwara T, Teramoto M, Kuramoto M: Homogenous, real-time duplex loopmediated isothermal amplification using a single fluorophore-labeled primer and an intercalator dye: Its application to the simultaneous detection of Shiga toxin genes 1 and 2 in Shiga toxigenic Escherichia coli isolates. Mol. Cell. Probes. 24(4), 190-195 (2010).

22. Hara-Kudo Y, Konishi N, Ohtsuka K et al.: Detection of Verotoxigenic Escherichia coli 0157 and 026 in food by plating methods and LAMP method: a collaborative study. Int. J. Food Microbiol. 122(1-2), 156-161 (2008).

23. Los M, Los JM, Węgrzyn G: Rapid identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) using electric biochips. Diagn. Mol. Pathol.17(3), 179-184 (2008).

24. Schuurman T, Roovers A, van der Zwaluw WK et al.: Evaluation of 5'-nuclease and hybridization probe assays for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli in human stools. J. Microbiol. Methods.70(3), 406-415 (2007).

25. Quinones B, Swimley MS, Taylor AW, Dawson ED: Identification of Escherichia coli 0157 by using a novel colorimetric detection method with DNA microarrays. Foodborne Pathog. Dis. 8(6), 705-711 (2011).

26. Nagy JO, Zhang Y, Yi W et al.: Glycopolydiacetylene nanoparticles as a chromatic biosensor to detect Shiga-like toxin producing Escherichia coli 0157:H7. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18(2), 700-703 (2008).

27. Chien YY, Jan MD, Adak AK et al.: Globotriose-functionalized gold nanoparticles as multivalent probes for Shiga-like toxin. Chembiochem. 9(7), 1100-1109 (2008).

28. Noguera P, Posthuma-Trumpie GA, van Tuil M et al.: Carbon nanoparticles in lateral flow methods to detect genes encoding virulence factors of Shiga toxin-producing Escherichia coli. Anal. Bioanal. Chem. 399(2), 831-838 (2011).

29. Jyoti A, Pandey P, Singh SP, Jain SK, Shanker R: Colorimetric detection of nucleic acid signature of Shiga toxin producing Escherichia coli using gold nanoparticles. J. Nanosci. Nanotechnol. 10(7), 4154-4158 (2010).

30. Los M, Los JM, Blohm L et al.: Rapid detection of viruses using electrical biochips and antivirion sera. Lett. Appl. Microbiol. 40(6), 479-485 (2005).

31. Hajra TK, Bag PK, Das SC, Mukherjee S, Khan A, Ramamurthy T: Development of a simple latex agglutination assay for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) by using polyclonal antibody against STEC. Clin. Vaccine Immunol. 14(5), 600-604 (2007).

32. Stefan A, Scaramagli S, Bergami R et al.: Real-time PCR and enzyme-linked fluorescent assay methods for detecting Shiga-toxin-producing Escherichia coli in mincemeat samples. Can. J. Microbiol. 53(3), 337-342 (2007).

33. Nielsen K, Smith P, McRae H, Yu W, Widdison J: Detection of Escherichia coli 0157:H7 by fluorescence polarization assay and polymerase chain reaction. J. Immunoassay Immunochem. 28(3), 251-265 (2007).

34. Teel LD, Daly JA, Jerris RC et al.: Rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli by optical immunoassay. J. Clin. Microbiol. 45(10), 3377-3380 (2007).

35. Zhang W, Bielaszewska M, Pulz M et al.: New immuno-PCR assay for detection of low concentrations of Shiga toxin 2 and its variants. J. Clin. Microbiol. 46(4), 1292-1297 (2008).

36. Willford J, Mills K, Goodridge LD: Evaluation of three commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kits for detection of Shiga toxin. J. Food Prot. 72(4), 741-747 (2009).

37. He X, Quinones B, Carter JM, Mandreli RE: Validation of a cell-free translation assay for detecting Shiga toxin 2 in bacterial culture. J. Agric. Food Chem. 57(11), 5084-5088 (2009).

38. Rozand C, Feng PC: Specificity analysis of a novel phage-derived ligand in an enzymelinked fluorescent assay for the detection of Escherichia coli 0157:H7. J. Food Prot. 72(5), 1078-1081 (2009).

39. Verstraete K, De Zutter L, Messens W, Herman L, Heyndrickx M, De Reu K: Effect of the enrichment time and immunomagnetic separation on the detectio n of Shiga toxin-producing Escherichia coli O26, O103, Olli, O145 and sorbitol positive O157 from artificially inoculated cattle faeces. Vet. Microbiol. 145(1-2), 106-112 (2010).

PL 218 839 B1

40. Hermos CR, Janineh M, Han LL, McAdam AJ: Shiga toxin-producing Escherichia coli in children: detection and clinical manifestations of 0157:H7 and non-0157:H7 infection. J. Clin. Microbiol. 49(3), 955-959 (2011).

41. Hu J, Green D, Swoveland J, Grant M, Boyle DS: Preliminary evaluation of a procedure for improved detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli in fecal specimens. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 65(1), 21-26 (2009).

42. Couturier MR, Lee B, Zelyas N, Chui L: Shiga-toxigenic Escherichia coli detection in stool samples screened for viral gastroenteritis in Alberta, Canada. J. Clin. Microbiol. 49(2), 574-578 (2011).

43. McDonald JE, Smith DL, Fogg PC, McCarthy AJ, Allison HE: High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Appl. Environ. Microbiol. 76(7), 2360-2365 (2010).

44. Development of a rapid, high-throughput method for induction of Shiga toxin-converting prophages has been described. This method may be potentially useful in both basic and epidemiological studies on these phages, as well as in the course of developing novel diagnostic procedures of EHEC infections.

Claims

1. Sposób wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), znamienny tym, że oparty jest na reakcji PCR z wykorzystaniem aktywności 5'-egzonukleazy polimerazy Taq i sond typu TaqMan oraz na detekcji sygnału pochodzącego z tych sond przy użyciu transiluminatora emitującego promieniowanie UV, przy czym sondy stanowią krótkie oligonukleotydy, komplementarne do genów toksyn Shiga 1 i 2, które zawierają na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w a) pierwszym etapie przeprowadza się reakcję PCR z wykorzystaniem sond typu TaqMan i aktywności 5'-egzonukleazy polimerazy Taq (ang. 5'-nuclease assay), po czym podczas reakcji PCR sonda wiąże się z komplementarną sekwencją na matrycy DNA i jest degradowana na etapie wydłużania przez polimerazę Taq posiadającą aktywność 5'-egzonukleazową, po czym następuje rozdział obu cząsteczek i emisja światła fluorescencyjnego, a następnie w b) drugim etapie, po zakończeniu reakcji PCR, probówkę, w której prowadzono reakcję, umieszcza się na transiluminatorze o źródle promieniowania ultrafioletowego 312 nm, po czym światło UV wzbudza fluorescencję pochodnej fluoresceiny FAM uwolnionej spod działania wygaszacza BHQ-1, i obserwuje się zielonożółte świecenie roztworu w probówce.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sondy stanowią krótkie oligonukleotydy, komplementarne do genów toksyn Shiga 1 i 2, które zawierają na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1 i określone są sekwencjami określonymi jako Seq. ID nr 3 i 6.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje do genu kodującego toksynę Shiga 1 opisane są przez Seq. ID No. 1 i/lub Seq. ID No. 2.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje do genu kodującego toksynę Shiga 2 opisane są przez Seq. ID No. 4 i/lub Seq. ID No. 5.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fluorescencja jest widoczna, tylko gdy znakowana sonda ulegnie degradacji, a tym samym, gdy do probówki zostanie wprowadzone DNA komplementarne do zaprojektowanych sond.

7. Sonda do wykrywania enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC), znamienna tym, że stanowi krótki oligonukleotyd nie dłuższy niż 80 nt, komplementarny do genów toksyn Shiga 1 i/lub 2, który zawiera na końcu 5' reporter fluorescencji FAM (6-karboksyfluoresceinę), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluorescencję BHQ-1 (ang. Black Hole Quencher).

8. Sonda według zastrz. 7, znamienna tym, że stanowi sekwencję do wykrywania genu kodującego toksynę Shiga 1 lub 2.

9. Sonda według zastrz. 7, znamienna tym, że wybrana jest spośród sekwencji Seq. ID No. 3 lub Seq. ID No. 6.

10. Sekwencja do ampiifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga 1, znamienna tym, że opisana jest przez Seq. ID No. 1 lub Seq. ID No. 2.

PL 218 839 B1

11. Sekwencja do amplifikacji fragmentu genu kodującego toksynę Shiga 2, znamienna tym, że opisana jest przez Seq. ID No. 4 lub Seq. ID No. 5.

12. Zastosowanie sond określonych zastrzeżeniami 7 do 8 do wykrywania i/lub diagnostyki enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC).

13. Zastosowanie sekwencji określonych zastrzeżeniami 9 do 10 do wykrywania i/lub diagnostyki enterokrwotocznych Escherichia coli (EHEC).